Pruebas De Infectividad En Virus

ESCUELA PROFESIONAL DE BIOLOGÍA

Pruebas de Infectividad en Virus y Diagnóstico serológico. ASIGNATURA

: Virología

DOCENTE

: Dr. Graciela Albino Cornejo

ALUMNO

: Rómulo Aycachi Inga

CICLO

: 2006 - II

Lambayeque, setiembre de 2006.

PRUEBAS DE INFECTIVIDAD EN VIRUS Y DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO Introducción Debido a que los virus, como ocurre con los plásmidos, se replican solo dentro de células vivas, la investigación sobre virus requiere el uso de hospedadores apropiados. Para el estudio de los virus bacterianos se usan cultivos axénicos en medio líquido o en medio semisólido con agar. Como la mayor parte de las bacterias son fáciles de cultivar, resulta relativamente simple estudiar los virus bacterianos y por esta razon se dispone de un crecimiento detallado de la multiplicación de estos virus. En lo que respecta a los virus de los animales, el hospedador inicial puede ser un animal susceptible al virus, pero a efectos de investigación es deseable disponer de hospedadores mas manejables. En 1907 el biólogo estadounidense Ross Granville Harrison descubre que los tejidos vivos pueden cultivarse, es decir, pueden crecer fuera de su órgano original. Este fue el comienzo para el desarrollo de los cultivos de tejidos y mas adelante el de los cultivos celulares (lineas celulares). Muchos virus animales pueden ser cultivados en cultivos de tejidos o cultivos celulares, y el uso de tales cultivos ha facilitado enormemente la investigación sobre los virus. Los anticuerpos, al ser específicos de antígeno y por tanto específicos del patógeno, son componentes críticos de la respuesta inmune, interaccionan específicamente con el antígeno sobre las células diana pero no matan a las células. Existe un grupo de enzimas inespecíficas conocido en conjunto como complemento que puede fijarse a los anticuerpos unidos al patógeno y lisar las células con el anticuerpo unido. La respuesta inmune es específica para anticuerpos individuales y depende de anticuerpos específicos, pero puede ser mediada o estimulada a través de mecanismos específicos como el complemento. En muchos casos, la inmunidad mediada por anticuerpos no es un mecanismo eficaz para controlar la diseminación de la infección. Algunos agentes infecciosos parasitan el organismo desde el interior de las células. P.ej. los virus animales se reproducen utilizando los sistemas celulares del hospedador y, en consecuencia, gran parte de su ciclo vital transcurre en el interior de las células del hospedador. Teniendo en cuenta que los anticuerpos están armados para reconocer al patógeno libre en la sangre, o a nivel de las superficies mucosas, las células infectadas del hospedador deben ser identificadas y destruidas por diferentes medios, generalmente a través de interacciones célula a célula propias de la inmunidad celular. Por fortuna, todos los patógenos endógenos producen antígenos que a su vez son presentados sobre la superficie de células diana infectadas. El antígeno es reconocido por una célula T citotóxica (TC) u actúa directamente sobre la célula diana infectada secretando proteínas citolíticas, llamadas perforinas, que destruyen la célula infectada. En el diagnostico de una enfermedad infecciosa no siempre es posible el aislamiento del patógeno. Una posible alternativa, en estos casos, es cuantificar el título de anticuerpos frente al patógeno que se sospecha. Cuando un individuo sufre una infeccion de la que se sospecha el patógeno etiológico, el título de anticuerpos, puede medirse mediante aglutinación, precipitación, enzimoinmunoanálisis (ELISA), métodos de inmovilización o radioinmunoensayo (RIA). La tecnica general consiste en establecer una serie de diluciones del suero (habitualmente diluciones al doble: 1:2, 1:4,

