หน้าที่ 1 - ความหมายและความสำาคัญ RNAi Technology ความหมาย RNA interference (RNAi) คือ กระบวนการในการควบคุมการแสดงออก ของลักษณะทางพันธุกรรมอย่างหนึ่ ง ซึ่งพบทั้งในพืช สัตว์ และมนุษย์ โดย อาศัยการทำางานของชิ้นส่วน double strand RNA (dsRNA) ซึ่งเมื่อผ่าน กระบวนการต่างๆแล้ว จะมีผลไปยับยั้งการทำางานของ messenger RNA (mRNA) ของยีนหนึ่ งๆอย่างจำาเพาะ จึงมีผลยับยั้งการทำางานของยีนนั้นได้ ความสำาคัญ RNAi เป็ นกระบวนการที่เกิดขึ้นโดยปกติตามธรรมชาติของ eukaryotic cell ทั่วไป ซึ่งกระบวนการเหล่านี้ มีความสำาคัญมากต่อการดำารงอย่่ของสิ่งมี ชีวิต โดยเฉพาะสิ่งมีชีวิตชั้นตำ่า หน้าที่สำาคัญของกระบวนการนี้ อาจกล่าวโดย สรุปได้เป็ น 3 ด้าน คือ การป้ องกันและต่อต้านการติดเชื้อไวรัส การป้ องกันจี โนม (genome) จาก jumping genes และ การควบคุมการแสดงออกของ ยีน RNAi มีความสำาคัญในกระบวนการป้ องกันและต่อต้านการติดเชื้อไวรัส โดยเฉพาะอย่างยิ่งในสิ่งมีชีวิตชั้นตำ่า ไวรัสหลายชนิ ดมีสารพันธุกรรมเป็ น แบบ dsRNA ซึ่งเมื่อไวรัสเหล่านี้ ปลดปล่อยสารพันธุกรรมเข้าส่่เซลล์ dsRNA จะถ่กตัดเป็ น short interference RNA (siRNA)โดย Dicer ซึ่ง เป็ นเอ็นไซม์ท่ม ี ีอย่่แล้วในสิ่งมีชีวิตบางชนิ ด จากนั้น Dicer จะกระต้น ุ ให้ RISC complex เข้ามาจับ และตัดสาย RNA เกิดการยับยั้งการสร้างโปรตีน ทำาให้ไวรัสไม่สามารถก่อโรคได้ RNAi ยังมีความสำาคัญในการป้ องกันจีโนม (genome) จาก Jumping genes (transposons) ซึ่งเป็ นลำาดับของดีเอ็นเอ ที่สามารถเคลื่อนที่ไปได้ ทั่วจีโนมของสิ่งมีชีวิต และพบ Jumping genes ได้ในสิ่งมีชีวิตทุกชนิ ด ซึ่ง ในกรณีท่ี Jumping genes เคลื่อนไปอย่่ในตำาแหน่ งที่ไม่ถก ่ ต้องและมีความ สำาคัญจะทำาให้เกิดความเสียหาย แก่เซลล์ของสิ่งมีชีวิตได้ Jumping genes หลายๆชนิ ดทำางานโดยการถอดรหัส ดีเอ็นเอ ให้เป็ น RNA ก่อน และจากนั้น จะถอดรหัสกลับเป็ นดีเอ็นเอแล้วไปแทรกอย่่ในตำาแหน่ งอื่นๆของจีโน มต่อไป บ่อยครั้งที่ RNA ที่เกิดขึ้นจะเป็ น dsRNA และเป็ นตัวเริ่มต้นกระบวนการ RNAi ดังนั้น RNAi จึงมีบทบาทช่วยป้ องกันจีโนมจาก Jumping genes โดยการทำาลาย dsRNA นอกจากนั้น RNAi ยังเป็ นกลไกสำาคัญที่มบ ี ทบาท ในการควบคุมการแสดงออกของยีน ที่พบในสัตว์หลายชนิ ด ตั้งแต่ระดับกลุ่ม หนอนพยาธิจนถึงระดับสัตว์เลี้ยงล่กด้วยนำ้านม พบว่ายีนหลายร้อยตำาแหน่ ง ในจีโนมของมนุษย์จะได้รบ ั การถอดรหัสออกมาเป็ น RNA ขนาดเล็กที่เรียก ว่า microRNA (miRNA) ซึ่ง miRNA จะบรรจุชน ิ้ ส่วนของลำาดับของยีน ต่างๆ ดังนั้น miRNA เหล่านี้ จึงอาจเกิดเป็ นโครงสร้างสายค่่ได้ เช่น เกิดเป็ น hairpin RNA (hpRNA) เมื่อเกิดเป็ น hpRNA ที่เป็ น dsRNA ขึ้นจะเป็ นการ
กระตุ้นให้เริ่มกระบวนการ RNAi ทำาให้เกิดการยับยั้งการแสดงออกของยีน ปั จจุบันเป็ นที่ทราบกันว่า miRNA มีบทบาทสำาคัญต่อการพัฒนาของสิ่งมี ชีวิตและการควบคุมการทำางานของเซลล์ โดยมีส่วนร่วมในกระบวนการพื้น ฐานทางชีววิทยาต่างๆ ไม่ว่าจะเป็ นการเปลี่ยนแปลงไปทำาหน้าที่เฉพาะของ เซลล์ (cell differentiation) การตายตามโปรแกรมเฉพาะของเซลล์ (apoptosis) เป็ นต้น ประวัติ พัฒนาการของความร้่ความเข้าใจเกี่ยวกับ RNAi คาดว่าเริ่มขึ้นเมื่อ ในปี 1990 Jorgensen และคณะ รายงานปรากฏการณ์ท่ีเขาทำาการทดลองใน การพยายามทำาให้สีของดอกพิท่เนี ย (petunia) มีสีเข้มขึ้น โดยการใส่ยีนที่ จะกระตุ้นการสร้างรงควัตถุสีแดงจากภายนอกเข้าไป แต่ผลที่พบ คือ ยีน สารสีของดอกพิท่เนี ย หยุดการทำางานลง ซึ่งในขณะนั้นยังไม่สามารถอธิบาย ได้ว่าอะไรเป็ นสาเหตุของปรากฏการณ์ดังกล่าว แต่เมื่อมองย้อนกลับไป อาจ ถือได้ว่า Richard Jorgensen และคณะเป็ นกลุ่มบุคคลแรกที่รายงานถึง ลักษณะที่คล้ายกับผลจากการเกิดกระบวน การ RNAi ในปี เดียวกันนี้ ยังมี การค้นพบปรากฏการณ์ท่ีคล้ายกันอีกโดย van der Krol และคณะเมื่อ ทำาการใส่ dihydroflavonol-4-reductase (DFR) or chalcone synthase (CHS) genes เข้าไปในดอกพิท่เนี ยและ Smith และคณะเมื่อ ทำาการใส่ chimaeric polygalacturonase (PG) gene ในมะเขือเทศ ซึ่ง ในปี 1990 นี้ ได้มก ี ารกำาหนดชื่อเรียกปรากฏการณ์ดังกล่าวว่า post transcriptional gene silencing (PTGS) ต่อมาในปี 1992 Macino และ Romano ได้มีการค้นพบปรากฏการณ์ท่ีใกล้เคียงกันใน Neurospora crassa เมื่อใส่ยีนที่ทำาให้มีการแสดงลักษณะเผือกโดยพบว่า Neurospora crassa บางส่วนไม่มก ี ารแสดงลักษณะเผือก ซึง ่ Macino และ Romano เรียกปรากฏการณ์ดังกล่าวว่า quelling อย่างไรก็ตามยังไม่มีผ้่ท่ีสามารถ อธิบายได้ว่าอะไรคือกลไกที่ทำาให้เกิด ลักษณะดังกล่าว จนกระทั่งในปี 1998 มีนักวิทยาศาสตร์ชาวอเมริกน ั 2 คน คือ Andrew Z. Fire และ Craig C. Mello ได้รายงานการศึกษา RNAi และกลไกที่เกี่ยวข้องจากการศึกษา แสดงออกของยีนในหนอนตัวกลม Caenorhabditis elegans (C. elegans) โดยพบว่าเมื่อฉีด mRNA (sense) ที่ควบคุมการสร้างโปรตีน กล้ามเนื้ อ ร่วมกับ antisense RNA ของ mRNA ดังกล่าว ให้แก่ C. elegan พบว่าหนอนมีการเคลื่อนที่แบบกระตุก (twitching movements) คล้ายลักษณะการเคลื่อนที่ของหนอนกลุ่มที่ขาดยีนที่ทำาหน้าที่สร้างโปรตีน กล้ามเนื้ ออย่างสมบ่รณ์ ในขณะที่ การฉีดเฉพาะ sense หรือ antisense RNA เพียงอย่างเดียวไม่พบการเปลี่ยนแปลงดังกล่าว
จากผลการทดลอง Fire และคณะตั้งสมมุติฐานว่า sense และ antisense RNA ที่ถ่กฉีดเข้าไปอาจจับเข้าค่่กันเกิดเป็ น dsRNA และ dsRNA ที่เกิดขึ้นมี ผลไปยับยั้งการแสดงออกของยีนกล้ามเนื้ อที่มร ี หัสเดียวกันนั้น ต่อมาเมื่อได้ ทดลองฉีด dsRNA ที่มร ี หัสพันธุกรรมของโปรตีนหลายๆชนิ ดของหนอนตัว กลม พบว่า การฉีดอาร์เอ็นเอสายค่่ท่ีมีรหัสพันธุกรรมหนึ่ งๆเข้าไป มีผลใน การยับยั้งการแสดงออกของยีนที่มีรหัสจำาเพาะนั้นๆ เมื่อได้ผลการทดลองที่ชัดเจน Fire และคณะ จึงรายงานว่า dsRNA มีความ สามารถยับยั้งการแสดงออกของยีนได้ และเรียกกระบวนการที่เกิดขึ้น ทั้งหมดนี้ ว่า RNA interference (RNAi) ซึ่ง RNAi มีความจำาเพาะต่อยีนที่มี รหัสเข้าค่่กันกับ dsRNA ที่ฉีดเข้าไป นอกจากนี้ ยังพบว่า ผลจาก RNAi ที่ เกิดในเซลล์ท่ีฉีด dsRNA เข้าไป ยังสามารถแพร่กระจายจากเซลล์หนึ่ งไป ยังอีกเซลล์หนึ่ ง ต่อๆ กันไป จนทั่วทุกเซลล์ของตัวอ่อนของหนอนตัวกลม และยังสามารถถ่ายทอดไปยังรุ่นต่อไปได้ด้วย และจากที่พบว่าการฉีด dsRNA เข้าไปเพียงเล็กน้อยสามารถก่อให้เกิดผลยับยั้งการแสดงออกของ ยีนได้ ทำาให้เข้าใจว่ากระบวนการ RNAi เป็ นกระบวนการที่อาจเกิดการ สังเคราะห์เพิ่มขึ้นเองภายในเซลล์ได้ หลังจาก Andrew Fire และ Craig Mello รายงานการค้นพบกระบวนการ RNAi เผยแพร่ลงในวารสาร Nature เมื่อปี 1998 บทความนี้ กระต้น ุ ให้เกิดความสนใจในการศึกษาเกี่ยว กับ RNAi เพิม ่ ขึ้นอีกมากมาย อาทิเช่น การศึกษาของ Misquitta และ Paterson ที่พบการรบกวนการแสดงออกของ MyoD gene ใน Drosophila โดยใช้กระบวนการ RNAi การศึกษาของ Ngô และ คณะที่พบ การกระต้น ุ ให้มีการทำาลาย mRNA ใน Trypanosoma brucei โดยใช้ double strand RNA การศึกษาของ Waterhouse และ คณะที่พบ กระบวนการต่อต้านการติดไวรัสในพืช ในปี 1998 และการศึกษาของ van West และคณะที่พบกระบวนการยับยั้งการแสดงออกของยีนใน Phytophthora infestans ในปี 1999 เป็ นต้น ต่อมาในปี 2001 จากการ ศึกษาของ Elbashir และคณะพบว่า Duplexes of 21-nucleotide RNAs สามารถกระต้น ุ ให้เกิดกระบวนการ RNAi ในเซลล์สัตว์เลี้ยงล่กด้วยนมได้ และในปี 2002 วารสาร Science ได้ยกย่องว่า RNAi เป็ นเทคโนโลยีแห่งปี ซึ่งในปี เดียวกันนี้ ยง ั มีการค้นพบ recombinant Dicer โดย Provost และ คณะ จากนั้นองค์ความร้เ่ กี่ยวกับ RNAi ในด้านต่างๆ ทั้งความร้่เกี่ยวกับ กลไก องค์ประกอบในกระบวนการ RNAi ก็พัฒนาขึ้นเรื่อยๆ ตามลำาดับ และ จากการค้นพบกระบวนการ RNAi ทำาให้ Andrew Fire และ Craig Mello ได้รับรางวัลโนเบล สาขาแพทยศาสตร์และสรีรศาสตร์ประจำาปี 2006
