Liberacion De Neurotransmisores

LIBERACIÓN DE NEUROTRANSMISORES REVISIÓN

Liberación de neurotransmisores: un proceso de fusión de membranas que transcurre en fracciones de milisegundos E. Alés, J.M. Poyato, V. Valero, G. Álvarez de Toledo RELEASE OF NEUROTRANSMITTERS: A PROCESS OF MEMBRANE FUSION OCCURRING IN FRACTIONS OF MILLISECONDS Summary. Introduction. The physiological mechanisms involved in neurotransmitter release were established thanks to the pioneer work of Katz, Del Castillo and Miledi at the neuromuscular junction. They termed their work as the quantal hypothesis of synaptic transmission. This hypothesis was further established morphologically by the work of Heuser and Reese. However, the molecular events underlying this process are poorly understood. We are starting to know which proteins interact between the vesicle and plasma membrane to promote fusion and to identify which molecules participate in the sensing of cytosolic calcium. Development. Thanks to the combination of molecular biology, electrophysiology and microfluorometry, a huge amount of new information is been obtained on the mechanisms participating in synaptic transmission. This data deals with processes concerning to different pools of synaptic vesicles and their availability to reach the presynaptic membrane; the molecular events responsible for the targeting of these vesicles with the plasma membrane; the sensitivity to calcium at the presynaptic membrane; the fusion of membranes required to release the vesicle contents, and the mechanisms responsible for membrane retrieval needed for presynaptic homeostasis. Conclusions. In this review we discuss new data regarding synaptic function. However, some key points are still a matter of controversy. Meanwhile the quantal hypothesis is valid, the precise processes by which channels and vesicles interact, membrane is recycled and vesicles reused are still controversial. New techniques should be developed to address these points [REV NEUROL 1998; 27: 111-7]. Key words. Calcium channels. Cell membrane capacitance. Exocytosis. Neurotransmitters. Synaptic transmission. Synaptic vesicles.

SINAPSIS QUÍMICAS Y RETARDO SINÁPTICO Una de las características fundamentales del funcionamiento del sistema nervioso es su capacidad para reaccionar ante distintos estímulos. Esta capacidad de respuesta se pone de manifiesto en multitud de funciones nerviosas, que incluyen desde el reflejo involuntario más sencillo, como puede ser el reflejo de retirada ante un estímulo doloroso, hasta reflejos condicionados complejos en los que participan un elevado número de estructuras del sistema nervioso y donde se requiere el relevo en múltiples neuronas para elaborar dicha respuesta refleja. En todas estas reacciones la rapidez en la ejecución ha sido una de las directrices que la evolución ha ido seleccionando. Los seres más rápidos en responder, en los que las respuestas ante estímulos se desarrollan de forma más veloz y coordinada, han sido los que fundamentalmente han conseguido dominar en la escala animal. El retardo en la ejecución de las respuestas en el sistema nervioso viene determinado por la distancia que tiene que recorrer el impulso nervioso a lo largo del axón y el número de estaciones de relevo (neuronas) que intervienen en la generación de la respuesta. En aquellas situaciones donde el efector es un músculo distal, por ejemplo en el reflejo rotuliano, parece claro que es el retardo en la velocidad de conducción a través de un metro de axón de una motoneurona espinal el factor principal que determina la latencia (el impulso nervioso tarda de 10 a 20 milisegundos en recorrer un metro de axón). Sin embargo, cuando las distancias que tiene que recorrer el impulso nervioso son cortas, por ejemplo Recibido: 11.11.97. Aceptado tras revisión externa sin modificaciones: 29.11.97. Departamento de Fisiología Médica y Biofísica. Facultad de Medicina. Universidad de Sevilla. Sevilla, España. Correspondencia: Dr. Guillermo Álvarez de Toledo. Departamento de Fisiología Médica y Biofísica. Facultad de Medicina. Universidad de Sevilla. Avda. Sánchez Pizjuán, 4. E-41009 Sevilla. Fax: +34 95455 1769. E-mail: [email protected]  1998, REVISTA DE NEUROLOGÍA

