Microbiologi

70

OBIECTIV ȘI ISTORIE DEFINITIA MICROBIOLOGIEI MICROBIOLOGIA (micros-mic, bios-viata, logos-vorbire) este stiinta care studiaza forma, structura (morfologia), genetica, procesele metabolice din organismele microscopice si submicroscopice. Microbiologia este o stiinta relativ tanara, care prezinta interes nu numai stiintific, ci si practic, pentru diferite domenii ale activitatii umane: medicina, agricultura, alimentatia, biotehnologia, etc. Fiind ea insasi o stiinta ce s-a putut dezvolta ca urmare a dezvoltarii tehnice si tehnologice, microbiologia a luat amploare abia in ultimele decenii ale acestui secol. Acumularile teoretice si practice din domeniile fizicii nucleare, ale biologiei celulare si moleculare, ale tehnicilor informationale, au condus la imbunatatirea logisticii microbiologiei si, implicit, la dezvoltarea rapida a microbiologiei ca stiinta de mare amplitudine. In unele ramuri industriale, microbiologia formeaza cvasitotalitatea proceselor tehnologice. Se pot exemplifica astfel industriile fermentative si a antibioticelor, statiile de epurare a dejectiilor, s.a., domenii in care cunoasterea fiziologiei si a metabolismului microorganismelor permite dirijarea corecta a proceselor tehnologice in vederea obtinerii unor produse utile vietii si activitatii umane, de calitate superioara si cu randamente ridicate. Principalele ramuri subordonate ale microbiologiei, cu statut aparte si avand preocupari specifice, sunt: • bacteriologia - se ocupa cu studiul bacteriilor; • micologia - se ocupa cu studiul ciupercilor microscopice si macroscopice; • protozoologia - se ocupa cu studiul protozoarelor; • virologia - se ocupa cu studiul virusurilor; • parazitologia - se ocupa cu studiul parazitismului si organismelor parazite; • algologia - se ocupa cu studiul organismelor acvatice simple, numite alge. La aceste discipline microbiologice trebuie adaugate si domeniile aplicative ale microbiologiei: • imunologia - studiaza sistemul mecanismelor de aparare al organismelor, care • le protejeaza fata de o eventuala infectie si/sau de orice substanta straina care • patrunde in interiorul lor. • microbiologia sanatatii publice si epidemiologice - are ca scop monitorizarea si controlul raspandirii bolilor in comunitati; • microbiologia alimentelor si a apei - examineaza rolul pozitiv sau negativ al microorganismelor in alimente si apa; • microbiologia solului - studiaza interrelatia dintre microorganism, sol si plante, rolul microorganismelor in fertilitatea solului si in circuitul elementelor biogene in natura; • microbiologia agricola - studiaza relatia dintre microorganisme si recolte, in

70 scopul cresterii productiei si calitatii acestora; • microbiologia petrolului - studiaza rolul microorganismelor in geneza zacamintelor de petrol; • • microbiologia mediului - studiaza microorganismele prezente in sol, apa si aer, ocupandu-se de solutionarea problemelor practice din domeniul sanitar; • •biotehnologia - include orice proces prin care oamenii utilizeaza microorganisme sau procese biologice pentru obtinerea unui produs dorit; • microbiologia industriala - utilizeaza microorganisme pentru a produce cantitati mari de produsi utili ca: vitamine, aminoacizi, enzime, medicamente; • ingineria genetica - implica tehnici care in mod deliberat modifica fondul genetic al organismelor pentru a induce obtinerea de noi combinatii genice. Reprezinta cel mai dinamic domeniu al microbiologiei moderne. Microbiologia medicală umană și veterinară și a patologiei plantelor-relațiile microorganismelor patogene- organisme gazdă, supraviețuirea și condițiile transmiterii în natură, influența factorilor de mediu, mecanismele moleculare de acțiune împotriva lor și reacția gazdelor față de agresiune. Desprinderea microbiologiei în ramuri diferite: Microbiologia solului, Microbiologia acvatică, Geomicrobiologie, Microbiologia medicala – fiecare cu tehnici speciale, concepte și terminologii proprii-determină un caracter autonom al acestor domenii interconectate două tipuri de demersuri: 1. autecologic=relația dintr-un microorganism(individ) și gazda sa (mediul său); 2. sinecologic= relațiile dintre microorganisme (comunitate biologică) și un anumit mediu: Microbiologia mediului (Jannasch, 1984)-studiu integrat al relațiilor biologice dintr-un habitat comun și interacțiunile ce apar cu alte organisme și mediul înconjurător. În prezent microbiologia ecosistemelor naturale (sol, apă, aer) se extinde și asupra zonelor expuse activităților perturbatoare umane (agricultura intensă, poluarea apelor, etc).

      

Particularități ale domeniului: biodiversitate imensă imposibilitatea reproducerii în laborator caracterul interdisciplinar tehnici și aparatură explorarea unor medii extreme implicarea societății umane

Rolul microoganismelor în funcționarea ecosistemelor are o importanță esențială-3 nivele diferite 1. Activitate la nivel individual 2. Activitate la nivel de ecosistem 3. Activitate la nivel global

70

SCURTA ISTORIE A MICROBIOLOGIEI Istoria microbiologiei ar putea fi stucturata in patru etape, si anume: 1. Perioada de individualizare ipotetica a factorului determinant al bolilor, in special umane; 2. Etapa cunoasterii nemijlocite a microorganismelor; 3. Perioada de sintetizare si de corelare a cunostintelor stiintifice in domeniul microbiologiei; 4. Etapa contemporana, de interconectare a microbiologiei cu alte stiinte, in scopul ridicarii valorii sale socio-umane. Aspecte importante ale istoriei microbiologiei. Descoperirea instumentului optic numit microscop, a ervolutionat vasta si diversa lumea a microorganismelor fara de care nu ar fi putut fi cunoscuta. ANTONIE VAN LEEWENHOEK (1632-1723) este cel care a descoperit lumea invizibila a microorganismelor, fiind primul care le-a observat prin marire cu ajutorul microscopului simplu, cu o singura lentila, de constructie personala. Pe baza desenelor detaliate ale "animalculelor" (animale foarte mici, mobile) observate pe preparate provenind din diferite medii - apa de ploaie, tartrul dentar si apele din canalele de scurgere - acestea au fost ulterior identificate ca fiind reprezentanti ai bacteriilor,drojdiilor si protozoarelor. Astfel, Leewenhoek a atras atentia asupra microorganismelor, fara sa le acorde statutul unor organisme aparte. ROBERT HOOKE, in urma studiilor realizate la microscop, descoperea in 1665 celula, marcand astfel inceputul unei teorii celulare, consolidate ulterior de alti savanti. MATTHIAS SHLEIDEN si THEODOR SCHWANN, in urma cercetarilor, stabilesc clar teoria conform careia toate organismele, deci si microorganismele, sunt alcatuite din celule. Studiile ulterioare privind structura si functiile celulelor au avut la baza aceasta teorie celulara, constituind una din cele mai importante generalizari ale Biologiei. LAZZARO SPALLANZANI (1729-1799) cunoscand indeaproape microscopul, se ocupa de teoria " generatiei spontane", subiect controversat in acea vreme. Se credea cu toata convingerea ca "dintr-o substanta organica in descompunere se pot naste spontan organisme vii". Aceasta teorie era cunoscuta de pe vremea lui Aristotel si a fost admisa fara obiectii, deoarece asa sustinea marele Aristotel. In anul 1665, biologul florentin FRANCESCO REDI (1626 - 1697) lanseaza primele critici timide in legatura cu teoria anterior amintita, lansand aforismul "omne vivum a vivo" (tot ce e viu vine din ceva viu). Un secol mai tarziu (1765), Spallanzani aduce argumente si combate teoria lui Aristotel, care avea sa domine totusi pana in 1861, cand Louis Pasteur o inlatura definitv printr-o sintagma ramasa celebra: "si microbii trebuie sa aiba parinti". Epoca pasteuriana-responsabilă de demonstrarea faptului că mediul extern = sursa de microorganisme cu atribuții în:

70 a. Transformările fermentative ale substanțelor organice (microorganisme specifice și străine); b. Patologice-particularitățile biologice ale microorganismelor patogene și modificarea proprietăților esențiale (virulența, patogenitatea, mutațiile).Ex . - reducerea nitraților Schonbein 1868; - nitrificarea Schloesing&Mϋntz. LOUIS PASTEUR (1822 - 1895), chimist, biolog si imunolog francez, unul dintre intemeietorii stiintelor microbiologice, este cel care a infiintat primele laboratoare de cercetare, fiind considerat geniul microbiologiei. Pasteur a demonstrat ca fermentatiile, considerate anterior procese pur chimice, sunt procese biologice determinate de actiunea microorganismelor, in special anaerobe. El dovedeste ca fermentatia este "un act corelativ unui proces vital", o sursa de energie necesara dezvoltarii germenilor, si ca "o fermentatie determinata are fermentul sau determinant". Realizarea faptului ca drojdiile joaca un rol crucial in fermentatii a reprezentat primul concept care asocia activitatea unui microorganism cu modificarile fizico-chimice ale materiei organice. Extinzand cercetarile sale asupra fermentatiilor, a pus in evidenta natura infectioasa a unor boli ale vinului si ale berii. Pentru impiedicarea alterarii vinului si berii, Pasteur a imaginat procedeul incalzirii blande - pasteurizarea - aplicat ulterior si laptelui si utilizat ca procedeu de sterilizare si in domeniul medical. Au fost puse astfel bazele tehnicilor aseptice care constituie in prezent standardele de laborator. Pasteur stabileste principiul specificitatii microbiene, punand bazele teoriei bolilor infectioase si demonstrand ca acestea sunt rezultatul patrunderii in organism a unor agenti patogeni: intre activitatea unui agent patogen si particularitatile pe care le determina exista o anumita specificitate. Pasteur evidentiaza principiul vaccinarii si stabileste bazele stiintifice ale prepararii vaccinurilor. A demonstrat pentru prima data ca agentii patogeni, chiar cei mai periculosi, pot fi modificati pentru a fi folositi ca vaccinuri. El a numit vaccinuri culturile avirulente utilizate pentru inocularea preventiva ce stimuleaza imunitatea organismului fata de tulpina microbiana virulenta. Incununarea operei sale a fost descoperirea vaccinarii antirabice, aplicata pentru prima data la om in 1885. ROBERT KOCH (1843-1916), savant german contemporan cu Pasteur, a avut de asemenea un rol deosebit in dezvoltarea microbiologiei medicale, prin descoperirea unor numerosi agenti patologici raspunzatori de numeroase boli la om si animale, cum ar fi tuberculoza, holera etc. El a elaborat o serie importanta de tehnici de izolare, utilizand mediile de cultura solidificate (cu gelatina) pe care cresterea microorganismelor se face sub forma de colonii izolate. Cum o colonie microbiana reprezinta descendenta unei singure celule parentale, insamantarea ei ulterioara intr-un mediu steril genereaza o cultura de celule din aceeasi specie sau tulpina. Descoperirea acestei posibilitati de a obtine culturi pure a constituit un progres care a stat la baza Microbiologiei moderne, deoarece a oferit un mijloc simplu si sigur de izolare a bacteriilor, in vedera studierii biologiei lor, a identificarii si incadrarii lor sistematice. Koch a utilizat tehnici de colorare pentru preparatele microscopice (frotiuri) si in 1882 a identificat bacilul care-i poarta numele (B.K.),

70 agentul patogen al tuberculozei. In 1905, Koch este recompensat cu premiul Nobel pentru fiziologie si medicina. HANSEN (1842- 1909) deschide calea Microbiologiei industriale moderne, prin utilizarea culturilor pure de microorganisme ca starteri de fermentatie. I. MECINIKOV (1845-1946), lucrand la Institutul Pasteur din Paris, a evidentiat procesul de fagocitoza, demonstrand pentru prima data rolul leucocitelor din sange in reactiile de aparare ale organismului fata de agentii patogeni, prin inglobarea si distrugerea acestora. P. EHRICH (1854-1915) este creatorul teoriei moderne a dezinfectiei si chimioterapiei selective, sintetizand primele substante chimice active in terapia bolilor produse de spirochete si protozoare. Lucrarile sale au deschis calea spre era substantelor chimioterapice. S. WINOGRADSKI (1856-1953), intemeietorul Microbiologiei solului, a descris procesul de asimilare la organismele chimiosintetizante si fenomenul de fixare al azotului atmosferic de catre microorganisme. A elaborat metode speciale pentru cercetarea activitatii microorganismelor din sol. A. FLEMING (1881-1955) deschide prin lucrarile sale era antibioticelor, de o mare importanta in medicina si biologie. In 1929 el observa ca unele culturi ale mucegaiului Penicillium elaboreaza o substanta antimicrobiana specifica: penicilina. Acest prim antibiotic a fost mai tarziu purificat de Florey si Chain (1940), care au oferit terapeuticii infectioase un produs stabil, atoxic pentru om si animal, activ in vivo asupra unor specii de micoorganisme. WAKSMAN in 1944 descopera streptomicina, antibiotic elaborat de multe specii de actinomicete si deschide calea pentru obtinerea de noi antibiotice. TWORT si D'HERELLE (1915-1917) au avut un rol deosebit in evolutia conceptelor fundamentale de bacteriologie si virologie prin descoperirea bacterofagilor (virusuri care paraziteaza bacteriile) si a fenomenului de lizogenie. A. LWOFF a adus contributii deosebite la definirea virusurilor, dupa 1953. El a analizat relatia dintre fag si bacterie, precum si fenomenul de lizogenie sugerand interventia unui mecanism similar in patogenia cancerului. Este laureat al premiului Nobel pentru biologie. Agentii infectiosi subvirali au fost izolati in 1971 de DIENER, care a demonstrat ca moleculele de ARN nude, numite viroizi, pot determina efecte patogene la plante. PRUSINER, in 1981-1984, a demonstrat ca moleculele de proteine, numite prioni, pot fi infectioase pentru om si animale. In Romania, doi savanti de renume mondial, VICTOR BABES si IOAN CANTACUZINO au contribuit la fondarea Microbiologiei moderne. VICTOR BABES (1854-1926) a lucrat in laboratorul lui Pasteur, iar mai tarziu in laboratorul lui Koch. De formatie anatomo-patolog, si-a insusit tehnicile microbiologice si a orientat investigatia medicala spre studiul actiunii reciproce microorganism-gazda. A colaborat cu A.V. Cornil la primul Tratat de Bacteriologie din lume aparut la Paris in 1885. A descoperit noi specii microbiene, a pus in evidenta corpusculii Babes-Negri in celulele nervoase ale indivizilor morti de turbare si corpusculii Babes-Ernst in bacilii difterici. In cercetarile sale asupra antagonismului bacterian a anticipat descoperirea antibioticelor; a studiat

70 numeroase boli infectioase. Este creatorul Institutului "Victor Babes" din Bucuresti si organizatorul primelor laboratoare de igiena si bacteriologie. IOAN CANTACUZINO (1863-1936), format in laboratorul condus de Mecinikov la Institutul Pasteur din Paris, a continuat cercetarile maestrului sau privind imunitatea nevertebratelor. A studiat patogenia holerei, tuberculozei si a altor boli, vaccinul si vaccinarea antiholerica . A creat Scoala contemporana de microbiologie, initial in laboratorul de medicina experimentala al Facultatii de Medicina din Bucuresti, apoi in Institutul de Cercetari Microbiologice pe care l-a fondat in 1921. Opera acestor doi mari savanti romani a fost continuata de alti savanti de reputatie internationala: Constantin Levaditi, Dumitru Combiescu, Constantin Ionescu-Mihaiesti, Stefan Nicolau, Mihai Ciuca, Gheorghe Zarnea si altii. In perioada de dupa 1910, din totalul premiilor Nobel pentru medicina si fiziologie, peste o treime au fost acordate microbiologilor si specialistilor in discipline inrudite. Microbiologia continua sa progreseze in fiecare an cu ajutorul a noi tehnici si noi date furnizate de cercetare. Microorganismele sunt organisme unicelulare care cuprind după Robert Whittaker a un sistem de organizare format din cinci regnuri de baza: 1. Procaryotae (Monera); 2. Protista; 3. Fungi; 4. Plantae; 5. Animalia. Constituirea acestor regnuri se bazeaza pe: tipul si structura celulara, organizarea si tipul de nutritie. Regnul Procaryotae - include organisme unicelulare de tip procariot. El cuprinde bacteriile si are doua subgrupe principale: eubacterii - bacterii cu structura celulara procariota caracteristica si archaebacterii - bacterii cu structura celulara si functii atipice. Regnul Protista - contine cea mai mare parte a microorganismelor eucariote unicelulare care sunt lipsite de tesuturi. El cuprinde alge microscopice care se caracterizeaza prin celule fotosintetizante si protozoare care sunt lipsite de perete celular si se hranesc pe seama altor organisme prin ingestie. Regnul Fungi - cuprinde organisme uni- sau multicelulare si uni- sau multinucleate, de tip eucariot. Celulele eucariote prezinta perete celular, nu sunt fotosintetizante si isi dobandesc nutrientii prin absortie. El cupinde microfungi (mucagaiuri si drojdii) si macrofungi. Regnurile Plantae si Animalia nu includ microorganisme, fiind reprezentate de organisme macroscopice, multicelulare. Plantele sunt alcatuite din celule eucariote cu perete celular si sunt fotosintetizante. Celulele animalelor sunt lipsite de perete celular, iar tipul de nutritie pentru acest regn este nutritia ingestiva. Este important de retinut ca virusurile nu sunt incluse in nici o clasificare, ca o recunoastere a caracterului lor de agenti infectiosi care nu au echivalent in lumea vie. Taxonomia se ocupa cu studiul clasificarii, nomenclaturii si identificarii organismelor vii.

70 Microorganismele diferă în mod fundamental unele de altele, fiind încadrate în 3 regnuri: protista, procariotae şi vira. Regnul Protista cuprinde microorganisme a căror celule sunt evoluate, de tip eucariot, cu nucleu şi organite celulare nespecifice cum sunt reticolul endoplasmatic, ergastoplasma etc.

are toate caracterele celulelor evoluate nucleu organite celulare comune nu are perete celular se divide prin direct sau prin mitoza Figura 1 – Celula de tip eucariot •

•

Algele sunt microorganisme acvatice, fotosintetizante, de la dimensiuni microscopice pâna la forme gigante, pluricelulare, filamentoase. Ele nu prezintă interes medical propriu-zis, cu excepţia agar-agarului din care se obţine agarul, polizaharid care serveşte la prepararea mediilor de cultură solide. Mycetele sau ciupercile microscopice sunt grupate în 4 clase. Din cele 12.000 de specii, doar 100 sunt de interes medical.

Figura 2 – Mycetele •

Protozoarele sunt microorganisme unicelulare eucariote, evoluate structural şi în general mobile, asemnănându-se cu celulele animale. Cele de interes medical se încadrează în 4 clase: flagelata, rhizopoda, sporozoa şi ciliata.

70

Figura 3 - Protozoarele Regnul Procariote cuprinde microorganisme a căror celule sunt primitive, de tip procariot, lipsite de nucleu adevărat şi de organite celulare nespecifice, dar cu un înveliş suplimentar numit perete celular.  nu au nucleu adevãrat ci un cromozom haploid format dintr-o moleculã circularã de ADN  lipsite de organite celulare comune cu excepţia ribozomilor  au perete celular rigid  Se divid direct

nu au nucleu adevãrat ci un cromozom haploid format dintr-o moleculã circularã de ADN lipsite de organite celulare comune cu excepţia ribozomilor au perete celular rigid Se divid direct

• •

Figura 3 – Celula de tip procariot Archaebacteriile sunt lipsite de interes pentru medicină. Ele sunt bacterii termofile, producătoare de metan. Eubacteriile cuprind un număr foarte mare de bacterii, dintre care cele de interes medical sunt: • bacteriile clasice - cu forme variate şi cu perete celular, • chlamydiile - bacterii cu parazitism intracelular obligatoriu şi care prezintă un mecanism de multiplicare unic în lumea bacteriilor, • rickettsiile - bacterii cu habitat intracelular (cu o excepţie), dar cu diviziune directă, întâlnită la majoritatea bacteriilor, • micoplasmele - bacterii cărora le lipseşte în mod natural peretele celular.

70 În prezent sunt incluse în eubacterii şi cyanobacteriile sau algele albastre, care sunt microorganisme acvatice. Regnul Vira cuprinde entităţi infecţioase de natură subcelulară care sunt virusurile şi viroizii. • Virusurile se deosebesc fundamental de formele celulare de viaţă. Ele sunt formate dintr-un singur acid nucleic (ADN sau ARN), învelit de o capsidă proteică şi sunt parazite obligatoriu intracelulare. Virusurile sunt particule inerte în stare extracelulară dar, după ce pătrund într-o celulă vie, deviază metabolismul acesteia în scopul propriei replicări. • Viroizii au o structură şi mai simplă, fiind alcătuiţi doar dintr-un acid nucleic cu GM mică. Unii dintre ei produc boli transmisibile la plante. Virusurile şi viroizii alcătuiesc împreună regnul VIRA, având următoarele particularități:  Entitãţi infecţioase acelulare cu parazitism obligatoriu intracelular  Acid nucleic (ADN sau ARN) şi un înveliş proteic – capsida. Uneori au un înveliş suplimentar – anvelopã.  Inerte în afara celulei gazdã  Paraziteazã celula la nivel genetic, deviazã metabolismul acesteia în scopul propriei replicãri

entitãţi infecţioase acelulare cu parazitism obligatoriu intracelular un singur acid nucleic (ADN sau ARN) Inerte în afara celulei gazdã paraziteazã celula la nivel genetic, deviazã metabolismul acesteia în scopul propriei replicãri

Figura 4 – Structura virusurilor Prionii sunt entităţi infecţioase de dimensiuni foarte mici (5nm), de natură proteică. Până în prezent există relativ puţine date referitoare la aceşti agenţi, dar se presupune că ei ar constitui cauza unor boli degenerative ale SNC, cum sunt bolile JacobCreutzfeld, Kuru, scrapia oilor etc. .

70

MORFOLOGIA MICROORGANISMELOR În acest capitol sunt prezentate notiuni despre forma si structura celulei microorganismelor, virusurilor , viroiziilor si prionilor, bacteriofagilor si ciupercilor. DEFINITII Microorganismele constituie un sistem complex de organisme acelulare și celulare, inzestrate cu un metabolism propriu si continuitate genetica, diferite ca morfologie, activitate biologica si pozitie sistematica. Cu toate acestea, tuturor microorganismelor le sunt comune cateva caracteristici: dimensiunile microscopice, organizarea lor monocelulară si pluricelulară, precum si structura internă relativ simplă. In categoria microorganismelor sunt incluse: 1. virusurile – acelulare; 2. bacteriile, drojdiile – monocelulare; 3. mucegaiurile, algele microscopice si protozoarele – monocelulare si pluricelulare. STRUCTURA CELULEI MICROORGANISMELOR Unitatea morfologica și functionala fundamentala a materiei vii o constituie celula. Se cunosc două tipuri de celule: procariote si eucariote. Celula procariota este mai simplă ca organizare, fiind fără nucleu, avand ADN dispersat in citoplasma, nedelimitat de membrana, sub forma de molecule mari de ADN spiralat sau sferic. Acest tip de celula este caracteristic bacteriilor, algelor albastre. Tipul mai evoluat, numit eucariot, intalnit la celulele constitutive ale plantelor, ale animalelor si ale unor microorganisme – mucegaiuri, drojdii – se caracterizează prin nucleu individualizat prevazut cu membrana, care delimiteaza astfel citoplasma. In acest tip de celule, ADN-ul se afla in nucleu, unde alaturi de proteine formeaza cromozomii – corpusculi ce se formeaza in timpul diviziunii celulare si care contin informatia ereditara specifica. Celula*, avand forme si dimensiuni diferite, este alcatuita din trei componente principale: citoplasma, nucleu si membrana celulara, constituind protoplastul. Ea este inconjurata de un perete celular, format din polizaharuri, hipo- si glicoproteine, avand rol protector fata de influentele exterioare celulei, care delimiteaza celulele intre ele si participa, alaturi de membrana citoplasmatica la diviziunea celulara. La unele microorganisme, peretele celular este acoperit de o capsula, de cili** sau de flageli** si de pili (fimbrii). *celula: lat. celulla- camaruta; vacuus – gol **cili, flageli – organe de locomotie Citoplasma este un sistem coloidal complex, macro si micromolecular, alcatuit structural din citoplasma fundamentala si din organite. In compozitia ei intra ioni de substante anorganice si compusi organici, alcatuind, de fapt, materia vie. Citoplasma fundamentală reprezinta partea nestructurata a citoplasmei si este transparenta, elastica, in continua miscare si transformare, majoritatea