1:8,1:16, 1:32, y así sucesivamente) y determinar la dilución máxima a la que se produce la reacción antígeno-anticuerpo. Una sola medida del título de anticuerpos no indica infección activa. Después de la infeccion, muchos anticuerpos dan títulos altos durante mucho tiempo; para establecer que una enfermedad aguda se debe a un determinado patógeno, es esencial demostrar una elevación del título de anticuerpos en muestras sucesivas de suero del mismo enfermo. En algunos casos, sin embargo, la mera presencia de anticuerpos puede ser suficiente para indicar infección. Así sucede cuando el patógeno se presenta raramente en la población. La presencia de anticuerpos es suficiente para indicar la existencia de una infección en el individuo. Un ejemplo significativo es el síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA). Se dispone actualmente de una prueba de ELISA muy sensible y fiable para la detección de anticuerpos contra el VIH. La exquisita sensibilidad del ELISA permite incluso la detección de título de anticuerpos muy bajo, por lo que se utiliza el ELISA rutinariamente para el rastreo de la infección por VIH en muestras de sangre. Inoculación de animales susceptibles En los primeros intentos para cultivos de virus, se utilizaba el huésped animal definido del agente por estudiar. Estos intentos tropezaban con la complejidad propia del animal entero, y las grandes diferencias de sensibilidad de un animal a otro, incluso dentro de una misma especie. El descubrimiento y desarrollo de cultivo in Vitro de células capaces de mantener la duplicación hizo que ya no se requiriera a los animales para la conservación ordinaria de la mayor parte de agentes virales. Hoy en dia la inoculación de animales susceptibles es usada en estudios de infectividad, ya que algunos virus no provocan efectos reconocibles en cultivos celulares pero originan la muerte en animales. También es usada para estudiar la oncogénesis viral, la patogenia de los padecimientos virales, la respuesta inmune a los virus y el efecto de los factores ambientales sobre las infecciones virales, así como el aislamiento primario de ciertos agentes. El método que se utiliza para inocular los virus a los animales depende de la sensibilidad del huésped respecto al virus, así como de la naturaleza de la prueba o del experimento. Es frecuente recurrir a las siguientes vías de inoculación: -

Intravenosa Intracerebral Intraperitoneal

-

Intranasal Intratraqueal Intradermica

Una vez lograda la duplicación del virus, se recogen tejidos pertenecientes a las zonas correspondientes del organismo, se les secciona u homogeniza y se almacena (generalmente a baja temperatura) para emplearla después como fuente de virus. El procedimiento general para una prueba de infectividad es realizar una dilucion seriada de la muestra desconocida, normalmente por diluciones decimales sucesivas, e inyectar muestras de cada dilucion a un cierto número de animales sensibles. Tras un periodo de incubación adecuado, se cuentan los animales vivos y muertos inyectados con cada una de las diluciones de la serie. Se suele considerar como valor de referencia la dilucion a la cual la mitad de los animales mueren. Aunque los métodos de diluciones seriadas son más prolijos y menos exactos que los basados en cultivos celulares, resultan esenciales en el estudio de algunos tipos de virus.