todas aquellas respuestas reflejas generadas por estímulos visuales, auditivos o funciones superiores, ya no es la distancia que debe recorrer el potencial de acción, sino el número de sinapsis químicas que deben superarse para transmitir el impulso nervioso de una neurona a otra lo que determina la eficacia en la transmisión de información. La visión actual del funcionamiento de la transmisión del impulso nervioso entre dos neuronas proviene de los trabajos clásicos realizados en las décadas de los 50 y 60 por el español José del Castillo, Bernad Katz y Roberto Miledi. Con sus trabajos, este grupo de fisiólogos estableció las bases del funcionamiento sináptico utilizando como preparación experimental la placa neuromuscular. En esta preparación realizaron los experimentos que sirvieron como base de la teoría cuántica de liberación del neurotransmisor, donde la cantidad mínima liberada de neurotransmisor (‘cuanto’) debería ser liberada a la hendidura sináptica de forma instantánea [1]. Esta teoría fue comprobada morfológicamente a principios de los 70 por Heuser y Reese [2]. Sus conocidos experimentos de criofractura de la placa neuromuscular mostraron de forma inequívoca que la liberación de un cuanto de acetilcolina se debía a la fusión de una vesícula sináptica clara con la membrana presináptica. Del Castillo, Katz y Miledi, además de fijar las bases y formalizar numéricamente la teoría cuántica de liberación del neurotransmisor, realizaron una serie de experimentos sobre el retardo sináptico [3]. Uno de los experimentos clásicos de este trabajo se muestra en la figura 1. El dispositivo experimental consiste en la estimulación eléctrica del terminal nervioso y el registro de la actividad extracelular registrada en la superficie del músculo en una zona cercana a la placa neuromuscular. El retardo sináptico en la placa neuromuscular oscila entre 0,5 y 2,6 ms, siendo el retardo más frecuente de 0,9 ms. En ningún caso observaron retardos inferiores a 0,5 ms. En la brillante discusión de este trabajo, Katz y Miledi llegaron a la conclusión de que el retardo sináptico se debe al tiempo que tardan en activarse los mecanismos implicados para que se produzca la liberación del

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Estímulo Presináptica Corriente

Postsináptica

Retardo sináptico 60

40

20

0 0

1

2

3 Tiempo

Figura 1. Determinación del retardo sináptico en la placa neuromuscular. a) Registro extracelular de la corriente postsináptica registrada tras la estimulación eléctrica del terminal. El retardo sináptico aparece como el período que transcurre desde la invasión del terminal por el potencial de acción (pre) y la generación de la corriente postsináptica. El artefacto de estimulación se observa al comienzo del registro. b) Secuencia de registros donde se observa un período de latencia (retardo sináptico) variable. c) Distribución de frecuencias de retardos sinápticos. El retardo mínimo es de 0,5 ms, el más largo de 2,6 ms y la media de la distribución se encuentra a 0,9 ms. (Tomado de Katz y Miledi [3]).

neurotransmisor y no al tiempo de difusión de las moléculas de acetilcolina a través de la hendidura sináptica. En experimentos anteriores realizados por Eccles y Jaeger (1958) [4] se había estimado el tiempo de difusión de la acetilcolina y determinado la distancia de la hendidura sináptica en la placa neuromuscular en 1 µm; estos cálculos indicaban que el retardo sináptico por difusión de neurotransmisor debía ser de tan sólo 1 µs, a diferencia del retardo mínimo observado de 500 µs (0,5 ms). Posteriormente, estudios por microscopía electrónica mostraron que la hendidura sináptica es mucho más estrecha (unos 50-70 nm), lo que sugiere un menor retardo debido a la difusión [2]. Los elegantes experimentos de Katz, Miledi y Del Castillo mostraron no sólo que la transmisión sináptica se producía por la liberación cuántica del neurotransmisor, sino que además sugerían que a nivel presináptico tenían lugar fenómenos moleculares que permiten acoplar la llegada de un potencial de acción con la maquinaria secretora que libera el neurotransmisor en fracciones de milisegundos. El avance reciente de la fisiología celular y la biología molecular está permitiendo caracterizar la cadena de eventos que tiene lugar durante la liberación del neurotransmisor e identificar las distintas moléculas que intervienen en el llamado acoplamiento excitación-secreción. El conocimiento detallado de es-