70 reactiilor biochimice din celula avand loc la nivelul acestui complex coloidal. Organitele reprezinta sisteme structurale subcelulare bine definite ca structura, forma, specializate in activitati intra si extracelulare. Exista doua categorii de organite: comune – intalnite in toate celulele organismelor vii, indiferent de origine, reprezentate prin reticulul endoplasmatic, ribozomii (granulele lui Palade*), complexul Golgi, mitocondriile, lizozomii si centrozomul – si organite cu rol specific unor anumite celule specializate sub aspect fiziologic, biologic. *George Emil Palade – savant roman, laureat al premiului Nobel pentru medicina, descoperitorul formatiunilor mitocondriale citoplasmatice si a rolului acestora in celula. In citoplasma mai pot fi gasite si incluziunile celulare, formatiuni bine conturate, cu sau fara membrana, cu functii temporare compuse din picaturi de grasime, granule de proteine sau glicogen, alte substante dizolvate in apa, reprezentand substante de rezerva si vacuolele , continand substante sub forma de solutii hidrice. Reticulul endoplasmatic este o retea canelara ce brazdeaza citoplasma multidirectional, considerat ca un sistem circulator celular deoarece are rolul transportorului de produsi celulari. Datorita reticulului endoplasmatic suprafata de schimb celular intre substantele citoplasmatice si spatiul intercelular se mareste, imbunatatindu-se astfel calitatea si randamentul acestui schimb. Totodata, reticulul endoplasmatic poate sintetiza proteine, lipide si hormoni pe care celula le secreta in lichidul intercelular. Ribozomii sunt forme granulare sferice in care are loc sinteza proteinelor, fiind constituite din ARN si proteine. Lizozomii sunt organite sferice continand enzime digestive, avand rolul apararii celulelor contra altor microorganisme prin digerarea (liza) acestora. Complexul Golgi reprezinta formatiuni membranoase sub forma de pachete asezate in teancuri, amplasate in apropierea nucleului, avand rolul sintetizarii unor substante celulare specifice si de transfer al acestora prin reticulul endoplasmatic in spatiul intracelular. Mitocondriile sunt corpusculi sferici sau ovoidali, granulari, ce contin sisteme enzimatice care participa la transformarile energetice din celula, deci care produc energie celulara. Centrozomul este un constituent celular (organit) care intervine indirect in diviziunea celulara, vizibil la microscopul electronic in vecinatatea nucleului, cu deosebire in timpul diviziunii. Impreuna cu masa citoplasmatica din jurul sau formeaza asa-numita centrosfera. In timpul diviziunii, in jurul centrosferei se contureaza filamente citoplasmatice radiale denumite aster. Centrozomul lipseste din celulele in care nu are loc diviziunea celulara. In interiorul celulelor mai pot fi intalnite organite cu forme variabile pigmentate diferit, cunoscute sub denumirea de cromoplaste, cloroplaste, s.a., avand culori specifice, cu deosebire in schimburile energetice si in reactiile redox si de schimb ionic intra si extracelulare. Nucleul este o formatiune protoplasmatica a celulei cu o organizare superioara, continand proteine si acizi nucleici (ADN, ARN), fiind responsabil de transmiterea caracterelor ereditare, in diviziunea celulara si in metabolismul

70 celular. Nucleul este bine individualizat in celulele eucariote de o membrana dublu stratificata, avand pori care permit schimbul de substante intre citoplasma si nucleu si se afla de obicei asezat in centrul celulei, fara ca aceasta sa reprezinte o 18 regula generala. Majoritatea celulelor au un singur nucleu, dar exista si celule polinucleare in structuri biologice superioare. Nucleul se compune din: nucleol, carioplasma (suc nuclear) si membrana nucleara. Nucleolul este o formatiune structurala din interiorul nucleului in compozitia caruia intra ARN si ADN, rolul sau fiind acela de formare a ARN-ului pe care-l transfera in citoplasma, transmitand acesteia informatia genetica continuta in ADN si cromozomi. Carioplasma*, sub aspect compozitional, este citoplasma continand in plus cromatina **– formata din acizi nucleici legati de proteine filamentoase, constituind substratul material al cromozomilor - si linina (acromatina)**. *grec. haryon – fara nucleu **grec. a – fara. Chroma- culoare; parti din nucleu care reactioneaza sau nu la coloranti bazici caracteristici pentru cromozomi – W. Fleming, 1879 Membrana nucleara este formata din trei straturi membranoase stratificate, traversate de pori prin care are loc schimbul de substante intre nucleu si citoplasma. Membrana celulara (plasmatica) este un invelis extern ce are o structura trilaminara ca si membrana nucleara, structura care face ca ea sa aiba o permeabilitate selectiva fata de substante si determina o anumita sarcina electrica (stratul exterior are sarcina electrica pozitiva, iar cel din interiorul celulei este electronegativ) care imprima membranei celulare un potential electric de membrana si o anumita polaritate. Potentialul electric de membrana este mentinut de ionii de sodiu (Na+) si potasiu (K+) repartizati neuniform in ambele parti ale membranei (cei de potasiu se gasesc preponderent pe partea interna a membranei, iar cei de sodiu sunt in numar mai mare in lichidul intercelular, dar sarcina stratului interior al membranei, din cauza unor anioni in exces, isi mentine sarcina electrica negativa). Membrana devine un sistem bine organizat, care pe de o parte separa celula de mediul sau, iar pe de alta, prin caracteristicile de membrana ultraselectiva, asigura legatura cu acesta, precum si desfasurarea normala a functiunilor ei fiziologice in mediul in care se dezvolta. Permeabilitatea membranei pentru ionii de sodiu creste de peste 500 de ori, devenind preponderenta celei a ionilor de potasiu. Se produce astfel o inversiune a sarcinilor electrice ale celor doua straturi – intern si extern – ale membranei celulare, cunoscuta sub denumirea de depolarizare, stare ce permite schimbul material si energetic intre celula si exterior prin deplasarea unor compusi ionici chiar impotriva gradientului de concentratie. Mecanismul transportului ionic-imaginativ, asemanator pomparii lichidelor, se face prin consum.

70

BACTERIOLOGIE FORME DE EXISTENȚĂ ALE BACTERIILOR Acest capitol cuprinde: • definitia, morfologia, structurile externe ale bacteriilor; • sporogeneza bacteriilor; • fiziologia, biochimia si metabolismul bacterian; • elemente si notiuni introductive de genetica bacteriana Bacteriile sunt microorganisme unicelulare de tip procariot care se reproduc asexuat prin diviziune directa (sciziune). Ritmul de diviziune este de 10 – 12 minute. Ele sunt organisme răspândite in natura, oriunde exista conditii minime de viata. In functie de modul de procurare al substantelor nutritive, bacteriile sunt autotrofe – cele care isi pot sintetiza din surse anorganice metabolitii esentiali si heterotrofe – acelea care trăiesc pe seama unor gazde vii de la care isi procura substantele necesare. Majoritatea bacteriilor patogene ce produc imbolnaviri sunt heterotrofe. MORFOLOGIA BACTERIILOR Morfologia propriu-zisă a bacteriilor se referă la: forma celulei, dispoziția spatială sau forma de existență, dimensiunile și afinitatea tinctoriala. Principalele forme celulare ale bacteriilor sunt: sferica, cilindrica si curba - spiralata. • cocii sunt bacterii rotunde, aşezate în grămezi (genul Staphylococcus), ovalare, aşezate în lanţuri (genul Streptococcus), lanceolate, dispuse în diplo ca două flăcări de lumânare, (specia Streptococcus pneumoniae) şi reniforme dispuse ca două boabe de cafea ce se privesc faţă în faţă (genul Neisseria) cu Ø de 0,8 - 1µ; • bacilii sunt bacterii cu formă alungită de bastonaş cu dimensiuni între 1,5 - 10µ. • cocobacilii sunt forme intermediare între coci şi bacili (Yersinia pestis, Bordetella pertussis, Haemophilus influenzae); • vibrionii sunt bacterii încurbate în formă de virgulă (Vibrio cholerae); • spirilii sunt bacterii spiralate cu 1-2 spire rigide (Spirillum volutans); • spirochetele sunt bacterii spiralate cu corpul flexibil şi 12-20 de spire (Treponema pallidum), foarte multe spire strânse (Leptospira) sau 2-3 spire (Borrelia): actinomicetele sunt bacterii foarte asemănătoare fungilor şi formează filamente sau hife lungi şi ramificate care se rup, rezultând forme bacilare (Actinomyces). Forma sferica se referă la coci. Daca celulele formate prin diviziune se separa si raman independente se numesc micrococcus; cand cocii sunt grupați perechi sunt denumiti diplococcus; daca ei sunt dispusi in lant se numesc streptococcus; dispunerea pe doua planuri perpendiculare a cocilor are denumirea de tetrade, iar structura de ciorchine (grupuri neregulate) este denumita staphylococcus. Forma cilindrică – alungita, de bastonaș – poate exista in doua forme si anume: vegetativă – care reprezinta starea de viata activa a celulei cu toate

70 funcțiile normale, si sporulată – forma de rezistenta, de autoconservare, pana se indeplinesc conditiile normale de transformare a sporului in forma vegetativa.

Figura 1 – Forma şi dimensiunile bacteriilor Sporul este o formațiune endocelulara (in interiorul celulei) care se formeaza pentru prezervarea celulei un timp mai indelungat. Bacteriile izolate asporulate (nesporulate) sunt denumite bacterium, iar cele sporulate se numesc bacillus. Ambele tipuri de bacterii pot fi dispuse spatial in lant, caz in care se numesc streptobacterii in palisada (ca scandurile gardului), dar mai pot fi si alte aranjamente spatiale. Bacteriile spiralate au corpul format dintr-o jumatate de spira – ca semnul virgulei – si se numesc vibrioni (vibrio), sau din mai multe spire – spirochete (spirochet) nedeformabile – ex: genul Leptospira – si deformabile – ex: genul Borrelia. In afara acestor 3 forme majore de bacterii, mai exista si unele mai rar intalnite in special la germenii saprofiti: forma patrata, elipsoidala denumirea fiind cea de cocobacil, fusiforma, etc.

70

Figura 2 – Aşezarea cocilor Dimensiunea diametrului cocilor variaza intre 1 – 5 micrometri, iar bacilii au lungimea de 0,5 – 10 micrometri si diametrul între 0,3 si 0,5 micrometri, ei putandu-se clasifica in: scurti, in lungime medie de 2 micrometri si lungi, la care lungimea este de aproximativ 10 micrometri. STRUCTURI EXTERNE ALE BACTERIILOR (Structura extraparietală) Unele bacterii au la exteriorul peretelui celular o structură complexă, care favorizează aderenta acestora la alte structuri sau mobilitatea celulelor.

Figura 3– Structura celulei bacteriene

70

STRUCTURI CELULARE OBLIGATORII Peretele celular este o componentă celulară obligatorie care înconjoară membrana citoplasmatică, peretele celular este o structură rigidă, specifică bacteriilor.

Figura 4 – Structura peretelui celular Acesta este format dintr-un strat bazal sau peptidoglican, asemănător la toate bacteriile şi un strat al structurilor superficiale, foarte diferenţiat, în funcţie de care bacteriile manifestă caractere tinctoriale diferite: bacterii Gram - pozitive, Gram negative şi acido-alcoolorezistente. Peptidoglicanul sau mureina este structura chimică responsabilă de rigiditatea peretelui celular şi care asigură forma şi rezistenţa mecanică a bacteriei. Prezent la toate bacteriile, el constă dintr-un schelet, format din molecule lungi paralele polizaharidice de N-acetil-glucozamină şi acid N-acetil-muramic. Moleculele de acid N-acetil-muramic din lanţurile vecine sunt legate între ele prin punţi polipeptidice, transversale. La bacteriile Gram - pozitive, peptidoglicanul are o grosime de 15-30 nm şi conţine până la 200 de lanţuri paralele de mureină. Stratul structurilor speciale este redus şi alcătuit din polimeri hidrosolubili care sunt acizii theicoici. Ei reprezintă antigenele de supafaţă ale bacteriilor gram-pozitive. Peretele celular al bacteriilor gram-pozitive este sensibil la acţiunea lizozimului care rupe legăturile dintre acidul N-acetil muramic şi N-acetilglucozamină. La bacteriile Gram-negative, peptidoglicanul are o grosime de 4-5nm. Stratul superficial este însă mult mai complex decât la bacteriile gram - pozitive fiind alcătuit dintr-o membrană externă, lipoproteine şi lipopolizaharidul de perete.

70

Figura 5 – Structura peptidoglicanului Membrana externă este formată dintr-un strat dublu fosfolipoproteic ce cuprinde o cantitate foarte mare de molecule proteice. Membrana externă se leagă de protoplast prin intermediul unei lipoproteine din membrana externă. Deasupra membranei externe a bacililor Gram-negativi se află lipopolizaharidul de perete (LPZ) sau endotoxina bacililor Gram-negativi. Aceasta este alcătuită din: • lipidul A care are o structură particulară, fiind format din unităţi dizaharidice de glucozamină, legate de beta-hidroxiacizi graşi cu 10-16 atomi de carbon fixaţi direct de membrana externă, • miezul sau “core”, numit şi antigen R, comun tuturor bacteriilor gram – negative, • unităţi monozaharidice repetitive (15-40) care sunt specifice de specie şi tip şi constituie antigenul O al bacteriilor gram-negative. LPZ este o toxină termolabilă, care se eliberează în mediul înconjurător de către bacteriile gram-negative numai după liza lor şi foarte reactivă în organismul gazdă. Astfel, lipidul A produce febră, activează mecanismele apărării antiinfecţioase şi în exces produce şocul endotoxic cu evoluţie gravă, chiar fatală. Spaţiul periplasmic. Sistemul structural dublu al peretelui celular la bacteriile gram-negative creează un compartiment ce se întinde de la membrana celulară până la membrana externă, numit spaţiu periplasmic. El conţine peptidoglicanul şi un gel care favorizează nutriţia bacteriei prin conţinutul în enzime degradative ca, de pildă, fosfataze, nucleaze, proteaze etc. Tot aici sunt prezente enzimele de inactivare ale unor antibiotice cum sunt beta-lactamazele şi cefalosporinazele. Bacteriile acido-alcoolorezistente de interes medical sunt bacilul tuberculos şi bacilul leprei. Peretele celular se aseamănă cu cel al bacteriilor gram-pozitive, dar structurile speciale conţin acid micolic şi o ceară, ce conferă acestor bacterii caractere

70 tinctoriale deosebite şi rezistenţă crescută la factorii de mediu. Acestea se colorează la cald prin tehnica Ziehl-Neelsen. Funcţiile peretelui celular: • asigură forma, rezistenţa mecanică şi osmotică a bacteriei; • reglează traficul molecular de perete în ambele sensuri • este sediul antigenelor de suprafaţă • este sediul unor factori de patogenitate; • are rol în diviziunea bacteriană şi în procesul de sporulare. Membrana citoplasmatică

Figura 6 – Structura membranei citoplasmatice Este o membrană fină (6,5-7nm), elastică, lipsită de rezistenţă mecanică. Pe secţiune apare trilaminată, fiind alcătuită din două straturi fosfolipidice dispuse cu părţile hidrofobe faţă în faţă. Printre moleculele fosfolipidice se găsesc molecule proteice, situate fie la nivelul unuia dintre cele două straturi fosfolipidice, fie le traversează fiind expuse la ambele feţe ale membranei. Mezozomii. Sunt structuri membranare care se formează prin invaginarea membranei citoplasmatice sub formă de buzunar, prezente la bacteriile gram - pozitive şi ocazional la cele gram - negative. Ei sunt în contact direct cu materialul nuclear fiind implicaţi în diviziunea cromozomului. Funcţiile membranei citoplasmatice: • este o membrană cu permeabilitate selectivă, îndeplinind funcţia de barieră osmotică ce reglează schimburile celulei bacteriene, în ambele sensuri cu mediul înconjurător. • secretă enzime hidrolitice în mediul înconjurător unde scindează substratul nutritiv în unităţi absorbabile, • îndeplineşte rolul mitocondriilor de la celulele eucariote, fiind centrul energogenezei celulare, • este sediul sintezei acizilor graşi, a fosfolipidelor,

70 •

este implicată în sinteza peretelui celular, al polizaharidelor capsulare, participând activ la creşterea şi diviziunea celulei bacteriene şi la formarea sporului bacterian.

STRUCTURILE EXTERNE CONSIDERATE STRUCTURI FACULTATIVE sunt capsula, flagelii și pilii, aflati in afara invelișului bacterian. Capsula, stratul ce acoperă celula, este de natura mucopoliglucidica sau mucoproteica. Stratul mucilaginos care poate ajunge la grosimi de 2 micrometri imprima bacteriilor proprietati de aderenta si rezistenta la factori chimici si fizici (antibiotice si lipsa de apa). Capsula reprezinta uneori, din cauza rezistentei la agentii fizico-chimici si biologici, un factor de patogenitate si de specificitate antigenica. Capsula este un înveliş compact, intim legat de celula bacteriană, vizibilă pe preparatele uzuale sub forma unui halou clar ce înconjoară bacteria. Din punct de vedere chimic, capsula tuturor bacteriilor de interes medical este de natură polizaharidică (Streptococcus pneuomoniae, Klebsiella etc.) cu excepţia capsulei bacilului cărbunos care este polipeptidică. Capsula are rol în rezistenţa bacteriilor faţă de fagocitoză, fiind astfel un factor de virulenţă. Variantele necapsulate ale aceloraşi specii sunt nepatogene. De exemplu, Streptococcus pneumonie, de tip S, capsulat, produce la şoarecele alb de laborator o septicemie mortală, pe când varinata necapsulată nu este patogenă. Capsula este o structură cu proprietăţi antigenice specifice (antigenele K) care permit diferenţierea unor serotipuri în cadrul speciei. Microcapsula este o structură discretă cu o grosime sub 0,2µm care nu se evidenţiază la microscopul optic, ci numai prin metode imunologice sau electronomicroscopice (Neisseria gonorrhoeae). Ea constituie un factor de virulenţă. Stratul mucos, glicocalixul este un strat amorf şi vâscos ce înveleşte bacteria. El este format din lanţuri lungi de polizaharide, cum sunt levanii şi dextranii, cu rol major în adezivitatea bacteriilor de suprafeţe. Astfel, de pildă, Streptococcus mutans produce cantităţi mari de dextran şi levan prin intermediul cărora se ataşează de suprafaţa dinţiilor contribuind la formarea cariilor şi a plăcii dentare. Funcţiile capsulei: • este un factor de aderenţă şi colonizare a bacteriile pe suprafeţe; • protejează bacteriile de diferiţi agenţi antibacterieni din mediu cum sunt: bacteriofagii, colicinele, complementul, lizozimul sau alte enzime bacteriolitice; • protejează bacteriile de acţiunea fagocitelor, fiind deci un factor de virulenţă; • reprezintă sediul antigenelor capsulare, importante în identificarea acestor bacterii. Cilii sau flagelii bacterieni Sunt apendici filamentoşi ai speciilor bacteriene mobile, cu originea în citoplasma bacteriană, şi servesc ca organe de locomoţie. Ei sunt prezenţi mai ales la bacili. Dispoziţia şi numărul cililor sunt caracteristice speciei. S-au descris bacterii atriche (fără cili), monotriche - cu un cil polar (Vibro cholerae), lofotriche - cu un smoc de cili situat la unul din polii bacteriei - (Pseudomonas fluorescens), amfitriche - cu cilii situaţi la ambii poli ai bacteriei (la genul Spirillum) şi peritriche - cu cilii dispuşi pe întreaga suprafaţă a bacteriei (Salmonella, E. coli, Proteus etc.).

70

Figura 7 – Cilii bacterieni Pilii bacterieni Numeroase specii bacteriene gram-negative au pe suprafaţa lor lor nişte apendici filamentoşi, rigizi, mai scurţi decât flagelii, în număr mare (100-500/celulă) şi cu dispoziţie în general peritrichă. Ei se evidenţiază numai prin microscopie electronică. Din punct de vedere funcţional, pilii se împart în: • sex pili codificaţi plasmidic şi care au rol în transferul de material genetic între bacterii. Sunt prezenţi mai ales la bacteriile gram-negative (Enterobacteriaceae, Pseudomonas), • pili comuni sau pili de aderenţă (fimbrii), în număr mare, codificaţi cromozomial, şi care servesc bacteriilor la fixarea fermă de mediul de cultură sau de celulele pe care se află. Ei constituie, deci, un factor important de virulenţă. În afară de aderenţă, pilii comuni mai au şi proprietăţi antifagocitare. Flagelii sunt formatiuni filamentoase prezente la unele bacterii, denumite mobile, ca organe de locomotie. Unele bacterii au un singur flagel sau un manunchi de flageli polarizat la un capat al celulei, la altele flagelii sunt amplasati pe intreaga suprafata a celulei in numar foarte mare (de ordinul 100 si 1000), iar lungimea lor poate atinge si 20 de micrometri, caz in care sunt cunoscuti sub numele de cili. Cel mai adesea nu există simultan cili si flageli. Ca structura, flagelii sunt alcatuiti dintr-o proteina specifica, cu structură helicoidală denumită flagelină. Ca urmare a structurii helicoidale și a specificitatii, flagelina este contractilă, fixându-se în spatiul periplasmic cu ajutorul unor formatiuni denumite cârlig și discuri. Flagelii se pot roti cu 40-60 de rotatii pe secunda in ambele sensuri de rotire (dreapta, stanga), imprimand datorita structurii helicoidale o miscare de deplasare a celulei bacteriene cu viteze de 2 pana la 100 de ori mai mare ca lungimea celulei intr-o singura secunda (spre comparare, campionul mondial la 100 m plat este de numai 5-6 ori mai rapid in raport cu inaltimea sa). Celulele mobile cu un singur flagel sunt numite monotriche, cele cu doi flageli, amfitriche, multiflagelate polare, lofotriche, iar ciliatele peritriche. Pilii sunt structuri proteice care acopera complet suprafata bacteriilor; pilii

70 comuni, au rol de aderenta bacteriana; altii sunt implicati in conjugarea bacteriana permitand trecerea materialului genetic de la o bacterie la alta, fiind cunoscuti ca pili sexuali (Factor F). Pilii comuni – numiti si fimbrii, sunt apendici filamentari rigizi, ce nu folosesc la deplasare, cu lungimi de aproximativ 1 micrometru si diametrul de circa 3 nanometri; sunt compusi dintr-un singur tip de proteina cu molecula in forma de filament helicoidal. Pe acesti pili exista receptori ce recunosc numai anumite structuri din organism si, prin aceasta, intervin in patogenitate, avand specificitate imuno-patogenica.

70

FIZIOLOGIA, BIOCHIMIA SI METABOLISMUL BACTERIAN Bacteriile se caracterizeaza printr-o mare complexitate metabolica si capacitate de adaptare, fiind raspandite peste tot in natura datorita posibilitatilor de a-si schimba metabolismul in functie de conditiile in care se gasesc, iar daca acestea lipsesc, ele construiesc forme rezistente ce le asigura o viata latenta chiar si pentru perioade masurate in sute de ani. Pentru a intelege fiziologia si metabolismul bacterian, in cele ce urmeaza va fi discutata compozitia chimica si rolul compusilor chimici in fiziologia bacteriana. Compoziția chimică a bacteriilor Dupa cum se stie, toate vietuitoarele, deci si bacteriile, contin in celula apa, proteine, glucide, lipide, minerale, enzime, vitamine si alte substante specifice. Apa reprezintă 70-80% din masa celulara si se gaseste sub doua forme: apa libera si apa legata de compusii moleculari ai celulei bacteriene. Ea constituie un mediu propice dispersarii componentelor celulare si participa la reactiile biochimice din metabolismul bacterian. Metabolismul – schimbul de substante chimice dintre celule si mediu - nu poate avea loc decat in solutii adevarate sau coloidale. Continutul de apa al celulelor permite reglarea presiunii osmotice celulare si utilizarea substantelor chimice la nivel atomic si molecular prin dilutii, disocieri si polarizari. Prezenta apei in celula imprima acesteia mobilitatea structurala, schimbarea formei si elasticitatea necesara adaptarii la medii diferite. Între formele vegetativă si sporulată există diferențe ale conținutului de apa, cu deosebire a apei libere, sporii având doar 15-20% apa sub forma de apă legata. Proteinele participa cu o pondere de 30-80% in masa uscata a celulei bacteriene, la structura careia participa mai mult de 23 aminoacizi, dintre care unii specifici doar bacteriilor, cum sunt: Diaminopimelic, Aminopimelic, Theicoic, sau izomerii seriei D ai Alaninei si Acidului glutamic. Proteinele se gasesc sub forma de aminoacizi, peptide simple sau polipeptide sau participa ca proteine complexe (heteroproteine). Heteroproteinele prezinta cea mai mare importanta pentru fiziologia celulara bacteriana datorita posibilitatii acestora de a realiza multiple combinatii biochimice complexe in functie de necesitatile fiziologice. Se vor intalni astfel combinatii binare sau polinomiale glucido-lipido-polipeptidice cum sunt mucoproteinele, cromoproteinele, acizii nucleici, enzimele, s.a. Rolul proteinelor in celula bacteriana este ,de asemenea, complex si vizeaza atat constructia celulara propriu-zisa (rol plastic), cat si transmiterea caracterelor genetice( energetic, antigenic, patogenic, enzimatic) etc. Enzimele sunt derivati proteici avand rol biocatalitic; se formeaza in celulele bacterie influentand desfasurarea reactiilor intracelulare (de exemplu mitocondriale) si extracelulare (cu rol antigenic, patogenic) sau ectocelulare (avand rol in permeabilitatea selectiva). Avand o specificitate de substrat, de grup si sterica, enzimele din zestrea celulei bacteriene – cca. 2000 – fac parte din toate clasele de enzime*: oxidoreductaze, hidrolaze, transferaze, liaze, izomeraze,

70 ligaze. Enzimele pot aparea in fiziologia si metabolismul bacteriilor prin inductie, ele numindu-se enzime inductive, existand numai la comanda si in prezenta inductorilor specifici sau ca o zestre celulara, acestea fiind cunoscute sub numele de enzime constitutive. Glucidele reprezintă 15-20% din masa substantei uscate a bacteriilor, in compozitia acesteia fiind cuprinse toate tipurile de glucide: omogene sau neomogene, simple si complexe. Ele sunt foarte importante pentru bacteriile anaerobe pentru care constituie singura sursa de nutritie. Rolul glucidelor in celula bacteriana este plurivalent si anume: energetic, structural, antigenic, patogenic sau de rezistenta celulara, etc. Este evident ca ele prezinta importanta capitala ca sursa de energie si ca substanta plastica ce intra in constitutia cvasitotalitara a tuturor partilor morfologice celulare. O caracteristică specifica bacteriilor Gram-pozitive este prezenta complexului poliglucidic neomogen – mureina. Lipidele din bacterii variaza in limite foarte largi in raport cu specia microorganismelor, dar si cu conditiile de mediu (metaboliti, substrat etc.) sau stadiul de maturitate. In general, continutul de lipide este de 2-14% din substanta uscata celulara, dar unele mycobacterii (Mycobacterium tuberculosis Koch)au si mai mult(30%). Lipidele bacterine sunt omogene (acizi grasi, gliceride, ceruri) si complexe (fosfolipide, lipoproteine, lipogliceni, etc.). Ceea ce-i specific bacteriilor este prezenta in celulele lor, in peretele mycobacteriilor, a acizilor grasi micoici (ac. Tuberculostearic , ac. Dicolipenic , ac. Micocerosic ) componenti ai cerurilor. Pentru bacterii este caracteristica lipsa steridelor (esteri ai alcoolilor policiclici numiti steroli). Totusi in Azobacter chroococcum, fixator de azot, s-a gasit un sterol (Schifferd, Anderson, 1936) cu structura neprecizata. Rolul lipidelor este divers, dar functiile energetice si de permeabilitate par a fi preponderente in fiziologia celulara bacteriana. Lipidele complexe, cum sunt fosfatidele, contin elemente structurale atat hidrofile, cat si lipofile, astfel ca solutiile lor apoase, de natura coloidala, joaca un rol important in reglarea permeabilitatii celulare. Fosfatidele pot absorbi glucide si protide, care pot fi eliberate dupa nevoie, prin desorbtie. In acest fel, ele pot functiona si ca transportori de substante in celulele bacteriene, iar alaturi de acizii ribonucleici au rol in biosinteza proteinelor. Continutul de substante minerale reprezinta 3-30% din substanta uscata a bacteriilor, acesta variind in functie de specie si de varsta. Rolul substantelor minerale rezida in primul rand din faptul ca formarea compusilor la nivel molecular se face sub forma unor complecsi ce contin obligatoriu elemente minerale sub forma ionica. Acestia (de ex. Ca, Mg) intra in structurile celulare, deci au rol plastic, ori activeaza sistemele enzimatice (citocromoxidazele cu fier), participa la formarea si transformarile acizilor nucleici (fosforul), regleaza presiunea osmotica celulara si permeabilitatea celulara (sodiul, potasiul, sulful), precum si potentialul de oxido-reducere la nivelul celular, etc. Oligo si microelementele minerale, caracterizate prin reactivitate chimica ori labilitate electronica ridicate, sunt prezente frecvent in celulele bacteriene (de ex. K, Na, Fe, Ca, Mg, S, Cu s.a.).

