Pewarnaan Pada Bakteri.docx

Pewarnaan Bakteri I. · · · ·

Tujuan Terampil melakukan pewarnaan gram untuk bakteri gram positif dan negatif. Mempelajari teknik pewarnaan gram untuk pengamatan mikroba. Mempelajari bentuk-bentuk dan struktur sel bakteri dari hasil pengamatan dengan pewarnaan gram. Membedakan kelompok bakteri berdasarkan reaksinya terhadap warna dan sekaligus menunjukkan sifat bakteri tersebut.

II. Tinjauan Pustaka Pewarnaan pada bakteri dibagi menjadi tiga, yaitu : 1. Pewarnaan sederhana Pewarnaan sederhana merupakan teknik pewarnaan yang paling banyak digunakan. Disebut sederhana karena hanya menggunakan satu jenis zat warna untuk mewarnai organisme tersebut. Kebanyakan bakteri mudah bereaksi dengan pewarnaan-pewarnaan sederhana karena sitoplasamanya bersifat basofilik (suka dengan basa). Zat-zat warna yang digunakan untuk pewarnaan sederhana umumnya bersifat alkolin. Dengan pewarnaan sederhana dapat mengetahui bentuk dan rangkaian sel-sel bakteri. Pewarna basa yang biasa digunakan untuk pewarnaan sederhana ialah metilen biru, kristal violet, dan karbol fuehsin yang mana pewarnaan sederhana ini dibagi lagi menjadi dua jenis pewarnaan. a. Pewarnaan Asam Merupakan pewarnaan yang menggunakan satu macam zat warna dengan tujuan hanya untuk melihat bentuk sel. Adapun zat warna yang dipakai dalam pewarnaan positif adalah metilen biru dan air furksin. b. Pewarnaan Basa Pewarnaan basa atau negatif merupakan metode pewarnaan untuk mewarnai bakteri tetapi mewarnai latar belakangnya menjadi hitam gelap. Pada pewarnaan ini mikroorganisme kelihatan transparan (tembus pandang). Teknik ini berguna untuk menentukan morfologi dan ukuran sel. Metode ini menggunakan cat nigrosin atau tinta cina. 2. Pewarnaan Diferensial (Gram) Pewarnaan Gram atau metode Gram adalah suatu metode empiris untuk membedakan spesies bakteri menjadi dua kelompok besar, yakni gram positif dan gram negatif, berdasarkan sifat kimia dan fisik dinding sel mereka. Metode ini diberi nama berdasarkan penemunya, ilmuwan Denmark Hans Christian Gram (1853–1938) yang mengembangkan teknik ini pada tahun 1884 untuk membedakan antara pneumokokus dan bakteri Klebsiella pneumoniae. Bakteri Gram-negatif adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat warna metil ungu pada metode pewarnaan Gram. Bakteri gram positif akan mempertahankan zat warna metil ungu gelap setelah dicuci dengan alkohol, sementara bakteri gram negatif tidak. Pada uji pewarnaan Gram, suatu pewarna penimbal (counterstain) ditambahkan setelah metil ungu, yang membuat semua bakteri gram negatif menjadi berwarna merah atau merah muda. Pengujian ini berguna untuk mengklasifikasikan kedua tipe bakteri ini berdasarkan perbedaan struktur dinding sel mereka. a. Bakteri Gram Negatif