tas etapas moleculares, no sólo permite entender desde un punto de vista molecular lo que ocurre en un terminal sináptico, sino que además ofrece el sustrato molecular de enfermedades o intoxicaciones del sistema nervioso. Por citar dos buenos ejemplos, se conoce desde hace tres años el lugar concreto de actuación de la toxina tetánica o de la toxina botulínica, dos sustancias que bloquean de forma irreversible la transmisión sináptica. En este artículo de revisión nos proponemos presentar de forma detallada las etapas por las que debe pasar una vesícula sináptica clara, que determinan el retardo de 500 microsegundos, entre la llegada de un potencial de acción y la liberación del neurotransmisor a la hendidura sináptica. UNA POBLACIÓN DE VESÍCULAS SINÁPTICAS SE ENCUENTRA LISTA PARA LA FUSIÓN CON LA MEMBRANA PRESINÁPTICA Al objeto de cumplir los requisitos de rapidez anteriormente expuestos en la transmisión sináptica, las vesículas sinápticas necesitan estar muy cerca de la membrana presináptica. Determinaciones realizadas sobre el transporte axónico, o transporte a través del citoplasma celular, indican que la velocidad de transporte de or-

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ganelas intracelulares se produce con extrema lentitud, comparado con el tiempo en microsegundos requerido para la fusión de vesículas sinápticas. Por ejemplo, los motores moleculares de actina, que posiblemente participan en el transporte de vesículas u otras organelas a un botón sináptico, transportan vesículas a una velocidad de dos micrómetros por segundo [5], lo que daría un retardo de al menos algunas centenas de milisegundos en transportar vesículas sinápticas del interior del terminal sináptico a la zona submembranaria donde va a tener lugar la fusión. Estos tiempos son demasiado largos para la rapidez requerida en una sinapsis. Para solventar este problema, la biología ha dispuesto una población de vesículas sinápticas claras ancladas con la membrana presináptica (docked vesicles) (Fig. 2), que no necesitan recorrer ni ser transportadas al lugar de fusión en el momento de la llegada del potencial de acción. Estas vesículas se encuentran ya a una distancia inferior a los 100 nm de la membrana plasmática, por tanto, no tienen que transportarse a la membrana presináptica, y poseen unas características moleculares específicas que las hacen responder con la fusión de membranas ante la llegada del estímulo fisiológico para la fusión, es decir, el incremento de la concentración intracelular de Ca2+ por la llegada del potencial de acción a través del axón. Actualmente existen evidencias electrofisiológicas, moleculares y morfológicas que sugieren la existencia de esta población de vesículas adosadas. El estudio funcional de las distintas poblaciones de vesículas sinápticas ha avanzado de forma espectacular en los últimos años gracias a la combinación de varias técnicas. Éstas incluyen técnicas para fijar la concentración de Ca2+ en el citosol o terminal sináptico, técnicas de simulación mediante ordenador de cómo tienen lugar los cambios de concentración de Ca2+ en la zona submembranaria, técnicas de medida de la exocitosis mediante la determinación eléctrica de la superficie de membrana celular, técnicas electroquímicas que permiten detectar la liberación de neurotransmisores procedente de una única vesícula y técnicas de fluorescencia en células únicas que permiten visualizar la dinámica de la exo y la endocitosis. Uso combinado de técnicas de fijación de la concentración de Ca2+ y medida de la capacidad eléctrica de la membrana Una de las grandes dificultades para el estudio de la dependencia de Ca2+ en el proceso de exocitosis ha sido la imposibilidad de mantener constante la concentración de Ca2+ intracelular. Sin este control de la concentración no es posible realizar estudios de dosis respuesta y, por tanto, obtener información cinética de la exocitosis. Desde la introducción de la técnica de patch-clamp [6] es posible dializar el citosol de una célula con soluciones que contienen distintas concentraciones de Ca2+ y por tanto estudiar la dependencia de Ca2+ de la exocitosis. Más recientemente se han desarrollado técnicas que permiten no sólo introducir una solución con concentración conocida de Ca2+, sino además permiten elevar la concentración de este ion a distintos niveles. El método más utilizado es el de liberar iones Ca2+ de compuestos enjaulados (caged compounds). Estos compuestos enjaulados son molecularmente muy similares a compuestos que tamponan Ca2+, como el EGTA, pero que ante un estímulo intenso de luz (flash) se destruyen y pierden su afinidad por los iones de Ca2+, provocando, por tanto, una liberación masiva de iones en el citosol. El compuesto enjaulado más utilizado ha sido el DM-nitrofeno, que permite liberaciones de Ca2+ controlables en función de la intensidad y duración del flash de luz. Así pues, en una misma célula se puede incrementar la concentración de Ca2+ a niveles conocidos y así