70 Pentru organismul uman, bacteriile sunt o bogata sursa de vitamine, deoarece ele sunt capabile sa sintetizeze aceasta categorie de substante, cu deosebire vitaminele hidrosolubile din grupul B. Astfel, vitamina B1 (tiamina) este sintetizata de bacterii in oxidarile intracelulare si metabolismul glucidelor, ca de altfel si vitaminele B2 (riboflavina) si B3 (vitamina PP), vitamina B4 (adenina) ce participă in calitate de cofactor in reactiile nucleatidelor. Acidul folic (vitamina B9) este cunoscut ca un factor de crestere pentru mai multe specii de bacterii (B.subtilis, Lactobacillus sp. etc.) fiind cofactor necesar biosintezei compusilor purinici. Cresterea unor microorganisme bacteriene, ca de exemplu Lactobacillus lactis Dorner, nu ar fi posibila fara prezenta vitaminei B12 (ciancobalamina). Vitamina H, acidul para amino benzoic, este denumit si “vitamina vietii bacteriilor”, deoarece reprezinta pentru acestea un metabolit primar absolut necesar vietii si inmultirii lor ,fiind si un factor de crestere. În functie de specie, bacteriile pot sintetiza pigmenti, ce se intalnesc in celulă (bacterii cromofore), legati endocelular de perete, ca in cazul stafilococilor (bacterii paracromofore) sau la exteriorul celulei bacteriene, ca la Pseudomonas, bacteriile din aceasta grupa fiind numite cromopare. Pigmentii pot fi sintetizati pentru un anumit scop (de protectie, ca de exemplu carotenoizii, pentru functia de coenzima in sistemele transmitatoare de electroni si de fosforilare oxidativa, de structura, pentru elementele functionale ale mitocondriilor*, ca factor de crestere pentru unele bacterii) sau pot rezulta din procesele catabolice. * mitos – fir; chondros – graunte; mitocondrie – organit subcelular in care se regaseste sediul fosfonilarii oxidative, absenta la procariote Bacteriile mai pot avea o serie de substante cu rol bactericid sau bacteriostatic asupra altor specii sau chiar impotriva propriei specii (substante purtand numele de bacteriocine). METABOLISMUL BACTERIAN Metabolismul reprezinta totalitatea proceselor biochimice intracelulare prin care substratul nutritiv este transformat in energie si compusi celulari. Metabolismul bacterian este de doua tipuri si anume metabolism energetic, prin care se asigura respiratia bacteriana in reactii catabolice de degradare cu eliberare de energie si metabolism de sinteza care asigur, prin reactii anabolice si catabolice, sinteza componentelor celulei bacteriene. Sursele de energie ale metabolismului energetic pot fi lumina in cazul bacteriilor fotosintetizante si reactiile biochimice de oxido-reducere la bacteriile chimio-sintetizante. Energia poate fi eliberata prin procese de oxidare aeroba, in care intervine oxigenul ce se fixeaza pe substrat si anaeroba, prin procesul de pierdere a hidrogenului, in absenta oxigenului, care este , de asemenea, un fenomen de oxidare in care se pierd unul sau mai multi electroni (sau sarcini electrice negative) ce sunt acceptati de alta substanta. In ambele situatii se poate discuta despre o respiratie bacteriana oxibiotica (aeroba) si anoxobiotica (anaeroba). Interventia directa a oxigenului in respiratia aeroba elibereaza din

70 substrat o cantitate insemnata de energie (de exemplu, prin oxidarea completa a glucozei de catre bacterii aerobe se obtin in final aproximativ 100 calorii/mol). Germenii anaerobi isi procura energia necesara activitatii lor metabolice prin procese fermentative, in absenta oxigenului, mai ales pe seama glucidelor. In acest caz eliberarea de energie este mai mica, iar descompunerea glucozei se opreste la stadiul de acid piruvic, alcooli sau acid lactic, cantitatea de energie fiind de aproximativ 50 ml/mol. Descompunerea anaeroba a glucozei are loc intr-un proces de fermentatie in care intervin compusii macroenergici* (superenergetici) ai fosforului (ADP, ATP, DNP etc), proces ce decurge in 11 etape succesive (dupa Mezerhof-Emden) ce vor fi abordate la microbiologia speciala. * makros – mare; ergos - actiune Bacteriile folosesc pentru respiratia lor cantitati diferite de oxidanti, astfel ca, in functie de potentialul lor de redox**, ele pot fi clasificate in: strict aerobe – cuprinzand bacteriile care folosesc ca sursa energetica O2, motiv pentru care dispun de toate enzimele lantului respirator, catalaza si perozidaza (M. tuberculosis); strict anaerobe – ce nu supravietuiesc in prezenta oxigenului, folosesc enzime de tip nicotinic si flavinic si nu au peroxidaza si catalaza; aerobe – ce traiesc la un potential redox mai mic, au cantitati mici de peroxidaza si se pot adapta ambelor tipuri de respiratie; acest tip de respiratie este adoptat de majoritatea bacteriilor; anaerobe microaerofile - care contin in cantitati mici catalaze si suporta unitati reduse de oxigen molecular. ** potentialul de oxido-reducere este diferenta de potential dintre un electrod inatacabil (platina, aur, carbune) si un sistem de oxidoreducere – care elibereaza electroni. Metabolismul de sinteza reprezinta totalitatea proceselor metabolice cu consum de energie care duc la sinteza unor produse necesare cresterii si multiplicarii bacteriilor. In functie de modul de procurare a acestor substante, pot fi deosebite 3 tipuri de bacterii: autotrofe* - care isi procura carbonul si aportul din substante anorganice (CO2, NH3-, NO3-); heterotrofe* - la care sursele de C si N provin din surse organice și isi pot sintetiza singure metabolitii esentiali; paratrofe* - ce se dezvolta doar intracelular si nu isi pot sintetiza singure metabolitii esentiali. *gr. autos – insusi; trephein – a hrani; heteros – altul; para – alaturi. CRESTEREA, MULTIPLICAREA SI MOARTEA BACTERIILOR Bacteriile sunt niste fiinte vii si, astfel, ele cresc, se inmultesc si mor. Acest proces complex nu se refera numai la indivizi, ci si la populatia bacteriana in totalitate. In primul caz biologia cresterii si dezvoltarii este dirijata ereditar, in cel de al doilea aceste fenomene depind cu precadere de conditiile de mediu. Creșterea individului bacterian se caracterizeaza prin adaugarea de protoplasma, ca rezultanta a fenomenelor predominant anabolice in raport cu cele catabolice si are ca efect o crestere a suprafetei si a volumului sau. Intre aceste doua caractere exista un raport strans corelat cu etapa de dezvoltare in care se afla bacteria: pe masura ce bacteria creste, se mareste si volumul sau, in timp ce suprafata sa devine proportional mai mica (ipoteza Leuckart – Spencer). Cand acest raport creste in favoarea volumului, celula bacteriana tinde sa se divida, sa

70 se multiplice. Cum aparatul nuclear este activ mai ales in momentul diviziunii celulei, volumul bacteriei creste semnificativ in perioada in care aparatul nuclear este in repaus. Raportul volum/suprafata al bacteriei se schimba in favoarea suprafetei odata ce diviziunea a luat sfarsit, dupa care se pregateste un nou ciclu de crestere. Multiplicarea bacteriilor inseamna cresterea numarului de indivizi intr-un mediu de viata favorabil si se realizeaza prin diviziune. Populatia care rezulta prin diviziunea bacteriilor creste in progresie geometrica cu ratia 2, timpul necesar pentru dublarea populaţiei numindu-se timp de dublare sau timp de generatie. In raport cu specia bacteriana, multiplicarea atinge un maximum de populatie care se poate mentine o perioada oarecare dupa care incepe declinul ei. Multiplicarea se petrece in faze succesive. Acestea sunt:  faza de lag* sau faza de ajustare, ce se caracterizeaza prin diminuarea numarului de indivizi care constituie inoculul, prin cresterea dimensiunilor germenilor viabili. *engl. Lag – intarziere, captusire Este o faza de acomodare a germenilor la noile conditii de viata. Durata de lag este, in general, apreciata pentru bacterii la aproximativ 2 ore, dar ea este in functie de specia bacteriana, cantitatea initiala de inocul si conditiile de mediu. De exemplu, bacteriile termofile si Escherichia coli au o faza de lag scurta (15-20 minute), in timp ce Mycobacterium are una mai lunga. In faza de lag cantitatea de N-total, P-organic, ARN si O2 consumat cresc.  faza logaritmica (exponentiala) de multiplicare este o faza de crestere rapida, in progresie geometrica, a bacteriilor si se caracterizeaza printr-o serie de manifestari cunoscute sub numele de “tinerete fiziologica"; microorganismele sunt mai permeabile si mai sensibile la factorii de mediu. Faza dureaza in medie 2-3 ore (M. tuberculosis). Curba de multiplicare evolueaza exponential pana in momentul in care una din substantele nutritive din mediu este consumata, iar in mediu se acumuleaza metaboliti toxici. Metabolitii consumati si produsi in mediu se numesc factori limitanti. In timpul acestei faze caracterele morfologice ale bacteriilor se omogenizeaza, activitatea si echipamentul enzimatic sunt mai bine dezvoltate, proprietatile biochimice si de metabolism se manifesta la parametrii optimi, rezistenta germenilor la agentii fizici, chimici si biologici devine caracteristica speciei.  faza stationara caracterizata prin faptul ca raportul dintre germenii care se divid si cei care mor ramane relativ constant, astfel incat numarul bacteriilor se stabilizeaza. Faza de stationare este denumita si faza de concentratie “M”, deoarece in aceasta etapă populația bacteriană atinge un maximum in cultură.  faza de declin (faza de moarte logaritmica) este etapa in care numarul germenilor morti intrece numarul germenilor vii, deoarece consumarea substratului nutritiv si acumularea de metaboliti toxici duc la moartea majoritatii bacteriilor, iar timpul de generatie creste la cateve zile; celulele vii imbatranesc, nu-si mai pastreaza caracteristicile, speciile patogene isi pierd patogenitatea si virulenta. In aceasta faza apar tendintele de sporulare. Ea nu este valabila in cazul culturilor bacteriene continue, caracterizate prin reinnoirea continua a substratului nutritiv si

70 prin recoltarea de asemena continua a germenilor in faza exponentiala. Culturile continue se fac in scopuri productive și prezintă o deosebita importanta industriala, biotehnologica in domenii de activitate de mare importanta economica si sociala. In fapt, cultura bacteriana este rezultatul inmultirii, cresterii numarului de germeni, intr-un mediu favorabil formandu-se o populatie avand caractere asemanatoare. Aspectul culturii bacteriene depinde de specia, varsta indivizilor precum si de mediul de cultura. Mediile de cultura bacteriana pot fi: artificiale, create in scopul asigurarii tuturor conditiilor pentru dezvoltarea si multiplicarea indivizilor si naturale (vii), avand provenienta animala (ou embrionat, animale de experienta, tesuturi animale, culturi celulare, sange etc.) si vegetala (culturi celulare, meristeme, parti din plante s.a.). Culturile bacteriene pot fi studiate in vitro – pe medii de cultura artificiale sau in vivo – direct pe mediile naturale, mai ales pentru germenii patogeni. Culturile bacteriene se dezvolta pe medii artificiale lichide si solide. Primele determina aparitia dupa o perioada de 18-20 ore a unei turbiditati (tulbureli) ce poate fi omogena, datorata germenilor de varsta tanara, cu vigoare ridicata care disperseaza uniform si rapid in mediu, denumita culturi S (smooth – netede) sau neomogena, cu grade de turbiditate diferite si uneori chiar limpezi dar cu depuneri pe vasele de cultura sau valuri de suprafata, purtand denumirea de culturi R (rough – rugoase). Culturile de medii solide sunt obtinute prin insamantarea germenilor bacterieni rezultati din multiplicarea unei singure celule bacteriene si se numesc colonii de culturi pure sau culturi clonare. Colonia bacteriana reprezintă cultura pură apărută după un timp de multiplicare de 2 - 6 ore, în care, din punct de vedere genetic, indivizii sunt identici. Dupa aspect, coloniile pot avea o forma geometrica regulata sau neregulata, conturate sau difuze, colorate sau necolorate, lucioase sau rugoase, limpezi, opace sau semimate, cu sau fara caracteristici specifice speciei. Coloniile - S au aspect lucios, cu margini conturate, forma rotunda sau ovoidala, diametru 1-2 mm, consistenta onctuoasa. Coloniile - R au suprafata aspra, forme cu margini neregulate, crenelate, uneori difuze in mediul de cultura, in general colorate si mate. Coloniile - M sunt variante ale tipului S dar contin germeni cu capsula si au o consistenta gelatinoasa sau mucilaginoasa, prezentand tendinta de a difuza in mediu sau de jonctiune intre ele. Coloniile - G sunt colonii pitice obtinute din germeni normali dar afectati de interventii exterioare (ex. antibiotice, antiseptice, carente nutritionale, etc.). Coloniile bacteriene se deosebesc intre ele prin anumite caracteristici de cultura, care, singure sau impreuna, constituie criterii de departajare. Astfel, diametrul coloniei bacteriene imparte coloniile in mari – cele care au diametrul mai mare de 2 mm, mijlocii si mici – coloniile cu diametrul sub 1 mm. O alta caracteristica este transparenta coloniilor. Sub acest aspect exista colonii translucide, ca cele date de streptococi si opace, caracteristice, in general, coloniilor de stafilococi. In functie de proprietatea de a produce pigmenti, bacteriile pot fi pigmentogene (cromogene), daca produc pigmenti, caz in care: a)se

70 coloreaza doar colonia (cazul bacteriilor cromofore si paracromofore) – de exemplu coloniile stafilococice colorate in alb, galben, auriu si b) se coloreaza si mediul, fiind cazul bacteriilor cromopare la care pigmentul este eliberat in exteriorul celulei – ca de exemplu bacilul piocianic care sintetizeaza si elibereaza in exterior doi pigmenti: piocanina – albastra si pioverina – verde. Alte caracteristici ce pot constitui criterii de identificare a coloniilor bacteriene, prezentate si anterior sunt: forma coloniei, rugozitatea coloniei, consistenta, forma conturului marginal, etc.

METABOLISMUL MICROBIAN În acest capitol sunt prezentate: • definitia, caracteristicile si caile metabolice ale metabolismului microbian; • tipuri de metabolism: energetic si de sinteza; • transportul substantelor 1. DEFINIȚIE, CARACTERISTICI, CĂI METABOLICE Definiție - Denumirea de metabolism vine din limba greaca, insemnand schimbare, modificare. Asadar se poate defini metabolismul microbian ca reprezentand totalitatea schimbarilor chimice, fizice si morfologice care au loc in celula microorganismului. Prin metabolism substantele din mediu sunt transformate (metabolizate) in constituienti celulari, energie si produsi de metabolism. Microorganismele autotrofe metabolizeaza substante anorganice.: dioxidul de carbon, apa, nitratii, elemente metaloide, compusi radioactivi. Cele heterotrofe folosesc in metabolism atat compusi anorganici cat si substante organice. Unii produsi, rezultati in urma activitatilor metabolice, prezinta o importanta deosebita in multe domenii precum agricultura, alimentatia, productia de medicamente, medicina umana si veterinara, etc. Caracteristicile principale ale metabolismului pot fi considerate urmatoarele: 1) prin reactiile metabolice se produce energie care se foloseste imediat in procese de biosinteza, crestere, transport sau se stocheaza sub forma esterilor fosforici ai unor acizi nucleici (de ex. adenozin fosfatii - ADP, ATP). 2) reactiile metabolice dau nastere constituientilor celulari si enzimelor implicate in metabolism; 3) metabolismul este un proces ciclic cu autoreglare ce mentine stabilitatea celulei, specificitatea si intensitatea reactiilor intracelulare, randamentul optim al activitatii celulare; 4) reactiile metabolice evolueaza dupa principiul eficientei maxime, adica productivitate maxima in reproducere, cu consum minim de energie; 5) toate reactiile biochimice metabolice sunt produse si catalizate de enzimele celulei, ce pot actiona (in functie de specificul fiecareia) in interiorul sau exteriorul microorganismului. 6) in procesele metabolice sunt implicati toti componentii celulei, cu exceptia acizilor nucleici, care avand rol ereditar, raman neschimbati. Necesitatea intelegerii modului de desfăsurare a metabolismului microorganismelor rezultă din consecintele practice ale acestuia, astfel: a) dezvoltarea unor procedee si practici adecvate impiedicarii proliferarii unor

70 microorganisme daunatoare sau nedorite de om, in profilaxia si combaterea unor boli; b) stabilirea unor biotehnologii si logistici necesare obtinerii unor produse de utilitate societatii umane, cum ar fi: alimente, medicamente, vitamine, etc.; c) aplicarea in practica a unor procedee de ecologizare si refacere a mediului ambiental cum ar fi degradarea si utlizarea deseurilor, refacerea terenurilor degradate de scurgerile petroliere prin utilizarea microorganismelor, etc.; d) bioingineriile genetice, etc. Căile metabolice prin care se desfasoara reactiile biochimice au loc in secvente enzimatice ce pot produce un metabolit intermediar sau unul final. Numim metaboliti produsele care participa la metabolism, atat cele ce sunt metabolizate, cat si cele rezultate in urma metabolizarii. Caile metabolice sunt dinamice, interdependente, se pot desfasura secvential si (sau) simultan, desfasurarea lor fiind functie de mai multe variabile, printre care: 1. caracteristicile si specificitatea microorganismului; 2. specificul, compozitia si concentratia substratului metabolizat; 3. caracteristicile mediului (temperatura, umiditate, etc.) in care isi desfasoara activitatea microorganismul; 4. concentratia metabolitilor rezultati sau folositi in reactii; 5. prezenta sau absenta unor substante specifice activatoare, inhibitoare, inductoare ale microorganismului sau a unor secvente metabolice. Desfasurarea secventelor poate fi liniara, atunci cand metabolitul rezultat din reactia enzimatica este folosit ca substrat in urmatoarea treapta, constituind astfel un lant liniar. Alte cai metabolice au o desfasurare ciclica, in care metabolitul utilizat la inceput poate fi regenerat pentru a-l folosi in initierea unui alt tur al ciclului. In anumite stadii secventiale, caile metabolice pot avea o desfasurare ramificata, una sau mai multe secvente producand metaboliti intermediari folositi ca substrat (reactant) pentru o urmatoare secventa (situatie in care tipul de cale metabolica este denumit ramificat convergent). Alteori, daca metabolitul intermediar este folosit ca substrat in doua sau mai multe secvente cu desfasurare simultana, atunci se poate spune ca avem de a face cu o cale metabolica divergenta. In metabolismul microbian sunt implicate doua tipuri de reactii biochimice, si anume: 1. reactii care au loc cu eliberare de energie (exergonice) cunoscute sub numele de reactii de degradare sau de catabolism (grec. katabole = distrugere, desfacere), acest tip de metabolism purtand numele de metabolism energetic ; 2. reactii de biosinteza, de anabolism (grec. ana = in sus, bole = aruncare) sau de conversie, consumatoare de energie (endergonice) prin care sunt sintetizate substantele compusilor nucleari, citoplasmatici, enzimele si alti compusi specifici celulelor microorganismelor, acest tip de metabolism fiind cunoscut sub numele de metabolism de biosinteza, sinonimele sale fiind anabolismul si metabolismul convertiv. Cele doua aspecte ale metabolismului reprezinta in fapt doua laturi contrarii ale unui fenomen unitar, procesele de catabolism si anabolism se presupun

70 reciproc, se conditioneaza unul pe altul si se desfasoara simultan in celula microorganismului. Interconditionarea celor doua tipuri de reactii este determinata de faptul ca energia rezultata din reactiile catabolice exergonice este folosita sub forma compusilor macroergici (grec. makros = mare, ergasthai = a lucra) in reactii anabolice consumatoare de energie (sunt cunoscuti multi compusi organici care inmagazineaza energia, printre care amintim: esterii fosforici ai acizilor nucleici, nucleofosfatii ca adenozin, uridinfosfatii, acetil erenzima A, etc.). De asemenea, o parte din metabolitii rezultati din reactiile catabolice pot constitui, partial sau total, reactanti de initiere (substrat ce este folosit) a unor cai anabolice ce conduc la sinteze de compusi celulari necesari dezvoltarii si existentei microorganismului. Prin urmare, căile metabolice centrale, descrise mai inainte, care indeplinesc atât functia energetică, cât si cea de furnizoare a precursorilor pentru biosinteza, sunt cunoscute sub denumirea de căi amfibiolice (grec. amphi = amandoua, dublu). Atunci când o cale metabolica centrala este blocata in funcționarea ei, prin folosirea intermediarilor rezultati in procesele de biosinteză, apar noi cai colaterale, auxiliare, cunoscute sub denumirea de căi metabolice anaplerotice. Prin folosirea acestor căi, celula microbiana se adapteaza rapid la conditii foarte diverse de mediu. Functionarea si interactiunea celor patru tipuri de cai metabolice sunt reglate de niste reactii de tip special (pace-maker), ce intersectează punctele esentiale. METABOLISMUL ENERGETIC Metabolismul energetic (catabolic) se desfasoara in doua faze: 1. faza descompunerii enzimatice a macromoleculelor in partile lor constitutive: aminoacizi, monoglucide, acizi grasi, etc., fara producere de energie utilizabila; 2. faza degradarii exergonice a constituientilor formati in prima faza, cu producerea unor cantitati importante de energie, utilizabila in alte reactii biochimice; energia este inmagazinata in compusi macroergici de tipul nucleotid fosfatilor. Degradarea are loc prin reactii de oxido-reducere in care o substanta donor doneaza un electron sau un ion de hidrogen unui acceptor, care astfel sufera o reducere. Reactiile redox sunt reversibile si catalizate enzimatic. Metabolismul catabolic (energetic) este cunoscut si sub denumirea de respiratie celulara si are urmatoarele caracteristici: • se desfasoara etapizat (in trepte); • energia se elibereaza in fractiuni, prin reactii de tip redox; • energia eliberata este inmagazinata in compusi chimici macroergici de tipul nucleotid fosfatilor si utilizata in reactii de biosinteza (anabolice), energie echivalenta cu 7.3 kcal/mol; • reactiile din metabolismul catabolic sunt juxtapuse celor anabolice; • celula microorganismului se "incarca" cu o cantitate de energie specifica, cunoscuta ca incarcare energetica sau energie potentiala, ce este data de suma concentratiilor compusilor chimici macroergici inmagazinati (de ex.: ATP + ADP + AMP care reprezinta cca 15 micromoli / g.s.n. celulara) putand fi

