Ky Thuat Nuoi Cay Te Bao Ung Thu

Thöû nghieäm phaân laäp vaø nuoâi caáy teá baøo ung thö coå töû cung

Ñaët vaán ñeà

“Söï soáng quaù phöùc taïp khoâng cho pheùp chæ qua moät vaøi nghieân cöùu maø hieåu ñöôïc toaøn boä cô theå con ngöôøi” – Linus Pauling. Hieän nay treân theá giôùi caùc öùng duïng kyõ thuaät cuûa haøng loaït coâng trình nghieân cöùu nuoâi caáy caùc teá baøo ung thö ñaõ vaø ñang giuùp caùc nhaø khoa hoïc töøng böôùc giaûi ñaùp nhöõng vaán ñeà cô baûn trong sinh hoïc phaân töû vaø caû nhöõng ñieàu bí aån trong cô theå con ngöôøi. Caùc nhaø khoa hoïc vaãn ñang tieáp tuïc tìm kieám vaø khaùm phaù ra nhöõng doøng teá baøo ñoàng nhaát veà maët di truyeàn. Caùc teá baøo ñöôïc choïn loïc naøy laø muïc tieâu cho vieäc tieán haønh caùc lieäu phaùp sinh hoïc nhaèm goùp phaàn ngaên chaän caên beänh hieåm ngheøo. Khoa hoïc veà nuoâi caáy teá baøo ung thö coù phaïm vi öùng duïng raát roäng vaø phong phuù caû trong nghieân cöùu khoa hoïc vaø trong thöông maïi. Doøng teá baøo ung thö ñöôïc söû duïng nhö moät vaät lieäu ñeå saûn xuaát ra caùc cô chaát. Caùc protein ngöôøi coù theå ñöôïc phaân laäp tröïc tieáp töø vieäc nuoâi caáy teá baøo. Caùc doøng teá baøo ñoùng vai troø quan troïng trong caùc kyõ thuaät taùi toå hôïp DNA trong sinh hoïc phaân töû. Ngöôøi ta coøn söû duïng doøng teá baøo ñeå thöû nghieäm caùc loaïi thuoác coù ñoäc tính ñeå ñieàu trò caùc beänh di truyeàn, ung thö. Vieäc nuoâi caáy teá baøo coøn goùp phaàn môû ra kyõ thuaät dung hôïp teá baøo. Kyõ thuaät naøy giuùp chuùng ta hieåu bieát nhöõng ñieàu bí aån xaõy ra beân trong cô theå con ngöôøi nhö caùc caáu taïo vaø chöùc naêng cuûa gen ngöôøi, caùc bieåu hieän vaø caùc cô cheá di truyeàn, caùc phaûn öùng sinh hoïc bình thöôøng vaø quaù trình phaùt trieån cuûa nhöõng gen beänh. Muïc tieâu chính cuûa luaän vaên naøy laø giôùi thieäu neàn taûng cô baûn vaø phöông phaùp luaän caàn thieát ñeå tieán haønh nuoâi caáy teá baøo ung thö noùi chung vaø ñaëc bieät laø thöû nghieäm phaân laäp vaø nuoâi caáy sô caáp teá baøo ung thö coå töû cung töø caùc maãu moâ sinh thieát cuûa caùc beänh nhaân ñöôïc chaån ñoaùn bò toån thöông loaïn saûn ôû giai ñoaïn IB, IIA vaø IIB. ÔÛ Vieät Nam vieäc nuoâi caáy caùc teá baøo coøn heát söùc môùi meõ. Döïa treân caùc taøi lieäu coù ñöôïc vôùi söï höôùng daãn cuûa caùc Thaày Coâ, caùc anh chò vaø söï hoã trôï cuûa beänh vieän Ung böôùu thaønh phoá Hoà Chí Minh em ñaõ coá gaéng tieán haønh coâng vieäc nuoâi caáy doøng teá baøo ung thö coå töû cung trong phaïm vi khaû naêng, thôøi gian vaø caùc ñieàu kieän kyõ thuaät hieän coù. Keát quaû cuõng môùi chæ döøng ôû möùc ñoä xaùc ñònh teá baøo ung thö coå töû cung coù theå nuoâi caáy trong moät moâi tröôøng nhaát ñònh vôùi caùc thao taùc chuaån, keøm theo ñieàu kieän moâi tröôøng vaø caùc duïng cuï thí nghieäm caàn phaûi ñöôïc voâ truøng tuyeät ñoái. Maëc duø tyû leä thaønh coâng ôû laàn thöû nghieäm phaân laäp vaø nuoâi caáy ñaàu tieân cuûa em laø 1/20 maãu sinh thieát nhöng ñaây laø tieàn ñeà ñeå em coù theå tieáp tuïc theo ñuoåi ñeà taøi naøy trong töông lai. Tp Hoà Chí Minh, thaùng 7 – 2004

Taï 1 Ngoïc Tuyeát Minh

Thöû nghieäm phaân laäp vaø nuoâi caáy teá baøo ung thö coå töû cung

1.1. MOÄT SOÁ MOÁC LÒCH SÖÛ NGHIEÂN CÖÙU VEÀ UNG THÖ Theo caùc taøi lieäu ñöôïc ghi cheùp töø thôøi coå ñaïi, caùc nhaø khoa hoïc ñaõ tìm thaáy daáu veát cuûa moät khoái u aùc tính ôû maãu xöông hoùa thaïch cuûa xaùc öôùp Ai Caäp (caùch ñaây 5.000 naêm) vaø moät baûn thaûo ñöôïc vieát treân giaáy coû lau moâ taû 8 tröôøng hôïp bò khoái u hay veát loeùt ôû phaàn ngöïc. Trong baûn moâ taû ngöôøi vieát coøn ghi theâm “khoâng coù caùch ñieàu trò”. Luùc baáy giôø thuaät ngöõ “cancer” chöa ñöôïc söû duïng. Hyppocrate, ngöôøi thaày thuoác Hy Laïp cuõng xaùc nhaän ung thö coù theå laøm cheát ngöôøi. Vaøo thôøi naøy ñaõ söû duïng thuaät ngöõ carcinoma ñeå moâ taû hai loaïi ung thö: loaïi suøi ra ngoaøi nhieàu chaân nhö loaøi cua (carcinoma) vaø loaïi phaùt trieån saâu trong thòt (sarcom). Tuy nhieân maõi ñeán theá kyû 15, Giovanni Morgagni môùi laø ngöôøi ñaàu tieân thöïc hieän giaûi phaãu töû thi moät beänh nhaân u xöông vôùi muïc ñích tìm hieåu baûn chaát vaø nguyeân nhaân beänh. Ñaây laø neàn taûng ñeå phaùt trieån khoa hoïc veà u böôùu (oncology). Naêm 1846, nhaø nghieân cöùu beänh hoïc ngöôøi Ñöùc Rudolph Virchow moâ taû teá baøo ung thö maùu vaø ñöa ra giaû thuyeát veà nguoàn goác ung thö teá baøo. OÂâng cho raèng taát caû caùc teá baøo, bao goàm caû teá baøo ung thö ñeàu coù nguoàn goác töø moät teá baøo khaùc. Giaû thuyeát cuûa oâng vaøo thôøi ñoù ñaõ raát tieán boä vaø vaøi thaäp kyõ sau giaû thuyeát naøy ñöôïc chöùng minh laø ñuùng. Ñaàu theá kyû 19, caùc nhaø khoa hoïc môùi heù môû phaàn naøo söï bí aån cuûa ung thö. Naêm 1911, Peyton Rous ñaõ khaùm phaù ñöôïc moät trong nhöõng viruùt gaây ung thö ñaàu tieân ñaët teân laø RSV. Ñoù laø moät retrovirus (viruùt phieân maõ ngöôïc) maø voán di truyeàn ñöôïc caáu taïo baèng RNA. Thôøi ñieåm naøy moät vaán ñeà ñaët ra cho caùc nhaø khoa hoïc laø laøm theá naøo RSV coù theå nhaäp vaøo voán di truyeàn cuûa teá baøo caáu taïo baèng DNA. Naêm 1960, Temin nghó ra raèng RNA coù theå taïo ra DNA nhôø moät chaát men. Möôøi naêm sau, Temin vaø Baltimore ñaõ chöùng minh ñöôïc söï hieän höõu cuûa enzym naøy, ñoù laø enzym sao cheùp ngöôïc vaø caùc viruùt gaây ung thö loaïi RNA ñöôïc goïi laø viruùt phieân maõ ngöôïc. Khaùm phaù naøy nhaän ñöôïc giaûi thöôûng Nobel Sinh lyù vaø Y hoïc naêm 1975. Naêm 1976, nhaø nghieân cöùu ngöôøi Phaùp Dominique Stehelin cuøng vôùi caùc ñoàng nghieäp ngöôøi Myõ Michel Bishop vaø Harold Varmus khaùm phaù moät ñieàu gaây söûng soát laø nhieãm saéc theå cuûa nhieàu ñoäng vaät, keå caû ngöôøi chöùa caùc gen coù theå chuyeån ñoåi

Taï 2 Ngoïc Tuyeát Minh

Thöû nghieäm phaân laäp vaø nuoâi caáy teá baøo ung thö coå töû cung

thaønh caùc gen gaây u, nhôø vaäy xaùc ñònh treân 60 loaïi gen cuûa teá baøo coù theå chuyeån thaønh gen gaây ung thö. Kieán thöùc cuûa nhaân loaïi veà di truyeàn hoïc, veà cô cheá sinh hoïc phaân töû ñaõ tieán trieån nhanh trong nhöõng naêm gaàn ñaây.Vaøo giöõa theá kyû 20 caùc nhaø khoa hoïc môùi baét ñaàu giaûi quyeát nhöõng vaán ñeà phöùc taïp cuûa di truyeàn hoïc. James Watson vaø Franci Crick vôùi hai trang thoâng baùo ngaén goïn veà moâ hình phaân töû cuûa DNA treân taïp chí Nature ñaõ laøm ñaûo loän nhaän thöùc cuûa giôùi khoa hoïc ñöông thôøi. Trong lòch söû sinh hoïc ít coù moác nghieân cöùu naøo coù taùc ñoäng roäng raõi nhö maïch xoaén keùp DNA cuûa hoï. Moâ hình cuûa Watson vaø Crick ñem laïi yù nghóa môùi meû cho vieäc nghieân cöùu chuû ñeà di truyeàn hoïc vaø ung thö. Cuõng vaøo thôøi ñieåm naøy thuaät ngöõ khaùng theå ñôn doøng xuaát hieän. Kyõ naêng taïo caùc khaùng theå ñôn doøng ñaõ cho ra ñôøi moät coâng ngheä môùi aùp duïng phoå bieán trong vieäc chaån ñoaùn sôùm vaø ñieàu trò moät soá beänh ung thö. Nhaø baùc hoïc tìm ra caùc khaùng theå ñôn doøng ñöôïc trao giaûi thöôûng Nobel vaøo naêm 1981 laø Cesar Milstein. Chuùng ta phaûi thöøa nhaän raèng ñeán cuoái theá kyû 20, nhaân loaïi ñaõ coù nhöõng böôùc tieán vöôït baäc veà vieäc nghieân cöùu ung thö treân cô sôû di truyeàn hoïc, ñoàng thôøi tìm ra nhöõng lieäu phaùp ñieàu trò môùi maø muïc tieâu nhaèm vaøo vieäc tieâu dieät caùc teá baøo ung thö chuyeân hoùa. Tuy nhieân, nhöõng ñieàu naøy ñeán nay vaãn chöa laøm thay ñoåi söï thaät veà moät caên beänh nan y. Nhöng duø sao chuùng ta cuõng coù quyeàn hy voïng ñeán naêm 2010 hay laâu hôn nöõa baûn phaân loaïi veà gen con ngöôøi seõ ñöôïc hoaøn taát, ñoù seõ laø neàn taûng ñeå caùc nhaø khoa hoïc tìm ra caùc tín hieäu ñieàu khieån quaù trình taùi taïo khoái u vaø tìm ra caùc gen baûo veä cô theå choáng laïi caên beänh naøy.

1.2. NHÖÕNG ÑAËC TÍNH CUÛA UNG THÖ NGÖÔØI 1.2.1. Baûn chaát cuûa beänh ung thö vaø söï phaân bieät giöõa u laønh vôùiø u aùc tính Ung thö laø moät beänh lyù aùc tính. Vì sao ung thö laïi laøm cho ngöôøi ta thaät söï sôï haõi khi maéc phaûi? Ta coù theå hình dung teá baøo ung thö nhö moät sinh vaät phaùt trieån ngoaøi voøng kieåm soaùt. Maø caùi gì hoaëc ñieàu gì naèm ngoaøi voøng kieåm soaùt ñeàu ñaùng lo ngaïi. Trong phaân hoaù teá baøo bình thöôøng, caùc cô cheá kieåm soaùt ôû möùc teá baøo thöôøng haïn cheá sinh tröôûng vaø phaân baøo ôû nhöõng möùc xaùc ñònh. Nhöng ñoâi khi moät teá baøo thoaùt khoûi möùc kieåm soaùt naøy vaø nhaân baûn leân moät caùch thaùi quaù. Sinh tröôûng thaùi

Taï 3 Ngoïc Tuyeát Minh

Thöû nghieäm phaân laäp vaø nuoâi caáy teá baøo ung thö coå töû cung

quaù coù theå daãn ñeán haäu quaû taïo ra khoái u, töùc laø moät khoái teá baøo baát thöôøng so vôùi nhöõng moâ chuaån möïc bình thöôøng. Coù phaûi taát caû khoái u ñeàu laø ung thö khoâng? caâu traû lôøi laø khoâng. Coù hai loaïi u. U laønh tính thöôøng goïi laø u laønh. Ñoù laø moät khoái teá baøo baát thöôøng vaãn giöõ laïi ôû vò trí goác nôi chuùng ñaõ phaùt sinh trong cô theå. Caùc u laønh cuõng coù theå gaây söï coá neáu chuùng sinh tröôûng lôùn cheøn eùp ôû moät soá cô quan bò khung xöông boïc kín nhö naõo hay phoåi. Nhöng thoâng thöôøng ôû caùc vò trí khoâng cheøn eùp caùc moâ khaùc ngöôøi ta coù theå duøng phaãu thuaät taïi choã caét boû hoaøn toaøn khoái u ra khoûi cô theå. Traùi haún vôùi u laønh laø caùc u aùc tính laø moät khoái moâ baát thöôøng coù theå phaùt trieån lan vaøo trong caùc moâ laân caän vaø thöôøng di caên vaøo nhöõng boä phaän ôû xa khaùc cuûa cô theå. Moät u aùc phaùt sinh töø moät teá baøo ung thö duy nhaát vaø dôøi choã ra khoûi moâ bình thöôøng noù ñaõ phaùt sinh. Neáu khoâng tieâu dieät hay caét boû, moät vaøi teá baøo ung thö ñoù seõ xaâm nhieãm vaøo trong caùc moâ bao quanh vaø khoái u goác seõ baønh tröôùng. Caùc teá baøo cuõng coù theå taùch khoûi khoái u, xaâm nhaäp vaøo heä tuaàn hoaøn (vaøo caùc maïch baïch huyeát vaø maïch maùu) vaø coù theå lan ñeán caùc vò trí môùi, taïo ra nhöõng khoái u môùi taïi nhöõng choã ñoù. Söï dôøi choã cuûa caùc teá baøo ung thö ra khoûi vò trí nguyeân thuûy cuûa chuùng ñöôïc goïi laø söï di caên (malignant progression).

Hình 1: Söï di caên

Taï 4 Ngoïc Tuyeát Minh

Thöû nghieäm phaân laäp vaø nuoâi caáy teá baøo ung thö coå töû cung

Noùi chung, ñeå phaân bieät giöõa u laønh tính vaø u aùc tính coù theå döïa treân caùc ñaëc ñieåm bieät hoaù vaø maát bieät hoùa, tyû leä phaùt trieån, tính chaát xaâm nhaäp taïi choã vaø söï di caên. Thuaät ngöõ bieät hoùa vaø maát bieät hoùa aùp duïng cho caùc teá baøo bieåu moâ cuûa khoái u. Söï bieät hoùa ñeå chæ möùc ñoä phaùt trieån cuûa caùc teá baøo bieåu moâ gioáng caùc teá baøo bình thöôøng caû veà hình thöùc vaø chöùc naêng. U bieät hoùa cao laø u goàm nhöõng teá baøo gioáng caùc teá baøo cuûa moâ sinh ra u. Noùi chung caùc u laønh tính ñeàu bieät hoùa cao. Caùc u aùc tính xeáp töø bieät hoùa cao ñeán khoâng bieät hoùa. Caùc u aùc tính goàm nhöõng teá baøo khoâng bieät hoùa ñöôïc goïi laø maát bieät hoùa (anaplasia). Söï maát bieät hoùa ñöôïc coi laø daáu aán cuûa chuyeån daïng aùc tính. Söï maát bieät hoùa ñöôïc ñaùnh daáu bôûi moät soá thay ñoåi veà hình thaùi vaø chöùc naêng nhö caû teá baøo vaø nhaân teá baøo ñeàu bieåu hieän ña hình thaùi – thay ñoåi veà kích thöôùc vaø hình daïng. Caùc teá baøo coù theå lôùn hôn nhieàu laàn nhöõng teá baøo keá caän cuøng loaïi trong khi caùc teá baøo khaùc coù theå cöïc kyø nhoû, daïng nguyeân thuûy. Moät hình aûnh khaùc cuûa söï maát bieät hoùa laø söï taïo thaønh nhöõng teá baøo khoång loà, moät soá teá baøo coù moät nhaân ña daïng khoång loà duy nhaát vaø moät soá khaùc coù hai hay nhieàu nhaân. Trong teá baøo khoång loà ung thö, nhaân teá baøo taêng saéc vaø lôùn so vôùi teá baøo. Ngoaøi caùc baát thöôøng veà teá baøo hoïc moâ taû treân, söï phaân cöïc cuûa caùc teá baøo maát bieät hoùa bò roái loaïn roõ reät. Caùc daûi hoaëc caùc khoái lôùn teá baøo u phaùt trieån voâ toå chöùc. Maëc duø caùc teá baøo ñang phaùt trieån naøy ñoøi hoûi ñöôïc cung caáp maùu, nhöng do moâ ñeäm huyeát quaûn ngheøo naøn neân vuøng trung taâm u thöôøng bò hoaïi töû vì thieáu maùu.

1.2.2. Sinh saûn cuûa teá baøo ung thö 1.2.2.1. Söï baát thuôøng cuûa nhaân vaø caùc nhieãm saéc theå Trong caùc teá baøo ung thö coù theå bieåu hieän caùc daïng baát thöôøng cuûa phaân chia nhö khoâng coù thoi voâ saéc coù theå daãn ñeán cheát teá baøo hoaëc nhieàu nhaân chia nhoû. Nhaân chia vôùi nhieãm saéc theå cöïc coù ñaëc ñieåm laø coøn toàn taïi trong gian kyø, moät vaøi nhieãm saéc theå khoâng ñöôïc huy ñoäng ñeán gaàn moät hoaëc hai trung theå coù theå daãn ñeán cheát teá baøo hoaëc taïo thaønh hai nhaân coù soá nhieãm saéc theå khoâng ñeàu. Tuy nhieân nhöõng daáu aán ñaëc hieäu cuûa teá baøo ung thö thöôøng bieåu hieän ôû söï baát thöôøng nhieãm saéc theå. Taï 5 Ngoïc Tuyeát Minh

Thöû nghieäm phaân laäp vaø nuoâi caáy teá baøo ung thö coå töû cung

Caùc phöông phaùp xeùt nghieäm gaàn ñaây coøn cho pheùp nhaän bieát nhöõng baát thöôøng nhieãm saéc theå cuûa caùc daïng u khaùc nhau. Ví duï nhö nhieãm saéc theå Ph1 quan saùt thaáy trong beänh baïch caàu loaïi tuûy maõn tính. Caùc u nguyeân baøo voõng maïc laø do söï thieáu huït moät phaàn nhieãm saéc theå 13. Phaàn lôùn caùc tröôøng hôïp u maøng naõo thieáu hoaøn toaøn hay moät phaàn nhieãm saéc theå 22.

1.2.2.2. Quan nieäm ñôn doøng Ngaøy nay ngöôøi ta cho raèng moät ung thö phaùt trieån töø moät teá baøo chuyeån daïng. Thöïc ra ngöôøi ta khoâng theå xaùc ñònh moät ung thö treân vi theå tröôùc khi noù ñaõ taïo thaønh nhieàu teá baøo, nhöng coù nhieàu baèng chöùng chöùng minh raèøng ung thö laø moät quaàn theå teá baøo ñoàng nhaát, moät doøng teá baøo. Ví duï nhö söï cheá tieát globulin mieãn dòch ñôn doøng trong caùc u töông baøo vaø trong caùc u lympho teá baøo B, taát caû caùc teá baøo u chæ cheá tieát moät daïng duy nhaát cuûa globulin mieãn dòch. Ngöôøi ta cuõng thaáy raèng hieän töôïng gheùp moät teá baøo duy nhaát coù theå coù hieäu quaû trong moät soá ung thö thöïc nghieäm (beänh baïch caàu chuoät). Trong quaù trình tieán trieån cuûa u, quaàn theå teá baøo ung thö chòu nhöõng ñoät bieán môùi. Söï tieán trieån doøng naøy bieåu hieän bôûi söï xuaát hieän nhöõng chuûng baát thöôøng hôn, coù tính chaát xaâm laán hôn vaø ñeà khaùng hôn vôùi caùc bieän phaùp ñieàu trò.