Terminal presináptico

Vesículas sinápticas

Terminal postsináptico

Figura 2. Poblaciones de vesículas sinápticas en un terminal nervioso. La mayor parte de las vesículas se encuentran en el citosol a distancias superiores a los 100 nm. Una pequeña población de vesículas está anclada y lista para la fusión ante la llegada de un potencial de acción. La presencia de vesículas ancladas hace posible la rapidez en la transmisión sináptica.

poder estudiar el fenómeno secretor con la utilización de técnicas de medida de la superficie de membrana o la determinación electroquímica de productos de secreción. Las técnicas de fijación de la concentración de Ca2+ se han utilizado en combinación con técnicas que miden directamente la exocitosis. La técnica con mayor resolución para estudiar la exocitosis es la de la medida de la capacidad eléctrica de la membrana. Esta técnica se basa en la relación directa que existe entre la capacidad eléctrica de la membrana plasmática y la superficie de membrana celular. Por tanto, cuando tiene lugar la exocitosis, que produce un incremento neto en la superficie de membrana celular al incorporarse la membrana vesicular en la membrana plasmática, se produce un incremento de la capacidad eléctrica de la membrana. Con esta técnica se pueden medir fusiones de vesículas únicas de hasta 50 nm de diámetro. Hasta ahora, estas poderosas técnicas no se han podido utilizar en un terminal sináptico en el sistema nervioso de mamíferos debido a su reducido tamaño. La información sobre las distintas poblaciones de vesículas se ha obtenido en células neuroendocrinas. Cuando se eleva la concentración de Ca2+ en el citosol mediante la fotólisis de DM-nitrofeno se observa que la superficie de la membrana se incrementa en tres fases. La primera fase se produce con un latencia muy corta después de haberse producido la elevación de Ca2+ y determina la fusión de un pequeño número, pero con una gran rapidez, de vesículas con la membrana plasmática. En células de la parte intermedia de la hipófisis la velocidad de fusión de vesículas es de unas 17.000 vesículas por segundo [7], habiéndose obtenido resultados similares en células cromafines [8]. Posteriormente a esta fase se produce la liberación de vesículas a una velocidad inferior, unas 2.000 vesículas por segundo. Esta fase incorpora un mayor número de vesículas y debido a su menor velocidad perdura durante más tiempo. Finalmente, se produce en el citosol, mientras se mantiene elevada la concentración de Ca2+, una liberación residual a una menor velocidad. Estos datos se han

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Vesículas ancladas

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NT Endosoma temprano Entrada de NT

H+

Vesiculación Fusión de endosomas Translocación

decir, se activaría únicamente cuando las concentraciones de Ca2+ son muy elevadas, produciéndose, por tanto, la liberación del neurotransmisor únicamente cuando se alcanzan concentraciones del orden de 100 µM. De esta forma se obtiene una respuesta más fásica que permite sincronizar la llegada de un potencial de acción con la fusión de un grupo reducido de vesículas sinápticas.

Translocación

EL CICLO DE LAS VESÍCULAS SINÁPTICAS Anclaje

Hendidura sináptica

Habilitación

Flicker

Fusión transitoria

Fusión completa

4 Ca2+

ATP

Membrana plasmática

Endocitosis Ca2+?

Ca2+

1

2

3

4

5

Figura 3. Ciclo vital de una vesícula sináptica.