Bakteri gram negative adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat warna metil ungu pada metode pewarnaan Gram. Bakteri gram positif akan mempertahankan warna ungu gelap setelah dicuci dengan alcohol, sementara bakteri gram negative tidak. b. Bakteri Gram Positif Bakteri gram positif adalah bakteri yang mempertahankan zat warna metil ungu sewaktu proses pewarnaan Gram. Bakteri jenis ini akan berwarna biru atau ungu di bawah mikroskop, sedangkan bakteri gram negative akan berwarna merah muda. Perbedaan klasifikasi antara kedua jenis bakteri ini terutama didasarkan pada perbedaan struktur dinding sel bakteri (Aditya,2010) Bakteri gram negatif memiliki 3 lapisan dinding sel. Lapisan terluar yaitu lipoposakarida (lipid) kemungkinan tercuci oleh alkohol, sehingga pada saat diwarnai dengan safranin akan berwarna merah. Bakteri gram positif memiliki selapis dinding sel berupa peptidoglikan yang tebal. Setelah pewarnaan dengan kristal violet, pori-pori dinding sel menyempit akibat dekolorisasi oleh alkohol sehingga dinding sel tetap menahan warna biru (Fitria, 2009). Sel bakteri gram positif mungkin akan tampak merah jika waktu dekolorisasi terlalu lama. Sedangkan bakteri gram negatif akan tampak ungu bila waktu dekolorisasi terlalu pendek (Fitria, 2009). Perbedaan relatif sifat bakteri gram positif dan gram negatif. Sifat Bakteri garam (+) Bakteri gram negatif(-) Komposisi dinding sel Kandungan lipid rendah (1- Kandungan lipid tinggi 4%) Ketahanan terhadap Lebih sensitif Lebih tahan penisilin Penghambatan oleh Lebih dihambat Kurang dihambat pewarna basa (VK) Kebutuhan nutrisi Kebanyakan spesies relatif Relatif sederhana kompleks Ketahanaa terhadap Lebih tahan Kurang tahan perlakuan fisik (Manurung, 2010). Pewarnaan tahan asam yang umum digunakan adalah pewarnaan Zieh – Neelson dengan pewarna utama karbol fuksin dengan pemanasan dan pewarna tandingan metilen blue Loeffler. Perlakuan panas tersebut diganti dengan penggunaan pembasah yaitu suatu deterjen untuk mengurangi tegangan permukaan lemak, untuk menjamin penetrasi. Pewarna yang mengandung pembasah ini disebut pewarna Kinyoun (Purwoko, 2010). Sekali sitoplasma terwarnai, maka sel-sel organisme seperti mikobakteri menahan zat warna tersebut dengan erat, artinya tidak terpucatkan sekalipun oleh zat yang bersifat keras seperti asam alkohol (yaitu 3% HCL dalam etanol 95%). Alkohol asam ini merupakan pemucat yang sangat intensif dan jangan dikelirukan dengan alkohol-aseton yang banyak digunakan dalam prosedur pewarnaan Gram. Kondisi pewarnaan ini, organisme yang dapat menahan zat warna itu dikatakan tahan asam dan tampak merah. Bakteri biasa yang dindingnya tidak bersifat terlampau lipoidal, pewarna karbol fuksin yang mewarnai sel dapat dengan mudah dipucatkan oleh alkohol-asam dan karenanya dikatakan tak tahan asam. Tercucinya karbol fuksin dapat diperagakan oleh terserapnya pewarna tandingan biru metilen oleh sel, sehingga bakteri tersebut tampak biru (Hadioetomo, 1993). Pewarnaan Ziehl Neelsen. Larutan carbol fuchsin 0,3% dituang pada seluruh permukaan sediaan, kemudian dipanaskan diatas nyala api sampai keluar asap tetapi tidak

4.

a.

b.

c.

d.