1.2.2.3. Thôøi gian nhaân ñoâi u Thôøi gian nhaân ñoâi u laø thôøi gian trung bình caàn thieát ñeå taêng gaáp ñoâi soá löôïng teá baøo ung thö. Ngöôøi ta coù theå ño treân nuoâi caáy hoaëc tính treân vivo töø khoái löôïng u. Thôøi gian nhaân ñoâi laø moät thaùng cho nhöõng u phoâi, hai ñeán ba thaùng cho nhöõng ung thö bieåu moâ daïng bieåu bì, boán ñeán saùu thaùng cho nhöõng ung thö bieåu moâ daïng tuyeán, boán ñeán möôøi hai thaùng cho nhöõng u tuûy. Coù moái lieân heä giöõa thôøi gian nhaân ñoâi vaø söï phaùt trieån cuûa u. Thôøi gian nhaân ñoâi ngaén u phaùt trieån nhanh, thôøi gian nhaân ñoâi daøi u phaùt trieån chaäm, khoâng coù thôøi gian nhaân ñoâi u ngöng phaùt trieån. Trong phaàn lôùn thôøi gian phaùt trieån khoái u, thôøi gian nhaân ñoâi luoân haèng ñònh vaø seõ caøng daøi hôn khi u ñaõ phaùt trieån lôùn. Thôøi gian nhaân ñoâi tröôùc heát phuï thuoäc vaøo heä soá taêng sinh, heä soá maát teá baøo. Heä soá taêng sinh bieåu loä tyû leä caùc teá baøo trong chu kyø. Heä soá maát teá baøo bieåu loä tyû leä

Taï 6 Ngoïc Tuyeát Minh

Thöû nghieäm phaân laäp vaø nuoâi caáy teá baøo ung thö coå töû cung

phaàn traêm caùc teá baøo bò maát ñi do hoaïi töû hoaëc do bong. Cuõng caàn phaûi nhaán maïnh raèng ôû caùc moâ bình thöôøng söï maát teá baøo laø 100%, soá teá baøo sinh ra khoâng nhieàu hôn teá baøo maát ñi – ñoù laø söï caân baèng noäi moâ cuûa moâ. Trong ung thö heä soá taêng sinh teá baøo thöôøng taêng cao nhaát trong khi söï maát teá baøo cuõng traàm troïng nhaát. Trong caùc daïng ung thö, caùc u maát bieät hoùa nhaát cuõng laø caùc u coù toác ñoä phaùt trieån vaø heä soá taêng sinh cao nhaát. Trong caùc teá baøo ung thö thôøi gian trung bình cuûa moät chu kyø teá baøo laø moät ñeán ba ngaøy, pha S coù thôøi gian khaù haèng ñònh (trung bình 16 giôø) nhöng pha G1 hay thay ñoåi nhieàu hôn. Chu kyø cuûa teá baøo ung thö khoâng ngaén hôn chu kyø cuûa caùc teá baøo bình thöôøng, thaäm chí chaäm hôn do söï keùo daøi cuûa phaân baøo nguyeân nhieãm. Ví duï chu kyø cuûa caùc nguyeân baïch caàu cuûa beänh baïch caàu caáp laø 50-60 giôø, trong khi chu kyø cuûa caùc nguyeân baøo tuûy bình thöôøng laø 24 giôø.

1.2.3. Nguyeân nhaân gaây ra ung thö Ngaøy nay cuoäc chieán choáng ung thö treân theá giôùi ñöôïc tieán haønh toaøn dieän treân nhieàu maët. Nhöõng nghieân cöùu thöïc nghieäm vaø dòch teã ñaõ ñoùng goùp lôùn lao trong vieäc xaùc ñònh moät soá nguyeân nhaân chuû yeáu cuûa ung thö ôû ngöôøi. Caùc nhaø khoa hoïc ñaõ chöùng minh roõ raøng raèng söï phaùt trieån ung thö thöôøng laø keát quaû töø söï tieáp caän vôùi nhieàu yeáu toá ruûi ro trong moâi tröôøng soáng. Hieän nay, theo ñaùnh giaù cuûa IARC (International Agency for Resarch on Cancer1998) coù 75 taùc nhaân ñöôïc keát luaän gaây ung thö cho con ngöôøi. Nhoùm taùc nhaân gaây hö haïi veà di truyeàn vaø gaây chuyeån daïng u cuûa teá baøo thuoäc caùc loaïi sau ñaây: (1) chaát gaây ung thö hoaù hoïc, (2) naêng löôïng tia, (3) vi khuaån sinh ung thö, chuû yeáu laø caùc viruùt. Moãi nhoùm taùc nhaân coù ñaëc ñieåm rieâng, nhöng nhieàu taùc nhaân coù theå cuøng taùc ñoäng vaø laøm taêng hieäu quaû caùc taùc nhaân khaùc. Caùc taùc nhaân gaây ung thö laøm theá naøo ñeå gaây ñöôïc ung thö. Nhö chuùng ta ñaõ bieát haàu heát ung thö laø keát quaû töø nhieàu daïng thay ñoåi di truyeàn. Caùc thay ñoåi naøy laø keát quaû töø haøng chuïc naêm tieáp xuùc vôùi caùc taùc nhaân ung thö coù aûnh höôûng gaây ñoät bieán. Noùi chung khi tyû leä phaân baøo caøng cao thì xaùc suaát sinh ñoät bieán caøng cao do heä quaû töø deã sinh nhaàm laãn trong töï nhaân ñoâi vaø toå hôïp laïi DNA. Moät vaøi taùc nhaân gaây ung thö döôøng nhö coù caû hai taùc duïng ñoù. Chaúng haïn caùc hocmon gaây ra ung thö vuù vaø

Taï 7 Ngoïc Tuyeát Minh

Thöû nghieäm phaân laäp vaø nuoâi caáy teá baøo ung thö coå töû cung

ung thö töû cung vöøa gaây ra taêng phaân baøo vöøa coù theå gaây ra caùc thay ñoåi di truyeàn seõ daãn ñeán ung thö. Nhöõng naêm gaàn ñaây caùc nhaø khoa hoïc ñaõ nghieân cöùu vaø bieát ñöôïc nhieàu taäp tính hoaït ñoäng gaây beänh cuûa caùc teá baøo ung thö. Nhö vieäc nhieãm viruùt vieâm gan B keùo daøi coù theå sinh ung thö gan. Nhieãm viruùt u nhuù (papilloma) gaây ra u nhuù ôû boä phaän sinh duïc coù theå daãn ñeán ung thö coå töû cung. Viruùt gaây ung thö trôû thaønh moät daïng thöôøng truù trong caùc teá baøo vaät chuû, thöôøng do cheøn nhaân acid nucleic vaøo trong DNA cuûa caùc theå nhieãm saéc vaät chuû. Theo Zibbert, viruùt sau khi xaâm nhaäp teá baøo ñaõ laøm thay ñoåi ñaëc tính di truyeàn cuûa teá baøo gaây roái loaïn phaân baøo. Do ñoù teá baøo taêng saûn hoãn loaïn vaø mang nhöõng ñaëc tính di truyeàn môùi. ÔÛ beân trong teá baøo, viruùt ñaõ maát heát hình thaùi bình thöôøng neân khoâng ñöôïc phaùt hieän nöõa. Chaát maøu cuûa acid nucleic cuûa viruùt ñaõ hoaø nhaäp keát hôïp vôùi chaát maøu cuûa teá baøo, moät DNA ñöôïc hình thaønh mang tính chaát cuûa teá baøo ung thö. Teá baøo beänh ñoù tieáp tuïc nhaân leân maø khoâng caàn söï hieän dieän cuûa viruùt nöõa. Thoáng keâ caùc ca ung thö lieân quan ñeán viruùt chieám khoaûng 15% caùc daïng ung thö ngöôøi treân toaøn theá giôùi. Tuy nhieân coøn raát laâu chuùng ta môùi bieát heát ñöôïc caùc nhaân toá ñaõ goùp phaàn gaây ung thö. Caùc nhaø khoa hoïc ñang tieáp tuïc tìm kieám nhöõng taùc nhaân bí aån naøy baèng phöông phaùp dòch teã hoïc.

1.3. CÔ SÔÛ PHAÂN TÖÛ CUÛA UNG THÖ Taát caû sinh vaät soáng ñeàu ñöôïc caáu taïo töø teá baøo. Moät soá loaøi sinh vaät, ví duï nhö vi khuaån, coù theå toàn taïi nhö sinh vaät ñôn baøo. Nhöõng sinh vaät khaùc, bao goàm caû ñoäng vaät höõu nhuõ ñöôïc caáu taïo töø voâ soá teá baøo, taát caû teá baøo keát hôïp vôùi nhau ñeå taïo neân moät sinh vaät soáng. Nhieàu teá baøo caáu taïo thaønh moâ nhö moâ lieân keát, moâ cô, nhieàu moâ caáu taïo thaønh cô quan nhö gan, phoåi. Ngoaøi ra cô theå ngöôøi coøn phuï thuoäc vaøo nhöõng teá baøo nhoû chuyeân bieät, chuùng seõ caáu taïo neân nhöõng cô quan chuyeân bieät nhö tim hay phoåi. Nhö vaäy, söï hoaït ñoäng cuûa teá baøo giuùp duy trì söï soáng. Tuy nhieân trong tröôøng hôïp ung thö, söï thay ñoåi chöùc naêng vaø caáu truùc cuûa teá baøo laø nguyeân nhaân chính.

1.3.1. Caùc gen gaây ung thö (oncogen) Taï 8 Ngoïc Tuyeát Minh

Thöû nghieäm phaân laäp vaø nuoâi caáy teá baøo ung thö coå töû cung

Theo quan ñieåm hieän nay ung thö ñöôïc xem laø beänh cuûa gen bôûi vì ngöôøi ta phaùt hieän ra haøng loaït caùc gen gaây ung thö (oncogen) vaø gen öùc cheá ung thö (antioncogen) coù trong teá baøo. Khi caùc gen naøy bò bieán dò thì deã daãn ñeán ung thö. Gaàn 50% caùc ung thö ñaõ ñöôïc nghieân cöùu, chaån ñoaùn baèng söï bieán dò cuûa moät gen laø gen p.53. P.53 laø moät antioncogen hay coøn goïi laø gen öùc cheá ung thö. Caùc nhaø khoa hoïc ñaõ chöùng minh raèng trong cô theå laønh maïnh cuûa con ngöôøi coù chöùa tieàn gen kích thích söï phaùt trieån (growth promoting protoocogen) hay coøn goïi laø tieàn gen gaây u. Ñoù laø gen caàn thieát cho vieäc haøi hoaø söï soáng. Vai troø chuaån möïc cuûa caùc tieàn gen gaây u trong teá baøo laø gì? Nhieàu tieàn gen gaây u maõ hoùa cho caùc nhaân toá loaïn sinh tröôûng – caùc protein kích thích phaân baøo hoaëc maõ hoùa cho caùc protein khaùc aûnh höôûng ñeán toång hôïp hay chöùc naêng cuûa caùc nhaân toá sinh tröôûng. Khi chuùng theå hieän chöùc naêng bình thöôøng, ñuùng löôïng phuø hôïp, vaøo ñuùng luùc caàn thieát thì caùc protein naøy kieåm soaùt phaân baøo vaø kieåm soaùt söï phaân hoùa ñuùng chuaån möïc. Ñeå moät tieàn gen gaây u chuyeån thaønh gen gaây u phaûi coù moät thay ñoåi hoaëc moät ñoät bieán xaûy ra trong DNA cuûa teá baøo. Coù theå laø do moät nhieãm saéc theå bò chuyeån ñoåi vò trí. Söï chuyeån vò xaûy ra khi caùc nhieãm saéc theå trao ñoåi laãn nhau caùc maûng nhoû cuûa chuùng. Thí duï söï bieán hình aùc tính trong beänh baïch caàu tuûy thì lieân quan ñeán söï chuyeån vò trí protooncogen töø vò trí bình thöôøng ôû theå nhieãm saéc 9 leân theå nhieãm saéc 22. Ñoù thöïc ra laø moät nhieãm saéc theå phoái hôïp goàm thaân laø nhieãm saéc theå soá 9, treân ñoù moät maûnh cuoái cuûa nhieãm saéc theå 22 gaén vaøo. Protooncogen myc trong ung thö lymphoma Burkitt laø do chuyeån vò trí theå nhieãm saéc 8 leân 14. ÔÛ moät tröôøng hôïp khaùc laø söï ñoät bieán treân DNA, moät nhaàm laãn trong töï nhaân ñoâi DNA hoaëc trong taùi toå hôïp phaùt sinh khi nhaân baûn caùc gen ñaõ ñöôïc sao maõ hay dòch maõ toaøn boä, haäu quaû laø quaù thöøa protein kích thích phaân baøo so vôùi möùc chuaån. Trong caùc tröôøng hôïp naøy möùc bieåu hieän gen chuaån bò thay ñoåi vaø teá baøo bò kích thích sinh soâi naåy nôû moät caùch tuøy tieän. Hieän nay caùc oncogen taïo ra caùc protein tham gia kieåm tra söï lôùn leân cuûa teá baøo coù theå ñöôïc phaân loaïi theo chöùc naêng nhö sau:

Taï 9 Ngoïc Tuyeát Minh

Thöû nghieäm phaân laäp vaø nuoâi caáy teá baøo ung thö coå töû cung

Nhoùm thöù nhaát laø gen maõ hoùa cho caùc yeáu toá taêng tröôûng nhö sis, int-2. Nhöõng oncogen yeáu toá taêng tröôûng naøy coù theå kích hoaït söï nhaân leân cuûa teá baøo nhöng khoâng ñuû khaû naêng gaây neân thay ñoåi veà kieåu hình.. Nhoùm thöù hai cuûa oncogen maõ hoùa cho caùc thuï theå cuûa yeáu toá taêng tröôûng nhieàu thuï theå trong soá ñoù gaén vôùi hoaït tính tyrosine kinase. Nhoùm thöù ba laø caùc thuï theå khoâng coù hoaït tính tyrosine kinase ñoù laø saûn phaåm gen mas. Nhoùm thöù tö laø caùc hoï protein gaén treân maøng nhö ras. Nhoùm thöù naêm laø nhöõng oncoprotein trong teá baøo chaát vôùi hoaït tính serine/threonine kinase goàm coù saûn phaåm raf, pim-1, mos vaø cot. Nhoùm thöù saùu goàm caùc oncogen maõ hoùa cho caùc yeáu toá ñieàu hoaø trong teá baøo chaát. Nhoùm thöù baûy, moät nhoùm oncogen lôùn maõ hoùa cho nhöõng yeáu toá phieân maõ ôû nhaân nhö myc, myb, fos, jun, rel.

1.3.2. Caùc gen öùc cheá ung thö (antioncogen) Trong khi caùc tieàn gen u maõ hoùa caùc protein khôûi ñoäng söï phaùt trieån teá baøo, thì caùc saûn phaåm cuûa caùc gen öùc cheá khoái u coù chöùc naêng laø ñieàu hoøa söï phaùt trieån teá baøo. Söï ñoät bieán hay maát gen öùc cheá khoái u coù theå gaây ra ung thö. Trong beänh böôùu nguyeân baøo voõng maïc, moät loaïi ung thö cuûa treû em mang tính di truyeàn, gaàn ñaây caùc nhaø khoa hoïc ñaõ khaùm phaù ra ñöôïc nguyeân nhaân laø do maát moät ñoaïn cuûa nhieãm saéc theå 13. Ñoaïn bò maát ñoù mang caùc gen kieàm cheá khoâng cho caùc oncogen cuûa ung thö naøy phaùt trieån. Theâm nhieàu baèng chöùng xaùc nhaän raèng baát kyø ñoät bieán naøo ngaên chaën gen trieät khoái u ñeàu goùp phaàn gaây loaïn phaùt phaân baøo, töùc khoâng kieåm soaùt noåi möùc phaân baøo chuaån möïc vaø coù theå sinh ra moät teá baøo ung thö. ÔÛ ung thö ñaïi traøng nhö ôû nhieàu daïng ung thö khaùc ôû ngöôøi, ngöôøi ta nhaän thaáy quaù trình di caên cuûa moät ung thö ñaïi traøng phaùt trieån töø töø qua ba chaëng. Daáu hieäu ñaàu tieân laø trong caùc teá baøo bình thöôøng cuûa bieåu moâ loùt ñaïi traøng xuaát hieän taàn soá phaân baøo baát thöôøng. Sau ñoù xuaát hieän moät u laønh (choài polip) trong vaùch ñaïi traøng. Vaø cuoái cuøng xuaát hieän moät khoái u aùc tính. Nhöõng thay ñoåi ôû möùc teá baøo naøy dieãn ra

Taï 10 Ngoïc Tuyeát Minh

Thöû nghieäm phaân laäp vaø nuoâi caáy teá baøo ung thö coå töû cung

song song vôùi ba thay ñoåi ôû möùc ñoä DNA bao goàm söï hoaït hoùa cuûa moät gen gaây u trong teá baøo vaø söï voâ hieäu hoùa cuûa hai gen öùc cheá khoái u.

1.3.2.1. Gen Rb Gen laøm phaùt trieån böôùu nguyeân baøo voõng maïc (retinoblastoma) ôû ngöôøi ñöôïc goïi teân laø gen Rb (retinoblastoma supectability gene). Ñoät bieán ôû gen Rb laøm phaùt trieån daïng ung thö khaùc ôû ngöôøi nhö sacoâm xöông (osteosarrcom). Khaùc vôùi beänh retioblastoma do di truyeàn, nhöõng ñoät bieán cuûa Rb thuôøng xuaát hieän ôû teá baøo sinh döôõng hôn laø do di truyeàn töø boá meï. Retinoblastoma taïo ra do ñoät bieán hai laàn ôû phaïm vi gen Rb cuûa theå nhieãm saéc 13. Thoâng qua caùc nghieân cöùu ngöôøi ta bieát saûn phaåm protein cuûa gen Rb tham gia trong ñieàu hoøa taêng tröôûng teá baøo.

1.3.2.2. Gen p53 Gen naøy naèm treân nhaùnh ngaén cuûa theå nhieãm saéc 17. Protein p53 coù vai troø ngaên caûn söï lan traøn cuûa caùc teá baøo bò hö haïi veà di truyeàn. Protein p53 khu truù ôû trong nhaân teá baøo vaø khi taùc ñoäng, noù coù chöùc naêng ñaàu tieân laø kieåm soaùt söï phieân maõ caû caùc gen khaùc. Söï bieán ñoåi p53 xaûy ra ôû gaàn moät nöûa soá ung thö ôû ngöôøi. P53 ñöôïc huy ñoäng ñeå laøm ngöøng söï hö haïi DNA vaø hoã trôï cho vieäc söûa chöõa DNA baèng caùch gaây döøng ôû G1 vaø kích thích caùc gen DNA ñöôïc söûa chöõa. Moät teá baøo coù DNA bò hö haïi neáu khoâng ñöôïc söûa chöõa seõ ñöôïc p53 ñieàu khieån ñi vaøo cheát teá baøo theo chöông trình. Do caùc hoaït ñoäng naøy p53 ñaùng ñöôïc goïi laø “ngöôøi canh gaùc boä gen”. Neáu maát ñoàng hôïp töû cuûa gen p53, toån haïi p53 khoâng ñöôïc söûa chöõa, ñoät bieán trôû thaønh coá ñònh trong caùc teá baøo ñang phaân chia vaø teá baøo seõ chuyeån daïng sang aùc tính, ñaëc bieät laø ôû moâ lieân keát. Gen p53 ñaõ ñöôïc phaùt hieän gaàn 20 naêm nay vaø ñöôïc xem laø gen duy nhaát giöõ vai troø trung taâm trong cô cheá gaây beänh ung thö.

1.3.2.3. Gen p73

Taï 11 Ngoïc Tuyeát Minh

Thöû nghieäm phaân laäp vaø nuoâi caáy teá baøo ung thö coå töû cung

Ñeán cuoái naêm 1977, caùc nhaø nghieân cöùu phaùt hieän ra gen p73, gen naøy maõ hoùa moät protein mang nhieàu ñaëc ñieåm töông töï nhö gen p53. Gen p73 coù moät vuøng gaén DNA gioáng moät vuøng töông öùng cuûa p53, noù coù theå gaây döøng chu kyø teá baøo vaø gaây cheát teá baøo theo chöông trình trong nhöõng ñieàu kieän thích hôïp. Nhieàu nghieân cöùu hieän nay ñang taäp trung vaøo gen hoï haøng cuûa p53 naøy. Gen p73 phoå bieán trong nhieàu loaïi u nhö u nguyeân baøo thaàn kinh, ung thö ñaïi traøng.