interpretado como indicativos de vesículas que se encuentran en distintas fases del proceso secretor, correspondiendo las que se liberan de forma más rápida a la población de vesículas más próximas a la membrana y más competentes para la fusión. Las otras dos poblaciones de vesículas corresponden a vesículas de reserva que únicamente son liberadas cuando se ha producido el agotamiento de la primera población de vesículas. La población de vesículas cercanas a la membrana plasmática se ha puesto de manifiesto en estudios de microscopía electrónica en células cromafines [9]. EL SENSOR DE Ca2+ DE LAS VESÍCULAS ANCLADAS ES DE BAJA AFINIDAD En células excitables, como lo son las células neuroendocrinas y las neuronas, el factor activador fundamental de la exocitosis es el incremento de la concentración de Ca2+ en el citosol o terminal sináptico. En estos tipos celulares la elevación de la concentración de Ca2+ se produce por la entrada al citosol de los iones de Ca2+ a través de canales iónicos voltaje-dependientes situados en la membrana plasmática. Estos canales se abren por la despolarización generada por la invasión del terminal nervioso por el potencial de acción, y permiten la entrada de iones de Ca2+ al interior celular. Se debe recordar que los iones de Ca2+ penetran al interior celular gracias al enorme gradiente químico existente entre el exterior y el interior celular (2 mM en el exterior comparado con 20 nM en el interior, diferencia de cinco órdenes de magnitud). La entrada de los iones de Ca2+ genera, a su vez, un gradiente de concentración para este ion en el interior celular, alcanzándose la máxima concentración en la vecindad del poro del propio canal de Ca2+ y disminuyendo ésta hacia el interior celular. Este hecho determina que las vesículas ancladas sientan concentraciones altas de Ca2+, mientras que las vesículas de la población de reserva únicamente detecten concentraciones más bajas de este ion. Si la maquinaria secretora respondiera con la fusión de vesículas sinápticas cuando se incrementa ligeramente la concentración de Ca2+ en el citosol, tendría lugar una respuesta de exocitosis mantenida (vesículas ancladas y de reserva) hasta que se restableciera a niveles basales la concentración de Ca2+. Este tipo de respuesta impediría discriminar la llegada de un nuevo estímulo ya que el terminal aún estaría activo (liberando neurotransmisor) cuando llegara el siguiente potencial de acción. Por esta razón, se cree que en un terminal nervioso el sensor de Ca2+ es de baja afinidad, es

En los últimos años se ha producido un gran avance en el conocimiento de cómo una vesícula sináptica se fija a la membrana presináptica y cómo se dirige desde su lugar de síntesis a la membrana presináptica. Se han descubierto proteínas que participan en este proceso y que son las responsables de las distintas etapas por las que tiene que pasar una vesícula sináptica hasta que sea reutilizada en el terminal sináptico [10]. Las vesículas sinápticas atraviesan varias etapas hasta que pueden ser reutilizadas, éstas son: 1. Síntesis de la vesícula sináptica a partir de endosomas tempranos; 2. Acumulación del neurotransmisor en el interior vesicular; 3. Aproximación a la membrana presináptica; 4. Habilitación de la vesícula para la fusión; 5. Fusión y formación de un poro que conecta el interior de la vesícula con el espacio extracelular; 6. Apertura completa del poro de fusión, y 7. Endocitosis y recaptación de la membrana vesicular para la posterior síntesis de vesículas. Estas etapas se muestran de forma esquemática en la figura 3. La formación de vesículas a partir de endosomas tempranos (budding) es un proceso no bien estudiado y del que se desconocen los factores que lo regulan. Sí parece que en la selección de la vesícula participan proteínas con actividad GTPásica, que son las responsables de dirigir las vesículas sinápticas hacia la membrana presináptica. La fase de acumulación del neurotransmisor en el interior vesicular se produce mediante transportadores específicos para los distintos neurotransmisores en la propia membrana vesicular. Existen cuatro tipos de transportadores, cada uno de ellos es suficiente para introducir los distintos tipos de neurotransmisores. Por ejemplo, las catecolaminas, serotonina y dopamina pueden acumularse en el interior vesicular sólo por un único transportador que no discrimina entre los distintos neurotransmisores de esta familia. Lo mismo ocurre para la acetilcolina y el glutamato, que se acumulan por el mismo transportador. Por ejemplo, una neurona con vesículas sinápticas colinérgicas puede liberar glutamato si éste es introducido en el soma mediante técnicas de microinyección. Este ‘engaño’ se debe a la falta de selectividad del transportador de la vesícula sináptica. Para que un transportador funcione adecuadamente necesita que se forme un gradiente de protones (acidificación) en el interior vesicular. La disipación de este gradiente es el que utiliza el transportador de neurotransmisores para cargar la vesícula de neurotransmisor. El gradiente de protones se genera gracias a la presencia en la membrana vesicular de una bomba de protones, similar a la que existe en las vacuolas de las células vegetales, que consume ATP. Estos mecanismos de concentración de neurotransmisor se han demostrado para las sinapsis catecolaminérgicas, donde la concentración de noradrenalina en el interior vesicular puede llegar a ser del orden de 1 M. La aproximación de la vesícula a la membrana presináptica es un proceso regulado por el incremento residual de la concentración de Ca2+ en el citosol. En estudios realizados en células cromafines se ha demostrado que los niveles de Ca2+ requeridos para esta acción son del orden de unas pocas unidades micromolares [8]. De esta forma, se garantiza un aporte continuo de vesí-

