Pi-25239-00-reapan 34845

1 Test per tube

                Product Catalog No: 25239­00

    ReaPan 34845          Reagent                                                                      

      Manufactured by 

                                      

 

2

ReaPan 34845 Reagent INTENDED USE The ReaPan 34845 reagent is a four color immunofluorescence stain for  the   labeling   and   identification   of   helper/inducer   (CD4+)  cytotoxic/suppressor   (CD8+)   cells   and   total   T­lymphocytes   (CD3+)  combined with a precise number of fluorescent counting beads for absolute  and   percentages   of   CD4+,   CD8+   and   CD3+   T­Cells   and   absolute  lymphocyte counts. This reagent is intended to be used in a “lyse­no wash”  protocol   for   flow   cytometry   analysis   of   erythrocyte­lysed   human   whole  blood.  SUMMARY AND EXPLANATION The ReaPan 34845 reagent contains fluorescently labeled antibodies that  bind   to   CD45,   CD3,   CD4   and   CD8   antigens   found   on   the   surface   of  circulating leukocytes.  The CD3 antigen is a complex of at least six proteins known collectively as 

3

the T­cell receptor (TCR) complex. The antibody used in this reagent binds  to the 20kDa ε  chain of this complex (1).

4

The CD4 antigen is a 59kDa protein. It interacts with class II molecules of  the  major histocompatibility  complex  and  is  the  primary  receptor  for  the  Human Immunodeficiency Virus (HIV) (2, 3). The CD8 antigen is a complex consisting of two disulfide linked subunits.  The   antibody  used   in   this  reagent   binds  to   the   32kDa   α   subunit   of   the  complex.   CD8   interacts   with   class   I   major   histocompatibility   complex  molecules (2,3). The CD45 antigen is a complex 180­220kDa transmembrane glycoprotein  which   is   expressed   in   high   levels   on   leukocyte   cell   surfaces   and   its  presence distinguishes leukocytes from non­haematopoietic cells (1). Clinical Relevance Cells   that   are   both   CD3+   and   CD4+   are   identified   as   helper/inducer  lymphocytes. Decreased CD4+CD3+ T­cell counts have been associated  with some forms of immunodeficiency (such as HIV). Suppressor/cytotoxic  lymphocytes are the subset of cells that have both CD3 and CD8 receptors  (5­7).   Increased   CD8+CD3+   T­cell   counts   have   been   observed   in   some 

5

cases of immunodeficiency (8) PRINCIPLE OF THE PROCEDURE The ReaPan 34845 reagent consists of murine monoclonal antibodies that  specifically  recognize   the   human  leukocyte   surface  antigens  CD3,   CD4,  CD8 and CD45. Each of the monoclonal antibodies is labeled with a unique  fluorochrome.   Specific cell subsets are stained when blood is combined  with the reagent and each monoclonal antibody binds to the binds to the  cell determinant molecules on the cell surface. Specific cell subsets are  identified when passed through a flow cytometer laser beam. The ReaPan 34845 reagent also contains a precise number of fluorescent  beads. When the reagent is combined with a known volume of blood the  reagent provides for the single platform determination of the absolute cell  concentrations of the stained subsets. The volume of sample analyzed can  be determined by multiplication of the total sample volume by the fraction  of total beads that were detected during the analysis. REAGENT

6

The ReaPan 34845 reagent is formulated in buffered saline with sodium  azide and stabilizer. It contains Allophycocyanin (APC)– labeled anti­CD4  monoclonal   antibody,   clone   RPA­T4;   R­Phycoerythrin(PE)–   labeled   anti­ CD8   monoclonal   antibody,   clone   LT8;   Atto™488–   labeled   anti­CD3  monoclonal   antibody,   clone   UCHT1;   and   Peridinin­chlorophyll­protein  Complex   (PerCP)–   labeled   anti­CD45   monoclonal   antibody,   clone  HI30.The monoclonal antibodies used in the ReaPan 34845 were assigned  these specificities at the 8th International Workshop on Human Leukocyte  Differentiation   Antigens  (9).   A   precise   number   of   fluorescent   counting  beads are included in the ReaPan 34845 reagent to allow single­platform  determination   of   absolute   CD4+,   CD8+,   CD3+   T­cell   and   absolute  lymphocyte counts.  The ReaPan 34845 reagent is provided in dried form  and dispensed in flow cytometer compatible sample tubes with each tube  containing   one   ready­to­use   test.  Fifty   (50)   tests   are   supplied   in   each  ReaPan 34845 reagent package. Precautions

1. Warning: The ReaPan 34845 reagent contains Sodium azide. 

7

2.