1.3.3. Gen ñieàu hoaø cheát teá baøo theo chöông trình

Chieáu xaï

Bax

Chemo’s

p53

Apoptosis Bcl-2

Oncogens

p21

E1A, tTAg,

Gadd45

Chu trình teá baøo

c-myc

Sô ñoà 1: Hieän töôïng chöông trình hoùa söï cheát teá baøo

Apoptosis – laø hieän töôïng chöông trình hoùa söï cheát cuûa teá baøo (programmed cell death – PCD) – hieän töôïng naøy trôû neân caàn thieát trong giai ñoaïn phaùt trieån naøo ñoù cuûa teá baøo. Ngöôøi ta cuõng quan saùt thaáy hieän töôïng naøy trong ung thö nhö gieát teá baøo ung thö baèng teá baøo NK (natural killers) hay baèng teá baøo ñoäc cuõng nhö teá baøo lymphocyt ñoäc phuû khaùng theå. Nhöng teá baøo ung thö deã ñi vaøo apoptosis laø khi gaây ra DNA hö haïi ñöôïc quyeát ñònh söï coù maët trong chuyeån daïng bieán dò cuûa gen p53 hoaëc söû duïng caùc thuoác ôû pha G1 hoaëc caùc tia ôû pha G2. Cô cheá ñieàu hoøa voøng teá baøo pha p53 chöa ñöôïc bieát chính xaùc nhöng coù leõ noù laø chaát ñieàu hoøa sao maõ cuûa caùc gen tham gia photphoryl hoùa nhieàu choã qua nhieàu enzym kinaza, ví duï kinaza cdk1 (cell division kinase) laøm photphoryl hoùa protein p53, p73 vò trí Ser-315. Khi ñöôïc photphoryl hoùa, p53 cuõng coù aûnh höôûng ñeán caùc protein bieán daïng cuûa caùc viruùt gaây ung thö loaïi DNA. Chính choã naøy p53 coù theå

Taï 12 Ngoïc Tuyeát Minh

Thöû nghieäm phaân laäp vaø nuoâi caáy teá baøo ung thö coå töû cung

ñoùng vai troø chuû yeáu trong ñieàu hoøa lôùn leân, bieät hoùa vaø söï cheát teá baøo theo chöông trình ñònh saün. Söï bieåu hieän gen cuûa protein p53 ñöôïc ñieàu hoøa qua nhieàu khaùng nguyeân, trong ñoù khaùng nguyeân PCNA (proliferation cells nuclear antigen). Khaùng nguyeân naøy laø cofactor cuûa enzym polymeraza sao cheùp S. Bôûi vaäy khi giaûm hoaït tính p53 thì phong beá söï ñi vaøo pha S cuûa chu kyø phaân chia teá baøo. Cuoái cuøng, ngöôøi ta phaùt hieän protein kìm haõm hoaït tính caùc kinaza cdk khaùc nhau ñöôïc goïi laø CKI (cyclin dependent kinases inhibitors) vaø quan troïng nhaát trong chuùng laø p21 – saûn phaåm cuûa gen ôû ñænh 1 (p53 mediated inhibitor of cdk). Moät chaát öùc cheá kinaza cdk khaùc nhau laø protein p16 INK 1 (Inhinitor of cdkS), gen maõ hoùa noù khu truù trong nhieàu doøng teá baøo ung thö. Gen naøy kìm haõm nhieàu ung thö mang teân MTS 1 (multiple tumor suppressor 1) hay CDK 4 I (CDK 4 inhibitor). Kieán thöùc coù lieân quan tôùi cô cheá apoptosis teá baøo ung thö raát caàn trong nghieân cöùu ñieàu trò ung thö. Cuõng caàn nhôù raèng gen p53 coù theå hôïp taùc vôùi gen Rb trong caûm öùng apoptosis vaø bieán hình ung thö. Hieåu bieát veà gen p53 vaø gen Rb bình thöôøng, ngöôøi ta coù theå taùch doøng (cloning) chuùng ñeå duøng trong ñieàu trò ung thö, ñoù laø moät trong nhöõng vaán ñeà haáp daãn cuûa sinh hoïc phaân töû.

Protein p.53

Kích thích toång hôïp p.21 (öùc cheá cdk)

Phong beá Sao cheùp AND

Kích thích gen öùc cheá

Kìm haõm GTP Kìm haõm gen ñieàu hoøa taêng tröôûng döông tính

taêng tröôûng teá baøo Laøm ngöøng sinh saûn teá baøo ôû giai ñoaïn G Sô ñoà 2: Vai troø cuûa Protein p.53

Taï 13 Ngoïc Tuyeát Minh

Thöû nghieäm phaân laäp vaø nuoâi caáy teá baøo ung thö coå töû cung

Ngaøy nay ñaõ xaùc ñònh ñöôïc raèng caùc gen ñeà phoøng hay gaây cheát teá baøo theo chöông trình cuõng tham gia taïo nhöõng bieán ñoåi quan troïng trong söï caân baèng ung thö. Moät nhoùm lôùn caùc gen ñieàu hoøa cheát teá baøo theo chöông trình ñaõ ñöôïc xaùc ñònh, caùc gen naøy ñöôïc ghi nhôù baèng caùc nhoùm ba chöõ baét ñaàu baèng chöõ b. Gen choáng cheát teá baøo theo chöông trình laàn ñaàu tieân ñaõ xaùc ñònh, bcl-2 laø moät thaønh phaàn cuûa moät nhoùm lôùn protein homodime vaø heterodime hoùa, moät soá protein naøy öùc cheá teá baøo cheát theo chöông trình (nhö chính bcl-2 vaø bcl-xL) trong khi caùc gen khaùc (nhö bax, bad, vaø bcl-xS) taïo ñieàu kieän cho teá baøo cheát theo chöông trình. Vieäc phaùt hieän ra gen bcl-2, moät gen prototyp trong loaïi naøy baét ñaàu vôùi nhaän xeùt laø khoaûng 85% caùc u lympho teá baøo B cuûa loaïi nang coù mang moät chuyeån ñoaïn ñieån hình t(14:18)(q22:q21). Caàn nhaéc laïi raèng 14q32 laø vò trí caùc gen chuoãi naëng cuûa globulin mieãn dòch cuõng lieân quan ñeán u lympho Burkitt. Vieäc xeáp caïnh vò trí hoaït ñoäng phieân maõ vôùi bcl-2 (khu truù ôû 18q21) gaây boäc loä quaù möùc bcl-2. Theo nhöõng cô cheá chöa bieát roõ, vieäc boäc loä quaù möùc bcl-2 baûo veä caùc lympho baøo khoûi bò cheát theo chöông trình vaø cho pheùp chuùng soáng laâu daøi, vì vaäy gaây neân söï tích luõy quaù möùc cuûa lympho baøo B, gaây beänh haïch vaø xaâm nhaäp tuûy xöông. Vì caùc u lympho boäc loä quaù möùc bcl-2 phaàn lôùn phaùt sinh laø do giaûm cheát teá baøo theo chöông trình hôn laø do buøng noå taêng sinh teá baøo, noù coù xu höôùng laønh tính (phaùt trieån chaäm) so vôùi phaàn lôùn caùc u lympho khaùc. Chöùng minh cho vai troø cuûa bcl-2 trong taïo u lympho laø nhaän xeùt raèng chuoät chuyeån gen vôùi bcl-2 phaùt sinh u lympho teá baøo B. Khoâng chæ chöùc naêng cuûa bcl-2 laø baát thöôøng maø söï khu truù cuûa noù cuõng khaùc vôùi haàu heát caùc gen ung thö khaùc. Noù naèm ôû laù ngoaøi cuûa maøng ty theå, löôùi noäi nguyeân sinh vaø maøng nhaân. Söï ñònh vò ty theå cuûa gen bcl-2 vaø caùc thaønh vieân khaùc cuûa hoï bcl-2 cuõng bieåu hieän chöùc naêng cuûa caùc gen naøy. Cô sôû sinh hoùa cuûa hoaït ñoäng bcl-2 chöa ñöôïc hoaøn toaøn hieåu bieát roõ. Cheát teá baøo theo chöông trình laø ñieåm cuoái cuøng cuûa chuoãi caùc söï kieän phaân töû gaây neân bôûi nhieàu kích thích vaø veà sau daãn ñeán söï hoaït hoùa caùc men thuyû phaân protein gaây cheát teá baøo (men caspase). Caùc thaønh vieân cuûa hoï bcl-2 aûnh höôûng moät caùch chính xaùc tôùi söï hoaït hoaù cuûa caùc caspase nhö theá naøo ñang ñöôïc khaûo saùt töôøng taän. Trong nhieàu moâ hình cheát teá baøo theo chöông trình, vieäc giaûi phoùng cytochrom C khoûi ty theå laø böôùc quan troïng trong chuoãi caùc söï kieän daãn ñeán cheát teá baøo theo

Taï 14 Ngoïc Tuyeát Minh

Thöû nghieäm phaân laäp vaø nuoâi caáy teá baøo ung thö coå töû cung

chöông trình. Moät chöùc naêng cuûa cytochrom C ñuôïc giaûi phoùng hình nhö laø hoã trôï cho söï hoaït hoaù men caspase 9 phaân huûy protein. Khu truù moät caùch chieán löôïc ôû maøng ngoaøi ty theå bcl-2 vaø yeáu toá töông ñoàng cuûa noù ñöôïc cho laø coù vai troø ñieàu hoaø söï ñi ra cuûa cytochrom khoûi nhieãm saéc theå vaøo trong baøo töông teá baøo. Söï ñi ra cuûa cytochrom C naøy ñöôïc ñieàu hoaø moät caùch chính xaùc nhö theá naøo thì chöa ñöôïc bieát roõ, nhöng coù moät soá baèng chöùng laø bax, moät thaønh vieân tröôùc cheát teá baøo theo chöông trình cuûa hoï bcl-2 taïo thaønh moät keânh trong maøng nhieãm saéc theå cho pheùp söï ñi ra cuûa cytochrom C (vaø vì vaäy daãn ñeán cheát teá baøo theo chöông trình), trong khi bcl-2 phong toûa hoaït ñoäng taïo keânh cuûa bax. Caùc thaønh phaàn tröôùc cheát teá baøo theo chöông trình vaø choáng cheát teá baøo theo chöông trình cuûa hoï bcl-2 taùc ñoäng nhö moät caùi bieán trôû trong ñieàu hoaø cheát teá baøo theo chöông trình. Tyû leä cuûa caùc chaát choáng cheát (bcl-2, bclXL) vôùi chaát gaây cheát (bax, bcl-xS, bad, bid) seõ quyeát ñònh moät teá baøo ñaùp öùng vôùi moät kích thích cheát teá baøo theo chöông trình nhö theá naøo. Caùi bieán trôû naøy seõ hoaït ñoäng ít nhaát moät phaàn do söï dime hoùa caïnh tranh giöõa caùc thaønh phaàn khaùc nhau cuûa caùc nhoùm chaát. Vì vaäy trong khi caùc homodime cuûa bcl-2 taïo ñieàu kieän cho söï soáng soùt cuûa teá baøo (coù leõ do söï thay theá bax taïo keânh töø maøng ty theå), caùc homodime bax taïo thuaän lôïi cho cheát teá baøo theo chöông trình. Cuoái cuøng maëc duø hoï bcl-2 cuûa caùc gen bcl-2 ñoùng vai troø quan troïng trong ñieàu hoaø cheát teá baøo theo chöông trình, ít nhaát coù hai gen keát hôïp vôùi ung thö khaùc cuõng lieân quan ñeán cheát teá baøo theo chöông trình laø gen p53 vaø protooncogen c-myc. Cô cheá phaân töû cuûa cheát teá baøo theo chöông trình gaây neân do hai böôùc caét ngang cuûa ñöôøng bcl-2. Gen c-myc gaây cheát teá baøo theo chöông trình khi caùc teá baøo bò ñieàu khieån bôûi hoaït hoùa c-myc, nhöng söï phaùt trieån ñöôïc giôùi haïn bôûi khaû naêng giôùi haïn cuûa caùc yeáu toá moâi tröôøng. Khi ñoái maët vôùi caùc tín hieäu nhö vaäy, teá baøo ñöôïc laäp chöông trình cheát bôûi ñieàu hoaø taêng p53 vaø caùc tín hieäu chöa ñöôïc xaùc ñònh khaùc. Bieåu loä quaù möùc cuûa bcl-2 coù theå giaûi thoaùt cho teá baøo khoâng bò cheát theo chöông trình gaây neân do c-myc. Vì vaäy hình nhö myc vaø bcl-2 coù theå hôïp taùc trong taïo u - c-myc kích thích sinh saûn vaø bcl-2 ngaên caûn cheát teá baøo ngay caû khi caùc yeáu toá phaùt trieån trôû neân bò haïn cheá. Ñaây laø moät trong nhieàu ví duï trong ñoù hai hay nhieàu gen ung thö hôïp taùc ñeå gaây phaùt sinh ung thö.

Taï 15 Ngoïc Tuyeát Minh

Thöû nghieäm phaân laäp vaø nuoâi caáy teá baøo ung thö coå töû cung

1.4. MOÄT SOÁ PHÖÔNG PHAÙP TAÙCH VAØ NUOÂI CAÁY TEÁ BAØO UNG THÖ 1.4.1. Lòch söû phaùt trieån nuoâi caáy cuûa teá baøo ung thö Khoa hoïc veà nuoâi caáy moâ vaø teá baøo ñaõ phaùt trieån moät caùch vöõng chaéc trong suoát theá kyû 20. Töø nhöõng naêm 1885, Wilhelm Roux ghi nhaän raèng phoâi gaø coù theå phaùt trieån ôû dung dòch muoái sinh lyù trong vaøi ngaøy. Nhieàu thöû nghieäm tröôùc ñoù cuõng chöùng minh raèng moâ cuûa caùc loaøi ñoäng vaät löôõng cö coù theå taùi sinh trong quaù trình nuoâi caáy. Naêm 1887 Arnold cho raèng caùc lymphoâ baøo cuûa eách cuõng coù theå soáng trong dung dòch muoái sinh lyù. Ngay sau ñoù vaøo 1998 Ljunggren chöùng minh teá baøo da cuûa ngöôøi coù theå phaùt trieån neáu ñöôïc nuoâi caáy trong dung dòch asetic. Maëc duø ñaõ coù nhöõng nghieân cöùu tröôùc nhöng ngöôøi ñöôïc xem laø cha ñeû cuûa phöông phaùp nuoâi caáy moâ laø Ross Harrison. Harrison laáy moâ töø phoâi eách ñöa vaøo haïch baïch huyeát thì caùc maûnh moâ khoâng chæ coù khaû naêng soáng soùt maø coøn phaùt trieån thaønh caùc maïng löôùi. Caùc thí nghieäm treân böôùc ñaàu ñaõ taïo neân laøn soùng chuù yù veà nuoâi caáy moâ in vitro, ñoàng thôøi söï thuùc ñaåy cuûa y hoïc buoäc ngöôøi ta quan taâm ñeán caùc loaøi vaät oån nhieät vaø coù quaù trình phaùt trieån bình thöôøng vaø beänh lyù gaàn gioáng ngöôøi. Naêm 1943, Wilton Earle - ngöôøi ñaàu tieân tieán haønh thí nghieäm veà doøng teá baøo lieân tuïc ôû loaøi gaëm nhaám töø moät teá baøo taùch rôøi. Naêm 1951, Geogre Gey thieát laäp doøng teá baøo ung thö töø coå töû cung ngöôøi (Hela). Naêm 1961, Hayflick vaø Moorhead ñaõ thöïc hieän nhöõng nghieân cöùu veà teá baøo bình thöôøng coù ñôøi soáng xaùc ñònh.

1.4.2. Moät soá phöông phaùp taùch teá baøo ung thö töø khoái u 1.4.2.1. Phöông phaùp taùch teá baøo ung thö töø khoái u cöùng hay khoái u di caên Hieän nay ñeå coù theå thu nguoàn maãu ung thö, ñaëc bieät laø töø caùc khoái u cöùng hay khoái u di caên töø cô theå beänh nhaân bò ung thö ñeàu phaûi ñöôïc tieán haønh phaãu thuaät taïi caùc beänh vieän. Nguoàn maãu sau khi thu seõ ñöôïc giöõ trong bình hoaëc loï chöùa saün moâi tröôøng nuoâi caáy thích hôïp (nhö RPMI 1640, DMEM …), ñoàng thôøi phaûi ñöôïc giöõ

Taï 16 Ngoïc Tuyeát Minh

Thöû nghieäm phaân laäp vaø nuoâi caáy teá baøo ung thö coå töû cung

trong ñieàu kieän laïnh nhö öôùp ñaù, hoaëc toát nhaát laø ñöôïc giöõ trong nitô loûng vì ñieàu naøy seõ giuùp duy trì ñöôïc ñaëc tính teá baøo. Quaù trình thu maãu vaø xöû lyù maãu phaûi ñöôïc tieán haønh nhanh choùng. Maãu sau khi thu seõ ñöôïc tieán haønh xöû lyù taïi phoøng thí nghieäm. Quaù trình xöû lyù maãu phaûi ñöôïc thao taùc trong ñieàu kieän voâ truøng. Sau khi löïa choïn phaàn moâ coøn soáng vaø loaïi boû phaàn moâ hö hoaëc cheát, phaàn moâ soáng coøn laïi seõ ñöôïc röûa qua nhieàu laàn baèng dung dòch muoái sinh lyù coù chöùa khaùng sinh hoaëc dung dòch HBSS – Hank’s balanced salt solution ñeå loaïi boû bôùt maùu. Sau ñoù caét khoái moâ ra thaønh töøng maûnh nhoû (1-2 mm3), thöôøng ñöôïc tieán haønh treân ñóa petri. Sau khi theâm vaøo ñóa petri moät ít dung dòch nuoâi caáy (1 – 2ml), duøng pipet hoaëc pastette ñeå chuyeån caùc maûnh moâ töø ñóa petri vaøo bình nuoâi caáy, ñeå trong tuû nuoâi khoaûng töø 2 – 3 giôø, ñieàu naøy seõ giuùp cho söï baùm cuûa teá baøo vaøo bình nuoâi caáy toát hôn. Theâm vaøo 5 – 10ml, ñeå yeân bình nuoâi caáy cho ñeán töø 72 – 96 giôø. Sau nhieàu ngaøy nuoâi caáy, teá baøo phaùt trieån baùm dính vaøo thaønh bình vaø khi ñeán maät ñoä caàn thieát seõ ñöôïc tieán haønh caáy chuyeàn. Ñaây laø moät trong nhöõng phöông phaùp ít laøm toån thöông ñeán teá baøo nhaát, thôøi gian thao taùc ngaén, ñoàng thôøi deã daøng thao taùc. Nhöng ñieàu caàn löu yù laø thao taùc phaûi chuaån, nhöõng maãu moâ phaûi ñöôïc caét nhoû, quaù trình thí nghieäm phaûi ñöôïc tieán haønh trong ñieàu kieän voâ truøng tuyeät ñoái ñeå traùnh söï nhieãm.

1.4.2.2. Phöông phaùp taùch teá baøo ung thö töø maãu dòch cuûa cô theå Phöông phaùp naøy thöôøng ñöôïc söû duïng ñeå taùch teá baøo töø nhöõng maãu dòch cuûa cô theå nhö: dòch maøng buïng, dòch maøng phoåi… Caùc maãu dòch ñöôïc thu taïi beänh vieän vaø ñem veà xöû lyù taïi phoøng thí nghieäm voâ truøng, tuøy theo maãu dòch laáy vôùi theå tích khaùc nhau. Ñem maãu dòch ñi ly taâm, khoaûng 3000g/ 20 phuùt. Loaïi boû dung dòch noåi, huyeàn phuø phaàn caën vôùi dung dòch muoái sinh lyù PBS. Neáu maãu chöùa soá löôïng teá baøo maùu nhieàu ta coù theå loaïi boû baèng phöông phaùp ly taâm vôùi dung dòch Ficoll. Khoaûng 10ml dung dòch teá baøo huyeàn phuø vôùi PBS hoaëc HBSS cho vaøo dung dòch Ficoll, ly taâm khoaûng 1000g/ 20 – 30 phuùt. Caùc teá baøo hieän dieän trong phaàn dung dòch ñeäm, ñem ly taâm khoaûng 600g/ 5 phuùt.

Taï 17 Ngoïc Tuyeát Minh

Thöû nghieäm phaân laäp vaø nuoâi caáy teá baøo ung thö coå töû cung

Quaù trình naøy laäp laïi cho ñeán khi thu ñöôïc heát phaàn teá baøo coøn laïi. Toaøn boä phaàn teá baøo thu ñöôïc seõ ñöôïc huyeàn phuø vôùi moâi tröôøng nuoâi caáy vaø chuyeån vaøo ñóa nuoâi.

1.4.2.3. Phöông phaùp taùch teá baøo baèng enzym Söû duïng enzym ñeå taùch teá baøo töø nhöõng moâ soáng laø moät trong nhöõng phöông phaùp phoå bieán nhaát. Hieän nay moät soá enzym ñöôïc söû duïng trypsin, collagenase, hyaluronidase, elastase, dipase, vaø papain … tuøy thuoäc vaøo maãu moâ ñeå choïn enzym vaø noàng ñoä enzym thích hôïp nhaèm coù theå taùch ñöôïc teá baøo vaø ñoàng thôøi khoâng aûnh höôûng ñeán söï phaùt trieån cuûa chuùng. Chaúng haïn trypsin laø moät enzym ñöôïc söû duïng phoå bieán trong vieäc taùc teá baøo ñoäng vaät vôùi hai quy trình: (1) Quy trình trypsin aám -

Caét nhoû khoái moâ thaønh nhöõng maûnh nhoû khoaûng 2 – 3mm3.

-

Theâm dung dòch trypsin vaøo (1g khoái moâ/ 10ml trypsin), noàng ñoä trypsin thöôøng ñöôïc söû duïng laø 0,25% (hoaëc coù theå laø 0,05%, 0,015%), hoaëc coù theå theâm vaøo chaát neàn EDTA (0,01% -0,02%),.

-

Khuaáy töø ôû nhieät ñoä 37oC. Ñeå ñaït ñöôïc maät ñoä teá baøo caàn thieát thì thôøi gian khuaáy coù theå töø 15 – 45 phuùt.

-

Ñem ñi ly taâm, 600g/ 5 phuùt, loaïi boû phaàn noåi, theâm moâi tröôøng vaøo chuyeån teá baøo vaøo bình nuoâi caáy.

-

Quaù trình naøy laäp laïi cho ñeán khi thu ñöôïc heát phaàn teá baøo coøn laïi. (2) Quy trình trypsin laïnh Coù theå uû caùc maûnh moâ nhoû trong dung dòch trypsin ôû noàng ñoä thích hôïp, taïi nhieät

ñoä khoaûng 4oC, ñieàu naøy seõ giuùp cho vieäc taùch teá baøo deã daøng vaø ít aûnh höôûng ñeán teá baøo. Sau 6 – 8 giôø, giaûi ñoâng khoaûng 30 phuùt ôû nhieät 37oC. Sau khi ly taâm loaïi boû phaàn noåi, theâm vaøo moâi tröôøng nuoâi caáy.