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VS

VS Sfi

Sbv Stg

Stg

D Sbv CAC NSF

S25

M Stx

Stx Figura 4. Proteínas que participan en la fusión de vesículas sinápticas. Sbv: sinaptobrevina; NSF: proteína de fusión sensible a N-etilmaleimida acoplado a proteína SNAP; Stx: sintaxina; S25: SNAP-25; Stg: sinaptotagmina; Sfi: sinaptofisina; M: Munc18-1.

culas a la zona presináptica. A este nivel parece ser que los microtúbulos son los principales responsables para esta aproximación. Experimentos recientes sugieren que parte de los microtúbulos se tienen que desestructurar para facilitar la aproximación de las vesículas a la zona submembranaria [11], siendo la destrucción de la capa submembranaria de actina dependiente de la concentración citosólica de Ca2+. Las vesículas se anclan y se habilitan para la fusión con la membrana presináptica. Estudios recientes han demostrado numerosas etapas en este proceso. Un paso crítico para la habilitación es la presencia de ATP, que permite la habilitación (priming) de vesículas sinápticas. Por tanto, existen moléculas ancladas con la membrana plasmática que no son susceptibles de producir fusión. El incremento de los niveles intracelulares de Ca2+ permite la fusión de membranas y la apertura del poro de fusión. En vesículas sinápticas parece que existe la maquinaria secretora y los canales de calcio responsables para la fusión se encuentran muy próximos. Por esta razón, la maquinaria secretora detecta y se activa por concentraciones muy elevadas de Ca2+ citosólico. La apertura del poro de fusión determina, desde su formación, la salida del neurotransmisor al espacio extracelular [12]. Experimentos realizados en mastocitos y células cromafines ponen de manifiesto que cuanto menor es el tamaño de una vesícula secretora, mayor es la fracción de contenido liberada durante las primeras etapas de expansión del poro de fusión. La apertura del poro de fusión puede ser un fenómeno transitorio (flicker) [13], con lo que incluso en situaciones de fusión transitoria se produce liberación de neurotransmisor al espacio extracelular [12]. Esta hipótesis de liberación de neurotransmisor durante fusiones transitorias fue propuesta como mecanismo de liberación en la placa neuromuscular hacia los años 80 [14], pero tuvo escaso eco en la comunidad científica internacional después de la instauración de la teoría vesicular y de reciclado de membrana [2]. Experimentos recientes realizados con técnicas de patch-clamp para determinar el incremento de superficie que tiene lugar durante la exocitosis y la combinación de técnicas electroquímicas que permiten detectar la liberación de neurotransmisor de vesículas únicas están permitiendo abordar de nuevo esta hipótesis de liberación a través de fusiones transitorias. La apertura del poro de fusión se produce