Andrew Fire และ Craig Mello http://130.15.90.245/index.5.jpg
หน้าที่ 3 - กลไกการเกิดกระบวนการ RNAi กลไกการเกิดกระบวนการ RNAi RNA interference (RNAi) ถือเป็ นกระบวนการในการควบคุมการ แสดงออกของลักษณะทางพันธุกรรมอย่างหนึ่ ง ดังนั้นเพื่อความเข้าใจใน กระบวนการ RNAi จึงขอกล่าวถึง การแสดงออกของยีนและการควบคุมการ แสดงออกของยีนก่อนจะกล่าวถึงการทำางาน ของกระบวนการ RNAi การแสดงออกของยีน(Nelson and Cox, 2000) การแสดงออกของยีน หมายถึง การถอดรหัสพันธุกรรมของยีนจากดีเอ็นเอ เป็ น mRNA แล้วเกิดการแปลรหัสเป็ นโปรตีน รหัสพันธุกรรมของยีนใน
ดีเอ็นเอ เป็ นตัวกำาหนดชนิ ดของโปรตีนที่เซลล์สร้าง โดยเริ่มจากการ ถอดรหัสพันธุกรรมที่อย่่ในดีเอ็นเอเป็ น mRNA ในนิ วเคลียส และแปลรหัส เป็ นโปรตีนในไซโตพลาสซึม ซึ่งโปรตีนนี้ มีความเกี่ยวข้องในทุกกระบวนการ ของสิ่งมีชีวิต เช่น เป็ นเอ็นไซม์ท่ีใช้ในการย่อยอาหาร เป็ นส่วนประกอบของ ตัวรับสัญญาณ (receptor) และ แอนติบอดี้ (antibody) ที่ปกป้ องร่างกาย จากสิ่งแปลกปลอมต่างๆ จีโนมของคนประกอบด้วยยีนประมาณ 30,000 ชนิ ดแต่จะมีเพียงบางยีน เท่านั้นที่สามารถใช้งานได้ในแต่ละเซลล์ เพราะมีการควบคุมการแสดงออก ของยีนให้เกิดขึ้นเฉพาะส่วนที่ต้องการเท่านั้น เรียกกระบวนการในการ ควบคุมให้มีการแสดงออกเฉพาะยีนที่ต้องการว่า การควบคุมการแสดงออก ของยีน (regulation of gene expression) การควบคุมการแสดงออกของยีน (Regulation of gene expression) (Nelson and Cox, 2000)
( www.mie.utoronto.ca/.../biopic/biofigures.htm) การแสดงออกของยีนเป็ นการถ่ายทอดข้อความทางชีวภาพหรือข้อความทาง
พันธุกรรมที่ บรรจุอย่่ใน ดีเอ็นเอไปยัง mRNA แล้วจึงแปลรหัสไปเป็ น โปรตีน ในเซลล์ร่างกายของสิ่งมีชีวิตทุกเซลล์มีข้อม่ลทางพันธุกรรมหรือยีน เหมือนกัน แต่ในระหว่างการเจริญเติบโตและการเปลี่ยนสภาพ (differentiation) แต่ละเซลล์มีกลไกการควบคุมการแสดงออกของยีนเหล่า นี้ ต่างเวลาหรือต่างวาระกัน การควบคุมการแสดงออกของยีนอาจแบ่งเป็ น 2 ช่วงคือ ช่วงระหว่างกระบวนการถอดรหัสพันธุกรรม (transcription) โดยเป็ นการ ควบคุมการสังเคราะห์ mRNA ซึง ่ ลำาดับเบสที่อย่่บนสาย mRNA ถ่กกำาหนด โดยลำาดับของเบสในสายแม่พิมพ์ดีเอ็นเอ ช่วงระหว่างกระบวนการแปลรหัสพันธุกรรมมาเป็ นโพลีเปปไทด์ (polypeptide) หรือโปรตีนโดยเป็ นการสังเคราะห์ โพลีเปปไทด์ หรือการ สร้างโปรตีน การควบคุมการแสดงออกของยีนมีผลต่อปริมาณของโปรตีนที่ถก ่ สร้างขึ้น และมีข้ันตอนการควบคุมดังนี้ (สามารถเข้าชมรายละเอียดได้ท่ี บทความการ ควบคุมการแสดงออกของยีน ) คือ 1.การควบคุมระดับจีโนม(Genomic control) 2.การควบคุมการถอดรหัส (Transcriptional control) 3.การควบคุมหลังการถอดรหัส (Post-transcriptional control) 4.การควบคุมการแปลรหัส (Translation control) 5.การควบคุมหลังการการแปลรหัส (Post-translation control) การควบคุมการแสดงออกของยีนโดย RNAi กระบวนการ RNAi เป็ นการควบคุมการแสดงออกของยีนในขั้น ตอน posttranscriptional processing ของ mRNA ซึ่งจากการศึกษาการ ควบคุมการแสดงออกของยีนโดยกระบวนการ RNAi ที่เกิดภายในเซลล์ของ คนและสัตว์หลายชนิ ดพบว่ามีกลไกคล้ายกันโดยจีโนมมีการ กำาหนดการ สร้างโมเลกุล RNA ขนาดเล็กที่เรียกว่า micro RNA (miRNA) ซึ่งเป็ น double-stranded RNA (dsRNA) และเป็ นจุดเริ่มต้นในการกระตุ้นกลไก การทำางานของ RNAi ในการขัดขวางการสร้างโปรตีน RNAi จึงมีบทบาทใน การควบคุมการแสดงออกของยีน และมีบทบาทสำาคัญต่อการควบคุม ลักษณะทางพันธุกรรม ควบคุมการทำางานของเซลล์ และรวมถึงการพัฒนา ของสิ่งมีชีวิต
หน้าที่ 4 - องค์ประกอบทีเ่ กี่ยวข้องในกระบวนการ RNAi Dicer