1.4.3. Nhöõng kyõ thuaät caàn thieát cho vieäc nuoâi caáy teá baøo Ngaøy nay vieäc nuoâi caáy teá baøo ñaõ ñöôïc thöïc hieän roäng khaép treân theá giôùi. Hôn 50 naêm keå töø laàn ñaàu tieân coâng boá söï xuaát hieän doøng teá baøo ung thö coå töû cung ôû ngöôøi (Hela), ñeán nay caùc nhaø nghieân cöùu ñaõ thieát laäp khoaûng 3.000 doøng teá baøo

Taï 18 Ngoïc Tuyeát Minh

Thöû nghieäm phaân laäp vaø nuoâi caáy teá baøo ung thö coå töû cung

ung thö vaø coù 1000 doøng ñöôïc söû duïng thöôøng xuyeân, phaàn lôùn coù nguoàn goác töø ung thö ôû ngöôøi. Ñaây laø nguoàn maãu caàn thieát cho caùc phaân tích sinh hoùa cuûa teá baøo ung thö. Ñieàu naøy môû ra cô hoäi cho caùc nhaø khoa hoïc coù ñieàu kieän nghieân cöùu, tìm hieåu saâu hôn veà caùc ñaëc tính sinh hoïc ñoàng thôøi xaùc ñònh vaø moâ taû ñaëc ñieåm cuûa teá baøo ung thö. Vôùi muïc ñích söû duïng caùc doøng teá baøo naøy ñeå nghieân cöùu hoaït tính cuûa caùc hoaït chaát khaùng ung thö trong ñieàu kieän in vitro, saûn xuaát vaccin ñieàu trò. Maëc duø nhöõng döõ lieäu coù ñöôïc töø caùc phoøng thí nghieäm vaãn caàn phaûi ñöôïc xem xeùt moät caùch thaän troïng, nhöng vai troø thöïc tieãn cuûa vieäc nuoâi caáy cuûa caùc doøng teá baøo ung thö trong nghieân cöùu vaø ñieàu trò beänh ung thö ñaõ ñöôïc thöøa nhaän.

1.4.3.1. Moâi tröôøng nuoâi caáy Hieän nay ngöôøi ta söû duïng moâi tröôøng nuoâi caáy toång hôïp ñaõ ñöôïc phaùt trieån töø nhöõng naêm 1950. Caùc chaát cô baûn coù trong moâi tröôøng nuoâi caáy bao goàm amino acid, carbohydrat, Vitamin, vaø muoái. Huyeát thanh vaø caùc thaønh phaàn khaùc nhö yeáu toá taêng tröôûng hocmon ñöôïc theâm vaøo moâi tröôøng cô baûn ñeå cung caáp nhöõng chaát caàn thieát cho teá baøo phaùt trieån. Moâi tröôøng nuoâi caáy ñaàu tieân laø moâi tröôøng BME (Eagle’s basal medium), ñaây laø moâi tröôøng do Harry Eagle thieát laäp coù theå söû duïng cho caû teá baøo bình thöôøng vaø teá baøo khoái u. Moâi tröôøng phaùt trieån tieáp theo sau ñöôïc goïi laø moâi tröôøng toái thieåu MEM (Eagle’s minium essential medium) cuõng do Harry Eagle thaønh laäp, MEM naøy ñöôïc taêng cöôøng theâm haøm löôïng amino acid. Trong khi ñoù thì moâi tröôøng DMEM (Dulbecco’s modified Eagle’s medium) do Dulbecco caûi tieán, trong ñoù caùc thaønh phaàn cuûa amino acid vaø Vitamin taêng gaáp 4 laàn, glucose taêng 4,5 laàn. Moâi tröôøng IMDM (Iscove’s modified Dulbecco medium) do Iscove thieát laäp treân cô sôû caûi tieán moâi tröôøng DMEM. Moâi tröôøng naøy chöùa selenium, amino acid, vitamin, sodium pyruvate, dung dòch ñeäm HEPES. Moâi tröôøng GMEM (Glasgow minium essential medium) laø söï bieán ñoåi khaùc cuûa moâi tröôøng Eagle duøng ñeå nghieân cöùu caùc yeáu toá gaây aûnh höôûng ñeán teá baøo. Moâi tröôøng naøy coù chöùa amino acid vaø vitamin cao gaáp hai laàn so vôùi moâi tröôøng Eagle.

Taï 19 Ngoïc Tuyeát Minh

Thöû nghieäm phaân laäp vaø nuoâi caáy teá baøo ung thö coå töû cung

Naêm 1950, Morgan vaø ñoàng söï ñaõ cho bieát moâi tröôøng coù theå hoå trôï cho caùc moâ phaùt trieån, ñoù laø moâi tröôøng 199, chöùa nhieàu thaønh phaàn coù theå tìm thaáy ôû moâi tröôøng Eagle vaø coù theå söû duïng cho nhieàu loaïi teá baøo khaùc nhau. Moät moâi tröôøng khaùc ít phöùc taïp hôn laø CMRL 1066 ñöôïc thieát laäp taïi Connaught Medical Research Institue, ñaây laø moâi tröôøng ñaàu tieân khoâng söû duïng huyeát thanh nhöng coù boå sung theâm moät vaøi chaát hoã trôï gaàn gioáng huyeát thanh. Moät moâi tröôøng khaùc khoâng huyeát thanh ñöôïc goïi laø moâi tröôøng Waymouth duøng ñeå nuoâi caáy teá baøo L929 ôû chuoät, nhöng moâi tröôøng naøy cuõng ñöôïc chöùng minh laø coù theå söû duïng trong nuoâi caáy caùc doøng teá baøo khaùc. Naêm 1959, McCoy moâ taû coâng thöùc cô baûn ñeå taïo ra moâi tröôøng hoã trôï cho muïc tieâu nuoâi caáy sô caáp. Moâi tröôøng RPMI 1640 do Moore vaø ñoàng söï thieát laäp taïi Park Memorial Institue, ñöôïc söû duïng phoå bieán cho nhieàu doøng teá baøo khaùc nhau vaø cuõng ñöôïc caùc phoøng thí nghieäm choïn löïa ñeå nuoâi caáy teá baøo vaø moâ baïch huyeát. Moâi tröôøng coù theå ñöôïc cung caáp töø caùc nguoàn thöông maïi vôùi caùc coâng thöùc khaùc nhau, nhö moâi tröôøng coù noàng ñoä bình thöôøng (coù theå söû duïng töø 9 – 12 thaùng), hoaëc moâi tröôøng coù noàng ñoä 10X (coù theå söû duïng trong voøng 12 – 24 thaùng), hoaëc moâi tröôøng coù noàng ñoä ñaäm ñaëc (coù theå söû duïng töø 2 – 3 naêm).

1.4.3.2. Huyeát thanh Maëc duø moâi tröôøng coù chöùa nhieàu chaát boå döôõng caàn thieát cho söï phaùt trieån, nhöng huyeát thanh laø yeáu toá hoã trôï cho khaû naêng soáng vaø phaùt trieån cuûa teá baøo trong nuoâi caáy. Huyeát thanh kích thích söï phuïc hoài caùc toån thöông cuûa teá baøo khi caáy chuyeàn vaø caùc protein trong huyeát thanh laøm baát hoaït trypsin traùnh caùc enzym gaây toån thöông teá baøo. Huyeát thanh coù tính khaùng oxy hoùa maïnh, ñoàng thôøi chuùng coøn coù taùc duïng caûi thieän tính dính cuûa teá baøo leân beà maët bình nuoâi. Huyeát thanh bao goàm hocmon, caùc nhaân toá taêng tröôûng, lipid, caùc protein vaän chuyeån vaø caùc chaát keát dính. Trong caùc nghieân cöùu nuoâi caáy teá baøo ung thö, huyeát thanh beâ vaø huyeát thanh thai boø ñöôïc söû duïng roäng raõi, ngoaøi ra cuõng theå söû duïng huyeát thanh ngöôøi vaø ngöïa. Hieän nay, tröø nhöõng doøng teá baøo ñöôïc thuaàn hoùa vôùi moâi tröôøng toång hôïp hoaøn toaøn, ña soá ñöôïc nuoâi caáy trong moâi tröôøng coù boå sung töø 5 – 20% huyeát thanh laø toát

Taï 20 Ngoïc Tuyeát Minh

Thöû nghieäm phaân laäp vaø nuoâi caáy teá baøo ung thö coå töû cung

nhaát vaø tyû leä naøy tuøy thuoäc vaøo loaïi teá baøo nuoâi caáy. Neáu söû duïng tyû leä huyeát thanh cao seõ laøm taêng giaù thaønh saûn phaåm.

1.4.3.3. Moâi tröôøng khoâng coù huyeát thanh Söû duïng huyeát thanh cho pheùp caùc teá baøo phaùt trieån khi nuoâi caáy nhöng cuõng coù nhöõng ñieàu baát lôïi. Ñaàu tieân, maëc duø thaønh phaàn cuûa moâi tröôøng ñaõ ñöôïc ñònh roõ nhöng löôïng huyeát thanh coù theå thay ñoåi tuøy thuoäc vaøo moãi ñôït nuoâi caáy. Söï thay ñoåi veà soá löôïng huyeát thanh seõ daãn ñeán söï thay ñoåi veà caùc thoâng soá bao goàm tyû leä soáng soùt cuûa teá baøo, tieán trình phaùt trieån. Moät vaøi thaønh phaàn trong huyeát thanh coù nhöõng yeáu toá öùc cheá söï phaân baøo cuûa moät soá teá baøo. Beân caïnh ñoù maëc duø huyeát thanh ñöôïc thöôøng xuyeân kieåm tra nhöng vaãn coù khaû naêng xuaát hieän virut. Vì nhöõng lyù do treân cuøng vôùi söï caân nhaéc veà giaù thaønh, neân ñaõ xuaát hieän caùc khuynh höôùng chuyeån qua söû duïng moâi tröôøng khaùc. Vaøo nhöõng naêm 1960 – 1970, ngöôøi ta ñaõ tìm ra moâi tröôøng khoâng caàn söû duïng huyeát thanh hay duøng vôùi löôïng thaáp. Sato vaø ñoàng söï laø nhöõng ngöôøi tieân phong tìm ra nhöõng chaát ñaëc bieät hieän dieän trong moâi tröôøng cô baûn ñeå thay theá huyeát thanh. Trong khi ñoù Ham vaø ñoàng söï taêng cöôøng noàng ñoä trong thaønh phaàn cuûa moâi tröôøng cô baûn baèng caùch boå sung hocmon, caùc protein vaän chuyeån, lipid vaø caùc nhaân toá keát gaén.

1.4.3.4. Moâi tröôøng vaät chaát Thoâng thöôøng caùc teá baøo ñoäng vaät phaùt trieån toát nhaát ôû nhieät ñoä 36,5oC + 1oC, tuy theá ôû nhieät ñoä thaáp hôn teá baøo vaãn phaùt trieån, nhöng chuùng seõ cheát moät caùch nhanh choùng khi nhieät ñoä ôû khoaûng 40oC. Ñaëc bieät khi nuoâi caáy teá baøo ñoäng vaät ñieàu kieän veà ñoä aåm vaø noàng ñoä CO2 trong khoâng khí raát quan troïng. Noàng ñoä CO2 thöôøng laø 5% thích hôïp nhaát. Phaàn lôùn caùc teá baøo ung thö caàn thieát phaûi oån ñònh ñoä pH töø 7,2 – 7,4 vaø moâi tröôøng phaûi ñöôïc thay ñoåi thöôøng xuyeân. Vì khi teá baøo phaùt trieån seõ taïo neân söï hoâ haáp gaây ra acid hoùa moâi tröôøng. Coù theå kieåm tra ñoä pH khi theâm phenol ñoû vaøo moâi tröôøng. Neáu moâi tröôøng maøu vaøng pH 6,5; maøu cam pH 7; maøu ñoû pH 7,4; maøu ñoû tía pH 7,8. Ñoä aåm khi nuoâi caáy cuõng raát quan troïng, söï boác hôi töø moâi tröôøng coù muoái seõ laøm cho teá baøo bò phaân giaûi gaây toån haïi ñeán maøng teá baøo.

Taï 21 Ngoïc Tuyeát Minh

Thöû nghieäm phaân laäp vaø nuoâi caáy teá baøo ung thö coå töû cung

Haàu heát caùc teá baøo ung thö phaùt trieån caàn thieát phaûi coù giaù ñôõ vaø haàu nhö caùc teá baøo ung thö phaùt trieån töø lôùp ñôn treân ñóa thuûy tinh hay ñóa nhöïa. Moät soá tröôøng hôïp ngoaïi leä laø ôû doøng teá baøo taïo maùu vaø teá baøo ung thö phoåi nhoû thích hôïp phaân chia ôû theå huyeàn phuø. Teá baøo baùm dính coù theå taêng soá löôïng lôùn baèng caùch baùm vaøo caùc giaù ñôõ nhôø vaøo caùc thaønh phaàn chaát neàn (ECM – Extracellular matrix). Hieän nay caùc protein ECM ñöôïc söû duïng phoå bieán bao goàm collagen, fibronectin, laminin.

1.4.4. Nuoâi caáy sô caáp Nuoâi caáy sô caáp laø laàn nuoâi caáy ñaàu tieân ôû caùc moâ ñöôïc laáy tröïc tieáp töø cô theå. Nuoâi caáy teá baøo ung thö coù theå laáy caùc moâ töø moät khoái u raén ôû cô theå (töø moâ goác hoaëc di caên) hay laø teá baøo ôû theå huyeàn phuø, ví duï nhö laø huùt dòch teá baøo ôû maøng buïng hay maøng phoåi. Ñaëc bieät caùc daïng teá baøo ôû theå huyeàn phuø naøy thuaän lôïi cho vieäc phaùt trieån doøng teá baøo bôûi vì trong dòch ñaõ coù saün teá baøo ñôn ñoäc vaø caùc cuïm teá baøo. Ñieàu naøy traùnh ñöôïc söï taùch teá baøo baèng phöông phaùp cô hoïc hay söï phaù huûy cuûa enzym. Caùc thaønh phaàn caáu taïo teá baøo ôû laàn nuoâi caáy sô caáp goàm nhieàu maãu moâ thöôøng khoâng ñoàng nhaát, coù nhieàu daïng nhö moâ taïo maùu vaø caùc daïng teá baøo stroma, nguyeân baøo sôïi. Tuy nhieân sau moät hay hai theá heä caùc doøng teá baøo nuoâi caáy coù tính chaát ñoàng nhaát hay ít nhaát cuøng daïng. Caùc daïng teá baøo ban ñaàu bò chuyeån daïng döôùi aùp löïc choïn loïc cuûa ñieàu kieän nuoâi caáy ñeå taïo neân söï ñoàng nhaát cuûa daïng teá baøo maïnh nhaát. Do ñoù ôû moãi laàn caáy chuyeàn maãu seõ gioáng nhau vaø ñaëc tính doøng teá baøo duy trì qua nhieàu theá heä. Teá baøo ñöôïc nuoâi caáy phaûi ñöôïc kieåm tra thöôøng xuyeân (toát nhaát laø moãi ngaøy) keå caû quan saùt baèng ñaïi theå vaø vi theå. Hình thaùi vaø maät ñoä teá baøo ñöôïc xem xeùt qua kính hieån vi vaø phaûi ñaùnh giaù ñöôïc söï laây nhieãm cuûa vi khuaån vaø caùc vi sinh vaät khaùc. Kieåm tra baèng caûm quan veà maøu saéc, tính chaát moâi tröôøng (ñuïc, daøy, hoaëc môø). Moâi tröôøng phaûi ñöôïc thay ñoåi haøng ngaøy vaø khoâng cho pheùp ñeå caïn moâi tröôøng hay thieáu caùc chaát dinh döôõng hoaëc bò acid hoùa. Ñoä pH cuûa moâi tröôøng thöôøng ñöôïc kieåm soaùt deã daøng baèng phenol ñoû.

1.4.5. Caáy chuyeàn

Taï 22 Ngoïc Tuyeát Minh

Thöû nghieäm phaân laäp vaø nuoâi caáy teá baøo ung thö coå töû cung

Khi caùc teá baøo ñöôïc nuoâi caáy phaùt trieån treân toaøn boä beà maët cuûa bình nuoâi caáy (ñoái vôùi lôùp ñôn) hoaëc laø ñoái vôùi nuoâi caáy teá baøo ôû theå huyeàn phuø ôû thôøi ñieåm maø moâi tröôøng ñaõ suy yeáu chaát dinh döôõng luùc ñoù ñoøi hoûi teá baøo phaûi ñöôïc caáy chuyeàn ñeå nhaèm duy trì khaû naêng phaùt trieån cuûa teá baøo. Tuy nhieân khi thöïc hieän caáy chuyeàn thì maät ñoä teá baøo seõ giaûm xuoáng nhöng ôû möùc ñoä teá baøo coù theå phaùt trieån trôû laïi moät caùch toái öu nhaát vaø ñaûm baûo löôïng moâi tröôøng ñaày ñuû cho teá baøo phaùt trieån tieáp tuïc. Ngöôøi ta söû duïng enzym nhö trypsin ñeå taùch teá baøo vaø phöông phaùp taùch naøy cuõng taùc ñoäng ñeán keát quaû thu hoaïch teá baøo trong nhöõng laàn nuoâi caáy. Sau khi nuoâi caáy sô caáp, teá baøo qua moät vaøi laàn caáy chuyeàn seõ ñöôïc tieán haønh nuoâi caáy thöù caáp ñeå taïo ra doøng teá baøo. Caáy chuyeàn ñöôïc thöïc hieän toát nhaát khi teá baøo phaùt trieån ôû log phase, luùc ñoù teá baøo ñöôïc xem laø khoûe maïnh nhaát. Sau ñoù doøng teá baøo caàn phaûi ñöôïc xaùc ñònh vaø nhaän daïng nguoàn goác.

1.4.6. Taïo doøng Doøng laø moät quaàn theå teá baøo coù nguoàn goác töø moät teá baøo rieâng bieät vaø taïo doøng laø quaù trình taùch teá baøo rieâng bieät vaø phaùt trieån caùc teá baøo ôû theá heä sau. Vì vaäy taïo doøng coù khaû naêng duy trì phaân baøo trong moät thôøi gian daøi maø khoâng thay ñoåi ñaëc tính ban ñaàu cuûa moâ goác. Hieäu quaû taïo doøng ñöôïc ñaùnh giaù treân tieâu chuaån nhö khaû naêng nuoâi caáy, caùc doøng ñöôïc saûn xuaát, soá löôïng teá baøo ñöôïc nuoâi caáy. Thöôøng hieäu quaû taïo doøng trong nuoâi caáy sô caáp raát thaáp khoaûng döôùi 1%, trong khi ñoù vaãn coù nhöõng doøng teá baøo coù hieäu quaû taïo doøng cao hôn trong nuoâi caáy sô caáp, tuøy thuoäc vaøo töøng doøng teá baøo maø hieäu quaû nuoâi caáy seõ thay ñoåi töø 10 – 100%. Ngöôøi ta coù theå taïo doøng teá baøo treân ñóa hoaëc trong agar.

1.4.7. Kyõ thuaät ñoâng laïnh teá baøo Baûo quaûn nguoàn teá baøo döôùi nhieät ñoä – 130oC cho pheùp döï tröõ teá baøo trong moät khoaûng thôøi gian daøi töø 20 ñeán 30 naêm. Thoâng thöôøng ngöôøi ta söû duïng chaát xuùc taùc ñoâng laïnh laø DMSO (dimethylsulfoxide) hoaëc Glycerol.

Taï 23 Ngoïc Tuyeát Minh

Thöû nghieäm phaân laäp vaø nuoâi caáy teá baøo ung thö coå töû cung

Thöôøng thôøi gian ñoâng laïnh hay raõ ñoâng cuõng aûnh höôûng ñeán khaû naêng soáng cuûa teá baøo vaø ñoâng laïnh ôû 1oC/phuùt ñöôïc xem laø ñaùp öùng toát nhaát. Ngöôïc laïi quy trình raõ ñoâng phaûi ñöôïc tieán haønh nhanh. Ñieàu naøy deã daøng ñöôïc thöïc hieän trong nöôùc aám ôû nhieät ñoä 37oC. Thöôøng teá baøo ñöôïc tröõ trong nitô loûng ôû nhieät ñoä -196oC, nhöng coù theå duy trì söï soáng trong thôøi gian ngaén ôû - 80oC.

1.5. NHAÄN DAÏNG DOØNG TEÁ BAØO UNG THÖ 1.5.1. Giôùi thieäu Theo caùc taøi lieäu nghieân cöùu hieän nay coù khoaûng 3.000 doøng teá baøo ung thö ñöôïc thieát laäp vaø coù 1.000 doøng ñöôïc söû duïng thöôøng xuyeân. Vì vaäy caàn thieát phaûi nhaän daïng vaø tìm hieåu ñaëc ñieåm cuûa caùc doøng teá baøo ung thö. Trong quaù trình nuoâi caáy hình thöùc bieåu hieän cuûa teá baøo coù theå thay ñoåi vaø caùc neùt ñaëc tröng nhö tính chaát bieät hoùa coù theå maát ñi, nhöng ñaëc tính di truyeàn vaãn duy trì qua nhieàu theá heä. Coù nhieàu lyù do quan troïng ñeå caàn thieát xaùc ñònh ñaëc ñieåm cuûa caùc doøng teá baøo ung thö. Ñieàu tröôùc tieân ñoù laø moái lieân quan giöõa doøng teá baøo ung thö vaø moâ goác, caàn thieát phaûi xaùc nhaän raèng doøng teá baøo ung thö naøy coù nguoàn goác töø moâ goác, ñieàu naøy coù giaù trò ñaëc bieät trong vieäc xaùc ñònh caùc lieäu phaùp trò beänh. Ñieàu quan troïng thöù hai laø nhaèm kieåm soaùt tính ñoàng nhaát vaø khaû naêng laây nhieãm giöõa caùc doøng teá baøo vôùi nhau. Lòch söû cuûa quaù trình nuoâi caáy teá baøo cho thaáy raèng söï laây nhieãm giöõa caùc doøng teá baøo vaãn thöôøng xaõy ra. Trong suoát nhöõng naêm 70-80 nhieàu coâng trình nghieân cöùu cuûa Stanley chöùng minh raèng söï laây nhieãm ñaõ xaûy ra ôû doøng teá baøo Hela. Heä quaû laø daãn ñeán söï laây nhieãm lan traøn ôû caùc phoøng thí nghieäm vaø söï pha troän giöõa caùc doøng teá baøo ñaõ xuaát hieän. Vaán ñeà laây nhieãm hieän nay vaãn coøn laø moät vaán ñeà nan giaûi. Caùc nhaø nghieân cöùu khoâng chæ quan taâm ñeán söï laây nhieãm giöõa caùc doøng teá baøo cuøng loaøi maø coøn laø söï laây nhieãm giöõa caùc doøng teá baøo khaùc loaøi. Vì vaäy caàn thieát phaûi coù phöông phaùp khoâng chæ xaùc ñònh roõ nguoàn goác duy nhaát cuûa doøng teá baøo maø coøn phaûi xaùc nhaän nguoàn goác cuûa loaøi.