70 calculata cu relatia: Ep = 0.5 (ADP) + 2(ATP) / (AMP) + (ADP) + (ATP) Se intalnesc trei tipuri de respiratie celulara si anume: 1. FERMENTATIA - reprezinta procesul biologic de oxido-reducere producator de energie, in care substantele organice sunt si donori si acceptori de electroni, ca de exemplu zaharurile care prin degradare produc energie inmagazinata in forma de ATP (cca 30%) format prin reactii de fosforilare. Fermentatia constituie modalitatea principala de procurare a energiei la drojdii si bacterii anaerobe, glucidele (in principal glucoza) fiind cel mai des folosita in metabolism, folosindu-se doua cai principale, si anume: - ciclul glicolitic Embden - Mayerhoff - Parnas, cale folosita de majoritatea microorganismelor, in care donorul de electroni este aldehida fosfoglicerica, iar acceptorul final acidul piruvic, care ulterior este utilizat in mai multe tipuri de reactie (vezi mecanismul fermentatiei alcoolice). - calea glucofosfatilor Warburg - Dickens - Horecker, de natura strict aeroba, prin care se inmagazineaza jumatate din energia ciclului glicolitic; ea este o cale de scurtcircuitare (shuntare) a caii glicolitice, fiind folosita pentru sinteza pentazofosfatilor necesari in sinteza nucletidelor si a altor acceptori de electroni. Acestor cai li se mai pot adauga inca doua: - calea Enter - Douderoff (E.D.), care furnizeaza precursori pentru biosinteza ARN si ADN, vitamine si acizi aromatici, fara producere de energie (intalnita la unele specii de bacterii din genul Pseudomonas); - calea fosfocetolazei, intalnita la un grup mic de bacterii lactice heterofermentative si care implica participarea enzimei fosfocetolaza; pe aceasta cale acetil fosfatul este scindat direct dintr-un monoglucid cu 5 sau 6 atomi de carbon. Toate cele patru cai de folosire a monoglucidelor (glucozei) sunt interconectate, avand un important complex enzimatic comun. Totusi, microorganismele, avand o mare variabilitate genetica, isi aleg calea sau caile majore cele mai convenabile. Chiar aceeasi specie poate folosi, in raport cu conditiile in care traieste, una sau mai multe cai. 2. RESPIRATIA AEROBA - reprezinta acel tip de respiratie in care donatorul de oxigen este o substanta anorganica sau organica, iar acceptorul final de electroni este oxigenul, substratul fiind complet oxidat pana la CO2 si H2O. Asadar, respiratia aeroba se caracterizeaza prin aceea ca electronii eliberati prin oxidarea substratului sunt transferati la oxigen prin enzime transportoare, energia rezultata stocandu-se in ATP prin cuplarea acestuia cu reactiile de oxido-reducere. Modalitatea de obtinere a ATP cu reactiile redox este denumita fosforilare oxidativa si are ca rezultat (in cazul substratului de glucoza) o energie de 688 kcal/mol din care cca 40% este inmagazinata in ATP, mult mai mare decat prin fermentatii. Enzimele ce catalizeaza reactiile de transfer de electroni sunt dehidrogenazele si actioneaza in functie de potentialul lor de redox (rH), de la rH-ul mai negativ la rH-ul mai pozitiv cel mai ridicat. Toate enzimele actioneaza numai in prezenta unor coenzime specifice, astfel: dehidrogenazele pirimidinice au coenzime NAD+ si NADP+ (Eo = -0.32V), cele flavinice folosesc drept

70 coenzime FMN+ si FAD+ (Eo = 0.05V), aldolazele, citocromoxidazele, piruvatdehidrogenaza folosesc drept coenzime citocromii, feredoxina, rubredoxina cu rHnegativ, iar kinazele utilizeaza cinonele (coenzimele Q sau ubichinonele) cu rH pozitiv. Sistemul transportor de electroni este localizat in mitocondrii la microorganismele eucariote si in membrana plasmatica si mezosomi la cele procariote. 3. RESPIRATIA ANAEROBA - este acel tip de respiratie celulara in care acceptorul final de electroni poate fi orice substanta anorganica exceptand oxigenul, iar donorul un compus organic sau anorganic. Ea se intalneste numai la bacterii si este explicitata mai pe larg la partea de microbiologie care se refera la circuitul azotului, fosforului si fierului in sol. METABOLISMUL DE BIOSINTEZA (anabolism, metabolism convertiv) Tipul acesta de metabolism presupune procese biochimice prin care microorganismele isi sintetizeaza, din molecule simple, constituienti celulari, comuni sau specifici, necesari desfasurarii activitatii lor vitale. In reactiile de biosinteza se folosesc produsi si energie inmagazinata rezultate din reactiile de catabolism, ele fiind reactii consumatoare de energie (endergonice). Pentru ca reactiile anabolice sa aiba loc, microorganismele trebuie sa gaseasca in mediu sursele de carbon si de energie, iar calea principala care le furnizeaza sunt reactiile catabolice care se desfasoara simultan cu reactiile anabolice, aceasta fiind o caracteristica a metabolismului, asa cum s-a aratat mai pe larg la inceputul acestui capitol. TRANSPORTUL SUBSTANTELOR Transportul substantelor de la exterior in interiorul celulei microorganismului are loc selectiv si in dublu sens, prin mai multe mecanisme, principalele fiind: 1. Difuzia pasiva, care este mecanismul de trecere lenta a substantelor din afara in interiorul celulei si invers, fara consum de energie, pe baza gradientului de concentratie, de la o concentratie mai mare la una mai mica, pana cand concentratiile se echilibreaza. Prin acest mecanism se transfera putine substante, printre care apa, O2, CO2, acizii grasi, unele substante liposolubile prin membrana plasmatica. 2. Transportul prin transportor este mecanismul prin care un transportor specific (carrier), de natura proteica, situat in plasmalema, fixeaza substanta si o transporta in partea cealalta a membranei. El se realizeaza prin trei modalitati, si anume: • prin difuzie facilitata, transportul substantei fixate pe carrier avand loc, ca si la difuzia pasiva, pe baza diferentei de concentratie dintre cele doua fete ale membranei plasmatice, fara consum de energie, pana la echilibrarea concentratiei. • prin transport activ, realizat cu consum energetic, impotriva gradientului de concentratie. Energia necesara este cuplata la transportorul proteic ce contine

70 un cuplaj complementar pentru substratul respectiv. Aceasta modalitate de transport este folosita de majoritatea microorganismelor pentru glucide, saruri minerale, aminoacizi. • prin translocatie (transfer) de grup, substanta ce trebuie transportata modificandu-si structura chimica la trecerea prin membrana, astfel incat in interiorul celulei nu se mai regaseste substanta initiala. Aceasta modalitate de transfer are loc cu consum de energie si cu participarea enzimelor fosfotransferaze, care au legat fosfatul prin legaturi macroergice ce inmagazineaza energia necesara procesului de transfer.

70

ELEMENTE SI NOTIUNI INTRODUCTIVE DE GENETICA BACTERIANA Genetica este stiinta care se ocupa cu ereditatea* si variabilitatea materiei vii. Legile geneticii, ale ereditatii si variabilitatii, sunt aceleasi pentru toate fiintele, dar pot infatisa aspecte particulare in raport cu gradul de dezvoltare, de organizare a acestora. * lat. hereditas – mostenire; notiunea de ereditate a fost introdusa de H. Spencer (1863) pentru a indica asemanarile dintre parinti si urmasi. Ereditatea nu este o proprietate invariabila, premanenta, ci se supune legilor generale ale dezvoltarii in care confruntarea dintre stabilitatea caracterelor si tendinta de schimbare este permanenta, avand drept consecinta aparitia indivizilor care ii indeparteaza de exemplarul de origine tipic, cunoscuti sub denumirea de mutante (mutanti). Toate fiintele vii, inclusiv virusurile, bacteriile, fungii, indiferent de originea lor, vegetala sau animala, au o capacitate diferita de variabilitate in raport cu potentialul lor mutagen. Intre genetica microbiana si genetica fiintelor superioare se pot evidentia unele deosebiri pe care le vom arata in continuare: a) microorganismele isi asigura descendentii numai pe linie verticală determinând ceea ce se cunoaste sub numele de clone, ca urmare a mutatiilor si a haploidei* ca un fenomen al asexualitatii lor; la fiintele superioare are loc un proces sexual constand din fuziunea completa a doi genomi** proveniti de la o celula mascul si una femela ce da nastere la un zigot***; desi exista procese cu aspect sexual si la unele bacterii, acestea se diferentiaza de cele ale fiintelor superioare deoarece celula bacteriana donatoare lasa, de obicei, numai o parte din genomul sau celulei primitoare, fenomen cunoscut sub numele meromixis, genomul integrat celulei primitoare fiind denumit endogenot iar fragmentul partial al celulei donatoare, exogenot; din acest motiv celula descendenta este diferita in raport cu cele din care a provenit; * grec. haplos – simplu, jumatate; eidos – forma; haploidul este o celula somatica care poseda in nucleu un numar impar de cromozomi; haploidia este un fenomen care implica haploizii si totodata un procedeu de a obtine genotipuri homozigote la fiinte superioare. ** grec. genos – urmas; genom, termen indus de Winkler (1920) pentru a defini setul complet de cromozomi mostenit ca o unitate de la un parinte. *** grec. zygos – a uni, a impreuna: zigot – celula diploida rezultata din fuziunea prin fecundarea unui gamet femel cu un gamet mascul, din care se dezvolta embrionul; grec gametes – gamet – celula sexuala matura b) la bacterii, cromozomul recombinat este un cromozom nou, in care endogenotul si exogenotul este integrat, in timp ce la fiintele superioare cromozomul se formeaza prin schimb reciproc de segmente. 55 In continuare sunt prezentate sintetic principalele aspecte,

70 notiuni si metode referitoare la genetica bacteriana. Asadar, dupa cum s-a amintit mai inainte, zestrea genetica a unei bacterii reprezentate printr-un set complet de cromozomi o constituie genomul bacterian si este organizat nuclear (cromozomul) si extracromozomial, ambele materiale genetice asigurand ereditatea, capacitatea de a transmite descendentilor caracterele distinctive de specie. Potentialul genetic, reprezentand informatia genetica a unei bacterii, poarta denumirea de genotip, iar a celor exprimate, pentru ca nu toate caracterele genetice potentiale se pot exprima real, se numeste fenotip. Cromozomul bacterian, materialul nuclear al genomului, este compus din mai multe componente si anume: un ADN (acid dezoxiribonucleic) cu doua antene si structura helicoidala (dublu helix), care detine informatia pentru functiile vitale ale celulei (nucleul are un singur cromozom si un singur ADN, celula fiind haploida si nu este invelit de membrana nucleara); gena, o unitate elementara a ereditatii localizata in cromozom, asezata in lant de-a lungul cromozomului si care codifica informatia ce controleaza sinteza, functia si specificitatea unei enzime; cistronul, un segment de ADN care codofica informatia necesara pentru sinteza unei enzime (a unui lant polipeptidic) continand cca. 1500 perechi de nucleotizi aranjate liniar; codonul, reprezentand unitatea morfologica corespunzatoare unei secvente din trei nucleotizi dintr-un cistrom care codifica includerea (sau neincluderea) unui aminoacid intr-un lant polipeptidic*. *limbajul in care informatia genetica este codificata in ARNmesager considera bazele azotoase adenina-A, guanina-G, citozina-C, timina-T si uracilul-U ca fiind “litere” care sub forma unei secvente de 3 nucleotizi de baze azotoase formeaza “cuvintele”; citirea se face succesiv, in grupe de 3 baze, intotdeauna de la capatul genei si in acelasi sens. Codonii pot fi de trei categorii: cu sens, cand specifica aminoacidul ce trebuie inclus in lant, gresit (missens), cand arata un alt aminoacid in locul celui necesar si nonsens, daca nu specifica aminoacizii, dar codifica semnalul “stop” la implantarea lantului polipeptidic. Acizii nucleici contin in molecula azotoase pirimidice (de obicei citozina si guanina precum si ambele forme de acizi nucleici), un zahar (D-riboza si respectiv 2-dezoxi-Driboza), acid fosforic sub forma unor saruri de Mg, Ca, s.a. Materialul genetic extracromozomial detine informatii neesentiale, care se pot pierde fara a afecta viabilitatea celulei dar contribuie la variabilitatea bacteriana. El se compune din plasmide si segmente genetice transpozabile continand ADN sub forma de secvente scurte sau mai lungi, care prin inserare in cromozom provoaca succesiunea bazelor azotoase. Plasmidele se diferentiaza in: plasmide propriu-zise (cu control relaxat), care confera rezistenta la antibiotice, sunt libere in citoplasma si se inmultesc autonom de genofor dar nu se transfera dintr-o celula in alta (neconjugative) si episomii** (cu control strict), elemente genetice neesentiale formate din molecule circulare continand cateva mii de perechi de baze. In celula pot exista in doua stari alternative – autonomi in citoplasma sau inserati in cromozomi.

70 **grec. epi – pe; soma – corp (Thomson, 1931) De fapt, episomii pot fi considerati niste minicromozomi ce pot favoriza conjugarea și recombinarea naturala. Plasmidele propriu-zise sunt de mai multe tipuri: (a) Factorul “R”, ce detine mai multe gene ce codifica rezistenta la antibiotice (din care una “RFT” este capabila de a transfera rezistenta, chiar in lipsa factorului “F”); (b) Factorul “F”, independent de citoplasma; (c) Factorul “COL”, ce detine informatii pentru sinteza unor compusi cu actiune antibacteriana (colicine). Episomii sunt plasmide cu control strict si se gasesc in stare autonoma, libere in citoplasma, cand se pot inmulti indepndent de genofor si in stare integrata intr-un anumit punct in genofor, replicandu-se simultan cu genoforul. Episomii au mai multe functiuni si au denumiri ce provin din functia detinuta: Factorul F (Fertility), continand 11 gene, ce codifica sinteza unor componente ale unor pili sexuali, (el putand fi de tip mascul F+ , donator si de tip femel F- , primitor); Factorul Hfr (high frequency recombination), care ofera o frecventa de recombinare de sute de ori mai ridicata ca a factorului F, pe care il contine; Factorul Ti (tumour inducing), agentul inductor al convertirii celulei normale in celula tumorala (gasit prima oara in 1907 de Smith si Townscad in bacteria Agrobacterium tumefaciens); Bacteriofagul, virulent si/sau temperat, cu proprietatea de a distruge bacteriile prin adsorbtia la suprafata celulei susceptibile, distruge, prin dizolvare, membrana celulara si infecteaza, prin pedicel* ADN-ul specific in bacterie; Factorul Vhf (very high frequency of recombination), are calitatea, in opozitie cu factorul Hfr , de a transfera, cu o frecventa mult mai mare, markerii terminali ai cromozomului, etc. Ereditatea reprezinta asadar, dupa cum s-a aratat anterior, mentinerea caracteristicilor de specie a ADN-ULUI cromozomial prin replicare semiconservativa. Variabilitatea biologica reprezinta, in cazul bacteriilor, aparitia unor modificari in celulele fiice, de lunga sau de scurta durata ori definitive. Asadar, variabilitatea biologica poate aparea sub influenta unor conditii de mediu, fiind limitata de genotipul existent si denumindu-se fenotipica**. **grec. phainen – a aparea; typos – chip, imagine; fenotipul reprezinta totalitatea unui organism la un moment dat (Johannsen, 1909), fiind rezultatul dintre genotip si mediu. In acest caz, ea este de scurta durata si reprezinta totalitatea variatiilor biologice, fiind alcatuita din variatia mediului, provocata de influentele factorilor de mediu si variatia genetica. Daca variabilitatea este rezultatul exclusiv al genelor segregate, al interactiunii si efectului aditiv al actului genelor, ea se numeste variatie (varianta*) genetica si se transmite in descendenta prin replicare, fiind definitiva. *lat. variare – a schimba; variatia reprezinta suma patratelor abaterilor de la media aritmetica si se simbolizeaza cu s2 Notand cu urmatoarele simboluri: VB - variabilitatea biologica, cu VM variabilitatea mediului, VG – variabilitatea genetica, atunci: VB = VM + VG sau VG = VB - VM Proportia din variabilitatea totala care este controlata de ereditate, in special

70 cea determinata de genele multipla cu efecte aditive (VA) se numeste heritabilitate (H sau h2) si se defineste ca fiind raportul dintre variatia genetica aditiva (VA) si variatia biologica: A B A G M h2 =V V =V V +V

Mutatiile, care presupun modificarea secventei bazelor azotoase, astfel incat numarul celulelor descendente difera de cel al celulelor mama, apar in perioada de diviziune celulara exponentiala, din cauza ritmului foarte rapid de crestere in timpul autoreplicarii. Celula care a suferit mutatia se numeste mutant. Mutatiile pot fi spontane, ce apar ca greseli de copiere in timpul autoreplicarii, datorita vitezei de autoreplicare, sau induse de catre factori inductori (agenti mutageni), ce pot fi fizici (radiatii u.v., X, gamma, etc.), chimici (ex. aminopurina) si biologici (de ex. gene supresor non sens care permit inserarea unui aminoacid in lantul polipeptidic al mutantului). Schimbarile ce pot aparea in cursul mutatiilor sunt variate, multiple si de multe ori imprevizibile deoarece actioneaza intr-un lant polimolecular cu sute si mii de secvente diferite, prin inlocuirea, inserarea, surprinderea sau inversarea ordinii bazelor azotoase. Transferul si recombinarea genetica este cea de a doua cale de a obtine mutanti, prin care, o celula donoare face transfer de material genetic la o celula receptoare, prin transmiterea unor fragmnte de ADN sau al intregului genom al celulei donoare la celula receptoare. Transferul si recombinarea genetica pot fi realizate prin trei modalitati: transformare, transductie si conjugare, pe care le vom descrie in continuare. In cazul transformarii, mutantul preia ADN-ul din cromozomul donorului, in starea fiziologica numita starea de competenta, in care ADN-ul transformat strabate peretele si membrana plasmata. Este un mecanism genetic care determina, de exemplu, rezistenta la antibiotice. Transductia este un fenomen descoperit de Zinder si Lederberg in 1952, care consta in transmiterea caracterelor de la o cultura bacteriana la alta cu ajutorul bacteriofagului, prin inocularea ADN-ului acestuia in celula bacteriana. Dar transductia poate avea loc si dupa urmatorul scenariu: bacteriofagul poate ramane intr-o stare neinfectioasa (stare de profag) cand se fixeaza de cromozomul bacteriei si se divide sincron cu aceasta, comportare numita lizogenie. Genele bacteriene pot fi transferate de la o celula la alta de catre fagii nevirulenti (temperati), caz in care au fost denumiti si fagi transductanti. In fine, cea de-a treia metoda de transfer si recombinare genetica o constituie conjugarea*, care reprezinta un proces ce determina unirea (sinapsa) unor cromozomi in meioza** de la materialul donor la acceptor prin episomi F+ si F(plasmide autonome libere in citoplasma cu functii sexuale). Celula donoare poseda factorul “F+” pe care il trece in celula receptoare care contine factorul “F-”, prin pilii sexuali. Spre deosebire de celulele fiintelor superioare, la care zigotul*** se formeaza din genoamele integrale ale celor doi parteneri, la bacterii, donorul lasa, de obicei, numai o parte din genomul sau acceptorului. In acest caz, fenomenul de transfer partial genetic se numeste meromixis****, iar zigotul partial merozigot. *lat. conjugatio – impreunare, unire **grec. meion – mai mic; meioza (diviziune reductionala) este totalitatea fenomenelor complexe

70 premergatoare formarii gametilor (celule sexuale mature) ***grec. zygotos –imperechiat, unit ****grec. meros - parte Conjugarea este calea cea mai frecventa de castigare a rezistentei la antibiotice. Bacteriile, dupa cum se stie, nu au cromozomi in sensul clasic al notiunii, ci ele poseda o singura formatiune cromozomiala circulara alcatuita din ADN dublu catenar cu o lungime de 1000-1400 micrometri care formeaza un singur grup de linkage. In general, bacteriile sunt complet haploide numai in anumite circumstante, de exemplu atunci cand sunt sub forma de spori. In restul ciclului vital ele sunt partial diploide datorita replicatiei ADN - ului care face ca unele gene sa se regaseasca intr-o singura doza, altele in doua sau chiar patru doze, aceasta deoarece, uneori, inainte de terminarea primei replicatii a ADN - ului, incepe al doilea sau chiar al treilea ciclu de replicatie. Atunci cand replicatia ADN - ului nu are loc, celulele bacteriene sunt haploide, partial diploide sau diploide in functie de momentul cand sinteza ADN - ului a fost blocata.

70

MORFOLOGIA ŞI BIOLOGIA SPORULUI BACTERIAN SPOROGENEZA BACTERIILOR Dupa cum se arata la morfologia bacteriilor, anumite specii de bacterii (de exemplu familia Bacillaceae) au o forma de rezistenta cunoscuta sub denumirea de spor. Forma sporului este sferica sau elipsoidala, dar pot exista mai rar si alte forme (suveica, maciuca), având dimensiuni reprezentând 5-15% din celula mamă. Aceste bacterii se transformă în spori, forme primitive de diferenţiere celulară, cu rezistenţă crescută la factorii de mediu şi care apar endocelular în condiţii nefavorabile de viaţă. Aceștia au un inveliş rezistent, format din mai multe straturi datorită căruia rezistă în mediul extern zeci de ani. Sporogeneza se întâlneşte numai la 2 genuri de bacterii gram-pozitive de interes medical, Clostridium şi Bacillus. Poziţia sporului bacterian constituie un caracter taxonomic. Poate fi centrală, subterminală şi terminală.

Figura 8 – Poziţia sporului Sporularea se declanşează în condiţii nefavorabile de viaţă, când bacteriile sunt lipsite de surse nutritive.

Figura 9 - Structura sporului Sporii nu sunt forme de înmulţire ale bacteriilor. Dintr-o bacterie vegetativă se formează un singur spor, care în condiţii favorabile de viaţă germinează şi va da naştere unei singure celule bacteriene vegetative identice cu aceea în care s-a format. Rolul sporului este asigurarea perpetuarii speciei bacteriene in conditii nefavorabile, bacteria trecand in aceasta forma de rezistenta, care nu are nici un rol in multiplicare sau patogenitate. Sporul la bacterii prezinta o forma primitiva de diferentiere celulara. El se

70 formeaza ca un tip nou de celula in celula vegetativa, cu ultrastructura, compozitie chimica si enzimatica diferita de ale celulelor vegetative, prezentand o deosebita rezistenta la conditii nefavorabile de mediu. Unele constrangeri mecanice specifice sunt impuse de natura peretelui celular in procesul de sporogeneza, de vreme ce toate bacteriile sporogene cu exceptia genului Desulfomaculum sunt grampozitive. Sporogeneza este un caracter de specie la bacterii din clasa Bacillaceae. La bacteriile anaerobe din genul Clostridium sporul este o structura constanta in timp ce la genul Bacillus sporul apare in mod facultativ. Pentru bacterii, forma caracteristica de spor este endosporul. El apare in interiorul celulei vegetative numite sporangiu sub forma unei formatiuni foarte rezistente in conditii de mediu nefavorabile. Endosporul este o formatiune sferica sau ovoidala al carui volum reprezinta 5-15 % din volumul si 30% din greutatea sporangelui. Structura clasica a endosporului bacterian este formată din trei straturi: exina-invelisul exterior, medina-stratul median si altul interior-intina care la randul lor se compun dintr-unul sau mai multe straturi. Sub invelisul sporal se gaseste un al doilea invelis de natura glucoproteica, numit cortex, avand un rol mixt de rezistenta mecanica, de reglare a presiunii osmotice care favorizeaza in anumite conditii transferul apei libere din endosperm spre exterior. In interiorul acesteia se afla celula propriu-zisa – protoplastul sporal format din sporoplasma (citoplasma continand organite ribozomiale si nucleoplasma). Sporularea se poate considera ca are loc in trei etape, si anume: pregatitoare, faza de prespor si stadiul de spor matur. La inceputul sporularii celula prezinta doi nucleoli complet separati spatiali ce condenseaza intr-un filament axial de cromatina, dupa care acesta se separa din nou in doi cromozomi, dintre care unul migreaza la o extremitate a celulei unde va fi izolat printr-un perete intr-un compartiment corespunzator viitorului spor. In acest compartiment sinteza ADN este inhibata. Aceasta poate fi considerata faza pregatitoare. In continuare are loc sinteza unor substante specifice sporale ce compun protoplastul sporal (presporul) si apoi a peretelui celular peptidoglicanic al viitoarei bacterii, iar cortexul sporal capata structura rigida care ii confera rezistenta deosebita la variatii de temperatura (si peste 100oC) si la scaderea umiditatii. In celula sporală au loc modificari substantiale compozitionale si fiziologice: volumul si greutatea se reduc, continutul de apa scazand de la cca 80% la aproximativ 15%; astfel structura ei gasindu-se acum sub forma de apa legata de diferite componente citoplasmatice, care sa favorizeze ulterioarele reactii biochimice. Modificarile mentionate au drept urmare formarea invelisurilor sporale prin depozitarea pe suprafata cortexului a unor straturi proteice multiple si incorporarea de cisteina*, iar citoplasma devine mai omogena, mai densa. Este faza de maturare, de spor matur, cand sporul se afla in stare de viata latenta (criptobiotica) in care enzimele sporale se afla in stare de inactivare, iar metabolismul endosporului este redus la zero, caracteristic starii de anabioza, desi celula nu este moarta. *aminoacid cu grupari sulfhidrice ce au proprietati de donatori –

70 acceptori de electroni, component al acizilor nucleici. Faza de spor matur se caracterizeaza prin acumulare in cantitate mai mare (10 – 15 %) de acid dipicolinic*, un compus specific capabil sa formeze chelati cu ionii de calciu si/sau magneziu, determinand in aceasta forma modificari structurale in sporoplasma, care au drept consecinta o crestere a rezistentei sporului la factori nefavorabili de mediu. *acid 2,4 piridin dicarboxilic Astfel, in timp ce celula vegetativa este inactivata la temperaturi putin peste 65oC in cateva minute, endosporul este inactivat termic abia in 10-20 de minute in mediu umed si la 180oC timp de 45-60 de minute in mediu uscat. Aceasta rezistenta la temperaturi ridicate se explica prin continutul mare de proteine cu sulf si a complecsilor acidului picolinic. Sporularea bacteriilor este un proces morfogenetic programat sa se desfasoare etapizat ,fiind controlat de cca. 50 de gene. Se cunoaste de exemplu ca sporogeneza la Bacillus subtilis este controlata de 42 de gene ale sporula Formarea sporului presupune o trecere de la un potential genetic total al unei celule vegetative la unul selectiv specific sporului insotit de o regresie a genelor vegetative. Trecerea de la forma vegetativa la sporulare se caracterizeaza printr-un moment critic, dincolo de care nu se mai poate influenta in nici un fel evolutia sporului, fenomenul fiind cunoscut prin sintagma fenomen de angajare. Sporogeneza reprezinta o alternativa a cresterii vegetative de adaptare a celulelor procariote la conditii fluctuante de mediu ce depasesc limitele normale de crestere. In timp ce bacteriile propriu-zise formeaza endospori, bacteriile actomicete, filamentoase si ramificate cu o mare varietate de tipuri morfologice, de regula gram-negative, produc un alt tip de spori numiti actinospori, ce au trei forme principale si mai multe intermediare: sporangiospori, endospori si artrospori (spori hifali). In cazul acestor bacterii sporogeneza este diferita fata de cea anterior descrisa, avand 4 stadii succesive si anume: la inceput celulele miceliene se spiraleaza, viitorul spor fiind separat de hifa printr-un perete ce determina formarea unor celule egale ce vor deveni spori. Apoi, in hifa sporogena are loc o aparitie a septurilor de sporulare asociate cu prezenta mezozomilor la distante de cca 1-2 micrometri. Septurile apar prin cresterea spre interior a unor diafragme inelare duble, ca o continuare a peretelui celular si a membranei citoplasmatice. Urmeaza formarea unui perete helicoidal gros, semirigid, dupa care sporii, initial de forma cilindrica, capata forma elipsoidala, peretele micelian vechi dezintegrandu-se. In faza de spor matur, sporii elipsoidali sunt inlantuiti si legati de filamentul vegetativ doar printr-o singura membrana. Mai sunt si alte tipuri de spori, ca de exemplu cei de origine hifală (artrospori)*, care provin din ingrosarea peretilor celulelor vegetative si acumularea de substante de rezerva, ori gonidiile rezultate prin contractia, condensarea si divizarea protoplasmei unei celule vegetative avand rol de reproducere (la Leptothrix ochracea), deosebindu-se intre ei atat structural, cat si prin rolul lor biologic. *arthrom – articulatie; askos – sac; aktinos - raza; mykes – ciuperci; kenis – praf; kistis – sac, vezica

70 Sporul – formă biologică de compensare → unele specii bacteriene plus alte microorganisme → rezistenţă mare la factorii de mediu → rol exclusiv în multiplicare la anumite specii, mai ales la fungi. Celula vegetală → sporulează → spor. Iniţierea sporulării → endospor – mono, rar bisporulate. Sporul → germinare → celulă vegetativă. Sporularea și germinarea sunt influențate de factori genetici represaţi de procese interne şi factori de mediu. Speciile sporogene cele mai cunoscute aparțin genurilor Bacillus și Clostridium (ambele au formă dreaptă, de bacil). Sporul bacterian – formă dormantă → proprietăţi:  Absenţa activităţii biosintetizante  Absenţa funcţiei de multiplicare  Intensitate scăzută a funcţiilor vitale (se reduc activitățile vitale)  Rezistenţă foarte mare față de diverși factori de mediu (temperatură, substanțe chimice, umiditate scăzută, etc). Etapele sporogenezei I.