(it.wikipedia.org/wiki/RNA_interference) Dicer คือ RNAse III nuclease ทำาหน้าที่ตัด double-stranded RNA และ pre-microRNA ออกเป็ น double-stranded RNA สายสั้นๆ ซึง ่ ยาว 20-25 นิ วคลีโอไทด์ เรียกว่า small interfering RNA (siRNA) โครงสร้าง ของ Dicer ประกอบไปด้วย RNase 2 โดเมน (domain) และ PAZ 1 โดเมน Dicer เป็ นตัวกระต้น ุ ปฏิกิริยา (catalyze) ในขั้นตอนแรกของ RNA interference pathway และเป็ นจุดเริม ่ ต้นในการสร้าง RNA-induced silencing complex (RISC) (Provost et al, 2002; Macrae et al, 2006; Jaronczyk et al, 2005; Bernstein et al, 2001) Small Interfering RNA(Elbashir et al. 2001) Small Interfering RNA (siRNA) บางครั้งร้่จก ั กันในชื่อ short interfering RNA หรือ silencing RNA โครงสร้างโมเลกุลของ siRNA เป็ น dsRNA สายสั้นๆ (ประมาณ 21 นิ วคลีโอไทด์)โดยมีนิวคลีโอไทด์ 2 ตัวยื่น ออกมา (overhange) จากปลาย 3' ของแต่ละสาย ผลจากการตัดของ
Dicer ทำาให้ได้สาย siRNA ที่มป ี ลาย 5' เป็ นหม่่ฟอสเฟต และปลาย 3' เป็ น หม่่ไฮดรอกซิล ปั จจุบันทราบว่า siRNA มีบทบาทในวิถี RNAi และเกี่ยวข้อง กับกระบวนการทางชีวภาพที่หลากหลาย เช่น กระบวนการต่อต้านไวรัส หรือการเปลี่ยนแปลงโครงสร้างโครมาตินในจีโนม Argonaute
(www.mskcc.org/mskcc/html/630) Argonaute (Ago) เป็ นเอ็นไซม์ท่เี ป็ นส่วนประกอบสำาคัญของ RNAinduced silencing complex (RISC) complex ที่ทำาหน้าที่แยก RNA สายค่่เป็ นสายเดี่ยว และเป็ นส่วนสำาคัญในการนำา siRNA เข้าส่่กระบวนการ RNAi จากการศึกษาในแมลงหวี่(Drosophila spp.) พบว่ามี Ago 5 ชนิ ด โดย Ago ต่างชนิ ดกันจะทำาหน้าที่แตกต่างกัน แต่ Ago ที่มค ี วามสำาคัญคือ Ago1 ทำาหน้าที่แยก miRNA สายค่่ให้เป็ นสายเดี่ยว และ Ago2 ทำาหน้าที่ แยก siRNA สายค่่ให้เป็ นสายเดี่ยว โครงสร้าง Ago แบ่งเป็ น 2 โดเมน คือ PAZ และ Piwi โดย PAZ domain เป็ นส่วนประกอบทั้งใน Ago และ Dicer ( PAZ domain ใน Dicer อาจมีหน้าที่แตกต่างออกไป) โครงสร้างของ PAZ domain ประกอบด้วย 2 ส่วน คือ บริเวณที่มีลักษณะ oligonucleotidebinding (OB) fold ซึง ่ ทำาหน้าที่ในการจับกับกรดนิ วคลีอิก และบริเวณที่มี ลักษณะเป็ น beta-hairpin ตามด้วย alpha-helix โดย PAZ domain ทำา หน้าที่จับกับกรดนิ วคลีอิก 2 ตัว ที่ย่ ืนออกมาจากปลาย 3' ของ siRNA เพื่อ ช่วยให้ siRNA จับกับ mRNA เป้ าหมายได้เสถียรมากขึ้น ส่วน Piwi domain มีคุณสมบัติคล้าย RNase ซึ่งเป็ นเอ็นไซม์ท่ีตัด RNA จาก DNARNA hybrids จึงเข้าใจว่า Piwi อาจทำาหน้าที่ในการตัด mRNA ให้กบ ั RISC(Rand et al, 2005; Sen and Blau, 2005)
RNA-induced silencing complex (RISC)
( www.mskcc.org/mskcc/html/63099.cfm) RNA-induced silencing complex (RISC) คือกลุ่มของโปรตีนที่ทำาหน้าที่ ร่วมกันในการแยก siRNA สายค่่เป็ นสายเดี่ยว แล้วช่วยจับสายที่เป็ น antisence ของ siRNA ที่แยกออกมา แล้วรวมเข้ากับ RISC เป็ น RISC complex โดยสาย antisence siRNA ที่เรียกว่า guide RNA มีเบสค่่สม กับ mRNA เป้ าหมาย และช่วยให้ RISC complex เข้าจับและทำาลาย mRNA เป้ าหมายได้อย่างแม่นยำา RISC ประกอบด้วยไรโบนิ วคลีโอโปรตีน
คอมเพล็กซ์ (ribonucleoprotein complex; RNP) หลายชนิ ด แต่มีเพียง บางชนิ ดเท่านั้นที่สามารถทำางานในกระบวนการ RNAi ทั้งนี้ สัตว์ต่างชนิ ดจะ มีองค์ประกอบของ RISC ที่แตกต่างกัน เนื่องจาก RNAi ของสัตว์บางชนิ ด ต้องอาศัย RISC complex เพื่อให้ทำางานได้ ในขณะที่สัตว์บางชนิ ดอาศัย การทำางานของ RISC เพียงอย่างเดียว(Preall et al, 2006; Gregory, 2005; Sen et al, 2005)
หน้าที่ 5 - กระบวนการทำางานของ RNAi กระบวนการทำางานของ RNAi (fig.cox.miami.edu/.../gene/how_siRNA_works.htm)