sampai mendidih atau kering selama 5 menit. Sediaan kemudian dibiarkan dingin selama 5-7 menit lalu kelebihan zat warna dibuang dan dicuci dengan air yang mengalir perlahan. Setelah itu larutan asam alkohol 3% (hydrochloric acid-ethanol) dituang pada sediaan dan dibiarkan 24 menit kemudian dicuci dengan air mengalir selama 1-3 menit, kelebihan larutan dibuang. Larutan methylene blue 0,1% dituang sampai menutup seluruh permukaan, dibiarkan 1 menit lalu larutan dibuang dan dicuci dengan air mengalir (Karuniawati, 2005). Pewarnaan Khusus Pewarnaan khusus merupakan metode pewarnaan untuk mewarnai struktur khusus atau tertentu dari bakteri seperti bagian spora, kapsul, flagel dsb. Contoh pewarnaan khusus :Pewarnaan Endospora Anggota dari genus Clostridium, Desulfomaculatum, dan Bacillus adalah bakteri yang memproduksi endospora dalam siklus hidupnya. Endospora merupakan bentuk dorman dari sel vegetatif, sehingga metabolismenya bersifat inaktif dan mampu bertahan dalam tekanan fisik dan kimia seperti panas, kering, dingin, radiasi, dan bahan kimia. Tujuan dilakukannya pewarnaan endospora adalah membedakan endospora dengan sel vegetatif, sehingga pembedaannya tampak jelas. Endospora tetap dapat dilihat di bawah mikroskop meskipun tanpa pewarnaan dan tampak sebagai bulatan transparan dan sangat refraktil. Namun jika dengan pewarnaan sederhana, endospora sulit dibedakan dengan badan inklusi (Aditya, 2010) Pewarnaan kapsul Pewarnaan ini menggunakan larutan kristal violet panas, lalu larutan tembaga sulfat sebagai pembilasan menghasilkan warna biru pucat pada kapsul, karena jika pembilasan dengan air dapat melarutkan kapsul. Garam tembaga juga memberi warna pada latar belakang yang berwana biru gelap. Pewarnaan spora Dinding spora relatif tidak permeable, namun zat warna bias menembusnya dengan cara memanaskan preparat. Pewarnaan flagel Pewarnaan flagel dengan memberi suspensi koloid garam asam tanat yang tidak stabil, sehingga terbentuk presipitat tebal pada dinding sel dan flagel. Pewarnaan nucleoid Pewarnaan nucleoid menggunakan pewarna fuelgen yang khusus untuk DNA (Rudi, 2010).

III. Alat dan Bahan Alat : · Gelas Benda 2 Buah · Gelas Penutup 2 Buah · Pipet 4 Buah · Bunsen 1 Buah · Mikroskop 1 Buah · Tissue Secukupnya Bahan: · Bakteri Sampel A 1 Tetes · Bakteri Sampel B 1 Tetes · Alkohol 96% 2 Tetes · Air Mengalir · Larutan Kristal Violet 2 Tetes

· · IV. Ø Ø Ø Ø Ø Ø Ø Ø

V.

