Seminar2

TẠO DÒNG VÀ BIỂU HIỆN GEN PROTEASE TRUNG TÍNH TỪ Bacillus subtilis Các tác giả: Nguyễn Hoàng Lộc, Nguyễn Văn Song, Hoàng Tấn Quảng, Lê Đức Dũng, Dương Đức Lợi, Trương Thị Bích Phượng, Đỗ Thị Bích Thủy

GIỚI THIỆU 



Protease là một nhóm enzyme lớn xúc tác cho phản ứng thủy phân protein thành các amino acid. Trong tự nhiên protease tồn tại trong cơ thể sinh vật và chiếm 15% toàn bộ hệ gen.



Một số kết qủa nghiên cứu về tạo dòng và biểu hiện gen protease: - Biểu hiện enzyme protease nội bào(PfpI) từ Pyrococcus furiosus (Halio et al.,1996). - Biểu hiện enzyme cysteine protease từ Streptococcus pyogenes (Gubba et al., 1998). - Biểu hiện endoprotease ngoại bào từ Aeromonas caviae T-64 (Nirasawa et al., 1999). - Biểu hiện enzyme cysteine protease từ Porphyromonas gingivalis (Margetts et al., 2000).







B. subtilis cũng sản xuất ra nhiều loại protease và một trong số chúng là protease ngoại bào. Gen mã hóa cho protease ngoại bào từ B. subtilis hầu như đã được biết trình tự, nhiều protease tái tổ hợp đã được sản xuất. Gen enzyme protease trung tính(npr) cũng đã được tạo dòng và biểu hiện trong Lactococcus lacfis spp. lactis JF254 (Riepe et al., 1994).



Chủng Bacillus subtilis C10 sản xuất ra 5 loại protease khác nhau: một trong số chúng là protease trung tính và bốn loại còn lại là protease kiềm.



Mục đích của nghiên cứu này là tạo dòng và biểu hiện gen protease trung tính từ Bacillus subtilis C10.

Các phương pháp nghiên cứu  





Polymerase reaction chain(PCR) Phương pháp chiết xuất DNA của Sambrook Phương pháp biến nạp bằng shock nhiệt ( hóa biến nạp) Điện di gel.





Xác định hoạt tính protease bằng phương pháp của Anson cải tiến Xác định protein tổng số bằng phương pháp của Bradford.

CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH A. Phân lập DNA và khuếch đại gen protease trung tính bằng PCR - DNA hệ gen của B. subtilis C10 được phân lập bằng phương pháp của Sambrook. - Khuếch đại DNA hệ gen với hai primers F và R thiết kế đặc hiệu dựa trên gen nprE.

Bảng 1. Primers đặc hiệu cho trình tự fulllength và coding của gen protease.

Sơ đồ 1. Gen protease trung tính (1916 bp)

Thành phần của phản ứng PCR: - 1.25 unit Pfu DNA polymerase - 5 µ 10xPfu DNA polymerase buffer - 200 µM deoxynucleotide (hỗn hợp dNTP) - 20 pmol mỗi loại primer - 1.5 mM MgCl2 40 ng DNA hệ gen - Nước cất thêm vào đến thể tích cuối cùng là 50 µl Biến tính DNA hệ gen 95oC trong 5 phút, tiến hành 30 chu kỳ. Phản ứng PCR được thiết lập theo protocol chuẩn. -



B. Tạo dòng và đọc trình tự của gen protease trung tính: - Sản phẩm PCR được cắt ra từ agarose gel 0.8% và được tinh sạch bằng Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System Kit (Promega). - Sau đó sản phẩm sẽ được gắn vào vector pET200/D-TOPO. - Thành phần của phản ứng nối gồm:1µl vector, 1µl dung dịch muối, 1µl sản phẩm PCR, và 3µl nước cất, tất cả được trộn đều và ủ ở 25 độ C trong 5 phút.