Otros usos de las inoculaciones en animales susceptibles son la comprobación de la inocuidad y poder protector de vacunas (poliomielitis), elaboración de éstas (rabia, viruela), efecto neutralizante de sueros inmunes y de pacientes (con fines comerciales y diagnósticos), etc., aunque su importancia se restringe cada vez más por los avances logrados con los cultivos de tejidos. Entre los animales que se emplean están monos, conejos, aves, ratas y ratones; estos últimos más que ningún otro. Inoculación de huevos embrionados (fecundados) Se han utilizado huevos fecundados para cultivar virus durante mas de 15 años. El cultivo de virus gripal en huevo embrionado fue empleado por primera vez por Burnet en 1935, demostrando que el embrión de pollo es un medio muy sensible para el aislamiento de estos virus, siendo además un medio estéril y poco costoso. Ha sido posible cultivar virus de diversos grupos en varias cavidades del huevo fecundado, o en el propio embrión en desarrollo. También se emplearon huevos de pato y de ganso para cultivar ciertos virus, pues estos animales tienen un periodo de incubación mas prolongado que el pollo; pero como regla, sigue usandose huevo de gallina de 6 a 8 días de incubación aproximadamente (a veces se usa huevos de mas tiempo de incubación). Para preparar los huevos para el cultivo, en primer lugar se desinfecta la superficie de la cáscara con yodo, y se perfora con un pequeño taladro estéril. Tras la inoculación, el agujero del taladro se sella con gelatina y se incuba el huevo. Los virus sólo pueden reproducirse en determinadas partes del embrión; por consiguiente, se deben inyectar en la region apropiada, P. ej. los mixovirus crecen bien en la membrana corioalantoidea, en tanto que el virus de la parotiditis prefiere la cavidad alantoidea. La infección puede producir una lesion tisular local conocida como pústula, cuyo aspecto, a menudo, es caracteristico del virus. El método exacto de inoculación y la edad del embrión que se emplea, dependen del virus problema. P. ej. para aislar en forma primaria el virus de la influenza a partir de material recogido de la garganta, suele inocularse este en la cavidad amniótica de embriones de 7 a 8 días; pero el virus se duplica fácilmente en la membrana alantoidea de embriones de 12 a 13 días, después de varias resiembras (“adaptación”) en el amnios. Los focos mas utilizados para la inoculación, a parte de las cavidades amniótica y alantoidea, son la membrana corioalantoidea y el saco vitelino. Algunas veces, puede inyectarse directamente el virus en el embrión en desarrollo, recurriendo a la inculacion intravenosa, intraperitoneal o intracerebral. Una vez que se duplicó el virus dentro de las células de las membranas o del embrión, puede liberarse a los líquidos vecinos, los cuales constituyen entonces una buena fuente de virus. P. ej. el virus de la influenza, que se duplica en el sistema respiratorio del embrión y en las células de la membrana amniótica, pasa al liquido amniótico, que luego puede recogerse con una jeringa y aguja. En cambio, otros virus, como p.ej. los de la viruela y el herpes, que se duplican en la membrana corioalantoidea, siguen unidos a las células en las lesiones o “pústulas” que se forman sobre dicha membrana. Al moler y deshacer en una solucion salina isotónica las membranas, logran liberarse estos virus. En consecuencia el crecimiento de un virus en un embrión de pollo puede provocar la muerte del embrio (p.ej. virus de la encefalitis), producir pústulas o placas sobre la membrana corioalantoidea (como herpes, viruela, vacuna), desarrollar hemaglutininas en los líquidos o tejidos embrionarios (p.ej. influenza) o desarrollar virus infectante (p.ej. poliovirus tipo 2). En el caso de los virus herpes y vaccinia, estos se pueden cuantificar por la técnica de inoculación de huevos embrionados al correlacionar el número de pústulas contadas con la dilucion viral inoculada. Actualmente el método preferido para cultivar virus de influenza aviar es la inoculación en huevos embrionados libres de patógenos específicos (SPF) o huevos negativos a anticuerpos específicos (SAN). El sobrenadante de los centrifugados de las muestras se inocula en el saco