Pregătirea celulei pentru procesul de sporogeneză  Contopirea materialului genetic într-o masă cromatică.  Segmentarea şi reorganizarea masei cromatice – replicarea acesteia în 2 cromozomi. II. Formarea presporului – stadiu incipient spor.  Constituirea unui sept transversal prin invaginarea membranei citoplasmatice – separarea cromozomilor central/excentric.  Evoluţia pe căi diferite a celor 2 segmente celulare: 1. Prespor → gradul ridicat de refringenţă şi opacitate faţă de lumină → organizarea învelişurilor sporale 2. Sporangiu – restul celulei vegetative care poate suferi liză totală (Bacillus cereus) sau rămâne ataşat de spor un timp nedefinit (Clostridium tetani). III. Maturarea sporului – stadiul final al organizării constituenților sporali cu însuşiri biologice caracteristice:  compoziţia chimică specifică  activitate metabolică scăzută  rezistenţă mare la factori fizici (temperatură) sau chimici. Constantele morfologice şi fizice ale sporului 1. Forma sporului– de regulă ovală, cu excepţia formei sferice la Cl. tetani. 2. Dimensiuni: L de 1,5-2 μm l de 0,5-1,2 μm. 3. Volumul este mai mic decât al celulei vegetative. 4. Afinitatea tinctorială este diferită faţă de cea a celulei vegetative.

70 • •

Se colorează și prin metoda Gram (palid contur spor) Pentru colorarea energică se folosesc soluţii concentrate. 5. Aşezare spor: central, subterminal, terminal, lateral. 6. Forma bacteriilor sporulate:  bacil nedeformat – spor central, genul Bacillus  lămâie – spor central (transversal mai mare decât al celulei vegetative), genul Clostridium  lampă de petrol – spor subterminal  rachetă de tenis – spor terminal  excentrică. Structura sporului Structură – densitatea este mai mare decât la celula vegetativă. 1) Inima sporului (sâmbure/core) – protoplast • sporoplasma corespunzătoare citoplasmei –alcătuită din granule de 10nm (ribozomi) • nucleoplasma – material nuclear ADN 2) Membrana internă (intină) ~ membranei citoplasmatice 3) Cortex (strat gros) extern membranei interne format din peptidoglican 4) Înveliş extern (exină/tunici sporale) – structură polilamelară 5) Exosporina (înveliş suplimentar) la anumite specii– rol de anvelopă laxă 6) Apendicii sunt expansiuni exterioare ale sporului, sub formă de smoc, cu lungimea 2-3 ori mai mare de decât lungimea sporului 7) Corpii parasporali sunt formaţiuni cristaloide – aflate pe suprafaţa sporului Particularităţile sporogenezei 1. Particularităţi biochimice:  Cantități reduse: apa liberă şi sărurile de P şi K  enzime metabolice lipsesc  concentraţi mari de Ca2+, Mg2+, Mn2+, cisteină 2. Particularităţi fiziologice  procese metabolice reduse  schimburi de substanţe nutritive (nu există) 3. Particularităţi biologice:  termorezistentă – căldură umedă (120oC) sau uscată (180oC) Germinarea sporului Fazele germinării  iniţierea germinării –transformarea sporului – creşterea volumului prin absorbţia de apă însoţită de pierderea însuşirilor specifice

70

 creşterea postgerminativă – redobândirea însuşirilor morfologice Determinismul proceselor de sporogeneză – germinare  factori genetici, aproximativ 50 de gene dispersate în celula vegetativă de compuşii chimici din mediu  factori de mediu: activant(+) sau inhibant(-) Factorii de mediu activanţi pentru sporogeneză sunt: temperatura optimă (18-49oC la B. anthracis), uscăciunea la speciile aerobe. Pentru germinare, temperatura optimă de multiplicare diferă de la o specie la altă specie, umiditate, şoc termic la 60-80oC. La speciile anaerobe aceștia sunt pH-ul=6-8, substanţele chimice (glucoza, aminoacizii, Ca2+, K2+, Na2+). Implicaţiile ecologice ale sporogenezei – existenţă saprofită → supravieţuirea nelimitată şi multiplicarea în medii naturale.

70

VIRUSURILE Virusurile sunt agenti patogeni alcatuiti din proteine si acizi nucleici de dimensiuni extrem de mici - intre 10 si 300 milimicroni – vizibile doar cu ajutorul microscopului electronic si activand intotdeauna ca paraziti celulari si intracelulari. Virusurile sunt lipsite de organizare celulara si intracelulara si ocupa un loc intermediar intre moleculele proteice si bacterii, avand forme spatiale diferite: cilindrice, sferice, ovoidale, poliedrice etc. Sub aspect compozitional, virusurile au doar un singur tip de acid nucleic (ARN sau ADN) si nu dispun de un complex enzimatic capabil de reproducere. Odata patrunse in celula gazda, virusurile modifica metabolismul celular, astfel incat, in locul metabolismului celular caracteristic, se substituie metabolismul specific virusului. Bolile produse la plante si la animale de catre virusuri se numesc viroze, ce se manifesta atunci cand sistemul imunitar, genetic sau dobandit, nu mai poate face fata atacului virulent. Virozele cele mai frecvente la om sunt cele ale gripei, ale hepatitelor B si C, ale poliomielitei, febrei aftoase, etc. La plante virozele cartofului, mozaicul tutunului,etc. Constituentii virali - structura virusurilor este atat de regulata si cristalina incat multe virusuri purificate formeaza agregate mari sau cristale daca sunt supuse anumitor tratamente. Organizarea unui virus este simpla si compacta, continand numai acele parti necesare pentru a invada si controla o celula gazda: un invelis si un miez central. Modelul de organizare a unui virus poate fi prezentat astfel:  Capsida  Invelis  Anvelopa (nu este prezenta la  toate virusurile)  Particula virala (virion)  Molecula de acid nucleic  Miez central (AND sau ARN) = genom viral  Diferite proteine (enzime) Nomenclatura virusurilor - Comitetul International de Taxonomie al Virusurilor (ICTV = International Commitee on Taxonomy of Viruses) este autoritatea care furnizeaza sistemul universal de clasificare si nomenclatura virusurilor. Acest sistem se bazeaza arbitrar pe nivele ierarhice de: ordin, familie, subfamilie, gen si specie. Nivelele inferioare speciei (subspecie, tulpina, varianta) sunt stabilite de experti apartinand unor grupuri speciale internationale. Nomenclatura formala a virusurilor nu implica utilizarea termenilor binominali latinizati. Numele de familie, subfamilie si gen se scriu cu litera initiala mare si caractere italice. Numele speciei, cu unele exceptii, nu se scrie cu litera mare si nici cu caractere italice. Exemplu: Ordinul Mononegavirales, Familia Rhabdoviridae, genul Lyssavirus, virus rabic. Nomenclatura virusurilor utilizeaza si termeni vernaculari, informationali: virusul gripal, virusul rabic.

70 Denumirea virusului are diferite proveniente: aspectul microscopic (forma, marimea), zona geografica sau anatomica de izolare, efectele asupra gazdei sau mai multe caractere combinate. De exemplu: togavirus, lat. toga = roba este un virus care are o anvelopa ca o manta; adenovirus, gr. aden = glanda, descoperit pentru prima data in vegetatiile adenoide; herpesvirus, numit dupa caracterul de raspandire al eruptiei herpetice, gr. herpes = a se furisa, etc. BACTERIOFAGII Exista unele virusuri care paraziteaza celulele bacteriene si provoaca distrugerea lor. Acestea poarta denumirea de bacterioifagi, mancatori de bacterii si sunt raspandite in toate mediile in care se gasesc bacterii. Caracteristic acestora este forma de cireasa cu coada; capul rotund cuprinzand ADN inconjurat de un invelis proteic,capsida,in care se afla o molecula de AND (sau ARN viral) iar coada,pedicel, formata din proteine, are la partea terminala o zona enzimatica capabila sa dizolve peretele celulei bacteriene, creand o bresa prin care infuzeaza ADN propriu. In prezenta unei bacterii, fagul este absorbit la suprafata celulei bacteriene,dizolva membrana, si prin pedicel injecteaza AND-ul fagic,care preia toate functiile de multiplicare.Prin multiplicarea ADN-ului bacteriofagului are loc dizolvarea celulei bacteriene si eliberarea virusului care poate ataca noi celule. Aceasta comportare reprezinta ciclul litic sau vegetativ,iar bacteriofagul se numeste virulent.. Daca sub aspect medical actiunea bacteriofagilor este benefica, ei fiind folositi in combaterea unor infectii, in unele domenii de activitate, acolo unde se utilizeaza bacterii, de exemplu in biotehnologii, virozarea cu bacteriofagi poate avea efecte catastrofale, compromitand uneori in totalitate productiile. Din acest motiv, cunoasterea fiziologiei si a morfologiei virusurilor bacteriofagi, a conditiilor lor de dezvoltare, constituie un factor esential in salvarea productiei. VIROIZII SI PRIONII Exista un numar mic de entitati cunoscute, ale caror proprietati sunt in dezacord cu definitia virusurilor, ca elemente genetice care modifica procesul celular normal, supunandu-l propriei replicari si care au o forma extracelulara. Ca atare, aceste entitati nu sunt considerate, in prezent, virusuri, desi par strans inrudite cu acestea. Din categoria acestor entitati, care reprezinta o categorie aparte de agenti infectiosi subvirali, fac parte viroizii si prionii. Viroizii sunt molecule mici de ARN circular care nu codifica proteine si sunt total dependente, pentru replicare, de enzimele codificate de celula gazda. Izolati in 1971 de T.O. Diener, viroizii au fost considerati virusuri, ulterior stabilindu-se conceptul de viroid. Spre deosebire de virusuri, la viroizi forma lor extracelulara este aceeasi cu forma intracelulara si nu au invelis proteic (capsida). Viroizii sunt cei mai mici agenti patogeni cunoscuti (de la viroidul cadang cadang al cocotierului care are 246 nucleotide, la viroidul citrus exorticus din 375 nucleotide). Ei reprezinta o categorie speciala de agenti patogeni subvirali, exclusiv la plante, determinand boli grave la importante forme de cultura: tuberculii fusiformi de la cartof; nanismul hameiului; nanismul si marmorarea clorotica la crizanteme si

70 altele. Interesant este ca molecula de ARN infectanta nu contine gene pentru codificarea proteinelor si deci viroidul este total dependent, pentru replicarea sa, de functiile gazdei. Existenta viroizilor ridica mai multe probleme interesante si intrigante in legatura cu boala pe care o reproduc. Localizarea viroizilor, in principal, in nucleul celulei gazda, impreuna cu capacitatea lor de a servi ca matrita ARN-ului, sugereaza ca simptomele de boala pot rezulta din interferenta viroidului cu mecanismele genetice si functiile metabolice ale gazdei. O asemenea interferenta poate determina producerea unor proteine "gresite". In mod cert, viroizii sunt sisteme genetice independente, cu proprietati determinate de secventa nucleotidica a acizilor ribonucleici respectivi. Prionii reprezinta extrema cealalta fata de viroizi, luand in consideratie parametrii care definesc virusurile. Ei au o forma extracelulara distincta, dar forma extracelulara este reprezentata in intregime de proteina. Cu toate acestea, particula de proteina este infectioasa si sunt cunoscuti diferiti prioni care produc o varietate de boli la animale si la om. Termenul de prion a fost introdus de Prusiner S.B., care in 1980 propune ipoteza prionului, pentru a distinge, de viroizi si virusuri, particulele infectioase proteice ce determina un grup de boli neurodegenerative. Bolile neurodegenerative determinate de prioni sunt in prezent clasificate impreuna, deoarece etiologia si patogeneza lor implica modificarea unei proteine celulare normale numite Prusiner PrP (proteina prionica). Aceste boli se manifesta ca boli infectioase, ereditare si sporadice. Acestea includ: encefalopatii transmisibile, encefalopatii spongiforme, etc. Boli reprezentative: scrapia oilor, boala "vacii nebune", boala Creutzfeld - Jacob, insomnia familiala fatala, etc. Pe lânga boala cu urmari grave, infectia prionică are ca rezultat producerea mai multor copii ale proteinei prionice. Aceasta proteina trebuie sa fie codificata de acid nucleic, altfel, existenta prionilor ar pune sub semnul intrebarii modelul central al fluxului de informatie genetica. Cunoasterea viroizilor si prionilor prezinta interes din mai multe motive: • extind definitia data virusurilor, fata de care sunt caracterizati; 23 • demonstreaza existenta atat a unor modalitati neasteptate prin care elementele genetice se pot replica, cat si a unor modalitati neasteptate prin care pot supune celulele gazda; • determina boli grave care la om au un caracter unic prin aceea ca sunt atat boli genetice (ereditare) cat si infectioase. Biologia prionilor, cu radacini in virologie, neurologie si neuropatologie, a devenit mai recent corelata cu disciplinele de biologie celulara si moleculara, ca si de chimie a proteinelor. Cunoasterea exacta a modalitatilor de multiplicare a prionilor si de producere a bolii vor deschide cu siguranta noi perspective in biochimie si genetica.

70

CIUPERCI MICROSCOPICE Ciupercile microscopice sunt denumite şi mucegaiuri – grupul fungi – microorganisme de tip eucariot cu un corp (tal) alcătuit din: organ vegetativ filamentos + organe reproducătoare specializate diferenţiate în funcţie de gen şi specie. Organul vegetativ este filamentos, unicelular/pluricelular –format din hife (miceliu) Înmulţirea se face prin sporulare – sporii fiind asexuaţi/sexuaţi. Răspândirea în natură: Rezervor natural – solul- vehiculaţi prin curenţii de aer. Straturile superficiale ale solului – organisme aerobe – degradarea materiei organice moarte – saprofit – degradare prin echipament enzimatic complex. Substanţele organice macromoleculare (celuloza, hemiceluloza, proteinele, lipidele) – întreţinerea circuitului natural al carbonului în natură – compuşi cu moleculă mai mică care pot fi sursa de hrană pentru alte organisme (bacterii) – humus. În apă se întâlnesc accidental. Bolile se numesc micoze – paraziţi la plante şi animale, așa de exemplu, mana, rugina, tăciunele, aspergiloza la animale, candidoza la animale şi om. ORGANIZAREA CELULARĂ A CIUPERCILOR MICROSCOPICE Corpul ciupercilor microscopice se numeşte tal, putând fi uni/pluricelular. Organul vegetativ filamentos = miceliu, ajută la absorbţia substanţelor nutritive din mediul exterior – celule filamentoase (hife) ramificate în jurul sporului germinat (ø = 1 – 1,5μm). Forma miceliului: - înmugurit/pseudomiceliu → drojdii + fungi imperfecți şi muguri aderenţi cu aspect de coroană - propriu-zis/adevărat – tuburi miceliene ramificate:  nesegmentat – unicelurar - celulă uriaşă = miceliu cenolitic, la clasa Phycomicetes  segmentate - pluricelular – hife din celule alungite cu pereţi despărţitori cu por şi nuclei în număr caracteristic fiecărei specii, de exemplu la clasele Ascomycetes, Basidiomycetes, Deuteromycetes. Partea reproducătoare – conține organe sporifere formate din elemente celulare diferenţiate pentru producţia de spori. Tipuri de spori: - perfecţi, obţinuţi pe cale sexuată la fungii perfecţi, clasa Eumycetes - imperfecţi, obţinuţi pe cale asexuată – organe de propagare la toţi fungii. Structura celulară

70 Prezintă caracteristici comune eucariotelor la care se adaugă altele specifice: - perete celular – conține de β – glucoză în cantitate mare - membrană plasmatică aderentă de citoplasmă - nucleul – formă sferică/ovoidală (ø = 1-2μm) – număr mic de cromozomi cu 2 sau mai mulţi nuclei. - incluzii de glicogen, granule de amidon, picături de grăsime Dinamica procesului de creştere Punctul de plecare este sporul care dezvoltă → hife submerse + hife absorbante + hife de extindere → în final, hife aeriene cu aspect pufos, lânos, catifelat. Miceliul se dezvoltă sub formă de raze – aspectul fungilor fiind de colonii extinse cu filamentele tinere spre exterior, iar cele bătrâne şi/sau moarte în centru. Spre final, se dezvoltă organele de reproducere, iar sporii sunt pigmentaţi în culoarea caracteristică. Caracteristici generale  fungii au echipament enzimatic complex – degradează orice substanţă organică  temperatura optimă este de 25-28oC, dar rezistă până la 90oC  xerofite, se adaptează la condiții cu apă liberă în cantitate mică  pH = 1-11, dar la valoarea de 5 este optim  majoritatea sunt aerobe, o mică parte sunt microaerofile şi facultativ anaerobe  pigmenţii sunt intracelulari şi extracelulari  produc exotoxine (toxine care migrează în afara microorganismelor şi îmbolnăvesc plantele, animalele şi omul)

70

ECOLOGIA ȘI IMPLICĂRILE MICROORGANISMELOR ÎN NATURĂ ȘI ÎN ACTIVITĂȚILE UMANE RĂSPÂNDIREA MICRORGANISMELOR ÎN NATURĂ Se poate preciza de la bun începul faptul că microrganismele au o mare capacitate de adaptare la condiții extreme de viață, incomensurabil mai mare decât a altor specii. Acest aspect este justificat de posibilitatea microrganismelor de a utiliza nutrienți inacesibili altor specii, așa de exemplu azotul molecular sau hidrocarburile. În sens evoluționist, microrganismele au perfecționat structuri funcționale care le facilitează răspândirea în mediu, precum sunt sporii în aer, cilii sau flagelii în apă sau caracterele de patogenitate. De asemenea au o capacitate rapidă de multiplicare în număr considerabil într-un timp foarte scurt putând coloniza noi habitate. Distribuția microrganismelor în mediu este influențată de particularitățile biotopului, așa de exemplu, bacteriile halofile sunt adaptate apelor sărate, bacteriile sulfuroase fotosintetizante anaerobe – ape stătătoare, bacteriile sulfuroase anaerobe- ape sulfuroase stătătoare, bacteriile sulfuroase aerobe-a ape sulfuroase cu turbiditate mare. Practic, răspândirea microrganismelor în natură este ubicvitară în toate mediile, aesr, sol, apă , biotă, având bineînțeles asigurate condiții favorabile de viață (hrană asimilabilă, tᵒ , umiditate, pH, etc),dar și condiționată de unii factori de mediu, cum sunt curenții de aer, curenții marini sau animalelle migratoare. Microflora habituală, care populează un habitat la un moment dat este încadrată în două tipuri, autohtonă, întâlnită în mod obisnuit, și alohtonă, reprezentătă de specii de microorganisme care nu frecventeză un habitat decât în anumite circumstanțe. Prima categorii de speciise identifică ușor întrucât microorganismele sunt fixate pe roci, plante sau animale. Diversitatea speciilor de microorganisme este influențată de bogăția în substanțe nutritive, populațiile fiind abundente și heterogene în medii bogate din punct de vedere nutrițional sau reduse numeric, formate dintr-o singură specie în cazul mediilor sărace în hrană. FACTORII DE MEDIU ŞI ACTIVITATEA MICROORGANISMELOR Factorii de mediu (ecologici) sunt factori abiotici care influențează dezvoltarea, activitatea fiziologică şi înmulţirea microorganismelor. Cunoaşterea relaţiei microorganism – factori de mediu conferă oportunitate în dirijarea activităţii lor fiziologice → activităţi dorite/stoparea activităţii lor. Fiecare factor de mediu declanşează un răspuns specific reprezentat grafic printr-o valoare optimă, o valoare minimă şi una maximă. Clasificarea factorilor de mediu: - factori fizici: temperatura, umiditatea, radiaţiile, presiunea atmosferică - factori chimici: pH, potenţialul de oxidoreducere, efectul faţă de substanţele chimice

70 1. Temperatura – microorganismele au exigenţe diferite cuprinse între 10 şi 105oC. Tipuri de microorganisme:  psihrofile (criofile, frigofile) – au un conţinut ridicat în lipide, capsula de natură poliglucidică (colonii mucilaginoase) mobile, pot prezenta pigmenţi, biotopul este constituit din sol, ape reci şi aer. Ex. bacterii – (Pseudomonas, Achrobacter, Aerobacter, Alcaligenes )+ fungi – (Candida, Rhodotorula, Cladosporium, Penicillum, Geotrichum)  mezofile, sunt numeroase, în sol, apă, sunt macroorganisme homeotrofe, conduc la putrefacţie şi sumt patogene.  termofile, au un metabolism foarte rapid, modificări structurale la proteine şi enzime termostabile, în structura lor sunt prezente complexe termostabile (poliamide) formate din acizi nucleici cu procent ridicat în citozină, timină, Mg, Ca. Biotopul este constituit din izvoare termale, gunoi de grajd, sol (bacteriile Streptomyces thermophille, B. sthearothermophyllus, Cl. nigricans; fungi Candida tropicalis, Aspergillus fumigatus) 2. Umiditatea- cea din sol are cea mai mare importanţă, umiditatea redusă determină dezvoltarea mare a actinomicetelor şi fungilor; inhibă dezvoltarea microorganismelor (bacterii foarte sensibile – celulozolitice, nitrificatoare, fixatoare de azot). Seceta mare determină dezvoltarea redusă a microorganismelor, favorizând apariția formelor de rezistenţă (chişti/spori) ex. actinomicetele – genuri eliminate; ex. Rhizobium, beijerinkia. 3. Radiaţiile -influenţa lor este corelată cu lungimea de undă. →radiaţiile ionizante, alfa, beta, gamma au fluxuri de electroni rapide, radicali liberi în funcţie de doza de iradiere, au efecte letale, mutagene, de adaptare. →radiaţiile gamma au putere mare de penetrare, sunt utilizate în sterilizarea la rece. Prezenţa oxigenului micşorează rezistența microorganismelor la iradiere  tratamentele termice micşorează rezistenţa microorganismelor la iradiere  bacteriile sunt mai sensibile decât fungii  bacteriile Gram+ sunt mai rezistente decât cele Gram-. Expl. Achromobacter este specia cea mai rezistentă Micrococcus radiodurans → radiaţiile X – putere de penetrare mică, sterilizarea aerului → radiaţiile UV – lungimea de undă = 136-4000Å, efectul antimicrobian maxim = 254nm întrucât distrug structura bicatenară a ADN – penetraţie mică în apă – 1cm – utilizate la sterilizarea apei potabile şi a aerului. → radiaţiile luminoase – lungimea de undă mai mare de 4000Å – efect pozitiv la fototrofe şi negativ la chimiotrofe. →ultrasunetele au efect distructiv la mai mult de 16000Hz prin erupţia structurii celulare – sterilizarea lichidelor şi obţinerea produşilor intracelulari (enzime, toxine, proteine). 4. Presiunea hidrostatică este relevantă în mediul marin populat cu microorganisme barofile denitrificatoare, prin care nitraţii sunt reduşi în nitriţi în condiţii de anaerobioză

70

5. Presiunea osmotică influențează microorganismele în funcție de cantitatea de substanţă dizolvată în mediul celular şi mediul de cultură. Tipuri de microorganisme:  normale, cale care adoptă presiuni osmotice reduse  osmofile, adoptă presiuni osmotice ridicate (concentraţii mari în glucide, ex. bacteriile 15-40%, mucegaiurile şi drojdiile 70%  halofile, adoptă presiuni osmotice ridicate (concentraţii mari de sare, ex. Micrococcus, Diplococcus, Sarcina, Bacillus; bacterii nitrificatoare, denitrficatoare, protolitice, sulfobacterii în mări şi oceane)  osmotolerante, acceptă în general presiuni osmotice ridicate Microorganismele au dezvoltare optimă la presiune osmotică intracelulară egală cu presiunea osmotică a mediului. Mucegaiurile au sensibilitate mare, excepţie făcând Aspergillus şi Penicillum. 6. Fenomenul de adsorbţie este influențat de natura chimică a substanţelor (legături ionice, forţe van der Waals) proprietăţile unor celule ale microorganismelor (încărcarea electrică, sinteza de substanţe gumoase). - argilele, au suprafeţe absorbante ideale prin rugozitatea particulelor foarte mici şi prezenţa cationilor. De natura cationilor depinde calitatea microorganismelor. Ex. Azotobacter se absoarbe foarte bine în soluri saturate în Fe3+ şi Al3+. Efectele absorbţiei: modificarea pH-ului, scăderea vitezei de difuzie a ionilor, concentrarea substanţelor nutritive (organice, biologic-active, toxine, antibiotice, vitamine). MICROFLORA AERULUI Sursele de microorganisme pentru aer și caracteristicile lor sunt:  Solul, apa și macroorganismele vegetale și animale, microorganismele fiind înglobate în substanțe organice, diseminate de agenți fizici, mecanici și biologici;  Microorganismele supraviețuiesc temporar, nemultiplicându-se în acest mediu;  Rol de vehicul la distanțe diferite prin inetrmediul curenților de aer;  Microorganismele sunt transportate sub formă de agregate celulare aderente de particulele de praf sau picăturile de apă, fiind deplasate de convecția termică și turbulența maselor de aer. Densitatea și numărul microorganismelor variază în funcție de altitudine, fiind întâlnite până la înălțimea de 12000m, densitatea fiind invers proporțională cu înălțimea, numărul cel mai mare de microorganisme se găsește în jurul altitudinii de 500 m, fiind influențate de frig, radiații ultraviolete și umiditate relativă scăzută. Numărul microorganismelor este mare la nivelul spețiului aerian aferent orașelor, spre deosebire de zonele alpine unde este foarte mic. În comunitățile umane numărul și densitatea microorganisme fluctuează în funcție de densitatea populației.