Safarin Larutan Iodin

Cara Kerja Disiapkan dua gelas benda dan penutupnya, Bakteri sempel A dan B diteteskan satu tetes pada masing-masing gelas benda, Sampel dipanaskan diatas api Bunsen hingga terfiksasi, jangan sampai pecah 1 tetes kristal violet diteteskan di atas gelas benda tersebut kemudian didiamkan selama 30 detik. Setelah itu, gelas benda dibilas dengan aquades hingga warnanya hilang, 1 tetes iodine diteteskan di atas gelas benda tersebut kemudian didiamkan selama 1 menit. Setelah itu, gelas benda dibilas dengan aquades hingga warnanya hilang, 1 tetes etanol 96% diteteskan di atas gelas benda tersebut kemudian didiamkan selama 30 detik. Setelah itu, gelas benda dibilas dengan aquades hingga warnanya hilang, 1 tetes safranin diteteskan di atas gelas benda tersebut kemudian didiamkan selama 1 menit. Setelah itu, gelas benda dibilas dengan aquades hingga warnanya hilang, Setelah pembilasan terakhir, gelas benda dikeringkan dan diamati di bawah mikroskop. Jika terbentuk warna ungu maka termasuk golongan bakteri gram positif , dan jika terbentuk warna merah atau merah muda maka termasuk golongan bakteri gram negatif. Hasil Pengamatan dan Pembahasan Tabel Hasil Pengamatan, Pengamatan Warna Hasil Ungu Merah Muda 1 Bakteri Sampel A ü Bakteri gram negatif 2 Bakteri sampel B ü Bakteri gram positif Praktikum ini memiliki tujuan agar praktikan terampil dalam melakukan pewarnaan gram untuk bakteri gram positif dan negatif, mempelajari teknik pewarnaan gram untuk pengamatan mikroba, mempelajari bentuk-bentuk dan struktur sel bakteri dari hasil pengamatan dengan pewarnaan gram, sera membedakan kelompok bakteri berdasarkan reaksinya terhadap warna dan sekaligus menunjukkan sifat bakteri tersebut. Prinsip dasar dari pewarnaan ini adalah adanya ikatan ion antara komponen selular dari bakteri dengan senyawa aktif dari pewarna yang disebut kromogen. Terjadi ikatan ion karena adanya muatan listrik baik pada komponen seluler maupun pada pewarna (Manurung, 2010). Pewarnaan Gram adalah pewarnaan diferensial yang sangat berguna dan paling banyak digunakan dalam laboratorium mikrobiologi, karena merupakan tahapan penting dalam langkah awal identifikasi. Pewarnaan ini didasarkan pada tebal atau tipisnya lapisan peptidoglikan di dinding sel dan banyak sedikitnya lapisan lemak pada membran sel bakteri. Jenis bakteri berdasarkan pewarnaan gram dibagi menjadi dua yaitu gram positif dan gram negatif. Bakteri gram positif memiliki dinding sel yang tebal dan membran sel selapis. Sedangkan baktri gram negatif mempunyai dinding sel tipis yang berada di antara dua lapis membran sel (Manurung, 2010). Langkah-langkah utama dalam teknik pewarnaan antara lain: Pembuatan olesan bakteri, olesan bakteri tidak boleh terlalu tebal atau tipis. Fiksasi, dapat dilakukan secara pemanasan atau dengan aplikasi bahan kimia seperti sabun, formalin, fenol. Aplikasi zat warna tunggal, atau lebih dari 1 zat warna. Pewarnaan gram pada praktikum ini dilakukan dalam 4 tahap yaitu: Pemberian cat warna utama (cairan kristal violet) berwarna ungu. Pengintesifan cat utama dengan penambahan larutan mordan JKJ. Pencucian (dekolarisasi) dengan larutan alkohol asam. No

a. b. c. a. b. c.

