Apresentação Tese 14.08.18 -final.pdf

UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA MARIA CENTRO DE CIÊNCIAS NATUARAIS E EXATAS PROGRAMA DE PÓS GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS – BIOQUÍMICA TOXICOLÓGICA LABORATÓRIO DE BIOGENÔMICA

ESTUDO TRANSLACIONAL DO EFEITO PROTETOR DO GUARANÁ (Paullinia cupana) NA EXPOSIÇÃO AO METILMERCÚRIO Thaís Doeler Algarve Orientadora: Ivana Beatrice Mânica Da Cruz Co-orientador: Toshiro Aigaki

INTRODUÇÃO o O desenvolvimento biológico é sensível às variáveis ambientais o Nutrição o Estresse o Drogas o Poluentes ambientais

Mercury

(CLARKSON, 1997; RICE & BARONE, 2000)

2

INTRODUÇÃO o 5 fases de desenvolvimento o Embrionária o Fetal o Infância o Fase reprodutiva o Senescência

(WHO, 2017; GRANDJEAN & LANDRIGAN, 2006)

3

INTRODUÇÃO o Complexidade no desenvolvimento do cérebro humano o Muito susceptível a interferências ambientais comparado ao cérebro maduro ou qualquer outro órgão.

o Placenta à não é eficiente contra poluentes ambientais o A concentração de Hg no cordão umbilical pode ser substancialmente maior que a do sangue da mãe

o Formação da barreira hematoencefálica o Até os 6 meses de idade (GRANDJEAN & LANDRIGAN, 2006)

4

INTRODUÇÃO

oDentre os 10 produtos químicos de maior risco à saúde humana, a OMS destaca os elementos As, Cd, Pb e Hg. o Sabe-se que as crianças à muito mais suscetíveis a poluentes ambientais, o Enzimas de desintoxicação são menos competentes • Alterações na estrutura da cromatina ou do DNA • MODIFICAÇÕES EPIGENÉTICAS • MUTAÇÕES

(WHO, 2010, 2011; BITTO et al., 2014)

5

INTRODUÇÃO o Em idosos o Pb – doença renal, acidente vascular cerebral e uso de psicofármacos o Cd – Aterosclerose o Hg – uso de psicofármacos

o Conflitos éticos em avaliar efeitos epigenéticos em populações o Uso de modelos animais (RAMBOUSKOVÁ et al., 2014)

6

INTRODUÇÃO o Metais “pesados” como o mercúrio (Hg) são conhecidos por sua ação tóxica no organismo o Metálico, Inorgânico e Orgânico o MeHg é o mais neurotóxico o Cérebro é o órgão mais suscetível Metilação

Oxidação

Hg+1

Hg0 Redução

ou

Hg+2

HgCH3 Desmetilação

oMeHg durante a gestação e o início da infância o Desordens, disfunções sistêmicas e neurais. (CLARKSON, 1997; RICE & BARONE, 2000)

7

INTRODUÇÃO o Fontes o Naturais o Vulcões o Solos ricos o Incêndios o Antropogênicas o Termoelétricas o Queimadas o Aterros sanitários o Uso e descarte irregulares (garimpo)

o Embora naturalmente presente no meio-ambiente, a queima de carvão (termoelétricas, queimadas) elevaram muito sua presença no ecossistema. (PSU ECOMERGE, 2015; FARELLA et al., 2006; WHO, 2007; ROULET et al., 1998, 1999, 2000a, 2000b)

8

INTRODUÇÃO

oEm 1953 a 1968, em Minamata – Japão o Doença de Minamata o 50.000 pessoas expostas o 2.000 casos confirmados • lesão cerebral, paralisia, fala incompreensível e delírios • PARESTESIA DISTAL ATÉ 30 ANOS APÓS O FIM DA EXPOSIÇÃO (EKINO et al., 2007; TAKIZAWA, 2009)

9

INTRODUÇÃO o Japão o Iraque o Guatemala o Paquistão

Graves sintomas, muitas vezes fatais Surtos de contaminação via dejetos industriais e grãos contaminados por fungicidas

Farinha contaminada (pão)

Déficit cognitivo, entre outros Alimentação à base de peixe Crianças sem sinais de intoxicação com níveis elevados de exposição

Grão cobertos com fungicida a base de Hg

o Ilhas Faroé o Nova Zelândia

o Republica das Seicheles o Amazônia - Brasil

(EKINO et al., 2007; RUSTAM; HAMDI, 1974; ORDÓÑEZ et al., 1966; SKERFVING; COPPLESTONE, 1976; GRANDJEAN et al., 2010; AXELRAD et al., 2007)

10

INTRODUÇÃO

o tipo de mercúrio envolvido;

a dose;

Efeitos variam com

a idade ou estágio de desenvolvimento da pessoa exposta (o feto é mais suscetível); a duração da exposição;

a via de exposição (inalação, ingestão ou contato dérmico).