alantoideo de al menos 5 huevos de 9-11 días de incubación y se incuba a 35-37ºC durante 4-7 días. Luego los huevos con embriones muertos, cuando esto ocurra, o los que queden al final del periodo de incubación se refrigeran a 4ºC y el líquido alantoideo se chequea con la prueba de hemaglutinación. Si se detecta actividad de hemoaglutinatión hay una probabilidad alta de la presencia de virus A de influenza o de un paramixovirus aviar. Los fluidos que den reacción negativa deben inocularse al menos en otro lote de huevos. Aislamiento en cultivos celulares Generalidades Los virus son microorganismos intracelulares y para evidenciarlos, se deben utilizar sistemas basados en líneas celulares que permitan su desarrollo. Los cultivos celulares son un tipo de biosustrato empleados para la propagación de los virus, constituyen, desde 1950, el sistema más empleado para el aislamiento y propagación de la mayoría de los virus, consisten en un sistema formado por células provenientes de un órgano o un tejido, normal o tumoral, mantenidas en medios de cultivo de composición química definida y en condiciones de temperatura, pH, aireación y humedad controladas. Dentro de éstos, los más usados son los cultivos en monocapa, aunque hay otros sistemas (cultivos en suspensión, explantos, cultivos de órganos, cultivos en microcarriers, etc). Los cultivos celulares en monocapa consisten en una capa de células que crecen adheridas a la superficie del recipiente que las contiene. Estos cultivos se preparan tratando el tejido original u otra monocapa con un agente que dispersa las células (una enzima o un agente quelante, o ambos combinados) para luego transferir la suspensión celular obtenida a un recipiente de vidrio o plástico en donde las células se adhieren y multiplican. La invasión viral se evidencia a través de un cambio celular o efecto citopático (EC) y mediante pruebas complementarias. No existe un cultivo celular susceptible a todos los virus, de modo que un laboratorio de diagnóstico viral debe disponer de distintos cultivos celulares. Por ejemplo, el virus herpes simplex crece bien in vitro en cultivos primarios, cepas y líneas celulares (MRC-5, RK, HEp-2, HeLa, Vero u otras); en cambio, otro virus de la misma familia, el citomegalovirus (CMV) sólo crece en cultivos primarios de pulmón fetal humano o bien en algunas cepas celulares derivadas del mismo órgano y especie (MRC-5). Por otro lado, una línea celular como HEp-2 puede ser bastante sensible a adenovirus, VRS, parainfluenza, herpes simples, poliovirus y otros, pero no permitir el crecimiento de CMV, rotavirus, influenza, etc; además, es posible que los pasajes sucesivos de una línea la hagan disminuir su sensibilidad a algunos virus, como sucede con Hep-2 en relación a VRS. Sistemas de cultivo más utilizados a) Cultivos primarios: Se caracterizan por tener varios tipos de células. La mayoría son de crecimiento limitado in vitro, generalmente resisten 5 a 10 subcultivos y son permisivas a un amplio rango de virus; p. e., células de riñón embrionario humano (REH). b) Cepas de células diploides: Derivadas de tejidos normales, se utilizan en la producción de vacunas, aislamiento viral y como sustratos para probar materiales tóxicos. Están constituidas por un tipo de células que retienen su número cromosómico diploide original; p.e., los fibroblastos de pulmón. c) Líneas celulares: Son células inmortalizadas en el laboratorio, resisten (n) número de pases y se caracterizan por derivarse de tejidos normales o de tumores malignos y se han pasado por los menos 70 veces in vitro; p.e., células Vero (riñón de mono verde africano), LLC-MK2 (riñón mono rhesus) y BSC-1 (también de tejido normal de riñón de mono) y HeLa y HEp-2 derivadas de células humanas malignas. Éstas generalmente tienen un número variable de cromosomas y a

veces también son denominadas líneas celulares heteroploides. Otras líneas celulares existentes son A9 (fibroblastos subcutáneos de ratón), BHK21 (fibroblastos de hámster), BRL3A (epitelio de hígado de rata), GHI, GH3 (epitelio de rata), L929, LS, S180 (fibroblastos de ratón), L1210, L5178Y, P388D1 (linfocitos de ratón), MCF7 (epitelio humano), 3T3-L1 (fibroblastos de ratón suizo), 3T3-A31 (fibroblastos de ratón BALB/c) y NRK49F (fibroblastos de riñón de rata). Algunos ejemplos de lineas celulares son: HEP-2: Células heteroploides humanas derivadas de carcinoma laríngeo. Recomendadas para RSV y ADENOVIRUS. MDCK: Línea celular diploide de riñón canino; para INFLUENZA y ocasionalmente PARAINFLUENZA. LLC-MK2: Línea celular heteroploide de riñón de mono Rhesus. Se recomienda para el aislamiento del virus PARAINFLUENZA. Requiere el agregado de tripsina cristalina al medio. MRC5: Línea celular diploide fibroblástica de pulmón embrionario humano. Se recomienda para el aislamiento de CITOMEGALOVIRUS, HERPESVIRUS.