1. Dicer ซึ่งมี dsRNA-specific endonuclease ที่สามารถจดจำาและจับ dsRNA ที่มีความคล้ายคลึง (homologue) กับ mRNA เป้ าหมาย จะตัด สาย dsRNA ออกเป็ นสายสั้นๆ ที่เรียกว่า small interference RNA (siRNA) ที่มีความยาวประมาณ 21-25 ค่เ่ บส 2. Argonaute 2 เข้ามาจับ siRNA ดังกล่าวเกิดเป็ น ribonucleoprotein complex (RNP) และเหนี่ ยวนำาให้โปรตีนชนิ ดอื่นเข้ามารวมกันเพื่อสร้าง เป็ น RNAi-silencing complex (RISC) 3. RISC ทำาการแยก siRNA สายค่่ออกเป็ นสายเดี่ยว โดยสายเดี่ยวที่เป็ น antisense ของ siRNA มีลำาดับเบสที่เป็ นค่่สมกับ mRNA เป้ าหมาย
(sense) จึงเป็ นตัวกำาหนดความจำาเพาะและการจดจำาให้ RISC complex เข้าจับและทำาลาย mRNA เป้ าหมายได้อย่างแม่นยำา 4. RISC ที่มี siRNA สายเดี่ยวรวมอย่่ด้วย (RISC complex) เข้าจับกับ mRNA เป้ าหมายโดยอาศัยลำาดับเบสค่่สมระหว่าง siRNA และ mRNA เป้ า หมาย จากนั้น mRNA จะถ่กย่อยโดย slicer ใน RISC complex และพบ ว่า RISC ที่มี miRNA สายเดี่ยวรวมอย่่ด้วย จะทำาหน้าที่ ทำาลาย mRNA ในพืช แต่ในสัตว์จะทำาหน้าที่กดการแปลรหัส(Translational repression) 5. mRNA ที่ถ่กย่อยจะถ่กทำาลาย เป็ นผลให้ไม่มี mRNA ผ่านเข้าส่่ กระบวนการแปลรหัสไปเป็ นโปรตีน ทำาให้ไม่มก ี ารสร้างโปรตีนจากยีนนั้น เกิดขึ้น การทำางานของ RNAi จึงเป็ น posttranscriptional regulation of gene expression หรือ posttranscriptional gene silencing (สามารถเข้าชมภาพเคลื่อนไหว ที่http://www.nature.com//focus/rnai/animations/index.html) หน้าที่ 6 - การประยุกต์ใช้เทคโนโลยี RNAi การประยุกต์ใช้เทคโนโลยี RNAi ปั จจุบันมีการพัฒนาเทคโนโลยี RNAi มาใช้ประโยชน์อย่างหลากหลาย โดย อาศัยหลักในการนำา dsRNA หรือ siRNA เข้าส่่ร่างกาย (transfection) เพื่อกระตุ้นกลไกการทำางานของ RNAi (Genc et al, 2004)ซึง ่ ร่ปแบบของ dsRNA หรือ siRNA ที่นำาเข้าส่่ร่างกาย มีอย่่ 5 ชนิ ด คือ 1.ร่ปของ dsRNA สังเคราะห์สายยาว 2.ร่ปของ dsRNA สังเคราะห์ท่ีผ่านการตัดโดย dicer เป็ น siRNA 3.ร่ปของ dsRNA ที่ผ่านการถอดรหัสจาก ดีเอ็นเอ ในหลอดทดลองและใช้ dicer ตัดเป็ น siRNA 4.ร่ปของ siRNA expression vector 5.ร่ปของ PCR derived siRNA cassette การนำา dsRNA เข้าส่่ร่างกายในร่ปแบบข้างต้นนี้ สามารถแบ่งออกเป็ น 2 กุ ล่ม คือ 1. วิธีการข้อที่ 1-3 เป็ นการนำาเข้าส่่ไซโตพลาสซึม (cytoplasm) 2. วิธีการข้อที่ 4-5 เป็ นการนำาเข้าส่่นิวเคลียส (nucleus) ในร่ปของ short hairpin RNA (shRNA) เพื่อส่งออกไปส่่ไซโตพลาสซึม (cytoplasm) ต่อไป
หน้าที่ 7 - เทคโนโลยี RNAi ในปั จจุบันและอนาคต(การนำา เทคโนโลยี RNAi ไปใช้ในพืช) เทคโนโลยี RNAi ในปั จจุบันและอนาคต ในปั จจุบันมีการนำาเทคโนโลยี RNAi ไปใช้เป็ นเครื่องมือในงานวิจัยด้านต่างๆ มากมาย ซึ่งอาจสรุปโดยรวมได้เป็ น 3 ด้าน คือ การนำาไปใช้ในพืช การนำา ไปใช้ในทางการแพทย์ และการนำาไปใช้ในด้านการศึกษา การนำาเทคโนโลยี RNAi ไปใช้ในพืช การนำาเทคโนโลยี RNAi ไปใช้ในพืช ส่วนใหญ่แล้วจะมุ่งเน้นการนำา RNAi ไปเป็ นเครื่องมือในการยับยั้งการแสดงออกของยีนเป้ าหมายที่จำาเพาะ หรือ ตำาแหน่ ง promoters ของยีนนั้น เพื่อปรับปรุงพันธ์ุพืชให้ได้ลักษณะใหม่ๆที่ ต้องการซึ่งสามารถถ่ายทอดไปส่่ รุ่นหลังได้ การสร้าง dsRNA ในพืชมีหลาย วิธี เช่น การสร้างพืชปรับปรุงพันธ์ุท่ีผลิต sense RNA และ พืชปรับปรุงพันธ์ุ ที่ผลิต antisense RNA แยกต้นกัน แล้วนำาทั้ง 2 ต้นมาผสมข้ามกัน ทำาให้ เกิดต้นพืชที่ผลิต dsRNA พบว่า ต้นพืชที่ผลิต dsRNA มีประสิทธิภาพในการ ยับยั้งการแสดงออกของยีนได้ดีกว่าต้นที่ผลิตเพียง sense หรือ anti-sense RNA เพียงอย่างเดียว (Wang et al, 2001) นอกจากนี้ วิธี hpRNA โดย การสร้างลำาดับทั้ง sense และ antisense RNA ให้อย่่ใน promoter เดียวกันโดยมี intron คั่นกลางระหว่างลำาดับ sense และ antisense ลำาดับเหล่านี้ จะสร้างเป็ น hpRNA หลังจากผ่านกระบวนการถอดรหัส ซึง ่ วิธี การใหม่น้ี มีประสิทธิภาพในการยับยั้งการแสดงออกของยีนในพืชได้ดี กว่า dsRNA โดยจะให้ผล 80-100% (Mallory et al, 2001) ดังนั้นจึงมีการนำา วิธี hpRNA มาใช้กันอย่างแพร่หลาย