3.

Sodium   azide   is   harmful   if   swallowed  (R22).   Wear   suitable  protective   clothing  (S36).   If   swallowed,   seek   medical   advice  immediately (S46). Contact with acids liberates toxic gas (R32).  Azides should be flushed with large amounts of water during  disposal to avoid deposits in lead or copper plumbing. Warning:   All   blood   specimens   are   considered   biohazards.  Handle   them   as   if   they  are   capable   of   transmitting   infection  and dispose off with proper precautions and accordance with  governmental regulations. The addition of the precise volume of blood is critical to obtain  correct results. Use a calibrated pipette and operate according  to the manufacturer’s instructions.

Storage and Handling  1. 2. 3.

Store the reagent at room temperature in a dry place. Do not  use the reagent after the expiry date mentioned on the label. Do not freeze or refrigerate the ReaPan 34845 reagent. The ReaPan 34845 reagent is light sensitive. Do not expose to  direct light either during storage or when mixed with blood.

8

4.

Use the zip lock to reseal the reagent pouch after you have  removed the desired number of tests. Do not use the tubes  beyond the expiration date indicated on the packaging.

Indication of Instability The ReaPan 34845 reagent is a dry glassy coating at the bottom of the  reaction tube.   Do not use if the reagents appears to be moist or it has  become dislodged from the bottom of the reaction tube. INSTRUMENT The   ReaPan   34845   reagent   is   designed   for   use   on   a   flow   cytometer  equipped   with   appropriate   computer   hardware   and   software.   ReaMetrix  recommends the BD FACSCalibur™ or Accuri™ flow cytometer; however,  results can be achieved using other platforms. The flow cytometer must be  equipped with 488 nm and 635 nm lasers and must be capable of detecting  light scatter (forward and side) and four­color fluorescence with emission  detectable in four ranges: 515–545 nm, 562–607 nm, >650 nm, and 652– 668 nm. It must be able to threshold or discriminate using the >650 nm 

9

channel.  Instrument   should   be   calibrated   by   setting   photomultiplier   tube  voltages,  fluorescence compensation,  and checking instrument  sensitivity  before use according to the manufacturer’s guidelines. The user is responsible to optimize the performance of the reagent for use  in   flow   cytometers   other   than   that   mentioned   above.  For   other   flow  cytometers,   set   up   the   cytometer   for   four­color   acquisition   following   the  manufacturer’s recommendations. Setup should include setting or checking  PMT voltages, fluorescence compensation, and instrument sensitivity. SPECIMEN COLLECTION The   blood   sample   should   be   collected   in   a   sterile   blood   collection   tube  containing K3EDTA. Follow the collection tube manufacturer’s guidelines for  the minimum volume of blood to be collected. The   anti­coagulated   blood   must   be   stored   at   room   temperature   (20°C   ­  25°C) and should be stained and analyzed within 24 hours of draw.   Interfering conditions

10

Refrigerated   or   previously   fixed   blood   specimens   can   yield   erroneous  results and should be rejected. Hemolyzed, aged, or partially clotted blood  specimens can affect flow cytometer performance. PROCEDURE Reagent Provided ReaPan 34845 reagent in a dried format Reagents and materials required but not provided 1. Blood collection tube containing K3EDTA 2. Calibrated pipettes 3. Vortex mixer 4. Lysing SolutionA or similar blood fix/lyse solution  5. Sheath fluidB 6. 0.2µm filtered, deionized distilled water or Milli­Q waterC 7. Flow cytometer Calibration BeadsD

11

A. B.

ReaLyse Lysing solution: ReaMetrix Catalog No: 25237­00

C.

Accuri Flow cytometer uses Milli­Q water/Distilled deionized water instead of  Sheath fluid 

D.

Calibration Beads: BD Catalog No. 340486

Sheath fluid: BD Catalog No.342003

Assay Protocol 1.

2.

3. 4.

Mix   blood   sample   (invert   blood   tube   at   least   10   times)   and  reverse pipette  50µL of blood into the correctly labeled tube  that contains the dry down reagent. Gently vortex each tube for 30 seconds. Incubate for 30  minutes at room temperature. Protect the tube from direct  light. Add 450µL  of 1X  ReaLyse  lysing  solution  to  each tube  and  vortex for 10 seconds. Return tubes to the dark for at least 15  minutes. Vortex sample tube thoroughly (at low speed) and load onto  cytometer for analysis.