70 Tipurile de microorganisme din aer sunt reprezentate de specii saprofite, patogene și condiționat patogene. Se consideră că circa 20% din bolile de natură infecțiosă sunt transmise pe calea aerului. Reprezentanți cei mai frecvent întâlniți sunt încadrați în genurile Staphylococcus, Sarcina sau Micrococcus. Factorii care influențează viața microorganismelor din aer sunt reprezentați de: • Temperatură-temperaturile din sezonul cald de primăvară și vară permit dezvoltatea exponențială a microorganismelor, pe de altă parte, iarna microorganismele sunt în număr mai redus din cauza temperaturilor neprielnice devzoltării microorganismelor; • Luminozitatea este un alt factor limitator pentru dezvoltarea microorganismelor întrucât radiațiile ultraviolete au rol distructiv pentru celula acestora; • Nebulozitatea este un factor stimulator vaporii pentru dezvoltarea microorganismelor, vaporii de apă în cantitate mare favorizându-le; • Speciile de microorganisme inzestrate cu forme de rezistență se sunt prezente în număr mai mare în acest mediu. Importanța microorganismelor din aer rezidă din faptul că acestea constituie un însemnat vehicul al agenților etiologici ai unor boli cu transmitere prin aer cum ar fi tuberculoza, difteria, antraxul, virozele respiratorii (gripele animalelor și omului), encefalopatiile, rujeola,varicela, micozele. De asemenea, aerul contribuie la realizarea poluării microbiologice, prin răspândirea microorganismelor de degradare, a căror acțiune păgubitoare este evidentă în multe domenii economice (industria alimentelor, furajelor, lemnului, etc). Având în vedere aceste aspecte, controlul microbiologic al aerului este un parametru util în diagnosticul epidemiologic servind la stabilirea din punct de vedere igienic a potențialului de transmitere patogenă aerogenă a unor boli, fiind de aceea frecvent aplicat spațiilor închise. MICROFLORA APEI În ceea ce privește acest mediu vital vieții, sursele de microorganismele sunt prezente aici direct proporțional cu conținutul în substanțe organice și anorganice din apă. Densitatea și numărul microorganismelor în funcție de proveniența sursei de apă pot fi descrise astfel:  Apă freatică - teoretic pură (sterilă) întrucât microorganismele sunt absente;  Apă de izvor - poate să conțină până la 20 microorganisme/cm3 ca urmare a însămânțării prin contactul direct cu straturile superficiale ale solului și atmosferei;  Apă de râu – în acest tip de apă se află o microfloră permanentă și o alta accidentală provenită din cadavre și dejecții; microorganismele patogene din această apă se reduc numeric prin diluție progresivă în funcție de debitul acestor râuri, de asemenea scad progresiv și din cauza rezistenței diminuate față de acești noi factori de mediu diferiți de cei naturali ai gazdei purtătoare parazitată (temperatură, resurse nutritive, exigențe respiratorii)), concurență cu microorganismele autohtone, consumul de

70





 

către bacteriofagi și protozoare sau efectul bactericid al ultravioletelor, cu alte cuvinte apele de acest tip oferă condiții vitrege microrganismelor alohtone (străine), precipiatțiile abundente conferind posibilități remarcabile privind creșterea numerică a microorganismelor din apa de râu; Apa lacurilor – asigură ca urmare a turbidități reduse stratificarea orizontală și verticală a microorganismelor, existând un număr mai mare de micorcelule la malul acesora, în sedimente, la temperaturi ridicate, aceste ape fiind mai cuarte din punct de vedere microbiologic decât cea de râu, reprezentată sute de milioane microorganisme/g; Apa mărilor și oceanelor – este reprezentată de microorganisme adaptate la presiuni osmotice și hidrostatice ridicate pentru a degrada materia organică, repartiția acestora fiind realizată pe verticală, abundența lor fiind maximă până la adâncimi de 75 cm, reprezentate de bacterii halofile și criofile, Marea Neagră reprezentă o excepția în această privință, întrucât densitatea și numărul maxim de microorganisme este întâlnit la adâncimea de 180-200 m adâncime, în zona cu hidrogen sulfurat în concentrații mari, aici fiind prezente bacteriii sulfuroase, sulfatreducătoare sau reducătoare; Apa de ploaie - în special, în regiunile poluate urbane este o sursă importantă de microorganisme spre deosebire de zonele nelocuite; Apa fecaloid-menajeră – este o apă cu un conținut foarte mare în microorganisme (1012 microorganisme/cm3) multe din specii fiind enterobacterii de tip coli.

Tipurile de microorganisme din apă sunt reprezentate de bacterii aerobe, facultativ anaerobe și strict anaerobe. Așa de exemplu, sunt prezente microorganismele acvatice cromogene (Sarcina aurantică, sarcina lutea, Chromobacterium violaceum, Pseudomonas fluorescens). De asemenea, întâlnim microorganisme organotrofe saprofite cu rol proteolitic, amonificator, nitrificator, denitrificator, fixatoare de azot și sulfobacterii. Bacteriile patogene sunt și ele uneori prezente, fiind surse primare de îmbolnăvire pentru oameni și animale cu germeni din genul Salmonella (S. typhi - febra tifoidă), Shigella (dizenteria), Corynebacterium (difteria), etc. Eschericia coli este o bacterii cu un rol aparte, de indicator microbiologic al calității apei. Importanța microorganismelor din apă este reflectată de mai multe aspecte, astfel: 1) Procesul de autopurificare a apei care constă în degradarea substanțelor organice adsorbite de diferite particule în suspensie sau sedimentate în mâl ajunse acolo prin poluare chimică sunt degradate de microorganisme prin procese de putrefacție și mineralizare în substanțe mai simple. Aceste substanțe servesc la rândul lor de hrană altor microorganisme (biomasă), autopurificarea realizânduse în două faze:  Faza de reducere este prima din faze cronologic vorbind, fază în care sunt active procesele anaerobe;  Faza de oxidare este faza în care sunt activate procesele aerobe, au loc oxidări intense, substratul organic scade cantitativ, în același ritm reducându-se și multiplicarea microbiană realizându-se autopurificare a

70 apei, preces definitivat de acțiunea bacteriofagilor. Acest proces este utilizat cu succes în fluxul tehnologic al stațiilor de epurare. 2) Productivitatea ecosistemelor acvatice este un important parametru în mediile acvatice, microorganisme fiind o importantă sursă de hrană pentru protozoare și metazoare, consumatori de ordinul I, care constituie la rândul lor hrană pentru alte categorii de cunsumatori. 3) Procesul de mineralizare constă în transformarea în elemente biogene a unor elemente chimice aflate sub formă de sedimente de fier și zăcăminte de petrol. 4) Importanță igienică privind potabilitatea apei prin aprecierea calității apei pe baza următorilor indici bacteriologici:  NTG reprezintă numărul total de germeni, fiind o metodă folosită la determinarea bacteriilor mezofile și organotrofe, acestea fiind cuprinse în intervalul 10-10000 microorganisme/cm3.  Numărul bacteriilor coliforme reflectă prezența bacteriilor de origine intestinală, E. coli fiind bacteria cea mai monitorizată dintre acestea datorită rezistenței mari în apă prin două tipuride teste:  IC (indexul colic) care reprezintă numărul probabil de coliformi/l apă, de exemplu apa potabilă are valori între 3-10/l apă;  TC (titrul coli) reprezintă cantitatea cea mai mică de apă în care se admite prezența E.coli, acesta fiind egal cu 300cm3 la o apă cu IC=3. Poluarea microbiologică a apei Procesul de poluarea microbiologică a apei este realizat de două tipuri de poluanți, astfel: 1) Poluanții primari sunt microorganisme de origine terestră sau aeriană deversate în diferite ape de suprafață, contribuind la impurificarea lor, așa cum se întâmplă cu unele bacterii de tip intestinal, virusuri și drojdii patogene. 2) Poluanți secundari sunt microorganisme autohtone obișnuite care contribuie la impurificare apelor prin proliferări intense, modificând caracterele organoleptice ale acestora (gust, miros, culoare). Aceste microorganisme sunt reprezentate de: a) Bacterii saprofite acvatice-foarte utile pentru că degradează substanțele organice poluante, așa de exemplu, ferobacteriile dezvoltate pe substraturi dure sau macrofite, care pot determina și coroziunea biologică a conductelor; sulfobacteriile din apele sulfuroase capabile să corodeze metalele, lemnul, ceramica, cauciucul, asfaltul; bacteriile mucilaginoase prezente în mâlul organic sub formă de agregate de filamente, capabile să colmateze filtrele și să obtureze conductele. b) Fungii sunt microorganisme prezenți în ape cu substanțe organice în cantitate mare, putând afecta și chiar distruge plantele acvatice, branhiile peștilor și chiar fauna bentonică, determinând mirosul și gustul neplăcut al apei, iar pe de altă parte diseminându-se prin sporii care traversează filtrele din rețeaua de apă potabilă. MICROFLORA SOLULUI

70 Microorganismele se pot găsi la mii de metri adâncime în ocean, la câțiva metri în pământ sau chiar pe stânca goală in desert. Dezvoltarea lor depinde de conditiile de nutritie si de ceilalti factori ai mediului extern. Masa de bacterii este raspandita neuniform in sol, astfel ca, pornind de la straturile superioare catre adancime, numarul microorganismelor devine tot mai mic. Dar nici microflora nu mai este aceeasi, ea modificandu-se in diferite stadii de mineralizare: la inceput bacterii asporogene, apoi sporogene. Astfel, in ordinea succesiunii apar urmatoarele grupe de bacterii: a. Bacterii nitrificatoare - genul Nitrobacter b. Bacterii denitrificatoare - Bacterium denitrificans, Bacterium fluorescens c. Bacterii fixatoare de azot - genul Azotobacter, Clostridium pasteurianum d. Bacterii ce se gasesc in nodozitati - Rhizobium phaseolus; la plantele leguminoase Rhizobium leguminosarum e. Bacterii de putrefactie - Bacillus sporogenes f. Bacterii butirice - Clostridium butyricum g. Bacterii sporogene - Bacillus mycoides, Bacillus mesentericus

INTERACȚIUNILE DINTRE POPULAȚIILE DE MICROORGANISME Majoritatea habitatelor naturale sunt populate de un număr mare de specii de microorganisme. Criterii de clasificare a interacțiunilor dintre populațiile de microorganisme sunt următoarele: 1.Localizarea și modul de existență al microorganismelor reprezentate de: • Comensalism • Simbioză • Parazitism • Prădare 2. Rezultatul asocierii manifestat ca: • Indiferent (neutralism/mutualism) • Benefic (cooperarea) • Dăunător (antagonism) 3. Gradul de dependență al speciilor de microorganisme participante: • Accidental • Facultativ • Obligatoriu În comunitățile biologice complexe funcționează mai multe interacțiuni concomitent sau chiar toate interacțiunile amintite anterior. Interacțiunile (+) măresc șansele dezvoltării populațiilor beneficiare, iar pe de altă parte interacțiunile (-) scad sansele dezvoltării populațiilor sensibile. Importanța acestor interacțiuni este reflectată în mecanismul de autoreglare numerică cu efect ecologic benefic, prin care se împiedică suprapopularea habitatelor și extinderea unor specii nedorite într-un anumit biotop.

70

RELAŢII ECOLOGICE ALE MICROORGANISMELOR In natură, diferite microorganisme nu trăiesc izolat. Trăind in acelaşi habitat mai multe specii, între ele se stabilesc interrelaţii complexe şi deosebit de importante. Mai ales în sol şi apă ele formează microbiocenoze. În timpul activităţii lor, ele intră în corelaţie unele cu altele, atât între ele, cât şi cu plante sau animale. Corelaţiile sunt foarte variate şi complexe. RELAŢIILE DINTRE MICROORGANISME Coexistenţa microorganismelor poate duce la diferite tipuri de interrelaţii:  sinergice – interrelaţii pozitive  antagonice – interrelaţii negative  indiferenta – interrelaţii neutre. Pe măsură ce numărul de microorganisme prezente într-un habitat creşte, şansele ca unul din aceste microorganisme să afecteze profund creşterea celuilalt scade, deoarece probabilitatea unei interacţiuni eficace între două microorganisme este mai mică. INTERRELAŢII DE NEUTRALISM Acest tip de interrelaţii apar în cazul când în acelaşi habitat întâlnim microorganisme cu necesităţi nutriţionale total diferite, astfel încât ele să nu intre în competiţie pentru acelaşi substrat nutritiv. Asocierea este lipsită de influențe reciproce considerabile, apare în condiții de mediu nefavorabile creșterii active, având importanță . Interrelaţiile apar atunci când în acelaşi habitat întâlnim microorganisme cu necesităţi nutriţionale total diferite, motiv pentru care nu intră în competiţie pentru acelaşi substrat nutritiv. INTERRELAŢII SINERGICE Sunt relaţii benefice uneia sau tuturor părţilor participante. Astfel două sau mai multe specii de microorganisme pot coopera în procese unde o singură specie nu ar putea atinge rezultatele scontate. Aceste interrelaţii se întâlnesc în diferite forme şi grade de manifestare. – Relaţii de comensualism Comensalismul este un tip de interrelaţie între două microorganisme în care numai unul dintre parteneri beneficiază, în timp ce celălalt nu este afectat. Relaţia este numită şi metabioză, adică succesiunea dezvoltării unor microorganisme pe seama activităţii altora. Astfel unele dintre ele creează condiţii favorabile de viaţă pentru altele. Asocierea se explică prin faptul că unii dintre parteneri elaborează substanţe care favorizează dezvoltarea celorlalţi parteneri.

70 Acest tip de interrelaţie poate îmbrăca mai multe aspecte, în funcţie de modul de acţiune al unuia dintre parteneri. Un microorganism poate modifica proprietăţile fizico-chimice ale habitatului creând condiţii favorabile dezvoltării altui microorganism. (Exp. Bacteriile anaerobe se pot dezvolta pe diferite produse numai datorită acţiunii bacteriilor aerobe care consumă oxigenul vătămător pentru ele. Drojdiile osmofilele se dezvoltă în concentraţii mari de zahăr. În urma oxidării şi fermentării acestuia, presiunea osmotică a soluţiei scade şi permite dezvoltarea drojdiilor neosmofile. În infecţia secundară cu agenţi patogeni la animale şi plante, un microorganism patogen primar pregăteşte calea altui microorganism patogen secundar). Un microorganism poate modifica substratul nutritiv făcându-l accesibil altui microorganism. (Exp. Microorganismele care descompun substanţele proteice şi determină alterarea alimentelor, creează posibilitatea dezvoltării microorganismelor care utilizează produsele de dezagregare ale proteinelor şi care sunt incapabile să descompună proteinele. Drojdiile, în procesul de fermentaţie, transformă zahărul în bioxid de carbon. Pe acest mediu, în care se găseşte alcool etilic, se dezvoltă bacteriile acetice. Acestea transformă alcoolul în acid acetic, care mai departe poate să fie oxidat de mucegaiuri în bioxid de carbon şi apă). Bacteria Nitrobacter trăieşte în asociere cu Nitrosomonas care îi furnizează nitriţii necesari în nutriţie. Bacteriile celulozolitice hidrolizează celuloza pâna la monozaharide, acizi organici şi alcooli asimilabili folosiţi ca sursă energetică de către Azobacter). Un microorganism produce un metabolit sau factor de creştere esenţial pentru un alt microorganism. (Exp. Desulfovibrio desulfuricans reduce sulfaţii la hidrogen sulfurat, care va fi oxidat aerob sau anaerob de bacteriile sulfuroase nepigmentate sau de cele fotosintetizante. Metanobacteriile produc, în anaerobioză, metan care va fi oxidat în anaerobioză de bacteriile metanooxidante. Unele microorganisme din sol secretă acizi aminici şi vitamine cu rol de factori de creştere pentru alte bacterii din sol). Un microorganism distruge sau neutralizează un factor chimic nociv pentru un alt microorganism. (Exp. Biodegradarea bacteriană şi fungică a fenolilor, acidului benzoic şi antibioticelor face posibilă dezvoltarea unor microorganisme sensibile la aceste toxine). – Relaţii de mutualism Mutualismul sau simbioza nutriţională, reprezintă interrelaţia în care fiecare dintre microorganismele implicate este avantajat. Acest tip de interrelaţie se deosebeşte de simbioza propriu-zisă prin faptul că nu este obligatorie şi permanentă. De exemplu, acest tip de interrelaţie se poate manifesta în sinteza unui metabolit care nu este sintetizat de niciunul din microorganismele cultivate separat. Cooperarea se poate referi fie la degradarea unor substanţe complexe, fie chiar la sinteza unor compuşi complecşi. Asociaţiile bacteriilor Bacter ftizic şi Bacter morgan formează în prezenţa unor zaharuri, metaboliţi gazoşi, pe care niciuna din cele două specii nu-i produce în culturi izolate. Cultivând împreună Mucor ramanianum şi Rhodotorula rubra este posibilă sinteza vitaminei B1, deoarece fiecare participant sintetizează altă parte a moleculei acestei vitamine.

70 Lactobacillus arabinosus nu poate creşte într-un mediu lipsit de fenilalanină, iar Streptococcus fecalis într-un mediu lipsit de acid folic. Crescute împreună, se dezvoltă bine chiar în medii lipsite de această substanţă deoarece fiecare bacterie sintetizează factorul de creştere necesar celeilalte. – Relaţii de simbioză Relaţia de simbioză este o relaţie de ajutor reciproc. Este deci un raport mutual favorabil între două unităţi de microorganisme diferite. Asocierea aceasta are scopul unor beneficii reciproce. Simbioza propriu-zisă presupune permanenţa relaţiei dintre parteneri, ei neputând exista independenţi. De Bary este primul microbiolog care a formulat conceptul de simbioză prin care definește viața împreună la licheni. Simbioza este în fapt o coabitare de lungă durată între două sau mai multe specii aflate în imediată apropiere, ceea ce conduce la obținerea de beneficii reciproce. Clasificarea simbiozelor se poate face după următoarele criterii: Tipul organismelor asociate: a) între două specii de microorganisme; b) între un microorganism și un macroorganism. Localizarea microorganismelor asociate: a) ectosimbioze, caz în care microorganismul este situat exterior celulelor sau țesuturilor gazdei (bacteriile inclavate în teaca gelatinoasă a cianobacteriilor sau la suprafața frunzelor sau organelor luminoase la pești sau în cavitățile corpului); b) endosimbioze, apar și se dezvoltă atunci când un microorganism în interiorul celulelor sau țesuturilor gazdei Gradul de dependență: a) facultative atunci când sunt libere sau asociate în natură ( așa de exemplu, relația dintre bacteria Rhizobium și plante leguminoase este posibilă în funcție de cantitatea de N anorganic; b) ecologic obligate (așa de exemplu, relațiile dintre bacteriile și protozoarele din rumen-obligate ereditar; algele endosimbiotenevertebrate marine) Natura relației: a)mutualistă- se produce atunci când ambele organisme participante se adaptează mai bine împreună; b) parazitară- se produce atunci când unul din parteneri este mai bine adaptat într-o asociație Condițiile de realizare a simbiozei Grad de permanență în cea mai mare parte a vieții organismului Specificitate desemnată ca fiind capacitatea de recunoaștere reciprocă a simbionților, realizată pe baza complementarității particularităților partenerilor. Semnificație ecologică-schimb de nutrienți și dispozitive comune de recunoaștere, apărare și favorizarea prădării, așa de exemplu, transferul de materii organice fotosintetizate la heterotrofe. Un caz interesant de simbioză este cel din chefir, o băutură acidulată din lapte, care este produsă prin simbioza între bacterii lactice şi drojdii. Acest produs conţine acid lactic, alcool şi bioxid de carbon. Drojdiile se dezvoltă în mod obişnuit în mediu acid, deci acidularea laptelui creează condiţii favorabile pentru rezvoltarea acestora. Drojdiile, consumând acidul lactic produs de către bacteriile lactice, favorizează dezvoltarea acestora, deoarece aciditatea ridicată le este vătămătoare. Pe lângă aceasta, drojdiile produc vitamine, de care bacteriile lactice au nevoie.

70 Relaţii de simbioză între bacterii şi drojdii se întâlnesc şi în aluatul de pâine, sau în bragă. Simbioza se întâlneşte şi între bacterii şi protozoare, caz în care simbioza este intracelulară. – Interrelaţii antagonice Relaţiile de antagonism sunt raporturi între microorganisme în care dezvoltarea unei specii este stânjenită sau total împiedicată de dezvoltarea altei specii. Acţiunea dăunătoare se poate datora unor mecanisme diferite:  modificarea condiţiilor de mediu,  competiţiei,  elaborarea unor substanţe toxice sau inhibitoare,  parazitismului,  predatorismului. – Antagonismul prin modificarea condiţiilor de mediu De exemplu în sol, prin activitatea unor microorganisme rezultă cantităţi mari de bioxid de carbon care inhibă dezvoltarea altor microorganisme sensibile (Rhizobium). Bioxidul de carbon acidifică în acelaşi timp mediul eliminând microorganismele sensibile la pH acid (Azotobacter, Nitrosomonas, actinomicetele). Scăderea potenţialului de oxido-reducere prin hidrogenul sulfurat produs de bacteriile sulfatoreducătoare elimină din mediu microorganismele aerobe. – Antagonismul prin competiţie În natură, substanţele nutritive se găsesc în cantităţi limitate, microorganismele intrând în competiţie pentru procurarea lor. Este deci o competiţie nutritivă.