ตัวอย่างการนำาเทคโนโลยี RNAi ไปใช้ในพืช 1. การใช้ RNAi ในการเปลี่ยนแปลงกระบวนการ metabolism ของพืชใน การผลิตสารต่างๆให้ลดหรือเพิ่มปริมาณสารบางชนิ ดที่พืชสร้างและเก็บ สะสมไว้ เพื่อการนำาไปใช้ประโยชน์ในจุดประสงค์เฉพาะต่อไป เช่น - ในธรรมชาติพบว่า ข้าวสายพันธ์ุหนึ่ งมี hpRNA ที่มีผลในการยับยั้งการ แสดงออกของยีนของ glutelin ซึง ่ เป็ นโปรตีนหลักในเมล็ดข้าว ทำาให้เกิด ข้าวสายพันธ์ุท่ีมีโปรตีนตำ่า จึงมีการนำาเทคโนโลยี RNAi ผลิตข้าวสายพันธ์ุน้ี มาใช้ในทางการค้า เป็ นข้าวสำาหรับผ้่ป่วยโรคไตที่จำาเป็ นต้องควบคุมปริมาณ โปรตีนในอาหาร (Meins, 2000) - การสร้างพืชกาแฟให้มีปริมาณคาเฟอีนน้อยลง โดยปรับปรุงพันธุกรรมพืช ให้สามารถสร้าง antisense hpRNA ของยีน CaMxMt1 ซึง ่ เป็ นยีนที่มีส่วน ในกระบวนการสร้างคาเฟอีน antisense hpRNA กระตุ้นให้เกิด กระบวนการ RNAi จึงมีผลยับยั้งการสร้างสารคาเฟอีน ทำาให้มีปริมาณ คาเฟอีนลดลง (Ogita et al, 2003)
2. การใช้ RNAi ในการเพิม ่ ความต้านทานต่อโรคในพืช เช่น - การสร้างพืชยาส่บ (Nicotiana tabacum) ที่มีความต้านทานต่อ tobamovirus โดยใช้เทคโนโลยี RNAi ในการยับยั้งการแสดงออกของยีน TOM1 และ TOM3 ซึ่งเป็ นยีนที่ถอดรหัสได้เป็ นโปรตีนที่จำาเป็ นต่อการเพิ่ม จำานวนของไวรัส ดังนั้นไวรัสจึงไม่สามารถเพิ่มจำานวนได้ ดังนั้นพืชยาส่บ ปรับปรุงพันธ์ุจง ึ มีความต้านทานต่อเชื้อไวรัสชนิ ดนี้ (Asano et al, 2005) - ไม้ผลยืนต้น พืชตระก่ลถั่ว และพืชไม้ประดับหลายชนิ ดจะมียีน iaam และ ยีน ipt ซึง ่ เป็ นยีนที่มค ี วามสำาคัญที่ทำาให้เกิดโรค Crown gall disease จาก เชื้อแบคทีเรีย Agrobacterium tumefaciens จึงมีการใช้ RNAi ในการ ยับยั้งการแสดงออกของยีนทั้ง 2 ตำาแหน่ ง ทำาให้พืชมีความต้านทานต่อโรค Crown gall disease (Dunoyer et al, 2006)
หน้าที่ 8 - เทคโนโลยี RNAi ในปั จจุบันและอนาคต(การนำา เทคโนโลยี RNAi ไปใช้ทางการแพทย์) การนำาเทคโนโลยี RNAi ไปใช้ทางการแพทย์ การรักษาโรคที่เกิดจากเชื้อไวรัส ในปั จจุบันมีการนำาเทคโนโลยี RNAi มาใช้ในการยับยั้งไวรัสก่อโรคหลาย ชนิ ด คือ hepatitis C virus (HCV), dengue (DEN) virus, severe acute respiratory syndrome (SARS) coronavirus, poliovirus, influenza A virus, hepatitis delta virus (HDV), human rhinovirus (HRV), hepatitis B virus (HBV), herpes simplex virus type-1 (HSV-1), human papillomavirus (HPV), JC virus (JCV), Epstein Barr virus (EBV) และ cytomegalovirus (CMV) แต่ท่ีกำาลังอย่่ในความ สนใจและมีผ้่ศึกษากันมาก คือ Human immunodeficiency virus-1 (HIV-1) การใช้ RNAi ในการยับยั้ง HIV-1 มีการศึกษารายงานไว้มากมาย โดยใช้ RNAi ทดลองยับยั้งการแสดงออกของยีนหลายตำาแหน่ ง และทดลองใช้ เวคเตอร์หลายชนิ ด แต่ผลที่ได้ตรงกัน คือ การทำางานในระยะแรกสามารถ ยับยั้ง HIV-1 ได้ แต่เมื่อเลี้ยงเซลล์ไว้เป็ นเวลานาน HIV-1 มีความสามารถ ในการหลบหลีก เพราะมีกลไกการยับยั้งการทำางานของ RNAi อย่างหลาก หลาย เช่น point mutation, double point mutation, partial หรือ complete deletion of the target sequence เป็ นต้น ดังนั้นจึงมีผเ้่ สนอ ว่า การใช้ siRNA combination therapy (SIRCT) คือ การใช้ siRNA เพื่อ ยับยั้งการแสดงออกของยีนไวรัสหลายตำาแหน่ งร่วมกันน่ าจะเลี่ยงการหลบ หลีก ของไวรัสได้ แต่ยง ั ไม่มีรายงานผลการทดลองดังกล่าว (Ben and