Taï 24 Ngoïc Tuyeát Minh

Thöû nghieäm phaân laäp vaø nuoâi caáy teá baøo ung thö coå töû cung

Ngöôøi ta ñaõ duøng caùc phöông phaùp nhö caùc marker DNA, phaân tích cytogenic, PCR… ñeå xaùc nhaän nguoàn goác cuûa doøng teá baøo vaø kieåm tra söï laây nhieãm vôùi caùc doøng teá baøo khaùc. Maët khaùc söï xaùc nhaän ñaëc ñieåm coøn bao goàm söï kieåm tra, theo doõi caùc ñieåm ñaëc tröng cuûa doøng teá baøo, söï quan saùt hình thaùi, tyû leä phaùt trieån, hieäu quaû taïo doøng, caùc bieåu hieän khaùng nguyeân, ñaëc ñieåm chu trình teá baøo.

1.5.2. Ñaëc ñieåm phaùt trieån cuûa doøng teá baøo ung thö Ñieàu quan troïng cuûa doøng teá baøo ung thö laø khaû naêng cung caáp nguoàn teá baøo môùi ñeå tieán haønh caùc nghieân cöùu veà beänh ung thö. Doøng teá baøo phaûi phaûn aûnh tính chaát cuûa moâ goác. Hieän nay, gaàn nhö taát caû caùc teá baøo ung thö coù theå phaùt trieån trong nuoâi caáy. Haàu heát doøng teá baøo ung thö coù khaû naêng phaân chia khoâng giôùi haïn, ñoái vôùi caùc doøng teá baøo lieân tuïc thì khaû naêng phaân chia leân ñeán caû ngaøn laàn. Moät doøng teá baøo coù theå trôû thaønh doøng teá baøo lieân tuïc (thay vì giôùi haïn) maëc duø teá baøo hieän dieän ôû möùc ñoä thaáp trong laàn nuoâi caáy ñaàu tieân nhöng nhöõng teá baøo naøy phaûi coù khaû naêng phaân chia khoâng giôùi haïn, hoaëc laø chuùng phaûi traûi qua quaù trình bieán naïp. Söï bieán naïp taïo neân bôûi moät virut caûm öùng ung thö hay baèng hoùa chaát. Khi caáy chuyeàn, caùc doøng teá baøo ung thö seõ traõi qua nhieàu giai ñoaïn phaùt trieån nhaát ñònh. Lôùp teá baøo ñôn ôû giai ñoaïn caáy ñaàu tieân seõ baùm vaøo giaù ñôõ vaø khi ñöôïc taùch rôøi bôûi enzym (nhö trypsin) thì caàn phaûi coù thôøi gian ñeå teá baøo hoài phuïc laïi nhöõng hö haïi do söï phaù huûy cuûa enzym. ÔÛ thôøi ñieåm naøy teá baøo phaùt trieån töông ñoái chaäm, ñöôïc goïi laø “lag phase – pha tieàm ñoät bieán”. Khi vieäc nuoâi caáy tieáp tuïc coäng vôùi söï thay ñoåi caùc yeáu toá taêng tröôûng trong moâi tröôøng thì seõ laøm taêng khaû naêng phaân chia teá baøo vaø laøm taêng soá löôïng teá baøo. Ñaây laø giai ñoaïn phaùt trieån nhanh, ñöôïc goïi laø log phase, thöôøng teá baøo phaùt trieån theo luõy thöøa. Cuoái cuøng khi teá baøo khoâng coøn tieáp xuùc vôùi chaát neàn hoaëc lieân quan ñeán vieäc söû duïng löôïng huyeát thanh hay caùc thaønh phaàn khaùc trong moâi tröôøng luùc ñoù maät ñoä teá baøo seõ giaûm xuoáng, ngöôøi ta goïi ñoù laø söï baõo hoøa maät ñoä hoaëc goïi laø “plateau phase”, ñaây laø moät trong nhöõng tính chaát cuûa doøng teá baøo trong ñieàu kieän nuoâi caáy ñaëc bieät.

Taï 25 Ngoïc Tuyeát Minh

Thöû nghieäm phaân laäp vaø nuoâi caáy teá baøo ung thö coå töû cung

Thöôøng ngöôøi ta ghi nhaän raèng tröôùc khi caáy chuyeàn “plateau phase” daøi hôn, coøn sau khi caáy chuyeàn thì “lag phase” daøi hôn.

1.5.3. Xaùc nhaän ñaëc ñieåm doøng teá baøo ung thö Khi moät doøng teá baøo môùi ñöôïc thieát laäp moái quan taâm haøng ñaàu laø phaûi xaùc ñònh roõ nguoàn goác cuûa doøng teá baøo. Thoâng thöôøng ngöôøi ta nuoâi caáy doøng teá baøo töø khoái u nguyeân phaùt, töø dòch cô theå hoaëc töø khoái u di caên… Khi xaùc ñònh nguoàn goác teá baøo neáu chæ xeùt treân khía caïnh naøy seõ khoâng coù giaù trò moät caùch hoaøn toaøn. Gaàn ñaây, ñieån hình laø söï chæ ñònh laïi doøng teá baøo SW626, theo caùc nhaø khoa hoïc raát coù theå laø doøng teá baøo naøy coù nguoàn goác töø ung thö keát traøng hôn laø töø ung thö buoàng tröùng (töø nhöõng naêm 1974 ngöôøi ta xaùc ñònh SW626 laø doøng teá baøo coù nguoàn goác töø ung thö buoàng tröùng). Hieän nay caùc nhaø khoa hoïc cho raèng caùc döõ lieäu bao goàm cô sôû moâ hoïc, giai ñoaïn vaø möùc ñoä bieät hoùa cuûa khoái u, bieän phaùp ñieàu trò (xaï trò, hoùa trò) caàn thieát phaûi ñöôïc xem xeùt khi xaùc ñònh nguoàn goác doøng teá baøo. Caùc döõ lieäu naøy khoâng chæ ích lôïi cho vieäc chaån ñoaùn vaø ñieàu trò beänh ñoàng thôøi coøn cung caáp vaät lieäu cho caùc marker DNA, hay ñaëc ñieåm cuûa teá baøo nhaèm so saùnh vôùi doøng teá baøo môùi phaùt trieån. Trong quaù trình nuoâi caáy phaûi ghi cheùp ñaày ñuû caùc möùc ñoä phaùt trieån cuûa teá baøo, ñaëc bieät laø caùc chæ soá veà doøng teá baøo.Thöôøng xaùc ñònh ñaëc ñieåm cuûa doøng ôû giai ñoaïn sôùm thì toát hôn. Khi nuoâi caáy teá baøo ôû giai ñoaïn sôùm (nuoâi caáy sô caáp) thöôøng coù chöùa nhieàu loaïi teá baøo hoãn hôïp. Ví duï khi nuoâi caáy teá baøo ung thö bieåu bì coù theå chöùa caùc teá baøo bieåu moâ vaø caùc loaïi teá baøo khaùc nhö nguyeân baøo sôïi, ñaïi thöïc baøo. Vì vaäy khi nuoâi caáy caùc teá baøo naøy seõ di ñoäng vaø ngöôøi ta coù theå deã daøng coù ñöôïc quaàn theå teá baøo ñoàng nhaát. Theâm moät ñieàu caàn löu yù nöõa laø doøng teá baøo môùi thieát laäp phaûi ñöôïc ñaët teân (ñeå traùnh söï nhaàm laãn vôùi caùc doøng teá baøo khaùc vaø yeâu caàu phaûi giöõ kín bí maät veà teân ngöôøi cho). Hieän nay caùc nhaø nghieân cöùu khoâng söû duïng teân beänh nhaân ñeå ñaët teân cho doøng teá baøo vì raát deã xaõy ra söï nhaàm laãn. Thöôøng ngöôøi ta ñaët teân cho caùc doøng teá baøo theo caùch xaùc ñònh nôi saûn xuaát vaø nguoàn goác moâ.Ví duï nhö doøng teá baøo ung thö buoàng tröùng coù teân goïi laø SKOV3 (Sloan Kettering Ovarian Cancer). Ñieàu naøy

Taï 26 Ngoïc Tuyeát Minh

Thöû nghieäm phaân laäp vaø nuoâi caáy teá baøo ung thö coå töû cung

raát coù lôïi vì teân goïi cuûa moät doøng teá baøo môùi xuaát hieän treân thò tröôøng seõ cung caáp moät löôïng thoâng tin ban ñaàu khaù roõ vaø chính xaùc cho caùc beänh vieän, thaày thuoác.

1.5.4. Taäp hôïp caùc doøng teá baøo ung thö Hieän nay treân theá giôùi ñaõ thaønh laäp Toå chöùc Hieäp hoäi Theá giôùi veà nuoâi caáy teá baøo trong ñoù coù treân 62 quoác gia laø thaønh vieân cuûa Toå chöùc naøy, taäp hôïp khoaûng 469 nhoùm. Rieâng doøng teá baøo ung thö coù nhieàu nhaát ôû ATCC (American Type Culture Collection). ATCC coù khoaûng 950 doøng teá baøo ung thö trong ñoù coù 700 doøng teá baøo coù nguoàn goác töø ngöôøi. Hieän nay chính phuû cuûa caùc nöôùc naøy ñang coù keá hoaïch hoã trôï voâ ñieàu kieän caùc hoaït ñoäng treân. Caùc ngaân haøng teá baøo ôû caùc toå chöùc treân coù khaû naêng cung caáp nhöõng doøng teá baøo toát nhaát cho caùc hoaït ñoäng nghieân cöùu ôû caùc phoøng thí nghieäm, caùc tröôøng ñaïi hoïc, beänh vieän. Caùc ngaân haøng baûo ñaûm nguoàn teá baøo khoâng bò nhieãm (ñaëc bieät laø nhieãm Mycoplasma). Ñaây ñöôïc xem laø yeáu toá haøng ñaàu ñeå ñaùnh giaù möùc ñoä uy tín vaø danh tieáng cuûa caùc ngaân haøng cung caáp doøng teá baøo. Hieän nay coù moät vaán ñeà ñöôïc ñaët ra cho caùc ngaân haøng teá baøo laø phaùt trieån theâm caùc doøng teá baøo môùi hay söû duïng caùc doøng teá baøo hieän coù. Treân thöïc teá caùc nhaø khoa hoïc nhaän ñònh raèng khoâng coù thôøi gian ñeå phaùt trieån theâm nhöõng doøng môùi. Chuùng ta chæ coù theå coù quyõ thôøi gian ñeå söû duïng nhöõng doøng teá baøo ñaõ coù moät caùch coù hieäu quaû nhaát. Caùc nhaø khoa hoïc cho raèng caàn phaûi coù nhieàu noã löïc vaø daønh nhieàu thôøi gian nhaát taäp trung vaøo vieäc tìm ra nhöõng ñaëc ñieåm cuûa caùc doøng teá baøo ung thö ñeå coù phöông phaùp trò beänh ung thö moät caùch coù hieäu quaû nhaát.

1.6. Caùc öùng duïng cuûa kyõ thuaät nuoâi caáy teá baøo ung thö 1.6.1. Khaùng theå ñôn doøng Thuaät ngöõ ñôn doøng coù nghóa laø moïi teá baøo saûn xuaát ra caùc khaùng theå ñeàu laø con chaùu cuûa moät teá baøo duy nhaát, do ñoù chuùng saûn xuaát moät loaïi phaân töû khaùng theå ñoàng nhaát. Caùc khaùng theå ñôn doøng ñöôïc thu töø nhöõng teá baøo nuoâi caáy chôù khoâng phaûi thu töø caùc ñoäng vaät thöïc nghieäm. Ñoù laø saûn phaåm cuûa caùc teá baøo lai taïo giöõa moät teá baøo

Taï 27 Ngoïc Tuyeát Minh

Thöû nghieäm phaân laäp vaø nuoâi caáy teá baøo ung thö coå töû cung

ung thö aùc tính voán coù theå nhaân baûn voâ taän trong moâi tröôøng nuoâi caáy vôùi moät teá baøo B saûn xuaát khaùng theå chuaån. Teá baøo lai mang tính baát töû cuûa teá baøo ung thö vaø mang khaû naêng saûn xuaát ra caùc khaùng theå cuûa teá baøo B. Ngöôøi ta coù theå taùch rieâng töøng teá baøo lai vaø nuoâi rieâng reõ. Moãi teá baøo seõ nhaân leân thaønh moät doøng teá baøo thuaàn khieát veà moïi maët keå caû tính ñaëc hieäu vôùi moät khaùng nguyeân. Caùc khaùng theå ñôn doøng coù khaû naêng tieâu dieät caùc teá baøo ung thö treân cô theå ngöôøi vaø treân chuoät mang ung thö thöïc nghieäm. Chaúng haïn moät khaùng theå ñôn doøng chuyeân hoùa cho moät khaùng nguyeân treân teá baøo ung thö coù theå toå hôïp vôùi moät chaát thuoác dieät caùc teá baøo. Khi tieâm chuûng vaøo moät beänh nhaân ung thö, chuyeân tính cuûa khaùng theå seõ nhaèm muïc tieâu laø caùc teá baøo ung thö vaø phaàn thuoác cuûa toå hôïp seõ dieät caùc teá baøo ung thö ñoù. Phöông phaùp tieáp caän ñeå ñieàu trò ung thö naøy ñang ñöôïc thöû nghieäm nhieàu vaø coù keát quaû ñaùng khích leä trong caùc ca ung thö tuûy xöông.

1.6.2. Caùc Interferon (INF) Interferon laø protein ñöôïc caùc teá baøo nhieãm vi ruùt saûn xuaát ra ñeå giuùp caùc teá baøo khaùc khaùng viruùt. Cô cheá hoaït ñoäng cuûa interferon nhö sau: (1) caùc viruùt nhieãm vaøo caùc teá baøo (2) baät caùc gen interferon trong nhaân caùc teá baøo ñeå sao mARN thoâng tin (3) thuùc ñaåy teá baøo cheá taïo caùc interferon (4) teá baøo nhieãm viruùt seõ cheát nhöng caùc phaân töû interferon cuûa noù coù theå khuyeách taùn sang nhöõng teá baøo khoeû maïnh laân caän kích thích chuùng sinh saûn ra caùc protein khaùc ñeå khaùng viruùt vaø khaùng khoái u. Coù ba loaïi interferon chuû yeáu laø INFα, β vaø γ, trong ñoù INFα ñöôïc söû duïng roäng raõi nhaát vaø coù hoaït tính roõ reät trong beänh baïch caàu teá baøo toùc, baïch caàu maïn tính theå tuûy, beänh ña u tuûy vaø moät soá u lympho aùc tính khoâng Hodgkin. Ngoaøi ra cuõng coù taùc duïng giôùi haïn trong moät soá ung thö thaän, ung thö haéc toá, sarcom Kaposi vaø moät soá ung thö bieåu moâ khaùc.

1.6.3. Caùc hoaït chaát khaùng ung thö Kyõ thuaät nuoâi caáy moâ coøn laø ñoái töôïng trong caùc nghieân cöùu veà sinh hoïc teá baøo, nhö söû duïng ñeå nghieân cöùu caùc hoaït chaát khaùng ung thö trong ñieàu kieän in vitro.

Taï 28 Ngoïc Tuyeát Minh

Thöû nghieäm phaân laäp vaø nuoâi caáy teá baøo ung thö coå töû cung

Hieän nay ngöôøi ta söû duïng moät soá thuoác ngaên chaän caùc teá baøo ung thö phaân chia ñöôïc goïi laø thuoác khaùng nguyeân phaân, ngaên ngöøa phaân baøo baèng can thieäp tôùi thoi phaân baøo. Moät thöù thuoác loaïi naøy coù teân laø vinblastin, phaân huûy caùc vi oáng, do ñoù ngaên chaän hình thaønh thoi tô. Ngaøy nay vinblastin ñöôïc nhieàu coâng ty thuoác baøo cheá töø loaøi caây döøa caïn, moät loaøi caây hoa maøu hoàng töôi, laù coù hoaït chaát vinoblastin, vò ñaéng, tính maùt, ñöôïc söû duïng döôùi daïng muoái sunfat ñieàu trò ung thö. Moät thöù thuoác khaùng nguyeân phaân khaùc laø taxol, laøm caùc vi oáng baát ñoäng, do ñoù ngaên thoi tô tieán haønh thay ñoåi caùc ñoäng thaùi phaân baøo caàn thieát. Taxol coù nhieàu höùa heïn hôn vì so vôùi nhieàu loaïi thuoác choáng ung thö khaùc, noù gaây ít phaûn öùng phuï vaø döôøng nhö coù hieäu löïc caû vôùi daïng ung thö buoàng tröùng vaø ung thö vuù khoù ñieàu trò. Taxol chieát töø voû caây thuûy tuøng Thaùi Bình Döông, moät loaøi caây moïc nhieàu ôû vuøng Taây Baéc Hoa Kyø. Caây thuûy tuøng khi bò ñeõo voû seõ laøm caây cheát. Vaø cöù ñieàu trò ung thö cho moät beänh nhaân caàn phaûi huyû dieät ít nhaát ba caây ñoä moät traêm tuoåi. Cuoái cuøng taxol trôû thaønh moät chuû ñeà tranh caõi cuûa caùc nhaø khoa hoïc baûo veä thieân nhieân. Gaàn ñaây caùc nhaø nghieân cöùu ñaõ aùp duïng caùc tieán boä kyõ thuaät söû duïng nhieàu loaøi thuûy tuøng khaùc nhau, toång hôïp neân taxol trong phoøng thí nghieäm vaø nuoâi caáy teá baøo thuûy tuøng thay vì phaûi troàng thuûy tuøng trong moâi tröôøng töï nhieân. Vaø môùi ñaây caùc nhaø khoa hoïc cuõng ñaõ tìm ñöôïc moät loaøi naám moïc treân thuyû tuøng töï chuùng cuõng coù theå taïo ra moät löôïng nhoû taxol. Ngöôøi ta hy voïng trong moät vaøi naêm nöõa nhöõng tieán boä veà coâng ngheä sinh hoïc seõ giuùp con ngöôøi khoâng caàn chaët haï caây thuyû tuøng Thaùi Bình Döông môùi cheá taïo ñöôïc loaïi thuoác taxol naøy.

1.7. NHÖÕNG VAÁN ÑEÀ LIEÂN QUAN ÑEÁN ÑEÀ TAØI THÖÏC HIEÄN 1.7.1. Sô löôïc veà ung thö coå töû cung Ung thö coå töû cung (cervical carcinoma) laø moät trong nhöõng beänh ung thö haøng ñaàu vaø laø nguyeân nhaân thöù hai gaây ra töû vong cho phuï nöõ treân toaøn theá giôùi. Haøng naêm coù 371.000 ca beänh môùi chieám tyû leä 10% trong taát caû caùc beänh ung thö ôû phuï nöõ.

Taï 29 Ngoïc Tuyeát Minh

Thöû nghieäm phaân laäp vaø nuoâi caáy teá baøo ung thö coå töû cung

Caùc vuøng coù tyû leä cao nhaát laø Trung vaø Nam Myõ, mieàn Nam vaø Ñoâng Chaâu Phi vaø vuøng Caribeâ vôùi tyû leä maéc phaûi ít nhaát laø 30 ca môùi treân 100.000 phuï nöõ moãi naêm. Ñoâng Nam AÙ chieám tyû leä trung bình vôùi gaàn 20 ca môùi treân 100.000 phuï nöõ moãi naêm. ÔÛ Vieät Nam, ung thö coå töû cung cuõng laø moät beänh phoå bieán. Theo thoáng keâ veà ghi nhaän ung thö quaàn theå ôû thaønh phoá Hoà Chí Minh (1998) ñaõ coù theâm 28,6 ngöôøi treân 100.00 phuï nöõ maéc beänh naøy moãi naêm, moät tyû leä khaù cao so vôùi khu vöïc.

Sô ñoà 3 : Tyû leä maéc phaûi vaø töû vong cuûa beänh ung thö coå töû cung ôû caùc khu vöïc do Toå chöùc y teá Theá giôùi (World Health Organization – WHO) kieåm soaùt. Ung thö coå töû cung khôûi phaùt töø lôùp bieåu moâ cuûa moâi sau, loã trong hoaëc cuûa moâi tröôùc coå töû cung. Giai ñoaïn ñaàu thöôøng khoâng coù hình aûnh ñaëc bieät, khi phaùt trieån coù ba hình daïng ñaïi theå khaùc nhau nhö daïng choài suøi, daïng loeùt, daïng cöùng thaâm nhieãm. Daïng vi theå thöôøng gaëp laø ung thö bieåu moâ teá baøo vaûy (squamous cells carcinoma) chieám 85%. Soá coøn laïi laø ung thö bieåu moâ tuyeán.