12

Quality Control Commercially available quality control whole blood control cells can be run  each day. Established values can be used to assess reagent and system  performance. FLOW CYTOMETER ACQUISITION AND ANALYSIS Start flow cytometer according to manufacturer’s instructions  (In the case  of   FACSCalibur™,   the   instrument   should   be   setup   and   calibrated   using  CaliBRITE™   beads   and   FACSComp™   software;   For   Accuri™   flow  cytometer   instruments,   the   performance   of   the   instrument   should   be  checked by Validation beads provided by Accuri.) For BD FACSCalibur™ Flow Cytometer Instruments 1. Draw five dot­plot views – Refer Figure 1

•

View 1: Anti­CD45 PerCP (FL3) versus side scatter (SSC–  Linear scale) 

13

•

View   2:  Anti­CD3   Atto488   fluorescence   (FL1)   versus   side  scatter (SSC– Linear scale) of events gated as CD45+ (R1)  from the View 1. 

•

View   3:  CD4   APC   (FL4)   versus   CD3   Atto   488   (FL1)   of  events gated as CD45+ (R1) from the View 1.

•

View 4: CD8 PE (FL2) versus CD3 Atto 488 (FL1) of events  gated as CD45+ (R1) from the View 1.

•

View 5: Anti­CD8 PE (FL2) versus Anti­CD3 Atto488 (FL1).  View­5   will   have   a   gate   (R3)   to   capture   the   fluorescent  reference beads.  The beads have a high FL1 and FL2 Mean  Fluorescence Intensity 2. Before acquisition adjust the FL3 threshold to minimize debris. 3. Set the number of events to capture at 3000 for R­3 gate (View  5) and start data acquisition. When 3000 beads are acquired in  the gate R3, acquisition stops. 4. Gate   the   brightest   CD45+   cell   cluster   in   View­1   and   gate   the  population   as   R1.   This   CD45+   cell   cluster   is   that   population  which   has   the   lower   SSC   intensity   and   higher   FL3   mean 

14

fluorescence intensity. It represents the lymphocyte population.  The Gate R1 is applied on View 2, 3 & 4. 5. Total CD3+ events can be identified in View 2 in R2. 6. The CD4+ and CD8+ cell populations can be identified in View 3  and View 4 in the upper right quadrants. 7. The absolute count for each cell type can be calculated using the  following equation,  (Gated Cell Count) x(Bead Absolute CellCount / µL = (Gated Bead Count) x(Test

Count per te Volumein µL

Where the Gated Cell count and Bead count are obtained from the Flow  Cytometer analysis, and the Bead count per test from the test kit provided. Example: If   the   bead   count   per   ReaPan   34845   test   is   50,000,   the   volume   of  blood tested is 50µl, the number of gated beads is 3,000 (Figure 1,  View 5, R3 gated events), and the number of gated CD4+ T­cells is  1,500 (Figure 1, View 3, UR quadrant) then the absolute CD4+ T­cell  count is 500 cell/µl.

15

Absolute CD4 CellCount=

View 1

1500 x 50000 = 500cells / µL 3000 x 50

View 2 View 5

16

View 3

View 4

Figure 1. Dot plot views:  View 1:  CD45 PerCP fluorescence (FL3 ­ log scale) versus side  scatter (SSC – Linear scale) View 2: CD3 Atto488 fluorescence (FL1­ log scale) versus side  scatter (SSC– Linear scale) View 3: CD4 APC fluorescence (FL4– log scale) versus CD3 Atto  488 (FL1– log scale) of events gated as CD45+ from View 1 View 4:  CD8 PE fluorescence  (FL2­ log scale) versus CD3 Atto488 (FL1­ log scale) of events gated as CD45+ from View 1.  View  5:  CD8 PE  fluorescence  (FL2­   log  scale)  versus  CD3 Atto488   (FL1  ­log  scale).  R3  captures the fluorescent reference beads

For Accuri™ Flow Cytometer Instruments

1. Draw five dot­plot views – Refer Figure 2. • View 1: CD45 PerCP (FL3­Log scale) versus side scatter  (SSC – Linear scale)

17

•

View 2: CD3 Atto488 fluorescence (FL1­Log scale) versus  side   scatter   (SSC  –   Linear  scale)  of   events  gated   as  CD45+  (P1) from the View 1.

•

View 3:  CD4 APC (FL4­ Log scale) versus CD3 Atto 488  (FL1­ Log scale) of events gated as CD45+ (P1) from the View  1.

•

View   4:  CD8   PE   (FL2­  Log   scale)   versus  CD3   Atto   488  (FL1­ Log scale) of events gated as CD45+ (P1) from the View  1.

•

View   5:   CD8   PE   (FL2­   Log   scale)   versus   CD3   Atto488  (FL1­ Log scale) of all events from View 1. View­5 will have a  gate (P2) to capture the fluorescent reference ReaCount beads.