PRINCIPII DE TAXONOMIE BACTERIANĂ In acest capitol sunt prezentate: • notiuni privind clasificarea, nomenclatura si identificarea microorganismelor • nivele de clasificare • desemnarea numelui stiintific al speciilor • sistemul natural, filogenetic de organizare a lumii vii

70 Taxonomia se ocupa cu studiul clasificarii, nomenclaturii si identificarii organismelor vii. CARL VON LINNE', un botanist suedez, a fost cel care si-a dat seama de importanta existentei unui sistem de recunoastere si definire a proprietatilor organismelor, stabilind reguli fundamentale pentru categoriile taxonomice sau taxoni. Sistemul lui Linne' a servit cu succes la incadrarea in categorii a celor peste doua milioane de tipuri diferite de organisme descoperite ulterior. Clasificarea este aranjarea ordonata a organismelor in grupe, preferabil intr-un sistem bazat pe relatii evolutive. Nomenclatura este procesul de desemnare a numelor pentru diferitele ranguri taxonomice ale fiecarei specii de microorganisme. Identificarea este procesul de descoperire si inregistrare a trasaturilor organismelor, asfel incat ele sa poata fi introduse intr-o schema taxonomica globala. Toti acesti termeni se aplica in sistematica, ce reprezinta studiul diversitatii microorganismelor si al relatiilor intre ele. NIVELE DE CLASIFICARE Taxonii principali intr-o schema de clasificare sunt organizati in 7 ranguri descendente, incepand cu un regn, cel mai mare si cel mai general, si terminand cu o specie, cel mai mic si cel mai specific. Toti membrii unui regn au in comun numai una sau cateva caracteristici generale, in timp ce membrii unei specii au in comun majoritatea caracteristicilor lor, reprezentand toti acelasi fel de organism. Intre nivelul superior si cel inferior, cei cinci taxoni in ordine descendenta sunt reprezentati de: phylum (pentru animale si protozoare) sau diviziune (pentru bacterii, fungi, alge si plante), clasa, ordin, familie si gen. Bacteriile sunt studiate, cu rare exceptii, nu ca indivizi, ci ca populatii obtinute in laborator sub forma de culturi pure. Culturile pure pot fi mentinute in stare viabila, subcultivate, supuse testelor experimentale si transportate de la un laborator la altul. Unitatea taxonomica fundamentala este specia bacteriana, care este definita dupa alte criterii decat la organismele superioare. Pentru bacterii nu exista granite strict naturale ale speciilor, nici separare geografica. Sub aspect practic specia bacteriana poate fi considerata ca o colectie de alte tulpini. Tulpina reprezinta unitatea practica de lucru, fiind formata din descendentii unei singure izolari din mediu, in cultura pura. Colonia reprezinta o aglomerare macroscopica de celule, care apare pe o zona bine delimitata a suprafetei mediului de cultura solid si provine din multiplicarea unei singure celule. Una dintre tulpinile speciei este desemnata ca tulpina tip si serveste ca tulpina purtatoare de nume pentru specie. Tulpinile tip ale speciilor sunt depozitate in asa numitele colectii de culturi (colectii de tulpini). De aici ele pot fi obtinute si utilizate ca tulpini de referinta pentru compararea directa cu izolatele noi in vederea identificarii lor corecte. Genul bacterian este un grup taxonomic bine definit, alcatuit din specii, in mod clar separate de alte genuri. DESEMNAREA NUMELUI STIINTIFIC AL SPECIILOR

70 Pentru desemnarea numelui stiintific sau specific este utilizat sistemul binominal (cu doua nume) al nomenclaturii. Numele stiintific este intotdeauna o combinatie a numelui de gen, urmat de numele de specie (epitetul specific). Initiala genului din numele stiintific este scrisa intotdeauna cu litera mare, iar a speciei cu litera mica. Ambele nume sunt scrise cu caractere italice sau subliniate. Epitetul specific se scrie cu initiala mica si nu se prescurteaza. Pentru denumirile stiintifice se utilizeaza limba latina sau greaca. Numirea unui organism nou descoperit este supervizata de un grup international de experti care verifica daca au fost urmate procedeele standard si ca nu exista deja un nume dat anterior organismului sau un alt organism cu acelasi nume. Denumirea unui numar de specii a fost data dupa numele unui microbiolog care a descoperit microorganismul respectiv sau a adus contributii importante in domeniu. Alte nume provin de la o particularitate a microorganismului (forma, culoare), locul unde poate fi gasit sau boala pe care o produce. Exemplificam cu cateva nume specifice: • Pseudomonas tomato - Gr. pseudo = fals; monas = unitate; tomato = fruct. Deci o bacterie care infecteaza tomatele. • Lactobacillus sanfrancisco - L. lacto = lapte; bacillus = bastonas mic. O specie utilizata in asociere cu o drojdie ( Saccharomyces exiguus) pentru fabricarea unui tip de paine din San Francisco. • Giardia lamblia - de la Alfred Giard, un microbiolog francez si Vilem Lambl, un medic din Boemia, ambii cercetand micoorganismul, care determina o infectie intestinala severa. SISTEMUL NATURAL, FILOGENETIC, DE ORGANIZARE A LUMII VII Celebrul botanist Carl Linnaeus, in opera sa "Systema naturae" (1735) a reunit toate microorganismele intr-un singur grup numit semnificativ "Chaos". Robert Whittaker a propus un sistem de organizare format din cinci regnuri de baza: 1. Procaryotae (Monera); 2. Protista; 3. Fungi; 4. Plantae; 5. Animalia. Constituirea acestor regnuri se bazeaza pe: tipul si structura celulara, organizarea si tipul de nutritie. Regnul Procaryotae - include organisme unicelulare de tip procariot. El cuprinde bacteriile si are doua subgrupe principale: eubacterii - bacterii cu structura celulara procariota caracteristica si archaebacterii - bacterii cu structura celulara si functii atipice. Regnul Protista - contine cea mai mare parte a microorganismelor eucariote unicelulare care sunt lipsite de tesuturi. El cuprinde alge microscopice care se caracterizeaza prin celule fotosintetizante si protozoare care sunt lipsite de perete celular si se hranesc pe seama altor organisme prin ingestie. Regnul Fungi - cuprinde organisme uni- sau multicelulare si uni- sau multinucleate, de tip eucariot. Celulele eucariote prezinta perete celular, nu sunt fotosintetizante si isi dobandesc nutrientii prin absortie. El cupinde microfungi

70 (mucagaiuri si drojdii) si macrofungi. Regnurile Plantae si Animalia nu includ microorganisme, fiind reprezentate de organisme macroscopice, multicelulare. Plantele sunt alcatuite din celule eucariote cu perete celular si sunt fotosintetizante. Celulele animalelor sunt lipsite de perete celular, iar tipul de nutritie pentru acest regn este nutritia ingestiva. Este important de retinut ca virusurile nu sunt incluse in nici o clasificare, ca o recunoastere a caracterului lor de agenti infectiosi care nu au echivalent in lumea vie. CLASIFICAREA BACTERIILOR Criterii de clasificare: 1. Tipul metabolic → în funcţie de necesităţile biochimice vitale: a) Autotrofe (fotoautotrofe); b) Heterotrofe (chimioautotrofe) – folosesc surse nutritive variate, fiind saprofite, comensale sau parasite. 2. Taxonomia bacteriilor → acţiune a sistematicii (ramura a biologiei) prin care sunt ordonate diferite specii de microorganisme, asemănător plantelor sau animalelor Direcţii taxonomice: identificarea – deosebirea indivizilor unei specii pe baza caracterelor puse în evidenţă; clasificarea → aranjarea ordonată a unităţilor de bază în unităţi mai mari cu însuşiri comune nomenclatura – denumirea corectă a diferitelor unităţi; Criterii de identificare a bacteriilor a. Morfologice şi tinctoriale (microscopice) → forma celulelor, modul de grupare al bacteriilor, mobilitatea celulelor (cili), metoda de colorare (Gram, Ziehl-Neelsen, etc); b. Fiziologice → proprietăţi fiziologice, pH, presiune osmotică, dependenţa faţă de O2, temperature optimă de dezvoltare; c. Culturale → caractere coloniilor pe medii solide sau lichide (forma, culoare, structură) d. Biochimice → acţiunea bacteriilor asupra unor substanţe chimice (glucoză, glicerină, substanţe proteice, cazeină, ser, albumină, gelatină, H2S, NO3, etc); e. Patogenitate → virulenţa (agresivitatea sau puterea de îmbolnăvii gazdele specifice); f. Antigenice sau serologice → proprietatea bacteriilor sau a toxinelor bacteriene (antigene) de a genera în organismul gazdei anticorpi specifici (imunoproteine) cu rol de aparare. Clasificarea taxonomică a bacteriilor → distribuirea sau aşezarea în grupe ordonate ierarhic a bacteriilor în funcţie de înrudiri şi asemănări stabilite prin criterii ştiinţifice după caracterele morfologice, fiziologice, culturale,

70 biochimice, antigenice, tinctuorialitate, culoarea şi tipul coloniei sau a aspectului pe medii lichide, înmulţirea şi modul de sporulare, patogenitatea pentru animale, om sau plante. Unitatea de bază a taxonomiei tuturor vieţuitoarelor este specia. Speciile sunt incluse prin clasificare în categorii de ordin superior : • Familii; • Ordine; • Clase; • Încrengături; • Diviziuni; • Regn. CLASIFICAREA TAXONOMICĂ A BACTERIILOR DUPĂ BERGEY Regnul Procariota: -

Photobacteria;

-

Scotobacteria: •

CLASA BACTERIA:  Ordinul Pseudomonales: • Familia Pseudomonaceae; • Familia Nitrobacteriaceae; • Familia Thiobacteriaceae; • Familia Spirillaceae.  Ordinul Eubacteriales: • Familia Azotobacteriaceae • Familia Rhizobiaceae • Familia Holobacteriaceae • Familia Achromobacteriaceae • Familia Baccilaceae • Familia Enterobacteriaceae • Familia Microccocaceae • Familia Lactobacillaceae • Familia Propirenibacteriaceae  Ordinul Actinomycetales:

70 • • • •

Familia Mycobacteriaceae Familia Actinomycetaceae Familia Streptomycetaceae Familia Corynebacteryaceae

 Ordinul Chamydobacteriales: • Familia Chamydobacteriaceae • Familia Beggiatoaceae  Ordinul Ricketsiales: • Familia Ricketsiacae  Ordinul Myxobacteriales: •

Familia Myxobacteriaceae

 Ordinul Chaulobacteriales: • Familia Chaulobacteriaceae  Ordinul Spirochetales: • Familia Spirochetaceae

RELAȚIILE MICROBIOLOGIEI CU MEDIU ROLUL MICROORGANISMELOR IN NATURA Microorganismele au un rol important in solubilizarea elementelor minerale indispensabile vietii plantelor: calciu, fosfor, potasiu. Se creaza astfel un circuit al

70 diferitelor elemente: carbon, azot, fosfor, sulf. Circuitul carbonului - este destul de complex, cuprinzand o serie de etape principale. Pe scurt, acest proces se desfasoara astfel: in aer exista CO2 care este singura sursa de carbon pentru plantele verzi.; in cloroplastele frunzelor, cu ajutorul energiei solare, CO2 este transformat de catre microorganisme in compusi organici complecsi: glucide, lipide si protide, proces conditionat de existenta unei cantitati suficiente de CO2 in atmosfera. Circuitul azotului - azotul intra in compozitia tuturor organismelor vii, transformarile compusilor organici cu azot cuprinzand urmatoarele etape: • amonificarea - faza in care sub actiunea microorganismelor (bacterii, mucegaiuri, actinomicete), compusii organici azotosi sunt transformati in compusi minerali cu azot si saruri de amoniu; • nitrificarea - a doua faza de transformare legata de oxidarea amoniacului, la inceput in acid azotos si apoi in acid azotic. Este procesul biologic cel mai raspandit in sol si de mare importanta pentru agricultura, deoarece plantele utilizeaza azotul sub forma de nitrati. Are loc sub actiunea a doua grupe de microorganisme, numite generic " bacterii nitrificatoare ": - prima etapă, cu obtinere de acid azotos, se realizeaza de catre bacteriile nitroase, NITROSOBACTERII (genul Nitrosomonas, genul Nitrospira, genul Nitrosocystis); - a doua etapa, cu obtinere de acid azotic, se realizeaza de catre bacteriile nitrice, NITROBACTERII (genul Nitrobacter). • denitrificarea - a treia faza in care sarurile azotate sunt reduse la azot molecular, sub actiunea microorganismelor: Bacillus subtilis, Bacillus mycoides, Bacterium denitrificans, Pseudomonas denitrificans, Thiobacillus denitrificans. • fixarea azotului molecular - ultima veriga, care duce la imbogatirea solului in azot, fenomen foarte important, determinat de faptul ca plantele verzi nu pot asimila singure azot atmosferic. Astfel, prin acest proces, se mentine echilibrul in azot. Fixarea azotului molecular se face cu ajutorul bacteriilor fixatoare de azot nesimbiotice si simbiotice. Dintre bacteriile fixatoare de azot nesimbiotice fac parte: - genul Azotobacter - aerobe - (A. agilis, A. vinelanolii, A. nigricans) - genul Clostridium - anaerobe - (C. pasteurianum, C. butyricum, C. naviculum) - genul Pseudomonas - (P. fluorescens, P. radiobacter) Dintre bacteriile fixatoare de azot simbiotice fac parte cele din genul Rhizobium: (R. phaseoli, R. trifoli, R. japonicum, R. meliloti, R. lupini, R. leguminosarum) Aceste bacterii simbiotice se gasesc in nodozitatile plantelor leguminoase: fasole, soia, mazare, lucerna, trifoi, aceste plante fiind numite " plante prima etapă, cu obtinere de acid azotos, se realizeaza de catre bacteriile nitroase, NITROSOBACTERII (genul Nitrosomonas, genul Nitrospira, genul Nitrosocystis); - a doua etapa, cu obtinere de acid azotic, se realizeaza de catre bacteriile nitrice, NITROBACTERII (genul Nitrobacter). • denitrificarea - a treia faza in care sarurile azotate sunt reduse la azot

70 molecular, sub actiunea microorganismelor: Bacillus subtilis, Bacillus mycoides, Bacterium denitrificans, Pseudomonas denitrificans, Thiobacillus denitrificans. • fixarea azotului molecular - ultima veriga, care duce la imbogatirea solului in azot, fenomen foarte important, determinat de faptul ca plantele verzi nu pot asimila singure azot atmosferic. Astfel, prin acest proces, se mentine echilibrul in azot. Fixarea azotului molecular se face cu ajutorul bacteriilor fixatoare de azot nesimbiotice si simbiotice. ce imbogatesc solul in azot". Circuitul sulfului - proces cu obtinere de acid sulfuric, este important prin faptul ca formarea H2SO4 usureaza trecerea sarurilor minerale in stare solubila, crescand astfel cantitatea de compusi minerali accesibili plantelor. Procesul este produs de sulfo-bacterii si tiobacterii. Circuitul fosforului - se realizeaza in trei etape: • mineralizarea fosforului organic prin trecerea in fosfati - are importanta deoarece compusii organici cu fosfor nu pot fi utilizati de catre plante; • "mobilizarea fosforului" - se face prin actiunea bacteriilor nitrificatoare, a tiobacteriilor; • reducerea fosfatilor de catre bacteriile anaerobe, cu formare de acid fosforos, acid hipofosfor si hidrogen sulfurat. Acest proces duce la pierderea unor fosfati, elemente nutritive pentru plante; poate fi evitat printr-o aeratie buna a solului. In acest sens, se poate folosi un preparat cu bacterii, care imbunatateste nutritia cu fosfor a plantelor. Preparatul se numeste "Fosfobacterin" si transforma fosforul din compusii organici in forma minerala. Circuitul fierului - fierul intra in constitutia tesuturilor vegetale sub forma de compusi organici. Dupa moartea plantelor, prin diverse procedee de fermentare conduse de microorganisme, compusii organici sunt mineralizati si apoi oxidati de catre bacterii in fier feric, Fe3+, care poate fi din nou folosit de catre plante. Astfel, se realizeaza circuitul complet al fierului. ROLUL MICROORGANISMELOR ÎN CIRCUITUL NATURAL AL CARBONULUI Dintre elementele chimice biogene carbonul este cel mai important deoarece intră componenţa tuturor substanţelor organice. Circuitul carbonului se realizează printr-o mare diversitate de mecanisme, care comportă patru etape principale: • Organizarea şi încorporarea carbonului mineral în materia vie, • Utilizarea substanţelor organice de consumatorii primari şi secundari, • Descompunerea sau mineralizarea substanţelor organice cu degajare de CO2, • Constituirea rezervelor de carbon organic şi mineral sub formă de humus sau de depozite geologice.

70 Microorganismele intervin în menţinerea unui echilibru între încorporarea bioxidului de carbon în substanţe organice (fotosinteză, chimiosinteză, asimilaţie la animale) şi procesele de mineralizare care îl restituie atmosferei (fig. 55)

Fig.55 – Schema circuitului biogeochimic al carbonului Cantitatea cea mai mare de carbon din natură se află sub formă de CO2, care provine din erupţii vulcanice, prelucrări industriale sau ca produs de catabolism al organismelor vii. Rezervorul carbonului este atmosfera unde acest element se găseşte sub formă de CO2 în proporţie de 0,032%. Circuitul carbonului este întreţinut de două procese contradictorii: fotosinteza care scoate carbonul din rezervor şi-l fixează şi respiraţia care restituie bioxidul de carbon atmosferei. Fotosinteza este întotdeauna mai mai intensă decât respiraţia. Circuitul carbonului nu se compensează exact. Carbonul nerestituit imediat prin respiraţie, intră în formarea biomasei în cadrul ciclurilor trofice. În felul acesta, întoarcerea sa în atmosferă este încetinită. Restituirea sa atmosferei se face prin descompunerea microbiologică – mineralizarea materiei organice moarte de origine vegetală şi animală. Cantitativ, această restituţie prin mineralizarea substanţei organice reprezintă 90% din cantitatea total de bioxid de carbon restituit atmosferei. O parte din substanţele organice ies pentru un timp din circuitul intern al carbonului şi se depozitează ca zăcăminte de combustibil organici şi zăcăminte de carbonat de calciu. Mobilizarea din aceste zăcăminte se face de obicei fără intervenţia microorganismelor, cel mai frecvent prin activitate antropogenă. ÎNCORPORAREA CARBONULUI MINERAL ÎN MATERIA VIE În natură, carbonul mineral se găseşte sub formă de CO2, bicarbonaşi şi carbonaţi. CO2 din atmosferă este consumat permanent de plantele verzi în procesul de fotosinteză. Cu toate acestea, rezerva de CO2 nu se diminuează deoarece există un echilibru dinamic între procesele de fotosinteză şi cele de mineralizare. Asimilarea CO2 prin fotosinteză şi mineralizarea carbonului organic cu eliberare de CO2, sunt două procese care se influenţează reciproc, existând o determinare reciprocă în ceea ce priveşte intensitatea lor, astfel încât conţinutul de CO2 şi O2 al atmosferei rămâne relativ constant. Conţinutul de CO2 al solului este de 10 ori mai mare decât al atmosferei. Apa oceanelor, fiind uşor alcalină, conţine bicarbonaţi ai CO2 solvit. Există un echilibru relativ constant între bicarbonaţii solviţi şi CO2 atmosferic, astfel încât oceanul este un rezervor de CO2 pentru atmosferă.

70 Microorganisme fotosintetizante şi, în mai mică măsură microorganisme chimiolitotrofe, prin procesele de fotosinteză şi respectiv chimiosinteză, determină încorporarea carbonului mineral (CO2) în materia vie. În aceste procese, CO2 este redus cu eliberare de O2 în atmosferă. Între circuitul carbonului şi al oxigenului există o strânsă întrepătrundere. Orice reducere a CO2, prin încorporarea carbonului în substanţe organice este însoţită de oxidarea apei şi eliberarea oxigenului şi orice oxidare a carbonului din substanţe organice, în cursul multiplelor reacţii de respiraţie şi combustie, implică formarea şi eliberarea de CO2 concomitent cu reducerea O2 din apă (fig. 56).

Fig.56 – corelaţia între circuitul carbonului şi al oxigenului Utilizarea carbonului organic de către consumatorii primari şi secundari Masa vegetală verde este utilizată ca hrană de consumatorii primari (animale ierbivore), care la rândul lor reprezintă hrană pentru consumatori secundari (animale carnivore). Consumatorii nu utilizează decât 10% din producţia primară, cu un randament de transformare destul de scăzut deoarece o bună parte din materia ingerată este eliminată prin dejecţii. În această etapă are loc o slabă mineralizare a carbonului prin respiraţie. Mineralizarea substanţelor organice Toate substanţele organice, după moartea organismelor a căror corp le-a format, cât şi dejecţiile eliminate în timpul vieţii, ajung în sol sau în bazinele acvatice unde sunt supuse unor procese de biodegradare prin variate mecanisme biochimice în care sunt incriminate microorganismele. Biodegradarea are ca ultim scop mineralizarea totală a substanţelor organice şi eliberarea de CO2, indiferent de procesele prin care are loc şi de produşii intermediari rezultaţi. Marea diversitate de substanţe organice acumulate în sol şi ape presupune existenţa a numeroase organisme de mineralizare. O importanţă deosebită prezintă biodegradarea resturilor vegetale în hidraţi de carbon şi substanţe aromatice.

70 Glucidele simple (ozele) şi oligozaharidele vegetale sunt mineralizate cu mare uşurinţă de toate microorganismele heterotrofe care le utilizează ca unică sursă de carbon şi energie. Mai greu mineralizate sunt unele polizaharide şi substanţe organice complexe macromoleculare. – Celulozoliza Celuloza, fiind componenta principală a ţesuturilor vegetale, va fi şi cel mai important compus cu carbon din sol şi ape. Biodegradarea celulozei pâna la CO2 şi apă se numeşte celulozoliză şi este realizată de o mare varietate de microorganisme celulozolitice, aerobe şi anaerobe, aparţinând bacteriilor şi ciupercilor. Agenţi de biodegradare. Cele mai importante genuri şi specii de bacterii sunt: Vibrio, Cellvibrio, Cellfacicula, Cellulomonas, Cromobacterium, Bacillus termocellulolyticus, Bacterium albidum, Streptomyces, Micronospora, Cytophaga, Sporocytophaga, Clostridium termocellum, C. cellulosolvens. Ele sunt aerobe şi anaerobe. Dintre ciupercile micromicete (mucegaiuri) cele mai active genuri sunt: Trichoderma, Aspergillus, Penicillium, Vetricillium,Sporotrichum, Monosporium, Alternaria, Cladosporium. Factorii de influenţă. În natură, descompunerea microbiologică a celulozei este foarte mult influenţată de factorii de mediu, printre care potenţialul de oxido-reducere, pH-ul şi conţinutul solului în azot asimilabil sunt cei mai importanţi. În general, celulozoliza este mai activă în orizonturile superioare ale solului, acolo unde potenţialul redox este mai ridicat. Bacteriile celulozolitice au activitatea optimă la pH = 5,7 – 7, actinomicetele la pH = 4,6 – 9,5, iar dintre mucegaiuri unele sunt mai active la pH acid, altele la pH neutru. În ce priveşte necesarul de azot, folosesc azot organic, săruri de amoniu, azotaţi. Biochimism. Toate microorganismele celulozolitice se caracterizează prin sinteza şi eliminarea extracelulară a celulazei, un complex enzimatic format din mai multe componente (celulaze, celobiază, beta-glucozidază). Toate aceste enzime hidrolizează în trepte celuloza la glucoză. Celulaze extracelulare care pot ataca fibrele celulozice naturale sunt produse numai de unele microorganisme. Celulazele produse de alte vieţuitoare pot acţiona numai asupra celulozei parţial transformate pe cale chimică sau mecanică.

70 Degradarea anaerobă a celulozei are loc în natură în mâlul lacurilor, în rumenul ierbivorelor, în bălegar. În funcţie de natura produselor rezultate, degradarea anaerobă poate avea loc prin: Fermentaţie hidrogenică cu formare de acizi butiric şi acetic. Cantitatea de gaze (H2, CO2) rezultate reprezintă 1/3 din cantitatea de celuloză fermentată. Acest tip de fermentaţie este produsă de bacteriile: Bacterium cellulose-disolvens, B. hidrogenicus, Clostridium thermocellus. Fermentaţia metanică determină formarea în afară de acizi şi formarea de gaze, care reprezintă ½ din cantitatea de celuloză fermentată. În compoziţia gazelor predomină CO2 şi CH3. Importanţă. Fermentaţia metanică are o importanţă deosebită în natură şi în practică, fiind folosită în procesele dirijate pentru transformarea în metan a reziduurilor rezultate din complexele animaliere. Pentru dirijarea fermentaţiei, dejecţiile animalelor se depozitează în metantancuri şi sub acţiunea microorganismelor aflate în număr foarte mare în materialul de dejecţie, au loc procese microbiologice care se desfăşoară în mai multe etape: Degradarea compuşilor organic de tipul celulozei, lipide, hidraţi de carbon, protein, sub acţiunea bacteriilor aerobe care consumă oxigenul aflat în rezervor. Prin acţiunea lor se formează acid lactic, acetic, propionic, butiric. Se formează condiţii favorabile anaerobiozei. Se dezvoltă bacterii Clostridium aceticum, C. desulfovibrio, care produc transformarea substanţelor existente, cu formare pe cale anaerobă a acidului acetic. Apoi intervin bacteriile metanogene Methanosarcina barkeri, Methanospirillum, care produc metan prin descompunerea acidului acetic. Valorificarea pe cale metanică a rezidurilor are importanţă practică pentru că permite obţinerea biogazului cu o putere calorică mare. Substratul fermentat este un valoros îngrăşământ organic, care nu mai prezintă mirosul şi caracterele iniţiale. Degradarea aerobă a celulozei are loc pâna la CO2 şi H2O. Se produce în cadrul proceselor de putrezire a reziduurilor vegetale. Este produsă de bacteriile: Cellulomonas, Cellovibrio, Cellofacicula, Cytophaga şi de mucegaiurile din genurile Trichoderma, Trichotecium, Alternaria, Mucor, Rhyzopus, Penicillum. Importanţă. Procesul are importanţă practică pentru că bacteriile din genul Cellulomonas pot fi cultivate pe medii bogate în celuloză, care produc o cantitate mare de celule, cu un conţinut proteic de 40%. Aceste proteine au compoziţie valoroasă în acizi şi sunt folosite ca furaj pentru animale. Drojdiile Candida robusta şi C. tropicalis pot fi folosite la obţinerea de drojdii furajere, cultivate pe produse rezultate de la fabricarea hârtiei, după ce a avut loc hidroliza acidă sau enzimatică a celulozei, cu formare de celobioză, care poate fi fermentată anaerob, cu formare de alcool carburant. În condiţiile cultivării aerobe rezultă biomasă de drojdie furajeră. Hemicelulozele sunt descompuse de bacterii hemicelulozolitice Pseudomonas, Achromobacter, Bacillus, Vibrio, Sporocytophaga, Streptomyces, Micromonospora şi de mucegaiuri: Mucor, Chaetonium, Penucillum, Aspergillus. Activitatea hemicelulozolitică este mai răspândită decât cea celulozolitică. Enzimele implicate în hidroliza hemicelulozelor sunt: xilanaza, manaza, gluconaza. Hemicelulozoliza se realizează în paralel cu celulozoliza, dar cu viteze diferite.

70

– Pectinoliza Substanţele pectice sunt substanţe de legătură din scheletul celulozic din tulpinile, frunzele şi fructele plantelor. Din punct de vedere chimic, sunt poliuronide cu greutate moleculară mare, formate din polimeriai acidului galacturonic asociaţi cu pentoze şi hexoze. Agenţii de degradare. Descompunerea substanţelor pectice este realizată de bacterii anaerobe şi aerobe: Bacillus, Pseudomonas, Flavobacterium, Streptomyces, Nocardia şi mucegaiurile: Fusarium, Penicillum, Aspergillus, Botrytis, Alternaria. Biochimism. Toate aceste microorganisme conţin complexul enzimatic pectinază format din: pectinmetilesterază, poligalacturonază, polimetilgalactunorază, pectintranseliminază.