Taï 30 Ngoïc Tuyeát Minh

Thöû nghieäm phaân laäp vaø nuoâi caáy teá baøo ung thö coå töû cung

b

a c

Hình 2: Coå töû cung (a: coå töû cung; b: coå töû cung saïch; c: coå töû cung bò suøi)

Hieän nay chöa coù caùch naøo phoøng ngöøa höõu hieäu loaïi ung thö naøy ngoaøi vieäc saøng loïc teá baøo hoïc ñònh kyø ñeå phaùt hieän vaø ñieàu trò kòp thôøi caùc toån thöông loaïn saûn hay taân saûn noäi bieåu moâ coå töû cung (cervical intraepithelial neoplasia – CIN). Taân saûn noäi bieåu moâ coå töû cung ñöôïc xeáp töø ñoä I ñeán III. CIN I töông ñöông vôùi loaïn saûn nheï, CIN II bao goàm loaïn saûn naëng vaø ung thö bieåu moâ taïi choã. CIN III ñöôïc xem laø toån thöông tieàn ung thö vôùi nguy cô cao tieán trieån thaønh ung thö bieåu moâ xaâm nhaäp. Vieän Ung thö quoác gia Myõ ñeà nghò thuaät ngöõ chaån ñoaùn môùi goàm coù hai nhoùm toån thöông: nhöõng toån thöông tröôùc ñaây goïi laø CIN I ñöôïc xeáp vaøo loaïi toån thöông noäi bieåu moâ ñoä thaáp (low- grade squamous intraepithelial lesion – LSIL) vaø nhöõng toån thöông CIN II vaø III ñöôïc xeáp vaøo loaïi toån thöông noäi bieåu moâ vaûy ñoä cao (highgrade squamous intraepithelil lesion – HSIL).

Taï 31 Ngoïc Tuyeát Minh

Thöû nghieäm phaân laäp vaø nuoâi caáy teá baøo ung thö coå töû cung

TEÁ BAØO BIEÅU MOÂ

UNG THÖ BIEÅU MOÂ (CARCINOMA)

MAÏCH BAÏCH HUYEÁT

MOÂ LIEÂN KEÁT

CÔ TRÔN

MAÏCH MAÙU

TEÁ BAØO DI CAÊN

SARCOMA (BÖÔÙU THÒT)

Hình 3: Hình thaùi vaø söï phaùt trieån ung thö bieåu moâ 1.7.2. Caùc hình thaùi beänh lyù coå töû cung 1.7.2.1. Toån thöông vieâm Coù hai loaïi toån thöông vieâm thöôøng gaëp laø vieâm do naám vaø vieâm do trichomonas vaginalis. Quan saùt treân neàn phieán ñoà vieâm do naám thaáy coù baïch caàu ña nhaân ít nhieàu thoaùi hoaù, coù caùc sôïi naám candida albicans coù hình ñoát tre hay chia nhaùnh nhö caùc caønh caây hoaëc caùc sôïi naám leptothrix maûnh daøi nhö sôïi toùc. Vieâm do tricomonas vaginalis thì thaáy coù raát nhieàu sinh vaät ñôn baøo daøi 10-30 micromeùt, baøo töông hình quaû leâ, maát roi hay chæ coù moät phaàn roi, coù nhaân leäch moät beân hay khoâng roõ nhaân nhöng deã phaùt hieän chuùng do maøu xanh xaãm khaùc vôùi maøu ñen cuûa nhaân teá baøo vieâm. Ñoâi khi beân caïnh caùc toån thöông do vieâm coù theå thaáy toån thöông dò saûn, loaïn saûn ñi keøm.

Taï 32 Ngoïc Tuyeát Minh

Thöû nghieäm phaân laäp vaø nuoâi caáy teá baøo ung thö coå töû cung

1.7.2.2. Toån thöông dò saûn Toån thöông dò saûn laø do söï bieán ñoåi bieåu moâ truï coå töû cung thaønh bieåu moâ daïng vaûy nhöng khoâng coù söï thay ñoåi veà caáu truùc vaø hình thaùi teá baøo treân moâ hoïc. Nhöõng teá baøo dò saûn ñieån hình coù theå ñöùng rieâng leû hoaëc saép xeáp thaønh nhoùm, ñaùm, kích thöôùc töông ñöông caùc teá baøo caän ñaùy nhöng phaàn lôùn hình ña dieän, coù moái lieân keát maät thieát, xeáp thaønh nhieàu taàng nhö teá baøo vaûy ôû da, coù theå thaáy caùc ñuoâi baøo töông hay caàu noái teá baøo nhöng khoâng thaáy ñöôïc chaát söøng.

1.7.2.3. Toån thöông loaïn saûn Toån thöông loaïn saûn coù söï baát thöôøng veà caáu truùc laãn hình thaùi teá baøo cuûa bieåu moâ vaûy ôû nhöõng möùc ñoä khaùc nhau. Trong ña soá tröôøng hôïp loaïn saûn nheï khi quan saùt treân neàn phieán ñoà thaáy caùc teá baøo ôû ñaây nhoû hôn teá baøo trung gian hoaëc ngoaïi vi, chuùng ñöùng rieâng leû hoaëc xeáp thaønh töøng ñaùm nhoû, hoaëc nhoùm teá baøo thöa thôùt vôùi hình thaùi teá baøo troøn hay ña dieän, tính ña hình nheï. Baøo töông khoâng roäng, coù theå chöùa nhöõng hoác saùng nhoû. Tröôøng hôïp loaïn saûn vöøa, teá baøo loaïn saûn vöøa nhoû hôn teá baøo trung gian hay ngoaïi vi nhöng nhaân khoâng ñeàu, taêng saéc vaø thöôøng lôùn hôn trong loaïn saûn nheï. Vaãn coù theå thaáy hoác saùng trong baøo töông ôû nhöõng möùc ñoä khaùc nhau vaø khoâng nhaän ñöôïc haït nhaân to, noåi roõ. Nhöõng teâù baøo naøy coù theå ñöùng rieâng leû, xeáp thaønh töøng daûi kieåu “doøng chaûy”, “noái ñuoâi” vaø khi thaønh ñaùm thì möùc ñaûo loän caáu truùc cuõng roõ hôn ôû loaïn saûn nheï bieåu thò baèng caùc teá baøo coù lieân keát loûng leûo vaø höôùng loän xoän. Moái quan heä giöõa viruùt sinh u nhuù ôû ngöôøi (HPV) vaø condylom ñöôïc ñaùnh giaù nhö loaïn saûn nheï hoaëc toån thöông bieåu moâ vaûy ñoä thaáp. Caùc condylom ñöôïc ñaëc tröng veà teá baøo hoïc baèng caùc teá baøo boùng (koilocyte). Nhöõng teá baøo naøy to hôn nhöõng teá baøo dò saûn, ñöùng rieâng leû, xeáp thaønh nhoùm hoaëc thaønh ñaùm vôùi caùc ñaëc ñieåm laø teá baøo khoâng ñeàu hoaëc hai nhaân, coù nhöõng vuøng saùng khoâng ñeàu quan nhaân vaø maøng baøo töông vöøa coâ ñaëc vöøa daày leân roõ reät. Tröôøng hôïp loaïn saûn naëng caùc teá baøo coù tính chaát khoâng ñieån hình roõ, trong ñoù loaïi caän ñaùy vaø trung gian saâu chieám öu theá so vôùi caùc teá baøo trung gian noâng vaø teá baøo ngoaïi vi cuõng coù loaïn nhaân. Thöôøng nhaân teá baøo saãm maøu, to nhoû khoâng ñeàu, löôùi nhieãm saéc ñaëc. Coù theå thaáy nhöõng nhaân coù muùi, hình nhaân chia trong khi baøo

Taï 33 Ngoïc Tuyeát Minh

Thöû nghieäm phaân laäp vaø nuoâi caáy teá baøo ung thö coå töû cung

töông heïp, öu bazô vaø leõ ñöông nhieân tyû leä nhaân treân baøo töông taêng leân. Trong vuøng loaïn saûn naëng coù theå thaáy caùc nhaân coù muùi, nhaân quaùi vaø nhaân chia.

1.7.2.4. Ung thö taïi choã Y vaên baøn raát nhieàu veà loaïi toån thöông naøy nhöng noùi chung ñeàu thoáng nhaát khoù phaân bieät vôùi loaïn saûn naëng veà teá baøo hoïc. Nhìn chung ñaëc ñieåm aùc tính bieåu hieän roõ hôn nhö teá baøo u ñaùy, caän ñaùy coù vieàn baøo töông moûng, öu bazô, nhaân côõ lôùn, khoâng ñeàu nhau roõ, taêng saéc, coù theå coù thuøy, muùi, goùc caïnh, tyû leä nhaân vaø baøo töông bò ñaûo ngöôïc, chaát nhieãm saéc keát tuï thaønh cuïc lôùn, khoâng ñeàu coù khi ñen nhö möïc. Coù theå thaáy haït nhaân phì ñaïi.

1.7.2.5. Ung thö bieåu moâ vaûy xaâm nhaäp Veà moâ hoïc cuõng nhö teá baøo hoïc, ngöôøi ta coù theå phaân loaïi ba típ teá baøo ung thö coå töû cung: típ teá baøo to khoâng söøng hoùa, típ teá baøo to coù söøng hoùa vaø típ teá baøo nhoû. Quan saùt teá baøo ung thö coå töû cung trong nuoâi caáy hoaëc treân neàn phieán ñoà thaáy coù nhieàu teá baøo vieâm, maûnh vuïn teá baøo, hoàng caàu thoaùi hoùa vaø chaát hoaïi töû (nhaát laø hoaïi töû huyeát) naèm laãn vôùi nhieàu teá baøo ung thö coù khi daøy ñaëc khaép nôi hoaëc coù khi ñöùng raõi raùc thaønh töøng ñaùm, boù, to nhoû khoâng ñeàu nhöng kích thöôùc teá baøo vaø nhaân thöôøng khoâng lôùn laém. Loaïi teá baøo ung thö söøng hoùa nhaân khoâng ñeàu, taêng saéc roõ, coù theå coù nhaân quaùi vaø neùt ñaëc tröng laø baøo töông öu acid vì coù chaát söøng. Ñoâi khi coù keøm raûi raùc teá baøo hình thoi vôùi nhaân daøi, saãm, cuõng coù theå thaáy teá baøo u raát to. Loaïi teá baøo ung thö khoâng söøng hoùa coù tính ña daïng roõ, nhaân troøn, hình baàu duïc. Teá baøo u ôû ñaây thöôøng nhoû hôn ôû loaïi söøng hoùa, ñöùng rieâng leû hay tuï taäp nhö hôïp baøo. Loaïi teá baøo ung thö nhoû coù teá baøo gaàn gioáng nhö teá baøo maàm cuûa bieåu moâ vaûy, chuùng nhoû nhöng nhaân to, taêng saéc, baøo töông heïp, coù theå thaáy haït nhaân nhieàu, to, noåi roõ, chaát nhieãm saéc baát thöôøng.

1.7.3. HPV vaø moái lieân heä vôi ung thö coå töû cung

Taï 34 Ngoïc Tuyeát Minh

Thöû nghieäm phaân laäp vaø nuoâi caáy teá baøo ung thö coå töû cung

Moái lieân heä giöõa HPV xaâm nhieãm ñöôøng sinh duïc vôùi ung thö coå töû cung ñaõ ñöôïc moät nhaø virus hoïc ngöôøi Ñöùc, Harold zur Hausen, nhaéc ñeán ñaàu tieân vaøo nhöõng naêm 1980. Keå töø ñoù, nhieàu nghieân cöùu quy moâ lôùn veà caáu truùc phaân töû cuûa viruùt vaø cô cheá gaây beänh cuõng nhö nhöõng vaán ñeà veà dòch teå hoïc ñaõ ñöôïc thöïc hieän ôû nhieàu nöôùc. Taàm quan troïng cuûa moái lieân heä naøy thaäm chí coøn cao hôn lieân heä giöõa huùt thuoác laù vaø ung thö phoåi. Ñeå cuûng coá theâm baèng chöùng veà vieäc HPV gaây ung thö, moät soá nghieân cöùu cho thaáy khi nhieãm HPV vaøo doøng teá baøo nuoâi caáy, viruùt laøm cho caùc teá baøo phaùt trieån moät caùch thieáu kieåm soaùt theo kieåu ung thö vaø caùc teá baøo naøy thöïc söï gaây ung thö khi tieâm vaøo chuoät. Beänh ung thö coå töû cung xaûy ra ôû phuï nöõ trong tuoåi sinh saûn vaø ñænh cao laø ôû ñoä tuoåi töø 35 ñeán 55 tuoåi. Ngoaøi vai troø quan troïng cuûa HPV, beänh coøn chòu taùc ñoäng cuûa nhieàu nhaân toá khaùc nhö vieäc huùt thuoác laù, quan heä sinh duïc vôùi nhieàu ngöôøi, coù nhieàu con, uoáng thuoác ngöøa thai, heä mieãn dòch baát thöôøng hay caùc beänh truyeàn nhieãm khaùc. Ñaëc bieät laø traïng thaùi mieãn dòch baát thöôøng cuõng laø moät nhaân toá quan troïng ñaåy maïnh nguy cô ung thö coå töû cung khi coù söï hieän dieän cuûa moät hay vaøi loaïi HPV.

Sô ñoà 4: Sô ñoà moâ hình nguyeân nhaân gaây nhieãm HPV vaø ung thö coå töû cung (moâ taû vai troø cuûa nhöõng nhaân toá haønh vi aûnh höôûng ñeán khaû naêng nhieãm HPV vaø laøm phaùt trieån ung thö coå töû cung).

Taï 35 Ngoïc Tuyeát Minh

Thöû nghieäm phaân laäp vaø nuoâi caáy teá baøo ung thö coå töû cung

Human papilloma virus (HPV) thuoäc hoï Papovaviridae, laø moät nhoùm viruùt ñöôïc bieát ñeán do gaây ra moät soá daïng muïn coùc, u nhoït (papilloma) hoaëc caùc muïn nhoït ôû boä phaän sinh duïc. Trong nhieàu naêm lieàn, caùc muïn nhoït ñöôïc xem nhö voâ haïi, ngoaïi tröø vaán ñeà thaåm myõ. Tuy nhieân trong thöïc teá, coù nhieàu type HPV lieân quan tröïc tieáp ñeán nhieàu beänh khaùc nhau töø muïn coùc thoâng thöôøng cho ñeán ung thö. Hieän nay, ngöôøi ta ñaõ phaùt hieän hôn 100 type (loaïi) HPV, trong ñoù coù hôn 30 type chuû yeáu xaâm nhieãm ôû ñöôøng sinh duïc, nhieàu type ñaõ ñöôïc giaûi trình töï. HPV chuû yeáu xaâm nhieãm caùc teá baøo bieåu moâ, ñaëc bieät ôû ñöôøng sinh duïc. Chu trình cuûa HPV khaùc vôùi haàu heát caùc viruùt khaùc ôû choã söï xaâm nhieãm xaûy ra ôû nhöõng teá baøo noäi bì hoaëc bieåu bì cô vaãn coøn khaû naêng taêng sinh. Baûng 1: phaân loaïi HPV Khoái u noäi bieåu moâ coå

Daïng HPV

töû cung Khoâng xaùc ñònh

30, 34, 39, 40, 53, 57, 59, 61, 62, 64, 66, 67, 68, 69

Low risk

6, 11, 16, 18, 31, 33, 35, 42, 43, 44, 45, 51, 52, 74

High risk

16, 18, 6, 11, 31, 34, 33, 35, 39, 42, 44, 45, 51, 52, 56, 66

Ung thö coå töû cung

16, 18, 31, 45, 33, 35, 39, 51, 52, 56, 58, 66, 68, 70

Giöõa naêm 1974 vaø 1976, caùc nhaø nghieân cöùu baét ñaàu ñaët vaán ñeà vaø phaân tích vai troø cuûa caùc type HPV trong ung thö coå töû cung. Naêm 1976, Meisels vaø Fortin coâng boá hai baùo caùo cho raèng söï hieän dieän cuûa koilocyte (teá baøo daïng maét cuù do söï co ruùt cuûa nhaân vaø moät vaàng trong môø xung quanh nhaân gaây ra bôûi söï xaâm nhieãm cuûa caùc thaønh phaàn papillomavirus) trong maãu queùt teá baøo coå töû cung cho thaáy coù söï xaâm nhieãm bôûi HPV. Hoï cuõng cho raèng coù theå phaân bieät giöõa caùc u nhoït khoâng phaùt trieån thaønh ung thö coå töû cung vaø nhöõng khoái u tieàn ung thö. YÙ töôûng naøy ñöôïc cuûng coá nhôø vieäc xaùc ñònh nhöõng haït töû cuûa papillomavirus trong nhöõng khoái u baát thöôûng ôû coå töû cung.

Taï 36 Ngoïc Tuyeát Minh

Thöû nghieäm phaân laäp vaø nuoâi caáy teá baøo ung thö coå töû cung

Caùc moâ taû veà tính khoâng ñoàng nhaát cuûa hoï papillomavirus vaø söï coâ laäp ñöôïc moät soá kieåu papillomavirus töø muïn nhoû ôû vuøng sinh duïc, cuõng nhö vieäc aùp duïng lai phaân töû ôû möùc ít nghieâm ngaët ñeå xaùc ñònh caùc type HPV lieân quan ñaõ cho moät caùi nhìn roõ raøng veà söï lieân heä giöõa nhieãm HPV vôùi ung thö ñöôøng sinh duïc, ñaëc bieät laø söï coâ laäp vaø taïo doøng HPV 16 vaø HPV 18 töø maãu sinh thieát ung thö coå töû cung. Nhieàu nghieân cöùu sau ñoù ñaõ cho nhieàu hieåu bieát toát hôn veà chöùc naêng cuûa gen viruùt ñoäc vaø chi tieát quaù trình xaâm nhieãm bôûi HPV. Naêm 1996, Hoäi Y teá theá giôùi (World Health Association) cuøng vôùi Toå chöùc nghieân cöùu veà xaâm nhieãm vaø ung böôùu ñöôøng sinh duïc Chaâu Aâu (European Research Organization on Genital Infection and Neoplasia) vaø Hoäi nghò thoáng nhaát caùc Vieän Söùc khoeû quoác gia veà ung thö coå töû cung ñaõ coâng nhaän HPV laø nguyeân nhaân quan troïng daãn ñeán ung thö coå töû cung. Cô quan quoác teá veà nghieân cöùu ung thö cuûa Toå chöùc Y teá theá giôùi ñaõ xeáp loaïi xaâm nhieãm HPV laø gaây ung thö ñoái vôùi ngöôøi laø HPV 16 vaø HPV 18, haàu nhö chaéc chaén gaây ung thö laø HPV 31, HPV33 vaø coù theå gaây ung thö laø caùc type HPV khaùc (tröø HPV6 vaø HPV11). Do ñoù, hieän nay xaâm nhieãm HPV ñöôïc coi laø nhaân toá trung taâm gaây neân ung thö coå töû cung.

1.7.4. Caáu truùc, thaønh phaàn vaø hoaït ñoäng cuûa HPV

Hình 4: Hình aûnh ñaàu tieân veà thaønh phaàn cuûa caùc viruùt qua kính hieån vi ñieän töû ñöôïc Strauss vaø ñoàng söï coâng boá naêm 1949. HPV coù ñöôøng kính khoaûng 55 nm chöùa DNA daïng voøng, maïch ñoâi, lieân keát vôùi protein gioáng histone. Voû capsid ñöôïc taïo thaønh töø 72 ñôn vò capsomere, moãi ñôn vò laø moät pentamer cuûa protein caáu truùc L1. Ngoaøi ra coøn coù moät loaïi protein caáu truùc khaùc laø L2 coù thaønh phaàn khaùng nguyeân lieân quan ñeán caùc phaûn öùng vôùi huyeát thanh mieãn dòch ñaëc hieäu 3,6.

Taï 37 Ngoïc Tuyeát Minh

Thöû nghieäm phaân laäp vaø nuoâi caáy teá baøo ung thö coå töû cung

1.7.4.1. Cô cheá gaây beänh Söï phaùt trieån ung thö do Papillomavirus thöôøng coù söï saùt nhaäp boä gen virut vaøo boä gen cuûa teá baøo chuû, vò trí saùt nhaäp laø baát kyø. Thoâng thöông boä gen virut seõ ñöôïc môû voøng ôû giöõa khung ñoïc môø cuûa E2, laøm baát hoaït gen naøy. Moät phaàn cuûa E2 vaø caùc gen khaùc gaàn keà vôùi E2 nhö E4, E5 vaø moät phaàn cuûa L2 thöôøng bò maát sau khi saùt nhaäp. Ñoaïn gen saùt nhaäp luoân giöõ vuøng maõ hoùa vaø ñieàu hoøa cuûa gen virut E6, E7. Trong boä gen virut, gen E2 ñöôïc bieát laø maõ hoùa cho nhaân toá ñieàu hoøa theo cô cheá ñieàu hoøa aâm promotor ñieàu khieån söï phieân maõ cuûa gen E6 vaø E7. Khi saùt nhaäp vaøo boä gen teá baøo chuû, gen E2 khoâng bieåu hieän chöùc naêng daãn ñeán söï bieåu hieän vöôït möùc gen E6 vaø E7 vaø protein gaây ung thö ñöôïc dòch maõ. Nhieàu baèng chöùng ñöôïc ñöa ra cho thaáy vai troø quan troïng cuûa gen E6, E7 cuûa viruùt: - Gen E6/E7 luoân ñöôïc bieåu hieän trong teá baøo ung thö. - Söï vaéng maët cuûa nhaân toá öùc cheá gen E6/E7 trong teá baøo ung thö. - Teá baøo ngöôøi ñöôïc baát töû hoùa khi coù söï hieän dieän cuûa caùc gen naøy. - E6/E7 antisense RNA laøm giaûm söï phaân chia teá baøo trong doøng teá baøo lieân tuïc vaø laøm maát tình traïng ung thö. - Protein E6 vaø E7 ñöôïc bieåu hieän vöôït möùc sau khi saùt nhaäp boä gen virut vaøo teá baøo chuû. Chuùng coù khaû naêng gaén keát vaø voâ hieäu hoùa chöùc naêng cuûa protein ñieàu hoøa taêng tröôûng teá baøo trong chu trình teá baøo vaø ñöôïc xem laø nguyeân nhaân daãn ñeán tình traïng ung thö.