Entre las líneas celulares que se emplean con más frecuencia están las células Hep-2, HeLa y Vero, en cuanto a células diploides las más utilizadas son las líneas de fibroblastos de pulmón (MRC5) que se usan para el aislamiento de citomegalovirus (CMV). El cultivo primario más utilizado es el riñón humano embrionario (RHE) que es permisible a los virus de circulación frecuente como el herpes (HSV), adenovirus (ADV), enterovirus, virus sincicial respiratorio (RSV) etc. En todo caso la elección por una u otra línea celular dependerá del virus que se quiera evidenciar. Aislamiento y detección Aunque el aislamiento viral es una buena técnica para el diagnóstico de infecciones virales asintomáticas, crónicas y recurrentes, su eficacia depende del momento en que se tome la muestra, del transporte óptimo y rápido de las muestras; además que se debe escoger el tipo de células que sean permisivas para el virus que se va a demostrar. Para los cultivos virales se utilizan monocapas celulares adheridas al lecho de un tubo, que requieren de sustratos esenciales para su mantenimiento, una solución amortiguadora y un pH adecuado, además se deben suplementar con suero fetal bovino, que contiene múltiples factores promotores de crecimiento celular. Una vez que la monocapa se inocula con una muestra pretratada que proviene de un individuo infectado, el virus se puede descubrir por: EFECTO CITOPATICO (ECP): El efecto citopático son cambios degenerativos específicos observados en una línea celular como consecuencia de la replicación de un virus infectante. Éste puede aparecer después de 3 ó 4 días. A través de éstos cambios morfológicos celulares es posible poner en evidencia la presencia de un virus en determinado tipo de cultivo de células. La observación microscópica de las células en busca de ECP debe realizarse diariamente. El ECP puede ser de varios tipos: la formación de sincicios, o de vesículas o inclusiones o el redondeamiento y desprendimiento de la monocapa celular. A veces la inoculación de una muestra o el virus semilla produce efectos tóxicos transitorios o irreversibles sobre el cultivo celular. Estos pueden tener un efecto parecido al ECP. Tal toxicidad puede hacerse evidente dentro de las 24 horas y puede ser reducida o evitada cambiando el medio. Algunos ECP caracteristicos de virus son: 1. Virus Respiratorio Sincicial: formación de sincicios o células gigantes en Hep-2. 2. Adenovirus: células redondeadas en Hep-2 con formación de racimos dejando áreas sin células. CUERPOS DE INCLUSION: En ciertas virosis es posible comprobar la presencia de estructuras anómalas dentro del citoplasma o núcleo de las células parasitadas, demostrables por tinción según métodos de Mann, Sellers o Giemsa. Por lo general estas estructuras, llamadas cuernos de inclusión, muestran afinidad por colorantes ácidos (eosina o fucsina ácida) y son eosinófilas. Las inclusiones intracitoplásmicas son redondas u ovales, de aspecto granular, y caracterizan a algunas infecciones, como la rabia (cuerpos de Negrí) y la viruela (cuernos de Guarnieri). Las intranucleares son de dos tipos, A y B; la primera provoca fuerte reacción de la materia nuclear, de modo que la inclusión se aprecia con un halo claro a su alrededor, libre de cromatina. Estas formas se ven en la fiebre amarilla y el herpes simple; las de tipo B ocasionan poca respuesta en la célula y por lo común ocupan los espacios sin cromatina. Se observan en la poliomielitis.