- Những vector tái tổ hợp từ phản ứng gắn được biến nạp vào tế bào E.coli BL21 Star™ (DE3) - Thành phần của phản ứng biến nạp bao gồm:3µl dung dịch phản ứng gắn, 50µl tế bào, 250µl môi trường SOC bằng phương pháp shock nhiệt ( Champion™ pET200 Directional TOPO® E - Sau 30 phút biến nạp ở 37 độ C, dung dịch được đặt vào môi trường LB chứa 50mg/ml Kanamycin và ủ ở 37 độ C, lắc 200rpm để qua đêm.





Tế bào biến nạp bao gồm Plasmid tái tổ hợp được dùng để tách chiết DNA để xác định thể tái tổ hợp. Phân tích trình tự bằng phương pháp flourescent dideoxy-terminator.



Champion™ pET200 Directional TOPO



Box1: pET TOPO® Reagents bảo quản -20°C. Box2: One Shot® TOP10 Chemically Competent E. coli bảo quản ở -80°C Box3:BL21 Star™(DE3) One Shot® Chemically Competent E. coli bảo quản ở -80°C









Polymerase reaction chain(PCR): Nguyên lý của PCR là khuếch đại 1 đoạn gene mong muốn nhờ sử dụng Taq polymerase trong môi trường chứa 4 loại dNTP và 2 primer dựa trên khuôn mẫu DNA đã biết hoặc không biết trước trình tự.

Mỗi chu kỳ PCR bao gồm 3 giai đoạn : 1. Biến tính (denaturation) ở 900C– 950C 2. Gắn mồi (annealing) ở 400C-650C 3. Kéo dài phân tử (extension) ở 700C_720C

Phương pháp biến nạp bằng shock nhiệt Nguyên lý của phương pháp này là dựa vào sự shock nhiệt để phá vỡ các liên kết trên màng tế bào sau đó cố định lại các liên kết đó ở nhiệt độ thấp. Các tế bào sẽ được ủ trong dung dịch CaCl2 để trở thành các tế bào khả biến. Các plasmid sẽ được đưa vào tế bào bằng shock nhiệt 42độ C( 45 giây), sau đó đặt lên đá để cố định lại các liên kết peptide trên màng tế bào. 

Điện di gel - Điện di là kỹ thuật dùng để phân tách và tinh sạch các phân tử, đặc biệt là các protein và các nucleic acid, dựa trên cơ sở kích thước(khối lượng), điện tích và cấu hình của chúng. - Khi các phân tử được đặt trong một điện trường thì chúng sẽ di chuyển về phía cực có điện tích trái dấu với mình. - Các phân tử có thể chạy điện di trên một khuôn đỡ như: giấy, cellulose acetate, gel tinh bột, agarose và polyacrylamide gel. Gel được ngâm trong dung dịch đệm thích hợp.





Xác định hoạt tính protease bằng phương pháp của Anson cải tiến -Nguyên lý của phương pháp này là dựa trên sự thủy phân cơ chất protein (cazein hoặc hemoglobin) bởi enzyme. Định lượng sản phẩm được tạo thành trong phản ứng bằng phản ứng màu với thuốc thử Folin, kết quả phân tích dựa vào đồ thị chuẩn Tyrosine.

 -

-

Tiến hành: Chuẩn bị các dung dịch tyrosine chuẩn Lập đồ thị đường chuẩn biếu diễn sự phụ thuộc của sự hấp thụ theo lượng tyrosine ở bước sóng 750nm. Sử dụng cuvette dày 1cm. Ống thí nghiệm: 2ml dung dịch casein 2% , cho 1ml enzyme. Sau một thời gian, cho vào 5ml dung dịch acid trichloracetic 5% để dừng phản ứng, lắc đều.Lọc.Lấy dịch lọc cho thêm vào dung dịch Na2CO3 6%, thêm thuốc thử Folin rồi đem so màu ở bước sóng 750nm.