1 Tetes 2 Tetes

Nama

d. Pemberian cat lawan yaitu cat warna safranin. Keempat tahap tersebut dijelaskan langsung dalam langkah percobaan di bawah ini. Langkah selanjutnya, 1 tetes kristal violet diteteskan di atas gelas benda tersebut kemudian didiamkan selama 30 detik. Setelah itu, gelas benda dibilas dengan aquades hingga warnanya hilang. Kristal violet merupakan reagen yang berwarna ungu. Kristal violet ini merupakan pewarna primer (utama) yang akan memberi warna pada mikroorganisme target. Kristal violet bersifat basa sehingga mampu berikatan dengan sel mikroorganisme yang bersifat asam. Dengan perlakuan seperti itu, sel mikroorganisme yang transparan akan terlihat berwarna (ungu). Pemberian kristal violet pada bakteri gram positif akan meninggalkan warna ungu muda. Perbedaan respon terhadap mekanisme pewarnaan gram pada bakteri adalah didasarkan pada struktur dan komposisi dinding sel bakteri. Bakteri gram positif mengandung protein dan gram negatif mengandung lemak dalam persentasi lebih tinggi dan dinding selnya tipis. Kristal violet yang diteteskan didiamkan selama 30 detik bertujuan agar cat atau pewarna ini dapat melekat sempurna pada dinding sel bakteri. Langkah percobaan yang dilakukan oleh praktikan dimulai dengan 1 tetes sampel yang berupa bakteri sampel A dan bakteri sampel B diteteskan di atas gelas benda yang berbeda. Kedua gelas benda berisi sampel tersebut dipanaskan (fiksasi) di atas bunsen burner. Hal ini bertujuan untuk menguapkan air sehingga hanya akan didapat bakteri saja. Proses fiksasi juga bertujuan supaya bakteri benar-benar melekat pada gelas benda sehingga olesan bakteri berupa tetesan sampel tidak akan terhapus apabila dilakukan pencucian. Yang perlu diperhatikan dalam proses fiksasi adalah bidang yang mengandung bakteri dijaga agar tidak terkena nyala api. Langkah selanjutnya, 1 tetes iodine diteteskan di atas gelas benda tersebut kemudian didiamkan selama 1 menit. Setelah itu, gelas benda dibilas dengan aquades hingga warnanya hilang. Iodine merupakan pewarna Mordan, yaitu pewarna yang berfungsi memfiksasi pewarna primer yang diserap mikroorganisme target atau mengintensifkan warna utama. Pemberian iodine pada pengecatan Gram dimaksudkan untuk memperkuat pengikatan warna oleh bakteri. Kompleks zat iodin terperangkap antara dinding sel dan membran sitoplasma organisme gram positif, sedangkan penyingkiran zat lipida dari dinding sel organisme gram negatif dengan pencucian alkohol memungkinkan hilang dari sel. Iodine yang diteteskan didiamkan selama 1 menit bertujuan agar pengikatan warna oleh bakteri menjadi semakin lebih kuat. Selanjutnya, 1 tetes alkohol 96% diteteskan di atas gelas benda tersebut kemudian didiamkan selama 30 detik. Setelah itu, gelas benda dibilas dengan aquades hingga warnanya hilang. Etanol 95% merupakan solven organik yang berfungsi untuk membilas (mencuci) atau melunturkan kelebihan zat warna pada sel bakteri (mikroorganisme). Tercuci tidaknya warna dasar tergantung pada komposisi dinding sel, bila komponen dinding sel kuat mengikat warna, maka warna tidak akan tercuci sedangkan bila komponen dinding sel tidak kuat menelan warna dasar, maka warna akan tercuci. Pemberian alkohol pada pengecatan ini dapat mengakibatkan terjadinya dua kemungkinan yaitu mikroorganisme (bakteri) akan tetap berwarna ungu atau bakteri menjadi tidak berwarna. Pemberian alkohol 96% juga menyebabkan terekstraksi lipid sehingga memperbesar permeabilitas dinding sel. Reaksi yang terjadi ketika penambahan alkohol 96% gram + : lipid << + alkohol 96% pori dinding sel yang terbentuk kecil, protein dinding sel terdehidrasi, pori tertutup (kompleks kristal violet-iodine tidak tercuci) gram - : lipid >> + alkohol 96% pori dinding sel yang terbentuk besar, protein dinding sel terdehidrasi, pori tidak tertutup (kompleks kristal violet-iodine tercuci) Alkohol 96% yang diteteskan di atas gelas benda didiamkan selama 30 detik kemudia dibilas dengan aquades dengan tujuan agar warna dapat luntur secara sempurna dan tidak ada yang tersisa di dalam gelas benda.