Los cuerpos de inclusión son de distintos tamaños; se presentan uno o varios en el citoplasma o en el núcleo y, por fusión, algunos ocupan todo el espacio nuclear, como sucede en el sarampión. Por medio del microscopio electrónico se ha comprobado en unos cuantos su integración por agregados de cuerpos elementales, aunque falta conocer su verdadera estructura. Los cuerpos de inclusión son de enorme valor en determinadas virosis (los cuerpos de Negri son peculiares de la rabia), pero en tejidos sanos y en enfermedades no virales se han encontrado formaciones parecidas a ellos. El aspecto particular y característico de cada tipo de inclusión suele orientar sobre el grupo de virus que la produce. La formación de cuerpos de inclusión ocurre tanto in vivo, en las infecciones naturales, como en los cultivos celulares infectados. Aparte de la acción citopática directa, la lesión de las células infectadas por un virus puede deberse a la respuesta inmune dirigida contra antígenos codificados por el virus y expresados en la superficie celular. HEMADSORCIÓN: Existen otros métodos para descubrir y caracterizar un virus en cultivo celular cuando todavía no se produce el ECP, o éste no es evidente o en los casos en que el virus se debe reconocer por otras propiedades o características en cultivo. Dentro de las técnicas que ayudan a identificar estas propiedades virales está la hemadsorción, que consiste en que cuando el virus infectante incorpora proteínas virales con propiedad de hemaglutininas en la membrana celular, las células infectadas se pueden descubrir por la adsorción de eritrocitos de ciertas especies animales, que se puede observar al microscopio de luz. Es el caso de los ortomixovirus y paramixovirus que se pueden reconocer por la hemadsorción de eritrocitos de cobayo a las células; la identificación se confirma con la inmunofluorescencia directa mediante anticuerpos específicos. Esta técnica se basa en la capacidad de glóbulos rojos de determinada especie animal de unirse a proteínas virales que están siendo incorporadas en la membrana plasmática en las células infectadas. Agregando glóbulos rojos a una monocapa infectada con virus es posible observar microscópicamente la adherencia de los mismos a células que contienen virus y que están expresando antígenos virales en su superficie. Por medio de esta técnica, es posible demostrar la infección por aquellos virus que presentan proteínas hemoaglutinantes.

Referencias -

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PRESCOTT L., J. HARLEY, D. KLEIN (1999). Microbiologia. 4º edic. Edit. Mc Graw Hill Mexico D.F.

ANEXOS:

Diferentes tipos de animales usados en laboratorio para la inoculación de virus

Inoculación de huevos embrionados para cultivo de virus de la gripe aviar

Estructura y puntos de inoculación en un huevo embrionado

Aislamiento tras la inoculación del huevo embrionado

Medio de cultivo para tejidos

Coloración de Giemsa

Tipos caracteristicos en cultivos celulares

Esquemas de algunas lesiones citopáticas características 1. Herpes simple. Inclusión eosinofílica intranuclear que desplaza la cromatina hacia la membrana nuclear, que adquiere un aspecto de “collar de perlas”. 2. Citomegalovirus. Inclusión eosinofílica intranuclear rodeada por un halo claro que la separa de la membrana nuclear. 3. Adenovirus. Inclusión intranuclear basófila. El núcleo suele presentar una forma de flor con una inclusión central separada casi completamente de la membrana nuclear retraída por un halo claro. 4. Enterovirus. Inclusión eosinofílica citoplásmica que desplaza al núcleo que se condensa. La célula aparece retraída y el citoplasma se vuelve más acidófilo

Células de riñon de pollo normal

Células con efecto citopatico celular en forma de sincitios, por virus de Newcastle

Células con efecto citopático celular, las células se observan con aumento de tamaño y forma redonda, por virus de influenza aviar

Cultivos celulares empleados para ciertos virus de animales Virus cultivado

Origen del cultivo de tejidos

Tipo celular

Virus de la Linfocitos humanos Glóbulos blancos inmunodeficiencia humana

Tipo de cultivo Cultivo ce1ular primario

Adenovirus

Riñón humano

Riñión de Cultivo celular embriones humanos primario

Rhinovirus, Enterovirus

Riñón humano, pulmón, prepucio

Fibroblastos fetales Línea celular humanos diploide

Virua del herpea símplex

Cáncer de útero humano

HeLaa

Linea celular continua

Influenzavirus

Riñón de perro

HDCK

Linea celular continua

Enterovirus

Rinón de mono

MGMK

Línea celular continua

a

Las líneas celulares continuas se suelen designar con cuatro letras.

+

GR cobayo =

Célula con hemaglutininas virales

Técnica de hemadsorción

Hemadsorción