de una forma dependiente de Ca2+ [15,16], acelerándose la apertura del poro de fusión cuando la concentración citosólica de Ca2+ se encuentra por encima de 1 mM. Este paso puede ser crítico para determinar si una fusión va a ser transitoria o completa, pues dependiendo de la cantidad de iones de calcio que hayan entrado durante el curso de un potencial de acción se producirá una fusión completa o transitoria. Esta hipótesis aún debe demostrarse a nivel de un terminal sináptico. La fusión completa de la vesícula permite la liberación de todo el contenido vesicular, quedando incorporada la membrana de la vesícula sináptica con la de la membrana plasmática. El siguiente paso que tiene lugar durante la exocitosis es la recaptación de membrana mediada por vesículas revestidas de clatrina. Este paso también parece ser dependiente de Ca2+ y de unas proteínas asociadas al citoesqueleto, entre las que la dinamina parece desempeñar un papel relevante. La posterior translocación de la vesícula hasta su completo reciclado está aún poco estudiada. El ciclo completo de una vesícula sináptica se produce en la placa neuromuscular en aproximadamente 1 minuto [17]. BASES MOLECULARES DEL ANCLAJE DE LAS VESÍCULAS SINÁPTICAS Las proteínas implicadas en el anclaje de las vesículas sinápticas con la membrana presináptica, y el lugar exacto donde éste debe producirse, se han descubierto muy recientemente. La hipótesis del lugar de reconocimiento y los cambios conformacionales que tienen lugar hasta que se produce la apertura del poro de fusión se muestran en la figura 4. Esta hipótesis, conocida como la hipótesis SNARE, fue propuesta por el grupo de Rothman en 1993 [18]. Se basa en la presencia de dos proteínas complementarias, una situada en la membrana vesicular y la otra en la membrana presináptica. Estas dos proteínas son distintas dependiendo del tejido donde se encuentren y son el sustrato de una proteína soluble existente en el citosol, llamada NSF, o proteína de fusión sensible a Netilmaleimida. Esta proteína forma un complejo en el citosol con otra proteína, la SNAP, o proteína de acoplamiento de la NSF. Este complejo tiene actividad ATPásica y forma el complejo de fusión cuando se une a las dos proteínas complementarias comentadas anteriormente. Por este motivo, las proteínas complemen-

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tarias reciben el nombre de receptores de las SNAPS (SNARE). La proteína existente en la membrana vesicular (SNAREv) se ha identificado y se la ha denominado, además, sinaptobrevina. La proteína existente en la membrana presináptica (SNAREt) se conoce con el nombre de sintaxina. La formación del complejo de fusión es el paso crítico previo a la fusión de membranas. Además de estas proteínas, existe una quinta proteína que participa en el complejo de fusión, la SNAP-25. Tanto la sinaptobrevina, como la sintaxina y la SNAP-25 son los lugares de actuación de las toxinas botulínica y tetánica. Una vez alcanzada esta fase del proceso, se adhiere una nueva proteína al complejo de fusión, la sinaptotagmina. Esta proteína parece ser el sensor de la concentración de Ca2+. La sinaptotagmina entra a formar parte del complejo de fusión y parece que debe salir del lugar donde se va a generar el poro de fusión para que éste pueda formarse. La sinaptotagmina requiere de la unión de varios iones de Ca2+ para que pueda realizar esta transición [10]. Los factores que determinan la expansión del poro de fusión no son conocidos, aunque se conoce el papel de los iones de Ca2+ a este nivel. Para que se produzca la fusión de vesículas sinápticas en el lugar apropiado (zona activa) parece ser que otra proteína, Munc18-1, desempeña un papel fundamental. La sinaptofisina se ha postulado como la responsable de formar el poro de fusión, aunque esta hipótesis aún está por demostrar.

CONCLUSIONES Y NUEVAS PERSPECTIVAS La gran confluencia de resultados obtenidos en los últimos años con técnicas tan diversas como biología molecular, electrofisiología y técnicas fluorescentes ha permitido identificar y disecar distintas etapas que intervienen en la liberación de neurotransmisores a la hendidura sináptica. Gracias a este abordaje multidisciplinar se han identificado moléculas que participan en la fusión de vesículas sinápticas en el terminal presináptico, moléculas que detectan los niveles de calcio en el terminal presináptico –que son las responsables de disparar el proceso de fusión–, y las distintas etapas por la que pasa una vesícula sináptica antes de liberar el neurotransmisor. Esta amplia visión del funcionamiento de un terminal sináptico ha permitido comprender en profundidad, a nivel molecular y fisiológico, entre otros, los mecanismos de acción de neurotoxinas como la tetánica y la botulínica. Sin embargo, aún quedan por dilucidar aspectos tan importantes como las bases moleculares y fisiológicas del estrecho acoplamiento que tiene lugar entre la maquinaria secretora y los canales de calcio del terminal presináptico y la estrecha regulación a la que está sometido un terminal nervioso para que funcione según las demandas de transmisores sinápticos particulares. Una mejor comprensión de estos aspectos será sólo posible con el desarrollo de nuevas técnicas que permitan estudiar el fenómeno secretor en terminales sinápticos individuales.