Setelah pembilasan reagen alkohol 96% pada gelas benda sebelumnya, selanjutnya diteteskan 1 tetes safranin di atas gelas benda tersebut kemudian didiamkan selama 1 menit. Setelah itu, gelas benda dibilas dengan aquades hingga warnanya hilang. Safranin merupakan pewarna tandingan atau pewarna sekunder. Zat ini berfungsi untuk mewarnai kembali sel-sel yang telah kehilangan pewarna utama setelah perlakuan dengan alkohol. Dengan kata lain, safranin memberikan warna pada mikroorganisme non target serta menghabiskan sisa-sisa cat atau pewarna. Pewarnaan safranin masuk ke dalam sel dan menyebabkan sel menjadi berwarna merah pada bakteri gram negatif sedangkan pada bakteri gram positif dinding selnya terdehidrasi dengan perlakuan alkohol, pori – pori mengkerut, daya rembes dinding sel dan membran menurun sehingga pewarna safranin tidak dapat masuk sehingga sel berwarna ungu. Pemberian reagen atau pewarna yang berganti dari satu pewarna ke pewarna lain dengan waktu yang telah ditentukan disebabkan karena zat-zat warna tersebut dapat berikatan dengan komponen dinding sel bakteri dalam waktu singkat. Karena itulah rentang waktu pemberian zat warna yang satu ke yang lainnya tidak lama sehingga proses identifikasi bakteri berlangsung cepat (efisiensi waktu). Setiap akhir pemberian reagen atau pewarna, selalu dilakukan pembilasan terhadap gelas benda dengan menggunakan aquades. pembilasan ini bertujuan untuk mengurangi kelebihan setiap zat warna yang sedang diberikan. Setiap akhir pembilasan pada masingmasing reagen, perlu dilakukan penyerapan air bilasan dari aquades dengan menggunakan kertas tissu agar aquades tidak tercampur dengan reagen atau pewarna baru yang akan diberikan. Setelah pembilasan terakhir, gelas benda dikeringkan dan diamati di bawah mikroskop. Jika terbentuk warna ungu maka termasuk golongan bakteri gram positif , dan jika terbentuk warna merah atau merah muda maka termasuk golongan bakteri gram negatif. Gambar skematik langkah kerja yang dilakukan oleh praktikan

Tabel prosedur pewarnaan gram

(Pradhika, 2008) Zat warna adalah senyawa kimia berupa garam-garam yang salah satu ionnya berwarna. Garam terdiri dari ion bermuatan positif dan ion bermuatan negatif. Senyawa-senyawa kimia ini berguna untuk membedakan bakteri-bakteri karena reaksinya dengan sel bakeri akan memberikan warna berbeda. Perbedaan inilah yang digunakan sebagai dasar pewarnaan bakteri. Sel-sel warna dapat dibagi menjadi dua golongan yaitu asam dan basa. Jika warna terletak pada muatan positif dari zat warna, maka disebut zat warna basa. Jika warna terdapat pada ion negatif, maka disebut zat warna asam. Contoh zat warna basa adalah methylen blue, safranin, netral red, dan lain-lain. Sedangkan anionnya pada umumnya adalah Cl-, SO4 -, CH3COO-, COOHCOO. Zat warna asam umumnya mempunyai sifat dapat bersenyawa lebih cepat dengan bagian sitoplasma sel sedangkan zat warna basa mudah bereaksi dengan bagianbagian inti sel (Rudi, 2010). Pewarnaan bakteri dipengaruhi oleh faktor-faktor seperti fiksasi, peluntur warna, substrat, intensifikasi pewarnaan, dan penggunaan zat warna penutup. Pada bakteri gram positif menunjukkan warna biru ungu dan bakteri gram negatif berwarna merah. Dalam praktikum ini digunakan salah satu pewarnanya yaitu safranin yang sesuai teori bersifat basa sehingga lebih mudah bersenyawa atau bereaksi dengan bagian-bagian inti sel bakteri. Bakteri Gram negatif adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat warna metil ungu pada metode pewarnaan Gram. Bakteri gram positif akan mempertahankan zat warna metil ungu gelap setelah dicuci dengan alkohol, sementara bakteri gram negatif tidak. Pada uji pewarnaan Gram, suatu pewarna penimbal (counterstain) ditambahkan setelah metil ungu, yang membuat semua bakteri gram negatif menjadi berwarna merah atau merah muda. Pengujian ini berguna untuk mengklasifikasikan kedua tipe bakteri ini berdasarkan perbedaan struktur dinding sel mereka (Rudi, 2010). Hasil pengamatan di bawah mikroskop menunjukkan bahwa bakteri sampel A memiliki warna merah muda (gram negative), dan Bakteri sampel B memilki warna ungu (gram positif). 1. Escherichia coli