- Ống kiểm tra: 2ml dung dịch casein 2% cho 5ml acid trichloracetic 5% vào ngay, lắc đều rồi mới cho 1ml enzyme vào.Tiến hành tương tự như trên. - Tính số đơn vị hoạt động thuỷ phân (HP) của 1ml dung dịch enzyme để xác định hoạt động theo công thức: HP/ml=(số ( mol tyrosine x 8)/t (đơn vị ) Trong đó, 8 là thể tích toàn bộ hỗn hợp phản ứng, t là thời gian ủ. - Tính hoạt độ thuỷ phân của chế phẩm: HP/glucoamylase chế phẩm = (HP/ml x 1000)/ a (đơn vị) a - số mg chế phẩm đem phân tích



Xác định protein tổng số bằng phương pháp của Bradford. -Đây là phương pháp định lượng protein dựa trên cơ sở sự hấp thụ ánh sáng của phức hợp protein-thuốc nhuộm. -Phương pháp này rất dễ sử dụng với một số lượng mẫu lớn và có thể tự động hóa. -Liên kết giữa thuốc nhuộm với protein được tiến hành nhanh chóng trong khoảng 2 phút, phức hợp protein-thuốc nhuộm tồn tại trong dung dịch một thời gian tương đối dài khoảng 1 giờ.



Tiến hành: -Chuẩn bị thuốc nhuộm: Dung dịch thuốc nhuộm có nồng độ cuối cùng là 0.01% Coomassie Brilliant Blue G-250; 4.7% Ethanol, và 8.5% H2SO4. -Chuẩn bị protein: Dung dịch protein được chuẩn bị trong dung dịch NaCl 0.15M. Dung dịch protein chuẩn:albumin huyết thanh bò (BSA)

 -

-

-

-

Phân tích: Ống thí nghiệm: 0.1 ml dung dịch protein trong đệm thích hợp (NaCl 0.15M), thêm vào 5ml dung dịch thuốc nhuộm protein, vortex. Ống đối chứng: 0.1ml dung dịch đệm và 5ml dung dịch thuốc nhuộm protein. Trong vòng từ 2phút đến 1giờ tiến hành đo độ hấp thụ ở bước sóng 595nm ở cuvette 3ml. Tiến hành xây dựng đường chuẩn. Đối chiếu để xác định hàm lượng protein.



      

S.O.C. Medium (may be stored at room temperature or +4°C): - 2% Tryptone - 0.5% Yeast Extract - 10 mM NaCl - 2.5 mM KCl - 10 mM MgCl2 - 10 mM MgSO4 - 20 mM glucose

Box1: pET TOPO® Reagents bảo quản -20°C - pET TOPO® vector,TOPO®-adapted: 15-20 ng/μl linearized plasmid DNA in: 50% glycerol 50 mM Tris-HCl, pH 7.4 (at 25°C) 1 mM EDTA 2 mM DTT 0.1% Triton X-100 100 μg/ml BSA 30 μM bromophenol blue 

- dNTP Mix: 12.5 mM dATP 12.5 mM dCTP 12.5 mM dGTP 12.5 mM dTTP in water, pH 8 - Dung dịch muối: 1.2 M NaCl 0.06 M MgCl2

- Nước cất. -Forward Sequencing Primer: 0.1 μg/μl in TE Buffer, pH 8 -Reverse Sequencing Primer:0.1 μg/μl in TE Buffer, pH 8 -Control PCR Primers:0.1 μg/μl each in TE Buffer, pH 8 -Control PCR Template: 0.1 μg/μl in TE Buffer, pH 8 -Expression Control Plasmid: 0.01 μg/μl in TE buffer, pH 8

Box2: One Shot® TOP10 Chemically Competent E. coli bảo quản ở -80°C - Môi trường SOC. - TOP10 cells - pUC19 Control DNA: 10 pg/μl in 5 mM Tris-HCl 0.5 mM EDTA, pH 8

Box3: BL21 Star™(DE3) One Shot® Chemically Competent E. coli bảo quản ở -80°C - Môi trường SOC. - BL21 Star™(DE3) - pUC19 Control DNA: 10 pg/μl in 5 mM Tris-HCl 0.5 mM EDTA, pH 8 back