Joost, 2006) การรักษามะเร็ง วิธีการในการรักษามะเร็งที่ใช้กันมากในปั จจุบันคือ เคมีบำาบัด (chemotherapy) แต่วิธีการนี้ มีข้อจำากัดในการใช้ คือ ร่างกายผ้่เป็ นมะเร็ง จะสร้าง P-glycoprotein ซึ่งเป็ นโปรตีนที่ทำาให้ยาที่ผ้่เป็ นมะเร็งได้รบ ั จาก การทำาการรักษาโดยเคมี บำาบัดถ่กกำาจัดออกจากเซลล์ ทำาให้การรักษาโดย เคมีบำาบัดมีประสิทธิภาพตำ่า ดังนั้นการใช้เทคโนโลยี RNAi เพื่อยับยั้งการ สร้าง P-glycoprotein ในร่างกายผ้่ท่ีเป็ นมะเร็ง ทำาให้การรักษาโดยเคมี บำาบัดมีประสิทธิภาพส่งขึ้น ซึ่งจากการศึกษาของ Rumpold และคณะในปี 2005 พบว่า สามารถใช้เทคโนโลยี RNAi ในการยับยั้งการสร้าง Pglycoprotein ซึง ่ ทำาให้เซลล์มะเร็งไวต่อ imatinib ลดลงได้ การปล่กถ่ายเนื้ อเยื่อ การปล่กถ่ายไตส่วนใหญ่จะพบปั ญหาการตาย (apoptosis) ของเซลล์บุผนัง ท่อไต (renal tubular epithelial cells) จากการบาดเจ็บที่เกิดจากเลือด มาเลี้ยงอีกครั้งหลังการขาดเลือด (ischemia-reperfusion injury) โปรตีน ที่มีส่วนสำาคัญในกระบวนการเหล่านี้ คือ Fas ซึง ่ จากการศึกษาของ Hamar และคณะในปี 2004 พบว่าสามารถใช้เทคโนโลยี RNAi ยับยั้งการสร้าง Fas ในหน่ซง ึ่ ทำาให้เซลล์บุผนังท่อไตมีความต้านทานต่อการตายมากขึ้น และเกิด การบาดเจ็บที่เกิดจากเลือดมาเลี้ยงอีกครั้งหลังการขาดเลือดน้อยลงได้ การชะลอวัย (anti-aging) ในปี 2003 Kenyon และคณะได้ทำาการทดลองเพื่อเพิ่มอายุขัยในหนอนตัว กลม C. elegans โดยสามารถปรับปรุงพันธุกรรมให้มีอายุยืนยาวกว่าปกติ โดยใช้เทคโนโลยี RNAi ในการยับยั้งการแสดงออกของ Daf-2 ซึ่งเป็ นยีน ของตัวรับ (receptor) ของฮอร์โมนอินซ่ลิน (insulin) และ insulin-like growth factor 1 (IGF-1) นอกจากนี้ ยีน Daf-2 ยังมีผลต่อการสืบพันธ์ุด้วย ในธรรมชาติพบว่าในสภาวะที่ไม่เหมาะสมหรือขาดแคลนอาหาร ยีน Daf-2 จะทำางานลดลง ทำาให้ C. elegans ที่อายุนอ ้ ยแสดงอาการกระตือรือร้น มี ชีวิตชีวา และมีการพัฒนาไปส่่การสืบพันธ์ุก่อนอายุท่ีแท้จริง แต่ C. elegans ที่โตเต็มวัยแล้วจะอายุยืนมากขึ้น จากการทดลองใช้ RNAi ในการ ยับยั้งการแสดงออกของยีนนี้ นอกจากจะพบว่าทำาให้หนอนอายุยืนขึ้นแล้ว ยังพบว่าหนอนทดลองมีสุขภาพดีตลอดช่วงอายุท่ียาวนานขึ้น แสดงว่าการ ยับยั้งการแสดงออกของยีนนี้ ไม่น่าจะรบกวนยีนอื่นๆ ที่จำาเป็ นของหนอน ผล การทดลองดังกล่าวทำาให้เกิดความสนใจเป็ นอย่างมาก เพราะ insulin/IGF-
1 pathway เป็ นวิถีท่ีควบคุมการมีชีวิตยืนยาวในสัตว์หลายๆชนิ ด รวมทั้งใน สัตว์เลี้ยงล่กด้วยนม หน้าที่ 9 - เทคโนโลยี RNAi ในปั จจุบันและอนาคต(การนำา เทคโนโลยี RNAi ไปใช้ในการศึกษาวิจัย) การนำาเทคโนโลยี RNAi ไปใช้ในการศึกษาวิจัยเทคโนโลยี RNAi จัดว่าเป็ น เครื่องมือที่มีประโยชน์มากต่อการนำามาใช้เพื่อศึกษาหน้าที่ของยีน เพื่อนำา ความร้่เหล่านั้นไปประยุกต์ใช้สาขาวิชาต่างๆ เหตุผลที่วิธีการนี้ มีการนำามา ใช้กันอย่างแพร่หลายและมีความนิ ยมเพิ่มขึ้น เรื่อยๆ เพราะการยับยั้งการ แสดงออกของยีนด้วยวิธีการอื่นๆ เช่น ‘gene knock-out’ ต้องทำาให้ โครงสร้างของยีนเปลี่ยนแปลงไป อาจทำาให้ยีนที่อย่่ในตำาแหน่ งนั้น หรือ ตำาแหน่ งข้างเคียงเสียหาย และอาจส่งผลต่อสิ่งมีชีวิตนั้นๆ แต่ด้วยเทคโนโลยี RNAi สามารถยับยั้งการแสดงออกของยีนหลังจากเกิดกระบวนการ ถอดรหัส ดังนั้นจึงไม่ทำาให้เกิดการเปลี่ยนแปลงสารพันธุกรรมของสิ่งมีชีวต ิ ตัวอย่างการนำาเทคโนโลยี RNAi ไปใช้ในด้านการศึกษา 1. การใช้เทคโนโลยี RNAi ในการศึกษาจีโนมของ C.elegans โดยใช้ แบคทีเรียเป็ นสื่อนำาให้เกิดกระบวนการ RNAi เพื่อสังเกตผลที่เกิดขึ้นจาก การยับยั้งการแสดงออกของยีน 16,757 ยีน (จากทั้งหมด 19,757 ยีน) และจัดกลุ่มยีนที่แสดงออกเป็ นลักษณะที่คล้ายกัน (Kamath et al, 2003) 2. การใช้เทคโนโลยี RNAi ในการศึกษายีนที่จำาเป็ นต่อการอย่่รอดของ Heterodera glycines (H.glycines) ซึ่งเป็ นหนอนพยาธิท่ีก่อให้เกิดถุงนำ้า (cyst) ของต้นถั่วเหลือง (Glycine max) เพื่อนำาไปใช้ในการควบคุมหนอน พยาธิชนิ ดนี้ โดยการใช้เทคโนโลยี RNAi ยับยั้งการแสดงออกของยีนที่คาด ว่าเป็ นยีนที่จำาเป็ นต่อหนอนพยาธิ และสังเกตว่าการขาดยีนใดจะทำาให้หนอน พยาธิตาย (Alkharouf et al, 2007) 3. การศึกษา RNAi ที่เกี่ยวข้องกับการทำางานของยีนที่ควบคุมนาฬิกา ชีวภาพของร่างกาย เป็ นการศึกษาเพื่อให้เกิดความเข้าใจกลไกการทำางาน ของนาฬิกาชีวภาพที่มีอย่่ใน