Gambar E. coli dengan perbesaran 1000 x Klasifikasi ilmiah Kingdom : Bakteria Filum : Proteobacteria Kelas : Gamma Proteobacteria Order : Enterobacteriales Famili : Enterobacteriaceae

Genus : Escherichia Spesies : E. coli Berdasarkan hasil pengamatan, terdapat bakteri Eschericia coli pada air WC. Berbentuk E. coli adalah basil (batang) yang pendek. Bakteri tersebut pada saat diwarnai menunjukkan warna merah muda yang berarti bahwa bakteri ini bersifat gram negatif. Menurut literatur, E. coli termasuk dalam famili Enterobacteraceae yang termasuk bakteri gram negatif dan berbentuk batang yang fermentatif. E. coli hidup dalam jumlah besar di dalam usus manusia, yaitu membantu sistem pencernaan manusia dan melindunginya dari bakteri patogen. Akan tetapi pada strain baru dari E. coli merupakan patogen berbahaya yang menyebabkan penyakit diare, sindrom diare lanjutan, muntaber, hemolitik uremic (hus), infeksi usus, infeksi saluran urin, dan neonatal meningitis. Peranan yang mengguntungkan adalah dapat dijadikan percobaan limbah di air, indikator pada level pencemaran air serta mendeteksi patogen pada feses manusia yang disebabkan oleh Salmonella typhi. Disamping itu, E. coli banyak digunakan dalam teknologi rekayasa genetika dan biasa digunakan sebagai vektor untuk menyisipkan gen-gen tertentu yang diinginkan untuk dikembangkan karena bakteri ini memiliki pertumbuhan yang sangat cepat dan mudah dalam penanganannya (Fajriana, 2008). Infeksi E.coli O157:H7 yang patogen pada manusia yaitu yang bersifat verotoksigenik yang telah menyebabkan 16.000 kasus penyakit melalui makanan (Food Born Diseases) dan 900 orang meninggal per tahun di AS, dengan perkiraan annual cost $ 200,000 hingga $ 600,000. Kejadian wabah tunggal pada tahun 1993 di Western AS telah menyebabkan 700 orang menderita sakit dan 4 orang meninggal (Sartika, 2005). VI. Kesimpulan 1. Pewarnaan yang digunakan dalam praktikum ini adalah pewarnaan Gram. Pewarnaan Gram adalah pewarnaan yang didasarkan pada tebal atau tipisnya lapisan peptidoglikan pada dinding sel dan banyak sedikitnya lapisan lemak pada membran sel bakteri. Pewarnaan ini berguna untuk membedakan spesies bakteri menjadi dua kelompok besar, yakni bakteri gram positif dan gram negatif. Langkahlangkah utama dalam teknik pewarnaan bakteri antara lain: a. Pembuatan olesan bakteri b. Fiksasi c. Aplikasi zat warna tunggal, atau lebih dari 1 zat warna. 2. Teknik pewarnaan gram pada praktikum ini dilakukan dalam 4 tahap yaitu: a. Pemberian cat warna utama (cairan kristal violet) berwarna ungu. b. Pengintesifan cat utama dengan penambahan larutan mordan JKJ. c. Pencucian (dekolarisasi) dengan larutan alkohol asam. d. Pemberian cat lawan yaitu cat warna safranin.

3. Dari hasil pengamatan warna bakteri, pada sampel A dapat dikelompokkan dalam bakteri gram negatif karena menunjukkan warna merah muda ketika diamati di bawah mikroskop. 4. Dari hasil pengamatan warna bakteri, pada sampel B dapat dikelompokkan dalam bakteri gram positif karena menunjukkan warna ungu ketika diamati di bawah mikroskop.