(WHO, 2017)

11

INTRODUÇÃO

Estresso oxidativo Interação com macromoléculas Inflamação Genotóxicos e epigenéticos

(SPILLER, 2018; GROTTO et al., 2011; OULHOTE et al., 2017; ALGARVE et al., 2013; KHAN et al., 2017)

12

INTRODUÇÃO o Hipótese da “pandemia de toxicidade no desenvolvimento” o Poluentes amplamente disseminados no ambiente o Fase de desenvolvimento neurológico é muito sensível o Manifestações neurofisiológicas e neurocomportamentais em crianças o QI reduzido, déficits de memória, de atenção, na linguagem e nas habilidades motora fina e visual-espacial

o Importância em estudar formas de proteger o neurodesenvolvimento infantil (GRANDJEAN & LANDRIGAN, 2014; EPA, 2018 )

13

INTRODUÇÃO O que pode estar protegendo essas crianças?

(NATIONAL INSTITUTE FOR MINAMATA DISEASE, 1986; BOISCHIO; BARBOSA, 1993)

14

INTRODUÇÃO o Paradoxo da dieta amazônica o Altos consumidores de frutas (> 10 frutas/semana) o laranjas (Citrus sp.), jambo (Eugenia sp.) e bananas (Musa paradisiaca) • Menores concentrações de Hg no sangue e cabelo

o Açaí (Euterpe oleracea) o Proteger a retina em ratos expostos ao MeHg • Efeito antioxidante

o Óleo de peixe o Protege o cérebro, rim, fígado e coração • Efeito antiinflamatório (HACON et al., 2008; BOISCHIO; BARBOSA, 1993; PASSOS et al., 2007; BRASIL et al., 2017; GROTTO et al., 2011)

15

INTRODUÇÃO

o Idoso da Amazônica e exposição ao MeHg o Há poucas pesquisas com idosos amazônicos e intoxicação pelo Hg, apesar de cronicamente expostos o Em uma população com idade entre 40-87 anos • Se reduz chances de catarata induzida por altos níveis de Hg

o Em uma população com idade entre 15-87 anos • Se à melhor desempenho locomotor em altas concentrações de Hg

o No município de Maués, AM o Alto consumo de peixe (1-2x ao dia) o Alto nível de longevidade o Boa aptidão funcional, equilíbrio e motora o Baixa incidência de DCNT associado ao guaraná (LEMIRE et al., 2010, 2011; COSTA KREWER et al., 2011; ANTONINI et al. 2016; RIBEIRO et al., 2013; MAIA-RIBEIRO et al., 2013)

16

INTRODUÇÃO

MANÁUS

Maués

PA

AM

(BARBIERI & GARDON, 2009)

MT 17

INTRODUÇÃO

Maués

(SANTOS, 2002)

18

INTRODUÇÃO

o Guaraná tem cerca de 2 to 7,5% de cafeína o 4x mais cafeína que o café

o Cafeínaà efeito protetor contra o MeHg o Ratos o Drosophila melanogaster o Neurônios (SH-SY5Y) o Elevação de enzimas detoxicantes (CYP) e aumenta a produção de GSH o Redução da excitotoxicidade o Antioxidante

(BJÖRKLUND et al., 2007; ENGIN et al., 2017; RAND et al., 2012; SMITH & ATROCH, 2007)

19

INTRODUÇÃO o Guaraná é habitualmente consumido pelos ribeirinhos o Antioxidante; o Antitumor; o Antissenescência; o Hipolipemiante; o Anti-inflamatório; o Antifadiga; o Melhora da performance cognitiva. o Protege contra os efeitos tóxicos o Cd à ratos o Paraquat à cultura de células o Hg à em C. elegans (BITTENCOURT et al. 2013; CADONÁ et al. 2016, 2017; MACHADO et al. 2015; SULEIMAN et al. 2016; KREWER et al. 2014; de OLIVEIRA et al. 2011; LEITE et al. 2011, 2013; BONADIMAN et al. 2017; ARANTES et al. 2016)

20

INTRODUÇÃO o Linhagem celular de neuroblastoma humano SH-SY5Y

o Muito utilizada para testar a neurotoxicidade de metais pesados in vitro o Comparáveis aos neurônios com relação às suas propriedades morfológicas, neuroquímicas e eletrofisiológicas

(FENG et al., 2016; ISHIHARA et al., 2016; JEBBETT et al., 2013; OHKUBO; MIYAMOTO; SHIRAISHI, 2016; TOIMELA; TÄHTI, 2004; UNOKI et al., 2016; ATCC, 2018)

21

INTRODUÇÃO

GENES DO DESENVOLVIMENTO HUMANO

Genes de segmentação e homeóticos são evolutivamente conservados entre Drosophila e mamíferos (PANDEY; NICHOLS, 2011)

22

INTRODUÇÃO Período imaginal

Período Pré-imaginal Metamorfose ao corpo adulto desenvolve-se a partir de célulastronco (Discos Imaginais)

1º Estágio

2º Estágio (MORATA, 1993; REGULSKI et al., 1987; ALBERTS et al, 2002)

3º Estágio

23

INTRODUÇÃO o Drosophila melanogaster

Núcleo Mosca Adulta

Ovo fertilizado (corte transversal)

o Modelo sensíveis e rápido o Utilizado para avaliar neurotoxicidade e parâmetros comportamentais e funcionais, como o sono e a locomoção o Processos celulares fundamentais e mecanismo de desenvolvimento conservados • Aproximadamente 75% dos genes humanos relacionados a doenças têm homologia funcional com a mosca

Metamorfose

Gema Núcleo

60

Pupa Minutos* Dias*

Estágios 3-4

120 180

Horas*

Larva

Blastoderma sincicial

0

9

Gastrulação

10

Embrião

24 Estágio 13

3º estágio

Eclosão

2º estágio 1º estágio

(RAND, 2010; PANDEY; NICHOLS, 2011)

Clivagem

Tempo após a fertilização*

* Incubando à 25°C 24

OBJETIVOS o Objetivos Gerais o Realizar ou estudo translacional determinando o efeito da exposição ao MeHg no ritmo circadiano da mosca-das-frutas D. melanogaster e o efeito neuroprotetor do guaraná tanto nas alterações comportamentais e neurotóxicas induzidas pela exposição ao MeHg nas moscas-das-frutas e em células de neurais SH-SY5Y. Ainda, realizar um estudo transversal para avaliar se o consumo de guaraná estaria protegendo uma população idosa ribeirinha amazônica.