Following table (Table­1) represents the Plot Specification Value to set  the scales: Table­1: Dot Plot View X & Y­Axis Scale Specifications Dot Plot Views View 1

Axis X­Axis

Scale FL3­Log scale

Min Value 500

Max value 200,000

18

View 2 View 3 View 4 View 5

Y­Axis X­Axis Y­Axis X­Axis Y­Axis X­Axis Y­Axis X­Axis Y­Axis

SSC­Linear scale FL1­Log scale SSC­Linear scale FL4­Log scale FL1­Log scale FL1­Log scale FL2­Log scale FL1­Log scale FL2­Log scale

0 500 0 50 200 50 500 50 500

175,000 500,000 120,000 1,000,000 1,000,000 500,000 500,000 500,000 500,000

2. In the Run Limit section of the Instrument template panel, set the 

3. 4.

instrument   Threshold   on   FL3   and   set   the   value   to   1000.  Before/After acquisition adjust the FL3 Threshold value to minimize  debris. Click on the Set Colour Compensation to open the compensation  matrix and set the compensation values as per Figure 3. In the Run Limit section of the Instrument template panel, set the  fluidics Flow rate on MEDIUM. Set the number of events to capture  at 3000 for P2 gate bead events (Figure 2; View 5)

19

5. Vortex   sample   tube   thoroughly   at   low   speed   and   load   onto   flow  6.

7. 8. 9. 10.

cytometer for acquisition. When 3000 bead events are acquired in  the gate P2, acquisition stops. Gate the brightest CD45+ cell cluster in View­1 and adjust the P1  gate around the lymphocyte population. This CD45+ cell cluster is  that population which has the lower SSC intensity and higher FL3  mean   fluorescence   intensity.   It   represents   the   lymphocyte  population. The Gate P1 is applied on View 2, 3 and 4. CD3+ cell clusters are separated using gate R1 (View­2, Figure 2).  The CD3+ cell population has the lower SSC intensity and higher  FL1 mean fluorescence intensity. In View­3 (Figure 2) cell clusters are separated using quadrant gate  Q1.   The   CD4+CD3+   cell  populations  can   be   identified   in   View­3  (Figure 2) in the upper right quadrant Q1­UR as double positives. In View­4 (Figure 2) cell clusters are separated using quadrant gate  Q1.   The   CD8+CD3+   cell  populations  can   be   identified   in   View­4  (Figure 2) in the upper right quadrant Q1­UR as double positives View­5 (Figure 2); fluorescent reference beads are separated using  gate P2. The beads have a high FL1 and FL2 Mean Fluorescence 

20

Intensity.

11. The absolute count for each cell type can be calculated using the  following equation.

(Gated Cell Count) x(Bead Absolute CellCount / µL = (Gated Bead Count) x(Test

Count per test) Volumein µL)

Where the Gated Cell count and Bead count are obtained from the Flow  Cytometer analysis and the Bead count per test from the test kit provided. Example: If the bead count per ReaPan 34845 test is 50,000, the volume of blood  tested is 50µl, the number of gated beads is 3,000 (Figure 2, View 5, P2  gated events), and the number of gated CD4+ T­cells is 1,500 (Figure 2,  View   3,   Q1­UR   quadrant)   then   the   absolute   CD4+   T­cell   count   is   500  cell/µl.

Absolute CD4 CellCount= View 1

1500 x 50000 = 500cells / µL 3000 x 50 View 2

21

View 5

View 3

View 4

22

Figure   2.   Dot   plot   views:  View   1:  CD45   PerCP   fluorescence   (FL3   ­   log   scale)  versus side scatter (SSC – Linear scale); View 2: CD3 Atto488 fluorescence (FL1­  log scale) versus side scatter (SSC– Linear scale) of events gated as CD45+ (P1)  from the View 1;  View 3: CD4 APC fluorescence (FL4– log scale) versus CD3 Atto  488 (FL1– log scale) of events gated as CD45+ (P1) from the View 1; View 4: CD8  PE fluorescence (FL2­ log scale) versus CD3 Atto488 (FL1­ log scale)  of events  gated as  CD45+  (P1) from  the View  1;  View 5:  CD8 PE fluorescence (FL2­ log  scale) versus CD3 Atto488 (FL1 ­log scale). R3 captures the fluorescent reference  beads

23

Figure 3: Accuri Flow cytometer Compensation settings for ReaPan 34845 Reagent

24

PERFORMANCE CHARACTERISTICS The performance data for ReaPan 34845  reagent was generated by  undertaking clinical validation. Accuracy The absolute counts for CD4+, CD8+ and CD3+ T­Cells determined  using   ReaPan   34845   reagent   were   compared   with   Dry­Tri   T­STAT  CD3/CD4/CD8 reagents (Figure 4, Figure 5 and Figure 6 ) using a BD  FACSCalibur™ flow cytometer. The absolute counts for CD45+ (Absolute Lymphocyte Count – ALC)  determined by the ReaPan 34845 were compared with a hematology  counter (Figure 7). 