Taï 38 Ngoïc Tuyeát Minh

Thöû nghieäm phaân laäp vaø nuoâi caáy teá baøo ung thö coå töû cung

HPV SÖÏ NHIEÃM TIEÀM TAØNG LÔÙP BIEÅU MOÂ

TEÁ BAØO AÙC TÍNH

SAÛN SINH SÖÏ NHIEÃM

GAÉN p53 vaø pRb HPV E6 / E7

SÖÏ SAÙT NHAÄP HPV DNA

ÑAÙP ÖÙNG MIEÃN DÒCH

Hình 5 : Cô cheá gaây beänh

1.7.5. Protein virut vaø chöùc naêng 1.7.5.1. Protein E1 E1 coù moät soá nhöõng ñaëc tính töông töï nhö khaùng nguyeân T lôùn cuûa viruùt SV40, noù maõ hoaù cho moät RNA polycistron, moät protein coù chöùc naêng gaén ñaëc hieäu vaøo DNA, gaén vaø thuyû phaân ATP, coù hoaït ñoäng thaùo xoaén khoâng phuï thuoäc ATP vaø raát thieát yeáu cho söï sao cheùp cuûa papillomavirus. Noù cuõng coù töông taùc vôùi DNA polymerase (alpha) teá baøo. Beân caïnh L1, khung ñoïc môû cuûa E1 laø caáu truùc baûo toàn nhaát giöõa caùc type viruùt khaùc nhau.

1.7.5.2. Protein E2 Khung ñoïc môû cuûa E2 maõ hoùa töø 2-3 protein khaùc nhau, taát caû ñeàu laø nhaân toá phieân maõ. Chuùng coù nhöõng aûnh höôûng khaùc nhau ñeán söï bieåu hieän gen cuûa viruùt vaø thöïc hieän ñieàu hoaø trong boä gen baèng caùch taïo dimer ôû nhöõng vò trí gaén thích hôïp. Trong nhieàu tröôøng hôïp, protein E2 coù khaû naêng öùc cheá söï phieân maõ cuûa protein viruùt E6 vaø E7. Protein E2 cuûa HPV 16 vaø HPV 18 coù chöùc naêng cuûa moät yeáu toá hoaït hoùa phieân maõ ôû teá baøo söøng coå töû cung ngöôøi.

Taï 39 Ngoïc Tuyeát Minh

Thöû nghieäm phaân laäp vaø nuoâi caáy teá baøo ung thö coå töû cung

Söï maát gen E2 thöôøng thaáy trong sinh thieát ung thö coå töû cung vaø trong doøng teá baøo cuûa loaïi ung thö naøy, cho thaáy söï maát ñoaïn naøy taïo thuaän lôïi cho söï chuyeån sang traïng thaùi aùc tính. Khoâng chæ ñoät bieán trong khung ñoïc môû cuûa E2 maø caû nhöõng ñoät bieán trong vuøng DNA gaén E2 trong LCR cuõng daãn ñeán taêng cöôøng hoaït ñoäng gaây ung thö cuûa HPV 16. Trong quaù trình phaùt trieån ung thö, söï ñöùt gaõy E2 laø moät hieän töôïng xaûy ra muoän vì trong nhöõng toån thöông tieàn aùc tính khoâng coù hieän töôïng naøy. Ngoaøi chöùc naêng hoaït hoùa phieân maõ, E2 coøn töông taùc vôùi E1 deã daøng gaén vôùi ñieåm khôûi ñaàu sao cheùp.

1.7.5.3. Protein E4 Saûn phaåm cuûa gen E4, protein E4, ñoùng vai troø trong söï tröôûng thaønh vaø phoùng thích HPV. Quaù trình naøy khoâng laøm tan teá baøo.

1.7.5.4.

Protein E5

Protein E5 quan troïng trong giai ñoaïn ñaàu cuûa söï xaâm nhieãm. Noù hoaït hoùa söï phaùt trieån cuûa teá baøo baèng caùch taïo ra caùc phöùc hôïp vôùi receptor cuûa caùc nhaân toá taêng tröôûng vaø bieät hoùa. Ngoaøi ra, protein naøy coøn coù vai troø trong vieäc ngaên chaän söï cheát theo chöông trình cuûa caùc teá baøo coù DNA hö hoûng.

1.7.5.5. Protein E6 Protein E6 cuûa HPV16 chöùa 151 amino acid vaø chöùa 4 caáu truùc gaén keõm ñieàu hoaø Cys-X-X-Cys coù theå taïo thaønh hai caáu truùc ngoùn tay keõm. Protein E6 cuûa HPV nguy cô cao coù moät soá tính chaát sinh hoïc ñaùng chuù yù nhö lieân keát vôùi protein E7 trong vieäc baát töû hoaù teá baøo ngöôøi, thaäm chí protein naøy coù theå baát töû hoùa moät soá loaïi teá baøo ñoäng vaät höõu nhuõ ngay caû khi khoâng coù söï hieän dieän cuûa protein E7. Protein E6 cuûa nhöõng viruùt naøy lieân keát vôùi gen ras trong quaù trình baát töû hoaù teá baøo cô baûn cuûa chuoät vaø kích thích söï phaùt trieån cuûa teá baøo Tính chaát quan troïng nhaát cuûa protein E6 laø noù coù khaû naêng gaén vaøo protein p53 cuûa teá baøo. Söï gaén keát naøy laøm taêng söï phaân giaûi cuûa p53 bôûi heä thoáng phaân giaûi

Taï 40 Ngoïc Tuyeát Minh

Thöû nghieäm phaân laäp vaø nuoâi caáy teá baøo ung thö coå töû cung

protein ubiquitin cuûa teá baøo. Söï töông taùc cuûa E6 ñoái vôùi p53 ñöôïc xem laø nguyeân nhaân chính cuûa baát oån nhieãm saéc theå trong teá baøo xaâm nhieãm bôûi HPV gaây ung thö.

1.7.5.6. Protein E7 Protein E7 goàm 98 amino acid laø moät phosphoprotein lieân keát keõm coù hai vuøng cys-X-X-Cys. Caáu truùc naøy cho thaáy söï töông ñoàng vôùi protein E6, chöùng toû chuùng coù lieân heä veà maët tieán hoùa. Phaàn ñaàu N cuûa protein E7 chöùa hai vuøng töông öùng moät phaàn vôùi vuøng baûo toàn 1 (CR-1) vaø hoaøn toaøn töông öùng vôùi vuøng baûo toàn 2 (CR-2) cuûa protein adenovirus E1A vaø vôùi moät vuøng töông töï treân khaùng nguyeân T lôùn cuûa SV40. Caû hai vuøng töông öùng treân protein E7 (cd1 vaø cd 2) goùp phaàn taïo neân tieàm naêng gaây ung thö cuûa noù. Töông töï vôùi E1A vaø khaùng theå T cuûa SV40, protein E7 cuûa HPV taïo phöùc hôïp vôùi protein retinoblastoma (pRB). ÔÛ caùc type HPV coù khaû naêng gaây ung thö (nguy cô cao) aùi löïc lieân keát cuûa E7 vôùi pRB lôùn hôn khoaûng 10 laàn so vôùi caùc type HPV thoâng thöôøng (nguy cô thaáp) do khaùc nhau moät amino acid ôû vò trí thöù 21. AÙi löïc cuûa E7 vôùi pRB coù aûnh höôûng lôùn ñeán hieäu quaû chuyeån hoaù teá baøo cuûa viruùt. Ngoaøi ra, söï lieân keát E7 vôùi pRB coøn laøm giaûi phoùng moät soá nhaân toá teá baøo nhö nhaân toá phieân maõ E2F. Söï taêng noàng ñoä E2F töï do trong teá baøo coù theå daãn ñeán söï keùo daøi tuoåi thoï teá baøo.

1.7.5.7. Protein p53 Protein p53 laø moät protein ñieàu hoøa phieân maõ, coù khaû naêng gaén vôùi moät soá trình töï DNA baèng ñaàu N, vaø taïo dimer hoaëc tetramer baèng ñaàu C. Chöùc naêng cuûa p53 trong chu trình teá baøo laø hoaït ñoäng ôû ñieåm kieåm soaùt R ñeå chi phoái söï tieáp dieãn cuûa chu trình phaân baøo. Ngoaøi ra p53 coøn taêng cöôøng kieåm soaùt ñeå ñöa teá baøo vaøo söï cheát theo chöông trình (apoptosis) khi coù sai hoûng. Protein E6 cuûa caùc type HPV gaây ung thö coù theå taïo thaønh phöùc hôïp vôùi p53, qua trung gian cuûa protein keát hôïp E6 (E6AP). Phöùc hôïp E6/p53 gaây ra söï giaûm noàng ñoä p53 trong teá baøo do ñoù khieán cho teá baøo coù DNA sai hoûng coù theå toàn taïi qua quaù trình phaân baøo. Protein cuûa caùc type HPV nguy cô thaáp (low risk) khoâng coù khaû naêng gaén vôùi p53 vaø khoâng aûnh höôûng gì leân söï oån ñònh p53 trong thöïc nghieäm.

Taï 41 Ngoïc Tuyeát Minh

Thöû nghieäm phaân laäp vaø nuoâi caáy teá baøo ung thö coå töû cung

1.7.5.8. Retinoblastoma Protein (pRb) Ñaây laø moät phosphoprotein coù troïng löôïng phaân töû khoaûng 105kD, ñöôïc phosphoryl hoùa ôû giai ñoaïn G2 cuûa chu trình teá baøo. Khi khoâng ñöôïc phosphoryl hoùa pRb taïo phöùc vôùi protein E2F vaø öùc cheá phieân maõ baèng caùch gaén protein öùc cheá. Khi ñöôïc phosphoryl hoùa, pRb khoâng coøn taïo phöùc vôùi E2F ñöôïc nöõa, khi ñoù. E2F dimer hoùa vôùi protein DP vaø hoaït hoùa söï bieåu hieän cuûa moät soá gen ñieàu hoøa ñöa teá baøo vaøo giai ñoaïn S, nhö DNA polymerase α, thymidylate synthase, ribonucleotide redutase, cyclin E vaø dihydrofolate reductase. Söï taêng cöôøng E2F töï do daãn ñeán taêng cöôøng chu trình teá baøo. Nhö ñaõ ñeà caäp ôû treân, protein E7 cuûa HPV nguy cô cao coù khaû naêng taïo phöùc lieân keát vôùi pRB vaø coù aùi löïc vôùi pRB cao hôn protein E7 ôû nguy cô gaây lieàu thaáp nhieàu laàn. Khi protein E7 taïo phöùc vôùi pRB, pRB khoâng theå taïo phöùc vôùi E2 vaø do ñoù E2F coù theå laøm chaát hoaït hoùa phieân maõ daãn ñeán söï taêng sinh teá baøo taïo ra khoái u.

1.7.5.9. Protein p27kip I Thuoäc hoï Cip/Kip thuoäc nhoùm CKI, p27kip I laø moät phosphoprotein nhaân coù 198 amino acid, coù gaén CDK ôû ñaàu N ñeå gaén vaø öùc cheá cyclin kinase D, E, A, B. Ñaàu 3’C cuûa protein E7 cuûa HPV coù khaû naêng lieân keát vôùi p27kip I vaø laøm maát hoaït tính cuûa noù. Nhö ñaõ ñeà caäp, nhoùm CKI öùc cheá hoaït ñoäng xuùc tieán phaân baøo cuûa nhaân toá CDK, do ñoù khi E7 lieân keát vôùi p27kip I laøm cho maát hoïat tính öùc cheá, khieán cho quaù trình tieán ñeán phaân baøo xaûy ra deã daøng hôn.

Taï 42 Ngoïc Tuyeát Minh

Thöû nghieäm phaân laäp vaø nuoâi caáy teá baøo ung thö coå töû cung

Hình 6: Söï nhieãm HPV

Hình 7: Tyû leä nhieãm caùc type HPV trong ung thö coå töû cung 1.7.6. Phaân loaïi HPV Taïi hoäi nghò thöôøng nieân veà Papillomavirus naêm 1995 (Quebec, Canada), ngöôøi ta thoáng nhaát phöông phaùp phaân loaïi caùc type HPV döïa treân söï so saùnh möùc ñoä khaùc nhau cuûa boä gen, cuï theå laø neáu coù söï khaùc bieät hôn 10% treân khung ñoïc môû cuûa L1 thì ñöôïc coi nhö thuoäc moät kieåu viruùt môùi. Öôùc tính hôn 77 type HPV ñaõ ñöôïc xaùc ñònh vaø giaûi trình töï hoaøn toaøn. Khoaûng hôn 39 kieåu khaùc ñang ñöôïc giaûi trình töï moät phaàn cho thaáy toång soá caùc type HPV leân ñeán hôn 100. Döïa treân caáu taïo cuûa nucleic acid, ngöôøi ta chia HPV ra thaønh nhieàu nhoùm nhoû. Moät trong nhöõng nhoùm nhoû ñöôïc bieát ñeán nhieàu nhaát laø nhoùm caùc HPV xaâm nhieãm chuû yeáu ôû beà maët nieâm maïc, thöôøng thaáy nhaát ôû ñöôøng sinh duïc. Hôn 40 type HPV ñöôïc xaùc ñònh thuoäc nhoùm naøy trong ñoù ñöôïc bieát nhaát laø HPV 16. Moät nhoùm nhoû

Taï 43 Ngoïc Tuyeát Minh

Thöû nghieäm phaân laäp vaø nuoâi caáy teá baøo ung thö coå töû cung

khaùc laø nhöõng viruùt ñaïi dieän bôûi caùc viruùt tìm thaáy trong caùc muïn coùc loaïn saûn daïng bieåu moâ (epidermodysplasia veruciformis lesions), thöôøng gaëp nhaát laø HPV 5. Nhöõng viruùt naøy cuõng ñöôïc tìm thaáy trong caùc veát lôû cuûa ngöôøi bò suy yeáu mieãn dòch.

1.7.7. Lòch söû nuoâi caáy teá baøo bieåu moâ coå töû cung Naêm 1975 Rheinwald vaø Green ñaõ thöû nghieäm nuoâi caáy haøng loaït lôùp teá baøo bao qui ñaàu söøng hoaù cuûa treû sô sinh nhöng khoâng thaønh coâng. Vaøo naêm 1976 Wilbank vaø Find laàn ñaàu tieân thöû nghieäm nuoâi caáy moät maãu teá baøo bieåu moâ coå töû cung thì thaáy teá baøo coù khaû naêng phaùt trieån in vitro. Nhöng tyû leä thaønh coâng trong caùc loaït thöû nghieäm nuoâi caáy naày raát haïn cheá. Thöôøng ôû laàn nuoâi caáy sô caáp tyû leä baùm ôû lôùp teá baøo söøng hoùa raát thaáp vaø nhanh choùng suy yeáu ôû laàn nuoâi caáy thöù caáp. ÔÛ nhöõng thöû nghieäm nuoâi caáy naøy nguyeân baøo sôïi thöôøng chieám öu theá. Thôøi gian sau ñoù caùc nhaø nghieân cöùu baét ñaàu chính thöùc tieán haønh nuoâi caáy teá baøo ung thö söøng hoùa töø caùc beänh nhaân bò toån thöông noäi bieåu moâ coå töû cung. Maëc duø doøng teá baøo ung thö coå töû cung ñuôïc Gay vaø coäng söï thieát laäp töø nhöõng naêm 1952 vaø ñöôïc söû duïng roäng raõi trong caùc nghieân cöùu sinh hoïc, nhöng chöa coù chöùng thöïc naøo xaùc nhaän doøng teá baøo Hela naøy coù nguoàn goác töø toån thöông noäi bieåu moâ. Maõi ñeán khi doøng teá baøo W12 (Sanley vaø coäng söï thieát laäp vaøo naêm 1989) vaø CIN 612 (Badell vaø coïâng söï thieát laäp vaøo naêm 1991) caû hai ñeàu coù nguoàn goác töø toån thöông bieåu moâ töû cung ñoä thaáp. Nhöõng haïn cheá gaëp trong nuoâi caáy teá baøo bieåu moâ bình thöôøng cuõng xaõy ra ôû quaù trình nuoâi caáy teá baøo ung thö coå töû cung söøng hoùa, theâm vaøo ñoù laø söï phöùc taïp cuûa caùc maãu sinh thieát coù nguoàn goác khaùc nhau. Nhöõng thí nghieäm sau ñoù cuûa Stanley vaø Parkison cuõng chöùng minh raèng teá baøo coå töû cung söøng hoùa coù theå nuoâi caáy lieân tuïc. Ham vaø coäng söï thöû nghieäm caùc phöông phaùp nuoâi caáy ñeå xaùc ñònh moâi tröôøng dinh döôõng vaø phaùt trieån cuûa caùc teá baøo söøng hoùa. Keát quaû laø teá baøo coå töû cung söøng hoùa coù theå phaùt trieån ôû moâi tröôøng MCDB 153 (Boyce vaø Ham) vaø teá baøo söøng hoùa phaùt trieån thaønh lôùp ñôn maø khoâng traõi qua quaù trình bieät hoùa in vitro. Trôû ngaïi lôùn thöôøng gaëp trong nuoâi caáy teá baøo ung thö coå töû cung laø söï nhieãm khuaån, nhieãm mycoplasma vaø nhieãm nguyeân baøo sôïi. Vì vaäy moâi tröôøng phaùt trieån

Taï 44 Ngoïc Tuyeát Minh

Thöû nghieäm phaân laäp vaø nuoâi caáy teá baøo ung thö coå töû cung

teá baøo ung thö coå töû cung ngay töø ñaàu phaûi coù thuoác khaùng sinh. Ngoaøi ra ngöôøi ta coù theå kieåm tra moät caùch coù hieäu quaû söï laây nhieãm nguyeân baøo sôïi baèng caùch thöïc hieän caùc thao taùc thaønh thuïc ñeå loaïi boû caùc daïng teá baøo khaùc trong quaù trình nuoâi caáy. Noùi chung, tyû leä thaønh coâng khi nuoâi caáy doøng teá baøo ung thö coå töû cung thöôøng thaáp, tyû leä thaønh coâng laø 1/10 maãu sinh thieát.