25

OBJETIVOS o Objetivos Específicos o Avaliar o efeito da exposição preimaginal de D. melanogaster ao MeHg através da ocorrência de distúrbios neuromusculares e no sono-vigília presentes na progênie de D. melanogaster obtida pela exposição parental ou preimaginal ao MeHg; o Analisar o efeito protetor do guaraná na neuro-oxi-inflamação de células neurais SH-SY5Y e na toxicidade neurogênica (distúrbios neuromusculares e no padrão sono-vigília) de D. melanogaster; o Analisar o potencial efeito protetor do guaraná contra o Hg e a relação com o Se na sobrevivência, neurotoxicidade motora e parâmetros gerais de saúde em idosos ribeirinhos amazonenses com e sem consumo habitual de guaraná. 26

RESULTADOS DRUG AND CHEMICAL TOXICOLOGY https://doi.org/10.1080/01480545.2018.1485689

RESEARCH ARTICLE

Parental and preimaginal exposure to methylmercury disrupts locomotor activity and circadian rhythm of adult Drosophila melanogaster Tha!ıs Doeler Algarvea,b,c , Charles Elias Assmanna,b Ivana Beatrice M^anica da Cruza,b

, Toshiro Aigakic

and

a

Graduate Program in Biological Sciences: Toxicological Biochemistry, Federal University of Santa Maria, Santa Maria, Brazil; bDepartment of Morphology, Laboratory of Biogenomics, Federal University of Santa Maria, Santa Maria, Brazil; cDepartment of Biological Sciences, Cellular Genetics Laboratory, Tokyo Metropolitan University, Tokyo, Japan ABSTRACT

ARTICLE HISTORY

Methylmercury (MeHg) is a well-known toxic pollutant. However, little is known about the effects of this toxic agent in an adult as a consequence of a parental or preimaginal exposure. This study used Drosophila melanogaster to investigate whether a parental or a preimaginal (eggs–larvae–pupae stages) exposure could impact parameters as viability, locomotor activity, and sleep patterns of

Received 28 February 2018 Revised 17 May 2018 Accepted 30 May 2018 KEYWORDS

27

ARTIGO 1 Exposição Parental

10

10 10

Moscas adultas coletadas e transferidas para um novo meio saudável

Moscas descartadas 10

Moscas adultas expostas 24h em meio com MeHg [0, 3, 6, 9 e 12µM]

Moscas transferidas para um meio saudável (sem tratamento) para ovipositar

Ovos (até moscas eclodirem) em meio saudável

Meio saudável

Exposição Preimaginal

Moscas descartadas

10

Moscas adultas coletadas e transferidas para um novo meio saudável

10

Moscas adultas ovipositando por 24h em meio com MeHg [0, 3, 6, 9 e 12µM]

Ovos (até moscas eclodirem) em meio com MeHg [0, 3, 6, 9 e 12µM]

Figure 1. General scheme of the parental and preimaginal treatment protocol. All treatments received 0.09% DMSO and used a corn-meal medium. MeHg treatment range from 0-12 µM. Drosophila melanogaster was used here as an experimental model.

Meio saudável

Parental and preimaginal exposure to methylmercury disrupts locomotor activity and circadian rhythm of adult Drosophila melanogaster. Algarve et al., 2018. 28

RESULTADOS E DISCUSSÃO – ARTIGO 1

A

B

C

D

Figure 2. Egg-adult viability and egg production in parental and preimaginal exposure to MeHg. (A) Egg-adult viability in 24 h of parental exposure model. MeHg significantly decreased the viability of flies from 9µM onward when parents were previously exposed to this toxicant during 24 h before laying eggs. (B) Egg-viability in MeHg preimaginal exposure. MeHg has a significant impact on viability from 6 µM onward. (C) Total egg production in parental MeHg exposure and (D) Total egg production in preimaginal exposure. Results showed that no difference was found compared to the control group in each treatment. Different letters indicate significant differences (p ≤ 0.05) by one-way analysis of variance followed by Tukey’s post hoc test. Data are presented as mean ± SEM.