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LIBERACIÓN DE NEUROTRANSMISORES: UN PROCESO DE FUSIÓN DE MEMBRANAS QUE TRANSCURRE EN FRACCIONES DE MILISEGUNDOS Resumen. Introducción. Las bases fisiológicas de la liberación de neurotransmisores a la hendidura sináptica quedaron establecidas gracias a los trabajos pioneros de Katz, Del Castillo y Miledi en la placa neuromuscular. Estos experimentos obtuvieron una corroboración morfológica con los experimentos realizados por Heuser y Reese. Sin embargo, sólo muy recientemente se ha obtenido información detallada sobre cómo se produce a nivel molecular la fusión de vesículas sinápticas con el terminal presináptico. Gracias a estos estudios se ha podido conocer el mecanismo de acción de la toxina tetánica y botulínica, y las distintas etapas por las que atraviesa una vesícula sináptica hasta liberar su contenido a la hendidura sináptica. Desarrollo. La gran confluencia de resultados obtenidos en los últimos años con técnicas tan diversas como de biología molecular, electrofisiología y técnicas fluorescentes está permitiendo identificar las moléculas que participan en la fusión de vesículas sinápticas

LIBERTAÇÃO DE NEUROTRANSMISORES: UM PROCESSO DE FUSÃO DE MEMBRANAS QUE DECORRE EM FRACÇÕES DE MILISEGUNDOS Resumo. Introdução. As bases fisiológicas da libertação de neurotransmisores na fenda sináptica foram estabelecidas graças aos trabalhos pioneiros de Katz, Del Castillo e Miledi na placa neuromuscular. Estas experiências tiveram uma corroboração morfológica com as experiências realizadas por Heuser e Reese. No entanto, só muito recentemente se obteve informação detalhada sobre como se produz, a nível molecular, a fusão de vesículas sinápticas com o terminal pré-sináptico. Graças a estes estudos pode-se conhecer o mecanismo de acção da toxina tetânica e botulínica, e as diversas etapas pelas quais passa uma vesícula sináptica até libertar o seu conteúdo na fenda sináptica. Desenvolvimento. O grande conjunto de resultados obtidos nos últimos anos com técnicas tão diversas como da biologia molecular, electrofisiologia e técnicas fluorescentes estão a permitir identificar as moléculas que participam na fusão de vesículas sinápticas no terminal pré-sináptico, moléculas que

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en el terminal presináptico, moléculas que detectan los niveles de calcio en el terminal presináptico y las distintas etapas por la que pasa una vesícula sináptica antes de liberar el neurotransmisor. Conclusiones. Los datos obtenidos recientemente amplían considerablemente la visión molecular de los eventos que tienen lugar en la transmisión sináptica. Sin embargo, aún quedan por dilucidar aspectos tan importantes como las bases moleculares y fisiológicas del estrecho acoplamiento que tiene lugar entre la maquinaria secretora y los canales de calcio del terminal presináptico y la estrecha regulación a la que está sometido un terminal nervioso para que funcione según las demandas de transmisores sinápticos particulares. Una mejor comprensión de estos aspectos será sólo posible con el desarrollo de nuevas técnicas que permitan estudiar el fenómeno secretor en terminales sinápticos individuales [REV NEUROL 1998; 27: 111-7]. Palabras clave. Canales de calcio. Capacitancia. Exocitosis. Neurotransmisores. Transmisión sináptica. Vesículas sinápticas.

detectam os níveis de cálcio no terminal pré-sináptico e as diversas etapas pelas que passa uma vesícula sináptica antes de libertar o neurotransmisor. Conclusões. Os dados obtidos recentemente aumentam considerávelmente a perspectiva molecular dos eventos que têm lugar na transmissão sináptica. No entanto, ficam aínda por clarificar aspectos tão importantes como as bases moleculares e fisiológicas do estrecho acoplamiento que ocorre entre a maquinaria secretora e os canais de cálcio do terminal pré-sináptico e a estreita regulação a que está sobmetida um terminal nervoso para que funcione de acordo com as necessidades de transmisores sinápticos particulares. Uma melhor comprenssão destes aspectos será possível apenas com o desenvolvimento de novas técnicas que permitam estudar o fenómeno secretor nos terminais sinápticos individuales [REV NEUROL 1998; 27: 111-7]. Palavras chave. Canais de cálcio. Neuro transmisores. Transmissão sináptica. Vesículas sinápticas.

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