ร่างกายของสิ่งมีชีวิตตั้งแต่แบคทีเรียจนถึง มนุษย์ ซึ่งจะมี circadian rhythms ที่สอดคล้องกับการทำางานของร่างกาย ที่เกิดขึ้นในช่วงเวลากลางวัน หรือกลางคืน เช่น การหลับและการตื่น โดย ทำาการศึกษาใน Drosophila spp. (Nawathean et al, 2005) และแมลง อื่นๆ พบว่า สามารถพบ clock genes ได้ท้ังในสมองและอวัยวะอื่นๆ โดย clock genes ที่พบในระบบสืบพันธ์ุเพศผ้่จะควบคุมจังหวะที่ทำาให้เกิดการ ผสมพันธ์ุ และวงจรการปล่อย sperm ในแต่ละวัน ส่วนใน Drosophila spp. เพศเมีย clock genes มีความสัมพันธ์กับระดับความสามารถในการ ออกไข่ท่ีขึ้นกับความสมบ่รณ์ของ โภชนาการ นอกจากนี้ การทำางานของ clock genes อาจมีความเกี่ยวข้องกับการป้ องกันสิ่งมีชีวต ิ จากความเครียด และการแก่ก่อนวัย การศึกษานี้ ถ่กนำาไปประยุกต์ใช้ในการศึกษากลไกการ
ทำางานของนาฬิกาชีวภาพที่ เกี่ยวข้องกับมนุษย์ ในด้านของระบบสืบพันธ์ุ โภชนาการ และ การยืดอายุขัยของมนุษย์ จากที่กล่าวมาข้างต้นจะเห็นได้ว่าในอนาคตเทคโนโลยี RNAi จะเป็ น เทคโนโลยีท่ีสำาคัญในการปรับปรุงพันธ์ุพืช การป้ องกันรักษาโรค ตลอดจน เป็ นเครื่องมือในการศึกษาหน้าที่ของยีนในพืช สัตว์ และมนุษย์ หน้าที่ 10 - ข้อเสียของเทคโนโลยี RNAi ข้อเสียของเทคโนโลยี RNAi เทคโนโลยีหลากหลายที่มีการนำามาใช้ในปั จจุบันต่างมีท้ังข้อดี และข้อเสีย ผ้่ ที่นำาเทคโนโลยีน้ันไปใช้จึงต้องพิจารณาอย่างรอบคอบ เลือกวิธีการที่เหมาะ สมที่สุดในการนำาไปใช้เพื่อให้เกิดประโยชน์ส่งสุด และลดผลกระทบหรือข้อ เสียของเทคโนโลยีน้ัน เทคโนโลยี RNAi ก็เช่นเดียวกัน แม้ว่าจะมีข้อดี มากมายดังที่กล่าวมาแล้ว แต่เทคโนโลยี RNAi ก็มีข้อเสียหลายประการ เช่น 1.ไม่สามารถปรับตัวตามการหลบหลีกของไวรัสบางชนิ ดได้ ทำาให้การใช้ เทคโนโลยีน้ี มีช่วงเวลาจำากัดในการยับยั้งการแสดงออกของยีน จนเมื่อไวรัส เปลี่ยนแปลงพันธุกรรมไปก็ไม่สามารถยับยั้งการแสดงออกของยีนได้ 2.ไม่สามารถประมาณช่วงเวลาที่ RNAi ให้ผลในการยับยั้งการแสดงออก ของยีนได้ 3.ทำาให้ลำาดับพันธุกรรมของโฮสต์เปลี่ยนแปลง เนื่ องจากชิ้นส่วน siRNA สามารถเข้าไปแทรกในลำาดับพันธุกรรมของโฮสต์ได้ 4.อาจเกิดการยับยั้งการแสดงออกของยีนอื่นที่ไม่ใช่ยีนเป้ าหมาย เนื่ องจาก siRNA เป็ นลำาดับนิ วคลีโอไทด์สายสั้น ๆ ซึ่งไม่เพียงแต่มีความจำาเพาะกับ ตำาแหน่ งเบสที่เป็ นค่่สมกันเท่านั้น แต่ยังมีโอกาสที่จะไปจับกับเบสค่่สมอื่นที่มี ความคล้ายคลึงกันได้ 5.ไวรัสที่ใช้เป็ นสื่อในการนำายีนเข้าส่่เซลล์อาจก่อโรคหรือไปกระตุ้นให้ oncogene ทำางาน 6.RNAi ที่ใช้ในการดัดแปลงพันธุกรรมพืชที่ใช้เป็ นอาหาร อาจส่งผลกับผ้่ บริโภค 7.ประสิทธิภาพของ RNAi ขึ้นอย่่กับคุณสมบัติของ เวคเตอร์ 8.เป็ นเทคโนโลยีท่ีต้องอาศัยความเข้าใจและชำานาญในการวิเคราะห์ 9.ค่าใช้จ่ายในการทำาการทดลองส่ง เนื่ องจากต้องใช้เครื่องมือประกอบหลาย อย่าง 10.เทคโนโลยีน้ี เป็ นเทคโนโลยีใหม่ มีการค้นพบมาไม่เกิน 10 ปี ดังนั้น ข้อม่ลต่างๆที่ได้มาจึงยังสามารถเปลี่ยนแปลงได้อย่่เสมอหากมีการค้น พบ ข้อม่ลต่างๆเพิ่มขึ้น
หน้าที่ 12 - การประยุกต์ใช้ RNAi ในประเทศไทย
หน้านี้ ต้องการความช่วยเหลือในการแก้ไข ช่วยแก้ไขได้ท่ีน่ี ในประเทศไทยมีการนำา RNAi มาประยุกต์ในหลายทาง ดังนี้ การศึกษาผล ของการใช้ RNA interference (RNAi) ต่อการเกิด passage effect ของ แบคคิวโลไวรัส Th-HaNPV ในเซลล์แมลง Helicoverpa zea (Hz) การ ศึกษาผลของการใช้ RNA interference (RNAi) ในการยับยั้งการ แสดงออกของยีน GFP ในเซลล์ Helicoverpa zea(Hz)การยับยั้งการเจริญ ของเซลล์มะเร็งเต้านมโดยใช้เทคนิ ค RNAi ยับยั้งการทำาหน้าที่ของยีน WT1 การใช้เทคนิ ค RNA Interference (RNAi) ในการยับยั้งการทำางานของยีน ที่กำาหนดการสร้างโปรตีนหุ้มอนุภาคไวรัสใบด่างในกล้วยไม้สกุลหวาย RNAi-mediated Suppression of Os2AP Converts Non-aromatic to Aromatic Rice การใช้ RNAi เพิ่มความต้านทานโรคกุ้ง