29

RESULTADOS E DISCUSSÃO – ARTIGO 1 M e H g P a re n ta l E x p o s u re 100

C lim b i n g p e r c e n t il e d is t r ib u t io n

5 25

80

50 75 95

60

40

20

0

A

0

B

3

6

9

12

M e H g (µ M )

M e H g P a re n ta l E x p o s u re 100

M e H g P r e im a g in a l e x p o s u r e

40

95

60

40

2 02 0

0 0

0

3 0

6 3

6 M e H g (µ M ) M e H g (µ M )

9

12

9

12

C lim b in g d is t r ib u t io n ( % )

50

60

C

( > 5 cm )

25

75

40

P r e im a g in a l E x p o s u r e

( > 6 cm )

5

80 C lim b i n g p e r c e n t il e d is t r ib u t io n

C lim b i n g p e r c e n t il e d is t r ib u t io n

80

P a re n ta l E x p o s u re

a

a b

30

c

c

b

b

d

20

c 10

d

0 0

D

3

6

9

12

M e H g (µ M )

0

3

6

9

Figure 3. Climbing ability assay of flies from parental and preimaginal exposure. (A) Climbing scheme. Flies were placed into a vertical vial (70 x 10 mm), 5 flies per well, 40 per treatment and repetition. Flies were simultaneously dropped and, 5 s after this, a picture was taken. (B) Climbing percentile distribution in parental exposure showed a doseresponse decrease in the 75th percentile. (C) Climbing percentile distribution in preimaginal exposure showed a dose-response decrease in the 50th percentile (median value). (D) Parental and preimaginal climbing ability response. Parental exposed flies are represented as the 75th percentile (flies that were able to climb ≥ 6 cm) while preimaginal exposed flies are shown as the 50th percentile (flies that were able to climb ≥ 5cm, the median value). MeHg was able to significantly decrease the climbing performance when flies were parentally-exposed and, also, significantly reduced the locomotor activity of flies exposed in the preimaginal period. Different letters indicate significant differences (p ≤ 0.05) by Kruskal Wallis analysis followed by Qui-square test and percentile distribution. Data are presented as median values or percentiles.

12

M e H g (µ M )

30

Control

30

3 µM

Sleep (min / 30min)

Sleep (min / 30min)

RESULTADOS E DISCUSSÃO – ARTIGO 1 25 20 15 10

25 20 15

5

0 0

12

24

36

48

60

72

0

C

0

12

24

Control

30

6 µM

25 20 15

0 Time (hr)

48

60

72

D

Control

12 µM

15

5

36

72

20

5 24

60

25

10

12

48

30

10

0

36 Time (hr)

Sleep (min / 30min)

Sleep (min / 30min)

Time (hr)

B

9 µM

10

5

A

Control

30

0 0

12

24

36

48

60

72

Time (hr)

Figure 4. Circadian rhythm in preimaginal exposed flies to MeHg. Sleep pattern during 72h has statistically changed by MeHg exposure. (A) 3 µM (B) 6 µM (C) 9 µM and (D) 12 µM. White and black bars above the horizontal axis indicate light and dark cycles, respectively. Considering the whole 72h data analysis, at 6 and 9 µM was observed a significant increase in sleep time compared to the control group (p < 0.0001). When divided into day periods, the nighttime period (black bars) from 6 µM onward (p < 0.0001) was shown a significant increase in sleep time compared to the control. Statistical analysis was performed by Friedman test followed by Dunn’s post hoc test. Data are presented as mean ± SEM.

31

Average of 3 days

RESULTADOS E DISCUSSÃO – ARTIGO 1

35

30

Sleep (min/30 min)

25

20

15

10

5

24

23

22

21

20

19

18

17

16

15

14

13

12

11

10

9

8

7

6

5

4

3

2

1

0

0

B

C

Time (h) Control

A

3 µM

6 µM

9 µM

12 µM

Figure 5. Daily circadian rhythm, 3 days average analysis from flies exposed to MeHg in the preimaginal period. (A) Sleep behavior 3 days average. Boxes represented areas with a clear difference between treatments and control group. (B) Sleep mean time from 2 to 7h showed a significant decrease in sleep time compared to the control group. (C) Sleep mean time from 18.5 to 24h showed a significant increase in sleep time compared to control group. Asterisks indicate significant differences (p ≤ 0.05) compared to the control group by two-way analysis of variance followed by Tukey’s post hoc test. Data are presented as mean ± SEM. *p ≤ 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001.

B

C 32

Both results deserve to be discussed more in depth. 2 mg/kg RESULTADOS E DISCUSSÃO –and ARTIGO 1 effects (WHO Table 1. Comparison of nighttime sleep time/30 minutes of Drosophila reared that exposur in the preimaginal period at different MeHg concentrations. present in fo MeHg (mM) et al. 2001, Statistics Control 3 6 9 12 Therefore, hu Nighttime 22! above Mean ± SE 17.70 ± 0.68 18.49 ± 0.77 20.13 ± 0.76 20.94 ± 0.59 19.97 ± 0.62 0.7 –0.927 mg. 19.75a 20.95b 20.89b 19.70b Median 18.11a Minimum 6.000 5.500 5.969 12.22 6.125 (nothing else Maximum 27.31 27.69 29.69 29.78 28.72 larly exposed Lower 95% CI 16.34 16.94 18.61 19.77 18.74 ingestion of Upper 95% CI 19.06 20.03 21.64 22.12 21.20 25% Percentile 13.02 12.69 13.79 16.70 16.45 Castro et al. 75% Percentile 23.20 24.64 25.55 25.45 24.00 mentioned a SE: standard error; CI: confidence interval. Different letters indicate significant differences (p # 0.05) by Friedman test toxic concen followed by Dunn's post hoc test. cies, some c 33