Acizii obţinuţi sunt sursă energetic. Importanţă. Pe lângă rolul lor în mineralizarea substanţelor pectice, şi eliberarea CO2, aceste microorganism sunt importante pentru topirea inului şi a cânepii. – Chitinoliza Chitina este uncompus organic complex care se găseşte în peretele celular al mucegaiurilor şi în carcasele insectelor. Din punct de vedere chimic, chitina este un polimer de betagluozamidă, cu un conţinut de azot de 6,9%. Agenţi de degradare. Chitina poate fi degradată de bacteria din genul Pseudomonas chitinivarus, Bacillus, Flavobacterium, Pseudomonas, Arthrobacter şi majoritatea speciilor de actinomicete. Dintre mucegaiuri active sunt: Trichoderma, Penicillum, Fusarium, Mucor. Biochimism. Descompunerea chitinei se face sub acţiunea chitinazei. Glucoza şi acidul acetic rezultat sunt apoi oxidate până la CO2 şi apă.

– Amiloliza Amidonul se întâlneşte ca substanţă de rezervă în diferite părţi ale plantelor. În sol se acumulează împreună cu aceste resturi vegetale. Agenţii de degradare. Degradarea amidonului este realizată de microorganismele producătoare de alfa- şi beta-amilaze. Ele sunt reprezentate de mucegaiuri: Aspergillus niger, A. oryzae, A. usami, Rhyzopus oryzae, Amylomyces rouxi. Mucegaiurile mai produc amilogalaucozidază (glucoamilază). Amilaze sunt produse şi de bacteria: Bacillus subtilis. Microflora amilolitică nu este specifică deoarece microorganismele care produc amilaze sunt extrem de variate şi numeroase: bacterii Gram negative şi positive, sporulate şi nesporulate, aerobe şi anaerobe, actinomicete şi mucegaiuri.

70 Amilazele sunt enzime hidrolizante. După formarea compuşilor simpli (maltoză, glucoză) aceştia reprezintă substraturi nutritive pentru alte specii de microorganisme dependente de aceste mucegaiuri amilolitice. Procesul natural de degradare al amidonului este nedorit, întrucât conduce la alterarea cerealelor şi a cartofilor. – Mineralizarea substanţelor aromatice Substanţele aromatice acumulate în sol provin fie din organismele vegetale, fie sunt sintetizate de unele microorganisme (mucegaiuri). Ele conţin un singur nucleu benzenic (fenoli, acizi fenolici, acid benzoic, cumarine), doi nuclei de benzen (flavone, antociani) sau mai mulţi compuşi fenolici condensaţi (lignină, taninuri, substanţe humice). Substanţa aromatică cea mai importantă din punct de vedere cantitativ este lignina. Mineralizarea ligninei este deci deosebit de imporatntă în circuitul carbonului. Ea se găseşte, după celuloză, în cantitatea cea mai mare, în vegetale, mai ales în cele lemnoase. Lignina este una din substanţele cele mai rezistente la biodegradare. Taninurile, substanţe larg răspândite în regnul vegetal, sunt mineralizate în sol. Agenţi de degradare. Compuşii fenolici sunt mineralizaţi de bacterii. Pseudomonas, Arthrobacter, Bacillus şi de mucegaiuri. Lignina este mineralizată de mucegaiuri: Aspergillus, Trichoderma, Trichothecium, Alternaria, Fusarium şi de bacterii: Pseudomonas, Flavobacterium, Agrobacterium. Taninurile sunt mineralizate de mucegaiuri: Penicillium, Aspergillus, Fusarium, Cylindrocarpon, Gliocladium. – Biodegradarea hidrocarburilor Unele microorganisme sunt capabile să degradeze hidrocarburile alifatice alifatice şi aromatice din sol şi ape. Mai rezistente la biodegradare sunt hidrocarburile ramificate (detergenţii). Hidrocarburile aromatice (benzen, toluen, xilen) sunt degradate de un număr mic de microorganisme deoarece numai puţine sunt capabile să deschidă molecula ciclică. Agenţi de degradare. Se cunosc mai multe specii de bacterii care folosesc ca unică sursă de carbon şi energie metanul: Methanomonas metanica sau propanul, Pseudomonas propanica. Alte hidrocarburi cu moleculă mică pot fi descompuse de Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas aeruginosa, Mycobacterium, Nocardia, Micronospora, Streptomyces. Hidrocarburile complexe sunt degradate de microorganisme foarte variate, bacterii: Pseudomonas, Micrococcus, Bacillus, actinomicete, levuri: candida lypolitica, mucegaiuri. Factori de influenţă. Biodegradarea hidrocarburilor este mai mult sau mai puţin intensă, în funcţie de compoziţia chimică, consistenţa, solubilitatea, toxicitatea şi concentraţia lor în mediul respectiv. Ea este favorizată de temperaturile relativ ridicate şi de prezenţa oxigenului. Biochimism. Hidrocarburile sunt metabolizate diferit, în funcţie de specie şi de tulpină. Ele sunt oxidate în alcooli, apoi în acizi graşi, iar aceştia degradaţi prin betaoxidare.

70 Importanţă. Acest proces de minaralizare prezintă nu numai importanţă bioedafică sau geologică ci şi în lupta împotriva poluării mediului ambiant. – Biodegradarea lipidelor Lipidele simple şi complexe se găsesc în materia organică vegetală şi animală. Ele pot fi transformate în compuşi mai simpli, sau oxidate la CO2 şi H2O. Agenţii de dagradare sunt mucegaiurile lipolitice: Aspergillus, Penicillum, Cladosporum, Rhyzophus, Geotrichum şi bacteriile: Bacillus, Pseudomonas, Achronobacter care produc lipaze. Biochimism. Sub acţiunea lipazelor, lipidele sunt transformate în acizi graşi şi glicerol. Glicerolul, după fosforilare, este metabolizat prin ciclul EMP (glicoliză), iar acizii graşi suferă o β-oxidare, în ciclul lui Lynen, până la CO2 şi H2O. Prin oxidarea completă a acizilor graşi se obţine o cantitate mare de energie. Rezervele de carbon Unele fracţiuni din resturile vegetale (taninuri, lignină) şi unii compuşi rezultaţi din metabolismul microorganismelor, în anumite condiţii, pot să sufere transformări care dau naştere la substanţe mai mult sau mai puţin polimerizate, rezistente la acţiunea microbiană. Aceste substanţe nou formate, în general de culoare închisă, stabilizate şi rezistente formează humusul, care reprezintă rezerva de carbon organic a solului. Humusul nu este însă inert deoarece, în contact cu aerul poate fi oxidat spontan sau este lent dar progresiv mineralizat de microorganisme. În afară de aceste rezerve, carbonul organic s-a depozitat sub formă de cărbuni şi petrol. Cărbunii s-au format probabil din lignină, iar petrolul din acizii graşi, prin procese fizico-chimice şi microbiologice, în perioade îndelungate de timp, în anaerobioză, de presiune ridicată şi la temperaturi mici. O altă rezervă de carbon sunt carbonaţii insolubili din rocile solului. Numai o parte din carbonul fosil este redat atmosferei, în special în urma arderilor industriale ale hidrocarburilor şi cărbunilor.

ROLUL MICROORGANISMELOR ÎN CIRCUITUL NATURAL AL AZOTULUI Azotul este un element biogen esenţial deoarece intră în compoziţia proteinelor şi a altor substanţe organice de mare importanţă pentru viaţa organismelor vii. Ciclul azotului este aproape perfect, adică închis, fără pierderi. Rezervorul de azot este atmosfera care conţine 79% azot.

70 Azotul molecular nu poate fi utilizat de plantele verzi, ci numai de unele microorganisme dotate cu echipament enzimatic specializat în acest scop. Aceste microorganisme fixatoare de azot molecular pot fi libere sau simbiotice, aerobe sau anaerobe. O altă sursă importantă de azot o reprezintă proteinele vegetale, animale şi microbiene, care returnează de fapt solului azotul absorbit sub formă de azotaţi şi săruri de amoniu, de către plantele verzi. Mineralizarea proteinelor şi a altor substanţe organice cu azot eliberează azotul mineral sub formă de amoniac. Amoniacul eliberat prin amonificare este oxidat de microorganisme în azotiţi şi azotaţi devenind din nou absorbabil şi utilizabil în biosintezele plantelor. .

Fig. 11 – Schema circuitului biogeochimic al azotului

70 Toate transformările compuşilor azotului sunt realizate de către microorganisme. În circuitul biogeochimic, acestor transformări li se adaugă altele de natură fizică şi chimică. Circuitul acestui element este foarte complex (fig. 57). El este alcătuit din două subcicluri: – fixarea azotului atmosferic de către organisme şi eliberarea azotului molecular în atmosferă. – mineralizarea substanţelor organice cu azot până la substanţe minerale utilizabile din nou de către plante (sinteza de nitriţi şi nitraţi) şi utilizarea acestor substanţe de către plante şi animale pentru sinteza de substanţe organice cu azot, aminoacizi, proteine, acizi nucleici, alcaloizi – uree. Mineralizarea se realizează prin procesul de amonificare urmat de nitrificare care cuprinde două etape: nitritarea şi nitratarea – Fixarea azotului molecular atmosferic Fixarea azotului molecular liber se face pe cale chimică prin procese fotochimice şi pe cale biologică prin fixarea microbiologică a azotului. Agenţi de fixare. După modul de viaţă, microorganismele fixatoare de azot se împart în două grupe: microorganisme simbiotice, care fixează azotul molecular în nodozităţile plantelor leguminoase (Rhizobyum) sau neleguminoase (Frankia). microorganisme libere (nesimbiotice) care pot fi bacterii aerobe sau anaerobe. Microorganismele nesimbiotice pot fi bacterii anaerobe sau aerobe. bacterii aerobe sunt: Azotobacter chroococcum, A. vinelandi, A. agilis, A. insignis, Azomonas, Klebsiella, Pseudomonas, Achromobacter, Arthrobacter, Aerobacter, Methanomonas. Cyanobacteriile cuprind genuri fixatoare de azot care aparţin familiilor Nostocaceae, Rivulariaceae, Scytonamataceae, Stigonemataceae. bacterii anaerobe sunt reprezentate de Clostridium pasteurianum, Cl. butylicum., Cl. felsineum, Cl. lactoacetophillum, Cl. madisoni, Cl. tetanomorphum, Cl. acetobutyllicum, Desulfovibrio desulfuricans, Rhodospirillum rubrum şi alte specii fotosintetizante. Biochimism. Toate bacteriile fixatoare de azot molecular se caracterizează prin prezenţa unui sistem enzimatic specializat, format din două fracţiuni enzimatice reducătoare: hidrogenază şi nitrogenază. Mecanismul fixării azotului molecular este un proces de reducere care reclamă o sursă reducătoare. Aceasta poate fi reprezentată de acidul piruvic, acidul alfa-cetoglutaric sau hidrogenul molecular. Acidul piruvic , de exemplu, furnizează, în cursul unei reacţii de fosforilare, puterea reducătoare (2H), acetilfosfatul format fiind utilizat la sintaza ATP-ului, care reprezintă sursa de energie necesară fixării azotului molecular. Intervenţia complexului enzimatic este secvenţială. Prima fracţiune, care este un sistem donator de hidrogen (HDS) conţine o hidrogenază şi enzime care catalizează reacţia de fosforilare. A doua fracţiune este un sistem activator al azotului (NAS), care conţine o nitrogenază care catalizează reducerea azotului. Hidrogenul eliberat în prima reacţie este acceptat de un transformator de hidrogen, frecvent reprezentat de ferodextrină şi transportat spre hidrogenază. Ferodextrina este o proteină cu greutate moleculară mică, care trece reversibil din starea oxidată în starea redusă.

70 Azotul molecular, activat de nitrogenază, formează un complex cu aceasta, care va fi redus de ferodextrină. Acest complex redus acceptă ATP-ul rezultat şi eliberează amoniacul ca produs final al fixării azotului molecular. Acesta intră în reacţie cu acizii alfa-cetonici, formând acizi aminici. Factori favorizanţi. Fixarea nesimbiotică este condiţionată de prezenţa în cantitate suficientă de calciu în sol şi de fosfaţi asimilabili, de temperatură şi de aerisirea convenabilă. Este un proces extrem de variabil. În condiţii favorabile, se pot fixa 30-40 kg azot la hectar. Fixarea simbiotică are loc în nodozităţile radiculare ale leguminoaselor de către Rizobium leguminosarum care se găseşte în sol sub formă de mici bastonaşe capabile să pătrundă prin porii radiculari. Ele se transformă ulterior într-un bacil mai mare şi la sfârşit ia formă aglomerată în faza simbiotică. Prezenţa în sol a unei anumite cantităţi de azot asimilabil favorizează apariţia ţi dezvoltarea nodozităţilor. Când cantitatea de azot asimilabil este foarte mare, formarea nodozităţilor este întârziată şi total inhibată. Cantitatea de azot fixată anual la hectar poate ajunge la 100-200 kg. Importanţă. Fixarea microbiologică a azotului prezintă o foarte mare importanţă din punct de vedere agricol, întrucât plantele verzi nu pot asimila azotul atmosferic, atmosfera fiind principalul rezervor de azot. Fixarea nesimbiotică a azotului molecular contribuie la îmbogăţirea solului în azot, dar aportul este mic, deoarece densitatea bacteriilor libere fixatoare de azot molecular ese relativ mic, iar randamentul este scăzut. În sol, fixarea azotului este sensibil redusă de prezenţa unor forme se azot mineral. – Mineralizarea substanţelor organice – Amonificarea Iniţial, substanţele proteice, ureea, bazele azotate, după moartea organismelor, sunt descompuse de către bacteriile amonificatoare la amoniac prin procesul de amonificare. Amoniacul rezultat în urma activităţii bacteriilor amonificatoare recţionează cu apa, formând ionul amoniu. Acest proces are loc în orizonturile superficiale ale solului, unde azotul se găseşte în cea mai mare parte sub formă organică de proteine, acizi nucleici, glucide aminate, îngrăşăminte artificiale (uree, cianamidă de calciu). Amonificarea proteinelor – Proteoliza Proteinele pot fi degradate sub acţiunea enzimelor proteolitice, care sunt enzime extracelulare, produse de bacterii şi mucegaiuri, microorganisme care produc în natură putrefacţia şi putrezirea materiei organice moarte. Aceste enzime proteolitice sunt proteaze, ele determinând hidroliza proteinelor. Prin hidroliza proteinelor de către proteazele extracelulare rezultă peptide şi aminoacizi. Existenţa lor este efemeră, întrucât suferă o serie de transformări imediate:  dezaminare microbiologică cu eliberare de amoniac,  sunt asimilaţi de către microorganisme,  sunt absorbiţi de către plante,

70

 sunt absorbiţi pe argile sau încorporaţi în fracţiunea humică a solului. Când degradarea proteunelor are loc în anaerobioză (putrefacţia) rezultă amine cu miros specific (putresceină, cadaverină), care apoi se oxidează în anaerobioză eliminând amoniacul. Agenţii de degradare. Amonificarea proteinelor (proteoliza) este realizată de bacterii şi mucegaiuri. Agenţii tipici ai putrefacţiei, care produc endo şi exoproteaze extracelulare, sunt bacterii răspândite în sol şi ape. Ele se caracterizează printr-o activitate fiziologică foarte diversă. Bacteriile de putrefacţie pot fi sporulate sau nesporulate, Gram pozitive sau negative. Pentru a fi active, necesită un pH de 7, dezvoltarea lor fiind inhibată la pH sub 4,5. Ele pot produce şi degradarea amidonului. Sunt bacterii rezistente la plasmoliză şi se pot dezvolta în medii cu o concentraţie de 7% clorură de sodiu. Bacterii de putrefacţie aerobe Pseudomonas fluorescens este o bacterie Gram negativă, nesporulată, care poate produce lichefierea gelatinei. Se dezvoltă la temperaturi mai mici. Genul Bacillus cu aproximativ 25 de specii are activitate proteolitică intensă. B. Subtilis, B. mycoides, B. megatherium, B. mesentericus, B. licheniformis, B. coagulans, B. putrificus, B. cereus sunt bacterii Gram negative, sporulate, foarte răspândite în natură. Genul Proteus, cuprinde bacterii Gram negative, sporulate şi mobile (P. vulgaris, P. mirabilis). prin degradarea proteinelor produce şi degradarea aminoacizilor cu formare de H2S. Bacterii facultativ anaerobe: Escherichia coli, Streptococcus faecalis, Enterobacter. Bacterii anaerobe: Staphylococcus albus, Micrococcus flavus, Bacillus putrificus, Clostridium sporogenes, Clostridium putrificum, Clostridium perfrigens, Bacillus pestorium. Dintre mucegaiuri, amonificatoare active sunt: Trichoderma, Köningii, Oidium lactis, Aspergillus niger, A. terricola, A. fumigatus, Penicillum intricatum, Mucor hiemalis, Rhizophus nigricans, Botrytis. Biochimism. degradarea proteinelor sub acţiunea echipamentului enzimatic are loc în trepte.

70

Formarea produşilor de putrefacţie are loc pe mai multe căi:  decarboxilarea aminoacizilor cu formarea de amine: cadaverină din lizină, putresceină din ornitină, histamine din histidină.  dezaminarea oxidativă, reductivă, hidrolitică a aminoacizilor prin transaminare la acizi, cetoacizi, hidroxiacizi.  degradarea triptofanului cu formare de produşi indolici.

 dezaminarea aminoacizilor cu formare de NH3. El poate fi folosit din nou în biosintezele celulare ca sursă de azot. Format în exces, se elimină în atmosferă.  din aminoacizii cu sulf rezultă H2S.  dezaminarea reductivă şi decarboxilarea aminoacizilor cu formare de H2 şi CO2. Importanţă. Putrefacţia este importantă penru că are loc mineralizarea formelor de azot organic şi transformarea cadavrelor în compuşi simpli. Putrezirea este o proteoliză produsă de mucegaiuri, uneori în asociaţie cu bacteriile, care are loc în aerobioză sau facultativ, anaerobioză, în urma căruia se formează produse la suprafaţa solului. Utilizarea amoniacului. Amoniacul rezultat din procesul de amonificare a glucidelor aminate, acizilor nucleici, acidului uric şi a acidului hipuric, cât şi amonificarea proteinelor poate urma în sol următoarele căi:  parte se transformă prin nitrificare în nitraţi,  parte este utilizată de microorganisme pentru sinteza de aminoacizi proprii,  parte este stabilizată pe substanţa organică a solului,

70

   

parte este absorbită de plantele verzi parte este absorbită de mineralele argiloase din sol, parte se va volatiliza în atmosferă, mică parte se pierde prin levigare.

Amonificarea ureei Ureea este un îngrăşământ frecvent folosit, amonificarea ei fiind importantă pentru fertilizarea solului. Amonificarea ureei este realizată de Bacillus probatus, Planesarcina ureae, Micrococcus ureae, Urobacterium care hidrolizează ureea prin acţiunea ureazei. În urma hidrolizei se formează bioxid de carbon şi amoniac. Ureea sintetică conţine adesea impurităţi care sunt însă şi ele biodegradabile. – Nitrificarea Sărurile amoniacale care se formează în urma procesului de putrefacţie sunt oxidate şi transformate în nitraţi, procesul fiind denumit nitrificare. nitrificarea este procesul cel mai răspândit din sol cu cea mai mare importanţă în agricultură. Nitrificarea este un proces de oxidare a sărurilor amoniacale care se realizează în două etape. În prima etapă se oxidează compuşii amoniacali la nitriţi prin procesul de nitritare. Apoi prin nitratare, nitriţii se transformă în nitraţi. Nitraţii solubili sunt utilizaţi din nou de plante. Nu toate resturile organice sunt mineralizate până la azotaţi. O mare parte sunt îngropate sub formă de sedimente. Întreaga mineralizare se desfăşoară sub influenţa diferitelor grupe de microorganisme. Nitriţii şi nitraţii sunt absorbiţi de plante care le transformă pe cale biosintetică din nou în aminoacizi şi proteine. În afară de amoniacul de origine biologică, în sol, se acumulează şi amoniac de origine nebiologică, eliberat de pe argile sau adus de îngrăşămintele amoniacale. Când condiţiile ecologice sunt favorabile, amoniacul este oxidat pe cale biologică până la azotaţi. Agenţi de nitrificare. Nitrificarea se realizează de către microorganisme autotrofe sau heterotrofe. – Nitrificarea autotrofă este realizată de două grupe de bacterii înalt specializate (nitroase şi nitrice), care îşi procură întreaga energie de care au nevoie din oxidarea azotului amoniacal sau nitros. Nitrificarea este deci rezultatul acţiunii succesive a celor două grupe de microorganisme, acest proces având loc în două etape: – Nitritarea presupune oxidarea amoniacului la nitriţi (a sărurilor amoniacale la acid azotos). Procesul este realizat de Nitrosomonas, Nitrosococcus, Nitrospira, Nitrosogeea, Nitrocystis. Biochimism. Reacţia globală a nitritării este:

70 NH4+ + 1/2O2 → NO2 - + 2H+ + 2H2O + 63,8 Kcal Oxidarea se realizează însă în trei trepte:

– Nitratarea presupune oxidarea nitriţilor (acidului azotos) la nitraţi. Se realizează de către Nitrobacter vinogradsky, Nitrobacter agilis, Nitrocystis, care preferă dezvoltarea pe substanţe minerale pure. Ei pot sintetiza substanţa organică celulară din compuşii minerali ai carbonului. Biochimism. Reacţia globală a nitrării este: NO2- + 1/2O2 → NO3- + 7,5 Kcal Mecanismul presupune o dehidrogenare a radicalului nitros după o prealabilă hidratare:

Bacteriile nitrificatoare (nitroase şi nitrice) se găsesc în toate solurile al căror pH este mai mare de 3,7 – 4,0, amendamentele calcaroase având o foarte mare influenţă favorabilă în dezvoltarea lor. Într-un gram de sol se găsesc 25000 de bacterii nitrificatoare. Bacteriile nitroase şi mai puţin cele nitrice, tolerează prezenţa materiilor organice. Influenţa materiilor organice asupra nitrificării depinde, în primul rând, de solubilitatea şi de gradul lor de descompunere a solului. Nitrificarea poate fi foarte activă în terenurile humice, la un pH şi aerare convenabilă. În special solurile brune, bogate în humus, conţin cel mai mare număr de bacterii nitrificatoare active. În sol, bacteriile nitroase şi nitrice sunt însoţite de specii bacteriene particulare heterotrofe. Aceste specii exercită o acţiune de accelerare asupra mersului nitrificării. Nitrificarea are loc şi pe stânci neatacate, pregătind terenul pentru licheni, muşchi şi plante superioare. Formarea zăcămintelor de nitraţi este o consecinţă a procesului de nitrificare. – Nitrificarea heterotrofă are un mecanism biochimic total diferit faţă de cel al nitrificării autotrofe Bacteriile Achromobacter, Corynebacterium, Nocardia, Agrobacterium, Alcaligenes produc nitriţi din oximele diferişilor acizi organici. Mucegaiurile Aspergillus flavus, Artrobacter globiformis produc din amoniac, sau alţi compuşi aminaţi, hidroxilamină, nitriţi şi nitraţi.

70 Utilizarea nitriţilor şi nitraţilor. Indiferent prin ce mecanism se produce, azotul nitric este produsul final al nitrificării. În sol el poate să urmeze mai multe căi: cea mai mare parte este absobită de plantele verzi,  parte este utilizată ca sursă de azot de către microorganisme,  parte se pierde prin levigare,  parte se pierde prin denitrificare. – Denitrificarea Denitrificarea constă în reducerea nitraţilor la diferiţi compuşi azotaţi: nitriţi, amoniac, azot liber. Denitrificarea propriu-zisă constă în reducerea nitraţilor la nitriţi, având ca produs final azotul molecular, în felul acesta eliberându-se azotul în atmesferă. În sens larg, denitrificarea este un proces respirator anaerob în care unele microorganisme folosesc nitraţii şi alţi compuşi oxidaţi ai azotului, ca acceptori finali de electroni. Denitrificatori sunt puţini. Acest proces are loc cu precădere în medii slab aerate unde se acumulează cantităţi mari de substanţe organice. În acest context, produşii finali ai denitrificării sunt compuşi azotaţi mai mult sau mai puţin reduşi: azotiţi, oxid de azot, amoniac, azot molecular. În sens agronomic, denitrificarea reprezintă totalitatea proceselor microbiologice prin care nitraţii, în mod secundar nitriţii, sunt reduşi la azpt molecular sau oxid nitros, care eliberându-se din sol în atmosferă, sărăcesc solul în azot asimilabil. Reducerea nitraţilor este frecventă în soluri, în special când conţinutul de apă atinge cel puţin 40% din capacitatea totală a solului. Sub acţiunea microorganismelor, nitraţii din sol pot fi supuşi următoarelor transformări:  utilizarea directă ca sursă de azot,  reducerea în nitriţi şi amoniac prin procesele de asimilare,  reducerea propriu-zisă a nitriţilor în azot elementar sau oxid de azot, cu pierdere reală de azot. Alături de denitrificarea biologică are loc şi o denitrificare chimică care decurge din instabilitatea nitraţilor în sol. În timp ce denitrificarea biologică este un proces anaerob, denitrificarea chimică este un proces aerob. Agenţii de denitrificare sunt numeroase bacterii care transformă nitraţii în nitriţi, amoniac, oxid de azot şi azot elementar. Transformarea nitraţilor în nitriţi şi amoniac este produsă de numeroase bacterii, dr numai unele realizează o denitrificare completă cu punere în libertate de azot elementar şi oxid de azot: Bacillus denitrificans, B. fluorescens, B. pyocyaneum, Pseudomonas, Achromobacter, Micrococcus, Spirillum. Marea majoritate a microorganismelor denitrificatoare sunt heterotrofe deşi se cunosc şi câteva specii autotrofe (Thiobacillus denitrificans, care în anaerobioză oxidează sulful pe seama nitraţilor pe care îi reduce la N2). Condiţii favorizante. Denitrificarea solului reprezintă un fenomen complex. Dacă solul este plin cu apă, nitraţii se descompun ca în soluţii şi pun în libertate azotul elementar. Dacă solul este saturat cu apă (40%), denitrificarea este destul de importantă, însă variabilă de la un sol la altul. Temperatura optimă este de 250C, iar pH-ul

70