25

Figure4:   Correlation   of   absolute   CD4+   T­Cell   counts  determined  using  ReaPan 

26

34845   compared   to   a   commercially   available   reagent   Dry   Tri   T­STAT  CD3/CD4/CD8

27

Figure   5:   Correlation   of   absolute   CD8+   T­Cell   counts   determined   using   the  ReaPan 34845 compared to a commercially available reagent Dry Tri T­STAT CD3/ CD4/CD8

28

Figure 6: Correlation of absolute CD3+ T­Cell counts (Total T­Cells) determined  using the ReaPan 34845 compared to a commercially available reagent Dry Tri T­ STAT CD3/CD4/CD8

29

Figure 7:  Correlation of CD45+ cell counts (ALC) determined using the ReaPan  34845 compared to the lymphocyte count obtained from a Hematology analyzer

Specificity The  antigen   specificities  for  the  CD3,   CD4,   CD8  and  CD45   monoclonal  antibodies   used   in   the   ReaPan   34845   reagent   were   confirmed   by   the  Human   Leukocyte   Differentiation   Antigens   (HLDA)   Workshops.   After  conjugation of the antibodies no additional cross­reactivity was observed. LIMITATIONS

1. The ReaPan 34845 reagent has only been validated with K3EDTA  treated whole blood. 2. Laboratories   should   establish   their   own   reference   ranges   for   the  absolute counts obtained using the ReaPan 34845 reagent. BIBLIOGRAPHY

30

1. Knapp W, Dorken B, Gilks WR, Rieber EP, Schmidt RE, Stein H, & 

von   dem   BorneAEGKr,   eds.  Leukocyte   typing   IV.     White   cell  differentiation antigens.  Oxford university press 1989 2. Reinherz   EL,   Meuer   SC,   and   Schlossman   SF.  The   delineation   of  antigen   receptors   on   human   T   lymphocytes.   Immunology   Today,  1983, 4:5­8. 3. Fauci AS: The human deficiency virus: Infectivity and mechanism of  pathogenesis. Science, 1988, 239:617­622. 4. Reinherz EL and Schlossman SF. The differentiation and function of  human T lymphocytes. Cell, 1980, 19:821­827. 5. Phillips A, Lee C, Elford J, et al.  Serial CD4 lymphocyte counts and  the development of AIDS.  Lancet 1991, 337:389­392. 6. Nicholson J.  Use of flow cytometry in the evaluation and diagnosis  of primary and secondary immunodeficiency diseases.  Arch. Pathol.  Lab. Med.  1989, 113:598­605 7. Yarchoan R, Venzon D, Pluda J, et al.   CD4 count and the risk of  death  in patients infected with  HIV receiving  antiretroviral therapy.  1991, 115:184­189.

31

8. Giorgi   J   &   Detels   R.     T­cell   subset   alterations   in   HIV­infected  homosexual   men:   NIAID   multicenter   AIDS   cohort   study.     1989,  52:10­18. 9. Heddy   Z,   Swart   B,   Nicholson   I,   &   Voss   E,   eds.   Leukocyte   and  stromal cell molecules; the CD markers.  John Wiley & Sons 2007.

WARRANTY This   product   is  warranted   only  to   conform   to   the   quantity   and   contents  stated on the label at the time of delivery to the customer. There are no  warranties, expressed or implied, that extend beyond the description on the  label of the product. ReaMetrix’s sole liability is limited to replacement of  the product. ReaMetrix is not liable for property damage, personal injury, or  economic loss caused by the product.  Note:   FACSCalibur,   CaliBRITE,   FACSComp   are   all   registered   trade   names   of   Becton­Dickinson; Accuri C6 flow cytometer is the trade name of Accuri.

32

33

Manufactured by ReaMetrix India Pvt. Ltd. Manufacturing License Number: KTK/25/519/2006 50­B, II Phase, Peenya Industrial Area Peenya, Bangalore 560058, India Ph: +91­80­28378693/5,  Fax: +91­80­41172451 E­mail: [email protected],  www.reametrix.com Rev No. 3.0,  22­Sep­09

34