RESULTADOS E DISCUSSÃO – ARTIGO 1

A

B

Figure 6. Uninterrupted activity for 30 minutes (UA30) and uninterrupted sleep for 30 minutes (US30) of flies exposed in the preimaginal period to MeHg. (A) UA30 in preimaginal exposure to MeHg significantly decreased compared to MeHg and the impact of MeHg was more intense during the nighttime. (B) US30 decreased in the daytime and increased in the nighttime period from 6 to 12 µM. Different letters indicate significant differences (p ≤ 0.05) by one-way analysis of variance followed by Tukey’s post hoc test. Data are presented as mean ± SEM. 34

0

12

0

12

0 ZT (h)

0

3 µM B

Control

0 30 20 10 0

0

0

12

0 ZT (h)

40 20

20 10

40

0 30 20 10

G 12

0

12

0

12

0

12

0 ZT (h)

0

12

0

12

0 ZT (h)

0

12

0

12

0 ZT (h)

0

6 µM

40

30 20 10

20 0 60 40 20

0

0

12

0

12

0 ZT (h)

H

0

30

60

20

40

10 0 30 20

20 0 60 40 20

I

0

12

0

12

0

0 ZT (h)

12 µM

10 0

0 ZT (h)

40

0 ZT (h)

10 0

20

12

0

60

30

0

60

20

10 0

12

20

30

20

0

20

0

0

E

0

Actogramas da Atividade

60

60

30

0 ZT (h)

20

F

9 µM

6 µM 9 µM

12

10

D

12

40

30

0

C

0

0

3 µM

Control

20 10

A

12

60

30

12 µM

Actogramas do Sono

RESULTADOS E DISCUSSÃO – ARTIGO 1

60 40 20 0 60 40 20

Supplemental material 1. Actograms of 72h sleep and activity data from 32 flies developed with or without MeHg medium (012 µM), showing the sleep disruption along the days and the decrease of activity caused by MeHg exposure (A-E) Sleep actograms and (F-J) activity actograms. (A and F) Control; (B and G) 3 µM; (C and H) 6 µM; (D and I) 9 µM and (E and J) 12 µM. White and black bars above the horizontal axis indicate light and dark cycles, respectively. Sleep data are represented as time (min/30 min), and activity data are represented as activity counts/30 min. Data are presented as mean values.

0

J

35

ARTIGO 2

Thaís Doeler Algarve, Charles Elias Assmann, Francine Carla Cadoná, Alencar Kolinski Machado, Maria Fernanda Manica-Cattani, Yukiko Sato-Miyata, Tsunaki Asano, Marta Maria Medeiros Frescura Duarte, Euler Esteves Ribeiro, Toshiro Aigaki, Ivana Beatrice Mânica da Cruz

36

ARTIGO 2

10 ♂ 10 ♀

10

Moscas descartadas

10 10

Troca de meio em até 24h após eclosão

10

Moscas adultas expostas 24h em meio padrão com 9µM MeHg e Guaraná (0, 1, 5, 10 e 20mg/mL)*

Moscas ovipositando 8h em novo meio com 9µM MeHg e Guaraná (0, 1, 5, 10 e 20mg/mL)*

*Todos os tratamentos com 0,09% de DMSO, inclusive o controle.

Ovos até o nascimento

Moscas adultas para as avaliações, mantidas em meio padrão, sem tratamento Avaliação da viabilidade, atividade locomotora e circadiana

37

ARTIGO 2 Meio DMEM/F12 10% soro fetal bovino 1% penicilina/estreptomicina

37 ºC Umedecida 5 % CO2 e 95% de O2

Células SH-SY5Y

Expostas 72h

MeHg e/ou Guaraná

Avaliações de viabilidade, formação de colônias, citocinas inflamatórias, ... 38

RESULTADOS E DISCUSSÃO – ARTIGO 2

a

b

Fig. 1 Egg-adult viability of Drosophila melanogaster treated with different guarana concentrations and MeHg. (a) Viability of flies developed in cultures supplemented with guarana at different concentrations (020 mg/mL); (b) Viability of flies developed in cultures supplemented with guarana at different concentrations (1-20 mg/mL) plus 9 µM MeHg. Different letters indicated significant differences (p ≤ 0.05) by one-way analysis of variance followed by Tukey’s post hoc test. Data are presented as mean ± SEM.

39

RESULTADOS E DISCUSSÃO – ARTIGO 2

a

c

b

Fig. 2 Climbing assay of flies developed in medium with MeHg (9 µM) plus guarana concentrations (1-20 mg/mL). (a) Female percentile distribution of climbing height values. (b) Male percentile distribution of climbing height values. (c) Frequency (%) comparison of fruit flies that climbed > 50 mm among different treatments. Different letters indicated significant differences (p ≤ 0.05) by Chi-square statistical analysis. 40

Control

30 25

20 Fig. 3 Circadian rhythm of flies developed in 9 µM MeHg, guarana (1-20 15 mg/mL) and 9 µM MeHg plus guarana, under 12h light/dark cycles. White 10 Boxes - light cycle; Grey boxes – dark cycle; Control group in black and 5 treatments in red lines. Statistical analysis was performed by Friedman test followed by Dunn’s post hoc test. Data are presented as mean0 ±0 SEM. 12 24

15

9 µM de MeHg

10 5

36

0

48

0

12

60

24

72

10

20 15 10

5 0 0

12

24

20 15 10

60

24

Control

72 Gua10

20 15 10

0

12

24

0

48

12

20 15 10 5 0 0

12

24

36

60

24

Control

72

0

Gua20

25 20 15 10

12

60

24

Control

72 Gua10

20 15 10

36

10

0 0

48

12

60

24

72

12

36 Time (h)

60

24

Control

72 Gua20

12

60 Control

24

72

36

48

HgGua10 Time (h)

60 Control

30

72 HgGua10

25

9 µM de MeHg + Gua 10 mg/mL

20 15 10

0

36

0

48

12

Time (h)

60 Control

30

20 15 10

0

48

Time (h)

25

0 0

48

Time (h) 30

5

9 µM de MeHg + Gua 1 mg/mL

15

5

0

5

Time (h)

48

25

36

HgGua1

5

Time (h)30

Sleep (min / 30min)

Sleep (min / 30min)

25

10

Control

20

0

Time (h) 30

30

15

HgGua1

25

5

0

36

20

36

5

0

Sleep (min / 30min)

12

25

5

Gua 20 mg/mL

48

Sleep (min / 30min)

25 Sleep (min / 30min)

Sleep (min / 30min)

Gua 10 mg/mL

0

Time (h) 30

30

25

0

0

36

72

30

5

5

60

Control

Gua1

Sleep (min / 30min)

15

25

Control

Sleep (min / 30min)

20

Sleep (min / 30min)

25

48

Time (h) 30

30

Sleep (min / 30min)

Sleep (min / 30min)

Gua 1 mg/mL

Gua1

36

Sleep (min / 30min)

Control

RESULTADOS

9µM MeHg

20

Time (h) 30

Control

25

Sleep (min / 30min)

Sleep (min / 30min)

9µM MeHg

30

24

72

36

48

HgGua20 Time (h)

60 Control

72 HgGua20

9 µM de MeHg + Gua 20 mg/mL

25 20 15 10 5

0

48

12

60

24

72

36 Time (h)

0 0

48

12

60

24

72

36 Time (h)

48

60

4172

RESULTADOS E DISCUSSÃO – ARTIGO 2

a

b

c

e

d

b

e

d

f

Fig. 4 Sleep behavior analysis of flies reared in guarana (1-20 mg/mL) and MeHg (9 µM) associated with guarana. US30 (a and b), UA30 (c and d) and total sleep time (e and f) show a guarana impact on sleep behavior and its effect on MeHg sleep disruption pattern. US30 (uninterrupted sleep for 30 min), UA30 (uninterrupted activity for 30 min). Different letters indicated significant differences (p ≤ 0.05) by one-way analysis of variance followed by Tukey’s post hoc test. Data are presented as mean ± SEM.

42

RESULTADOS E DISCUSSÃO – ARTIGO 2

a

b

c

Fig. 5 Guarana cytoprotective effects on SH-SY5Y human neural cells culture exposed to MeHg and guarana for 72 h. (a) Effect of MeHg exposure at different concentrations (0.03-9 µM); (b) Effect of guarana exposure at different concentrations (50-1000 µg/mL); (c) Effect of MeHg (6 µM) exposure plus guarana (100 µg/mL); MTT: mitochondrial metabolic activity/cell viability. PG: cellular damage/mortality. Different letters indicate significant differences (p ≤ 0.05) by one-way or two-way analysis of variance followed by Tukey’s post hoc test. Data are presented as mean ± SEM. 43

RESULTADOS E DISCUSSÃO – ARTIGO 2 Control

MeHg

Fig. 6 Clonogenic assay performed in SHSY-5Y neural cells exposed to 3 µM MeHg, 100 µg/mL guarana and 3 µM MeHg plus 100 µg/mL guarana for 7 days. Different letters indicate significant differences (p ≤ 0.05) by one-way or two-way analysis of variance followed by Tukey’s post hoc test. Data are presented as mean ± SEM.

MeHg+Guarana

Guarana

Fig. 7 Cytokines levels of SHSY-5Y neural cells treated with 3 µM MeHg, 100 µg/mL guarana and 3 µM MeHg plus 100 µg/mL guarana for 72h. Interleukin-1 beta (IL-1β); interleukin-6 (IL-6); tumor necrosis factor alpha (TNFα); interferon gamma (IFNγ); interleukin-10 (IL10). Different letters indicate significant differences (p ≤ 0.05) by one-way or twoway analysis of variance followed by Tukey’s post hoc test. Data are presented as mean ± SEM. 44

RESULTADOS – ARTIGO 3 Plasmatic mercury levels of Amazonian Riparian Subjects and their potential association with health factors and survival in 8 -years follow-up Thaís Doeler Algarve, Charles Elias Assmann, Euler Esteves Ribeiro, Ednea Aguiar Maia-Ribeiro, Rafael Noal Moresco, Verônica Farina Azzolin, Suziani da Cruz, Fábio Andrei Duarte, Paula Dalla Vechia, Toshiro Aigaki, Ivana Beatrice Mânica da Cruz

o Coleta de sangue Maués

o Entrevista estruturada o Indicadores de saúde

PA

AM

MT

homem mulher Total

Frequência Percentual 248 45,9 292 54,1 540 100

Idade

Média 72,30

SD 7,866

Homem Mulher

Idade Média 72,90 71,79

SD 7,442 8,184 45

RESULTADOS E DISCUSSÃO – ARTIGO 3 Table 1. Descriptive statistic of Hg, Se and Se/Hg ratio Média Hg (µg/g) 0.011 Se (µg/g) 0.150 Se/Hg 14627

Desvio Padrão Mínimo Máximo 0.002 0.006 0.015 0.014 0.128 0.194 3045 8.80 22.67

25º 0.010 0.141 12250

Percentis 50º (Mediana) 75º 0.011 0.012 0.147 0.159 13846 17111

Table 2. Logistic regression to determine the influence of biological and health indicator factors in the association between higher levels of Hg, Se and 8-year riverine elderly mortality. Relacionado ao Hg Idade Sexo TBARS AOPP NOx HAS DCV Colesterol Constante Relacionado ao Se Idade Sexo TBARS AOPP NOx HAS DCV Colesterol Constante

Wald

Risco

95% I.C. do Risco

p

78.896 29.053 0.844 0.144 3.999 4.081 0.019 2.590 6.696

211.321 0.037 1.020 0.997 0.980 0.467 1.098 1.006 0.084

64.851-688.610 0.011-0.123 0.977-1.065 0.980-1.014 0.960-0.999 0.223-0.977 0.292-4.136 0.999-1.013

< 0.0001 < 0.0001 0.358 0.705 0.045 0.043 0.890 0.107 0.010

0.233 52.725 7.124 2.698 5.907 7.053 0.859 0.016 3.865

1.131 0.165 0.967 1.008 0.987 1.862 0.647 1.0003 3.167

0.686-1.867 0.102-0.269 0.942-0.991 0.998-1.018 0.977-0.997 1.177-2.945 0.257-1.625 0.996-1.005

0.629 < 0.0001 0.008 0.100 0.015 0.008 0.354 0.899 0.049

TBARS (lipídeos oxidados); AOPP (proteínas oxidadas); NOx (óxido nítrico); HAS (hipertensão arterial sistêmica); DCV (doença cardiovascular). 46

RESULTADOS E DISCUSSÃO – ARTIGO 3 Healthy Elderlies

Elderlies with some diagnosed diseases

Figure 2. General model to understand the effects of Hg and Se in health maintenance and they level in elderly with a diagnosed disease. Data are presented as mean +/- SD. Significant differences (p < 0.05) by two-way Anova followed by Bonferoni post hoc test.

47

RESULTADOS E DISCUSSÃO – ARTIGO 3 Disease prevalence

Figure 3. General model to understand the effects of Hg, Se and Se/Hg ratio in the prevalence of metabolic diseases. Healthy individuals were considered as control. Metabolic Syndrome (MS); Systemic Arterial Hypertension (SAH); Type 2 Diabetes mellitus (T2DM); Cardiovascular Disease (CVD). Data are presented as percentages. Significant differences (p < 0.05) by Kruskal-Wallis analysis followed by chi-square test. 48

RESULTADOS E DISCUSSÃO – ARTIGO 3

A

B

C Figure 4. Mortality percentage among elderly riverine and the consumption of guarana. (A) Hg (0.011 µg/g); (B) Se (0.147 µg/g); (C) Se/Hg ratio. Data are presented as percentage. Significant differences (p < 0.05) by Kruskal-Wallis analysis followed by chi-square test.

49

RESULTADOS E DISCUSSÃO – ARTIGO 3 Figure 5. Kaplan-Meier survival curves for mortality in riparian elderly by the influence of each marker at their 50th percentile. (A) Hg (0.011 µg.g-1), (B) Se (0.147 µg.g-1) and (C) Se/Hg (13.84 µg.g1).Dotted line: higher level, Full line: lower level. Significant differences (p < 0.05) by Kaplan-Meier survival analysis. p = 0,004

p = 0,363

A

B

p = 0,020

C

50

RESULTADOS E DISCUSSÃO – ARTIGO 3 p = 0.004

Control

A

Guarana

B

p = 0.359

Control

Figure 6. Kaplan-Meier survival curves for mortality in riparian elderly by the influence of different levels of Hg, Se and Se/Hg ratio, all at 50th percentile, and with and without the combination of the effect of guarana. (A an B) Hg (0.011 µg.g-1), (C and D) Se (0.147 µg.g-1) and (E and F) Se/Hg (13.84 µg.g-1). Control: no guarana intake; Guarana: habitual intake (5 or more days/week). Dotted line: higher level, Full line: lower level. Significant differences (p < 0.05) by Kaplan-Meier survival analysis.

Guarana

D

C

p = 0.019

Control

E

Guarana

F

51

RESULTADOS E DISCUSSÃO – ARTIGO 3 p = 0.852

Control

A

Guarana

B

Figure 7. Kaplan-Meier survival curves for mortality in riparian elderly by the influence of different levels of Se/Hg with and without the combination of the effect of guarana. (A) 25th percentile (12.25 µg.g-1), (B) 50th percentile (13.84 µg.g-1) and (C) 75th percentile (17.11 µg.g-1) and combined with the effect of guarana. Dotted line: higher level, Full line: lower level. Significant differences (p < 0.05) by Kaplan-Meier survival analysis.

p = 0.019

Control

C

Guarana

D p =0.002

Control

E

Guarana

F

52

RESULTADOS E DISCUSSÃO – ARTIGO 3 Table 3. Results of Spearman correlation between Hg, Se and Se/Hg biomarkers and motor tests outcomes. Spearman's rho

Guaraná razão Se/Hg (µg/L) sexo idade Grupo etário idoso Hg (µg/L) Se (µg/L) equilibrio unipodal direito equilibrio unipodal esquerdo agilidade e equilibrio dinamico (TUG) TUG 2 forca dos membros inferiores capacidade aerobica (marcha estacionaria) forca dos membros inferiores

Hg (µg/L) Coef. de Correl. -0.070 -0.836** 0.181** -0.571** -0.716** 1.000 0.345** -0.022

Se (µg/L)

0.105 0.000 0.000 0.000 0.000 . 0.000 0.661

Coef. de Correl. 0.214** 0.081 0.401** -0.373** -0.415** 0.345** 1.000 0.059

0.000 0.063 0.000 0.000 0.000 0.000 . 0.234

0.001

0.994

0.010

0.932

-0.049

0.692

0.086*

0.050

-0.007

0.882

-0.091*

0.039

0.088 0.001

0.228 0.986

0.125 0.032

0.085 0.472

-0.004 0.016

0.957 0.718

-0.020

0.665

-0.014

0.760

0.004

0.934

-0.037

p

0.416

0.065

(Continua ao lado)

p

Se/Hg ratio (µg/L) Coef. de p Correl. 0.034 0.426 1.000 . -0.007 0.866 0.355** 0.000 0.459** 0.000 -0.836** 0.000 0.081 0.063 0.060 0.225

0.155

0.068

0.134

Spearman's rho

posição sentada p/de pé posiconar alternadamente no degrau permanecer em pé com um pé na frente permanecer em pé sobre um pé Circunf. braço reto Circunf. braço contraído Circunferência cintura Circunferência quadril Rel. cintura/quadril Gordura subcutanea (escapular/triceps) Circunferência coxa Circunferência panturrilha

Hg (µg/L) p

Se (µg/L)

Se/Hg ratio (µg/L) Coef. de p Coef. de p Correl. Correl. -0.042 0.338 0.063 0.151

Coef. de Correl. -0.085

0.052

0.097*

0.029

0.003

0.943

-0.086

0.051

0.026

0.547

0.044

0.312

0.022

0.618

0.053

0.228

0.080

0.070

-0.049

0.263

-0.084 -0.092*

0.053 0.033

-0.007 -0.018

0.875 0.673

0.086* 0.099*

0.048 0.023

-0.106*

0.014

-0.037

0.395

0.100*

0.021

-0.080

0.066

0.015

0.737

0.080

0.065

-0.068 -0.045

0.115 0.304

-0.064 -0.039

0.139 0.370

0.064 0.033

0.137 0.448

-0.096* -0.103*

0.027 0.017

0.014 -0.020

0.739 0.642

0.116** 0.112**

0.007 0.010

** Correlação é significativa no nível 0,01 (bicaudal); * Correlação é significativa no nível 0,05 (bicaudal). 0.000 = < 0.0001

53

DISCUSSÃO

o Consumo de atum ou outro peixe cozido ou assado o Inversamente proporcional com a incidência de acidente vascular cerebral esquêmico

Atum é um peixe carnívoro, frequentemente associado a altos níveis de Hg do atum... Mas neste estudo, aparentemente não houve prejuízo à saúde...

(MOZAFFARIAN et al., 2005)

54

CONCLUSÕES o O MeHg afetou o desempenho locomotor na exposição parental e preimaginal e o ritmo circadiano na exposição preimaginal de Drosophila, além de ambos os protocolos afetarem a viabilidade. Estes resultados corroboram a hipótese da ocorrência de uma pandemia causada pela exposição ao MeHg associada a distúrbios do sono em seres humanos;

o O guaraná foi capaz de proteger do dano do MeHg no desempenho locomotor, o ritmo circadiano e a viabilidade quando Drosophila foram expostas durante todo o desenvolvimento (desde o período parental até o fim do preimaginal). Estes resultados corroboram a hipótese de que os efeitos tóxicos causados pela exposição ao MeHg poderiam ser atenuados pela dieta amazônica;

55

CONCLUSÕES

o Em cultura de células neurais SH-SH5Y, o guaraná foi capaz de atenuar os efeitos do MeHg na citotoxicidade e resposta inflamatória (aumento da IL-1b, IL6, TNFa, IFNg e redução da IL-10). O conjunto destes resultados sugerem que o mecanismo causal relacionado ao efeito protetor do guaraná a exposição ao MeHg envolve ação antioxidante e anti-inflamatória nas células neurais. Aumento da chance de risco em idosos relacionado com hipertensão e os níveis de Hg;

o Em idosos ribeirinhos, o risco associado a níveis elevados de Hg plasmático é reduzido em mulheres e em idosos que consomem guaraná, mas elevado com a idade e com a presença de alguma doença associada (voluntário não saudável);

56

CONCLUSÕES

o Risco de ter Hg plasmático elevado é maior em homens que não consomem guaraná, independente da idade e doença associada (voluntário não saudável). Ainda, quanto maiores os níveis de Se, maiores as chances de risco quando o Hg está baixo;

o O guaraná reduziu o risco do Hg independentemente da idade e de ter alguma doença associada, levando em consideração o sexo, níveis de óxido nítrico e AOPP.

57

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58

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AGRADECIMENTOS

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Obrigada pela atenção!

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