1.7.8. Thò tröôøng doøng teá baøo ung thö coå töû cung Hieän nay phaàn lôùn doøng teá baøo ung thö coå töû cung ñöôïc cung caáp bôûi ATCC (American Tissue Culture Collection) vaø DSMZ (Deutsche Sammlung Von Mikroorganismen und Zellkulturen). Moät soá doøng ñöôïc söû duïng phoå bieán ôû caùc phoøng thí nghieäm hieän nay nhö: C-33A, C-41, C41 II, Caski, Hela, Hs 588.T, Hs 636.T, HT-3, KB-3-1, ME 180, MS751, SiHa, SISO, SW756, Hela P3, Hela AG, Hela S3, SNG-N, SNG-P…Hela S3 (coù nguoàn goác töø teá baøo ung thö bieåu moâ coå töû cung ngöôøi) nuoâi caáy trong moâi tröôøng HAM’s F12 vaø 10% FBS vaø thích hôïp phaùt trieån doøng trong moâi tröôøng N16 HHF. Hela S3 do T.T vaø P.I.Drarcus thieát laäp töø naêm 1955. Doøng teá baøo Hela S3 cuõng ñöôïc söû duïng ñeå nghieân cöùu caùc khaùng nguyeân coù nguoàn goác töø caùc viruùt sinh u. Caùc nghieân cöùu cho thaáy raèng caùc khaùng nguyeân coù nguoàn goác töø caùc viruùt sinh u coù theå ñöôïc nhaän bieát bôûi caùc teá baøo T. Ví duï ñieån hình nhaát ôû ngöôøi laø caùc peptid coù nguoàn goác töø protein E7 cuûa HPV 16, virut naøy coù maët trong nhieàu ung thö bieåu moâ coå töû cung, caùc teá baøo T ñaàu ñoäc teá baøo coù theå taán coâng vaø gieát caùc teá baøo ung thö ngay khi chuùng xuaát hieän. Doøng teá baøo SNG-M vaø SNG-P laø khoái u di caên coù nguoàn goác töø ung thö coå töû cung ngöôøi ñöôïc nuoâi caáy trong moâi tröôøng HAM’s F12 vôùi 20% FBS (Ishiwatari.Y vaø Nozawas). Ñaây laø doøng teá baøo phaùt trieån khaù toát nuoâi caáy hôn 13 thaùng vaø caáy chuyeàn hôn 65 laàn vaø vaãn tieáp tuïc phaùt trieån oån ñònh. SNG-M vaø SNG-P ñöôïc söû duïng treân cô sôû phaân tích chu trình teá baøo ñeå nghieân cöùu so saùnh giöõa moät teá baøo bình thöôøng vaø teá baøo ung thö coå töû cung ñang ñöôïc xaï trò ñeå xem xeùt vieäc xaï trò vaøo thôøi ñieåm naøo laø ñaït hieäu quaû nhaát. Trong moâi tröôøng nuoâi caáy ôû phoøng thí nghieäm, haàu heát caùc teá baøo bình thöôøng chæ phaân chia trong voøng 20 – 50 theá heä thì ngöøng laïi. Chuùng tieáp tuïc phaân chia cho ñeán khi chuùng chaïm phaûi nhau thì ngöøng laïi khoâng

Taï 45 Ngoïc Tuyeát Minh

Thöû nghieäm phaân laäp vaø nuoâi caáy teá baøo ung thö coå töû cung

phaân chia nöõa, hieän töôïng naøy ñöôïc goïi laø öùc cheá phuï thuoäc maät ñoä. Ngöôïc laïi caùc teá baøo ung thö khoâng phaûn öùng vôi cô cheá kieåm soaùt naøy. Baèng caùch nghieân cöùu caùc teá baøo ung thö trong moâi tröôøng nuoâi caáy caùc nhaø nghieân cöùu thaáy raèng teá baøo ung thö khoâng chòu aûnh höôûng gì hoaëc chòu aûnh höôûng caùc nhaân toá kieåm soaùt phaân baøo keùm hôn caùc teá baøo bình thöôøng. Caùc teá baøo ung thö coù theå phaân chia maõi khoâng bò giôùi haïn chöøng naøo chuùng coøn ñöôïc cung caáp chaát dinh döôõng. Neáu teá baøo ung thö ngöøng phaân chia chuùng seõ ngöøng taïi nhöõng thôøi ñieåm ngaãu nhieân hôn laø ngöøng ñuùng ôû thôøi ñieåm khuûng hoaûng. Vieäc xöû lyù ung thö baèng phöông phaùp xaï trò laø nhaèm ngaên chaën ñeå caùc teá baøo ung thö ngöøng phaân chia. Vì vaäy khi teá baøo bò huyû dieät trong gian kyø thì moïi hoaït ñoäng phaân baøo seõ ngöøng ngay. Hieän töôïng naøy coù theã thaáy khi chieáu xaï lieàu cao. Hela P3 (coù nguoàn goác töø teá baøo ung thö bieåu moâ coå töû cung ngöôøi) ñöôïc nuoâi caáy trong moâi tröôøng DM210 khoâng huyeát thanh. Doøng SiHa vaø CaSki (cuõng coù nguoàn goác töø teá baøo ung thö bieåu moâ coå töû cung ngöôøi) ñöôïc nuoâi caáy trong moâi tröôøng DMEM vôùi 10% fetal cafl serum – coù söû duïng theâm 0,25% trypsin khi taïo doøng. Doøng SiHa vaø CaSki coù khaû naêng kieåm soaùt HPV16 vaø Hela P3 coù theå khaùng laïi HPV18. Caùc nhaø nghieân cöùu ñaõ söû duïng nhieàu doøng teá baøo nuoâi caáy nhö Hela P3, CaSki, SiHa ñeå thöû nghieäm vieäc ñieàu trò ung thö coå töû cung baèng caùch döïa treân söï maát taùc duïng töông hoã giöõa protein vôùi protein, coù lieân quan ñeán protein gaây öùc cheá ung thö. Chaúng haïn nhö oncoprotein E7 vaø E6 lieân keát, taùc duïng töông hoã naøy vôùi protein viruùt nhö viruùt papilloma ôû ngöôøi coù theå giaûi phoùng ra nhöõng protein öùc cheá ung thö vaø ñieàu naøy coù theå coù ích trong ñieàu trò ung thö coå töû cung. Baèng caùc nghieân cöùu nuoâi caáy teá baøo caùc nhaø khoa hoïc coøn chöùng minh raèng söï thay ñoåi tieán trình cuûa nhieãm saéc theå vaø söï xaâm nhaäp cuûa HPV laøm phaùt trieån ung thö coå töû cung. Ngoaøi caùc HPV ñaùng chuù yù nhö HPV 16, HPV 18 coøn coù caùc HPV khaùc nhö HPV31, HPV33, HPV35, HPV45 ñöôïc tìm thaáy trong caùc khoái u coå töû cung. Caùc nhaø khoa hoïc cho raèng söï xuaát hieän cuûa caùc HPV naøy coù lieân quan ñeán vaán ñeà ñòa lyù (HPV 45 tìm thaáy phoå bieán ôû caùc beänh nhaân nöõ ôû Chaâu Phi vaø caùc nöôùc Nam Myõ). Trong nhieàu naêm qua baèng caùc thöû nghieäm nuoâi caáy töø doøng teá baøo Hela, CaSki caùc nhoùm nghieân cöùu ñaõ chæ ra ñöôïc nhieàu gen öùc cheá ung thö, trong ñoù coù gen BRCA 1 khu truù ôû 17q bieåu hieän beänh ung thö vuù vaø ung thö töû cung. Caùc nhaø khoa

Taï 46 Ngoïc Tuyeát Minh

Thöû nghieäm phaân laäp vaø nuoâi caáy teá baøo ung thö coå töû cung

hoïc cho raèng neáu söï ñieàu trò döïa treân gen öùc cheá ung thö ñöôïc phaùt trieån thì caùc nhaø ung thö hoïc coù khaû naêng xaây döïng nhöõng test chaån ñoaùn thích hôïp vaø beänh nhaân hoaøn toaøn ñöôïc lôïi töø bieän phaùp ñieàu trò nhö theá. Söï maát thöôøng xuyeân caùc gen öùc cheá ung thö ñaët ra cho caùc nhaø khoa hoïc moät caâu hoûi coù phaûi beänh naøy gioáng nhö beänh khieám khuyeát di truyeàn. Vaø caâu traû lôøi laø tìm bieän phaùp ñieàu trò baèng caùch thay theá gen chính laø muïc tieâu thích hôïp nhaát. Coâng trình nghieân cöùu nhieàu naêm qua ñaõ cho thaáy raèng gen p53 coù theå raát phuø hôïp ñeå duøng ngaên chaêän söï sinh saûn teá baøo ung thö hoaëc ñeå phaù huûy caùc teá baøo naøy.

Taï 47 Ngoïc Tuyeát Minh

Thöû nghieäm phaân laäp vaø nuoâi caáy teá baøo ung thö coå töû cung

1. VAÄT LIEÄU – HOAÙ CHAÁT 1.1.

Ñoái töôïng nghieân cöùu

Ñeå thöïc hieän ñöôïc nhöõng thí nghieäm nghieân cöùu veà ñeà taøi naøy, chuùng toâi ñöôïc söï giuùp ñôõ vaø hoã trôï veà nguoàn maãu vaø nhöõng thoâng tin caàn thieát cuûa nguoàn maãu töø Beänh vieän Ung Böôùu cung caáp. Sau khi tieán haønh khaùm laâm saøng vaø chaån ñoaùn giai ñoaïn beänh, caùc baùc só taïi phoøng khaùm seõ laáy sinh thieát nguoàn maãu töø choã suøi cuûa coå töû cung cuûa beänh nhaân. Tuøy theo töøng giai ñoaïn, choã suøi coù theå töø 2 – 5cm. Troïng löôïng maãu ñöôïc cung caáp thöôøng khoaûng 1,4 – 1,6g. Nguoàn maãu coù ñöôïc töø nhieàu beänh nhaân coù ñoä tuoåi khaùc nhau, giai ñoaïn beänh khaùc nhau, nôi sinh soáng khaùc nhau. Qui trình xöû lyù nguoàn maãu seõ ñöôïc tieán haønh taïi phoøng thí nghieäm Coâng ngheä Sinh Hoïc Phaân Töû – Lab C, tröôøng Ñaïi hoïc Khoa Hoïc Töï Nhieân.

Hình 6: Maãu sinh thieát 1.2. Duïng cuï – Thieát bò – Hoùa chaát I.2.1. Duïng cuï -

Ñóa petri (ñöôøng kính 10cm) Erlen 50ml, 100ml, 250ml Ñeøn coàn Becher 50ml, 100ml, 250ml Micropipette (10-100ml vaø 100-1000ml) Keïp cong vaø thaúng Keùo cong vaø thaúng Ñaàu type 10-100ml vaø 100-1000ml Buoàng ñeám NEUBAUER

Taï 48 Ngoïc Tuyeát Minh

Thöû nghieäm phaân laäp vaø nuoâi caáy teá baøo ung thö coå töû cung

-

Lamelle OÁng ly taâm Bình roux Eppendorf 1500µl Bình xòt coàn 1.2.2. Thieát bò

-

Tuû caáy voâ truøng Tuû aám CO2 daïng kho Noài aùp suaát (autoclave) Maùy khuaáy töø gia nhieät Maùy ly taâm Maùy aûnh kyõ thuaät soá Tuû saáy Tuû laïnh Kính hieån vi ñieän töû Kính hieån vi soi ngöôïc Microfilter Caân ñieän töû

1.2.3. Hoùa chaát Dung dòch PBSA g/l NaCl 8,00 KCl 0,20 2,16 Na2HPO4.7H2O 0,20 KH2PO4 1000ml H2O caát vöøa ñuû pH 7,2 Boå sung 50µg/ml Gentamicin, 5µg/ml Ampotericin B sau khi PBS ñaõ ñöôïc haáp khöû truøng. - Trypsin 1% Trypsin 1g PBS voâ truøng (vt) 100ml Loïc voâ truøng baèng 0,45 – 0,22µm Microfilter Baûo quaûn laïnh ôû 4oC. - EDTA 1% EDTA 1g Nöôùc caát 100ml Haáp khöû truøng

Taï 49 Ngoïc Tuyeát Minh

Thöû nghieäm phaân laäp vaø nuoâi caáy teá baøo ung thö coå töû cung

-

-

-

-

-

Trypsin – EDTA Trypsin 0,25% vt 25ml EDTA 1% vt 500µm PBS vt 24ml o Baûo quaûn laïnh ôû 4 C. Pen – Strep 200X Penicilin G 1.000.000 ñôn vò Streptomycin 1g sulfate Loïc voâ truøng baèng microfilter 0,45 – 0,22µm Baûo quaûn laïnh – 20oC Gentamicin Gentamycin 80mg/2ml Loïc voâ truøng baèng microfilter 0,45 – 0,22µm Baûo quaûn laïnh – 20oC. Ampotericin B Ampotericin B 50mg Nöôùc caát 10ml Loïc voâ truøng baèng microfilter 0,45 – 0,22µm Baûo quaûn laïnh ôû 4oC. Moâi tröôøng DMEM (Dulbecco’s modification of Eagle’s medium) vôùi huyeát thanh 10%. L-Arginine HCl 84 mg/l L-cystine 48 L-glutamic acid 75 L-glutamine 584 Glycine 30 42 L-histidine.HCl.H2O L-isoleucine 105 L-leucine 105 L-lysine.HCl 146 L-methionine 30 L-phenylalanine 66 L-serine 42 L-threonine 95 L-tryptophan 16 L-tyrosine 72 L-valine 94 200 CaCl2 0,10 Fe(NO3)3.9H2O KCl 400

Taï 50 Ngoïc Tuyeát Minh

Thöû nghieäm phaân laäp vaø nuoâi caáy teá baøo ung thö coå töû cung

MgSO4.7H2O 200 NaCl 6400 3700 NaHCO3 125 Na2HPO4.H2O D-Ca pantothenate 4 Choline chloride 4 Folic acid 4 i-insitol 7,2 Nicotinamide 4 Pyridoxal HCl 4 Riboflavin 0,4 Thiamine HCl 4 D-Glucose 4500 Phenol red 15 Sodium pyruvate 110 Boå sung huyeát thanh FBS (Fetal Bovine Serum) 10%

2. PHÖÔNG PHAÙP NGHIEÂN CÖÙU ÑEÅ TAÙCH TEÁ BAØO UNG THÖ 2.1. Caùc yeáu toá caàn ñöôïc khaûo saùt -

Taùch teá baøo ung thö coå töû cung baèng phöông phaùp cô hoïc. - Taùch teá baøo ung thö coå töû cung baèng quy trình Trypsin aám. - Khaûo saùt thôøi gian khuaáy maûnh moâ. - Thöû nghieäm nuoâi caáy sô caáp teá baøo ung thö coå töû cung. 2.2. Trình töï thí nghieäm Böôùc 1: Thu nhaän maãu vaø ghi nhaän caùc thoâng tin lieân quan ñeán maãu vaät, bao goàm: - Teân tuoåi ngöôøi cho maãu - Chaån ñoaùn giai ñoaïn beänh - Thôøi gian laáy maãu (ngaøy, giôø) - Thôøi gian tieán haønh thao taùc taïi phoøng thí nghieäm Böôùc 2: Tieán haønh chieáu UV khöû truøng tuû caáy, maãu, duïng cuï vaø hoùa chaát (haáp khöû truøng neáu caàn) Böôùc 3: Tieán haønh taùch teá baøo töø maãu moâ baèng phöông phaùp cô hoïc hoaëc baèng quy trình Trypsin aám. Böôùc 4: Thöû laïi quy trình taùch teá baøo baèng caùch thay ñoåi noàng ñoä Trypsin ghi nhaän maät ñoä teá baøo theo thôøi gian. Böôùc 5: Thöû nghieäm nuoâi caáy sô caáp teá baøo.

Taï 51 Ngoïc Tuyeát Minh

Thöû nghieäm phaân laäp vaø nuoâi caáy teá baøo ung thö coå töû cung

2.3. Caùc quy trình chính söû duïng trong thöïc nghieäm. 2.3.1. Quy trình voâ truøng 2.3.1.1. Duïng cuï – Hoùa chaát -

-

a) Duïng cuï Duïng cuï baèng thuûy tinh vaø kim loaïi ñöôïc voâ truøng baèng caùch haáp khöû truøng hôi nöôùc vôùi autoclave (121oC ôû 1 atm trong 30 phuùt). Duïng cuï nhöïa: lau baèng coàn 70o, ñeå khoâ töï nhieân vaø chieáu UV 30 phuùt tröôùc khi söû duïng. b) Hoùa chaát PBS, nöôùc caát: haáp khöû truøng hôi nöôùc Moâi tröôøng DMEM, enzym Trypsin: loïc voâ truøng. c) Thao taùc loïc voâ truøng Duøng moät oáng tieâm môùi (khoâng caàn kim tieâm) hoaëc oáng huùt laáy dung dòch caàn loïc. Môû bao bì filter, tra ñaàu oáng tieâm vaøo ñaàu filter, nhaác filter ra khoûi bao bì. EÙp Piston hoaëc bao cao su ñeå dòch loïc chaûy vaøo moät bình chöùa voâ truøng. Ñaët mieáng loïc trôû laïi bao bì, ruùt oáng tieâm ra, tieáp tuïc huùt dung dòch ñeå loïc neáu caàn thieát. 2.3.2. Quy trình xöû lyù maãu moâ taïi phoøng khaùm beänh vieän Ung Böôùu.

Taï 52 Ngoïc Tuyeát Minh

Thöû nghieäm phaân laäp vaø nuoâi caáy teá baøo ung thö coå töû cung

Chaån ñoaùn giai ñoaïn beänh baèng moû vòt

Baám maãu sinh thieát

Ghi nhaän thoâng tin maãu, thôøi gian thu maãu

Röûa maãu qua dung dòch PBSA coù khaùng sinh Penicillin – Streptomycin trong 10 phuùt

Röûa maãu qua dung dòch PBSA coù khaùng sinh Gentamycin – Ampotericin B trong 10 phuùt

Tröõ maãu trong eppendorf chöùa saün 1ml moâi tröôøng DMEM coù huyeát thanh FBS 10%

Tröõ eppendorf ôû nhieät ñoä 4oC

Chuù yù: Nhöõng thao taùc treân ñöôïc tieán haønh trong ñieàu kieän khoâng voâ truøng, vì vaäy deã daøng xaûy ra söï nhieãm vi sinh vaät vaøo maãu vaät. Ñeå traùnh ñöôïc söï nhieãm thì caùc duïng cuï vaø dung dòch phaûi ñöôïc voâ truøng, thao taùc xöû lyù maãu phaûi nhanh vaø ñöôïc thöïc hieän gaàn ñeøn coàn. Vieäc söû duïng khaùng sinh trong dung dòch PBSA ñeå röûa maãu nhaèm muïc ñích coù theå loaïi boû hoaëc giaûm söï nhieãm vi sinh vaät vaøo maãu vaät. 2.3.2. Quy trình taùch teá baøo baèng quy trình trypsin aám. (a) Chuyeån maãu ñöôïc tröõ trong eppendorf coù chöùa moâi tröôøng DMEM 10% FBS vaøo ñóa petri (ñöôøng kính10cm). (b) Röûa maãu baèng PBSA coù khaùng sinh Gentamycin – Ampotericin B töø 2 – 3 laàn ñeå laøm saïch maãu. (c) Söû duïng keùo cong hoaëc thaúng caét maãu moâ ra thaønh töøng maõnh nhoû, tieáp tuïc caét nhuyeãn caùc maõnh moâ.

Taï 53 Ngoïc Tuyeát Minh

Thöû nghieäm phaân laäp vaø nuoâi caáy teá baøo ung thö coå töû cung

(d) Chuyeån nhöõng maõnh moâ ñaõ caét nhoû vaøo erlen 50ml, theâm vaøo 5ml TrypsinEDTA. (e) Khuaáy töø ôû nhieät ñoä 37oC töø 15 – 60 phuùt, khaûo saùt maät ñoä teá baøo theo thôøi gian. (f) Sau 15 phuùt laáy erlen ra khoûi maùy khuaáy töø, ñeå yeân trong voøng 2 -3 phuùt. Huùt phaàn dung dòch noåi phía treân cho vaøo oáng ly taâm, ñem ly taâm 1000v/ 5 phuùt. (g) Phaàn maãu coøn laïi trong erlen tieáp tuïc khuaáy ôû 37oC. Sau 15 phuùt seõ tieán haønh thao taùc nhö phaàn (f) cho ñeán khi naøo thu ñöôïc toaøn boä löôïng teá baøo caàn thieát. (h) Sau khi ly taâm 1000v/ 5 phuùt, loaïi boû phaàn noåi, sau ñoù theâm vaøo 5ml moâi tröôøng DMEM 10% FBS. (i) Ñeám maät ñoä teá baøo ung thö (tröø teá baøo maùu, hoàng caàu, baïch caàu …). (j) Cho maãu vaøo gieáng nuoâi trong tuû aám 37oC, 5% CO2. (k) Quan saùt keát quaû sau 24 giôø, 48 giôø, 76 giôø … 2.3.3. Quy trình taùch teá baøo baèng phöông phaùp cô hoïc. (a) Chuyeån maãu ñöôïc tröõ trong eppendorf coù chöùa moâi tröôøng DMEM 10% FBS vaøo ñóa petri (ñöôøng kính10cm). (b) Röûa maãu baèng PBSA coù khaùng sinh Gentamycin – Ampotericin B töø 2 – 3 laàn ñeå laøm saïch maãu. (c) Söû duïng keùo cong hoaëc thaúng caét maãu moâ ra thaønh töøng maõnh nhoû, tieáp tuïc caét nhuyeãn caùc maõnh moâ. (d) Theâm vaøo ñóa petri 1ml FBS, chuyeån nhöõng maõnh moâ vaøo bình roux. (e) Ñeå yeân trong voøng 24 giôø, ñeå giuùp cho söï baùm teá baøo ñöôïc xaûy ra. (f) Theâm vaøo 5ml moâi tröôøng DMEM, cho vaøo tuû aám 37oC, 5% CO2. (g) Quan saùt keát quaû sau 24 giôø, 48 giôø, …

Taï 54 Ngoïc Tuyeát Minh

Thöû nghieäm phaân laäp vaø nuoâi caáy teá baøo ung thö coå töû cung

Hình 15: Maãu sinh thieát ñöôïc tröõ trong eppendorf chöùa 1ml moâi tröôøng DMEM coù huyeát thanh FBS 10%

Hình 16: Chuyeån maãu ñöôïc tröõ trong eppendorf coù chöùa moâi tröôøng DMEM 10% FBS vaøo ñóa petri

Hình 17: Söû duïng keùo cong hoaëc thaúng caét nhuyeãn maãu moâ Khuaáy töø ôû nhieät ñoä 37oC töø 15 – 60 phuùt, khaûo saùt maät ñoä teá baøo theo thôøi gian

Theâm vaøo ñóa petri 1ml FBS, chuyeån nhöõng maõnh moâ vaøo bình roux

.

Hình 18: Huùt maãu sau khi khuaáy cho vaøo oáng ly taâm

Taï 55 Ngoïc Tuyeát Minh

Hình 19: Chuyeån nhöõng maõnh moâ vaøo bình roux

Thöû nghieäm phaân laäp vaø nuoâi caáy teá baøo ung thö coå töû cung

Hình 20: Ñem ly taâm 1000v/ 5 phuùt

Hình 21: Cho bình roux vaøo tuû aám 37oC, 5% CO2

Hình 22: Cho maãu vaøo gieáng nuoâi ñaët trong tuû aám 37oC, 5% CO2

2.3.4. Phöông phaùp xaùc ñònh maät ñoä teá baøo baèng phoøng ñeám NEUBAUER -

Röûa phoøng ñeám baèng nöôùc caát Saáy khoâ Röûa laïi phoøng ñeám baèng coàn 70oC Saáy khoâ Ñaët lamelle leân phoøng ñeám Ñoùng bôùt chaén saùng Xaùc ñònh thò tröôøng phoøng ñeám döôùi kính hieån vi quang hoïc Cho maãu vaøo phoøng ñeám Xaùc ñònh maät ñoä teá baøo theo quy taéc ñeám phía treân, beân phaûi cuûa caùc oâ trong phoøng ñeám Phoøng ñeám goàm 9 oâ lôùn Moãi oâ lôùn goàm 16 oâ nhoû Ñeám soá teá baøo trong 5 oâ lôùn (Vuøng 1,2,3,4,5) Moãi oâ lôùn coù theå tích: 1 x 1 x 0,1 = 0,1 mm3 = 10-4 ml Maät ñoä teá baøo = (soá teá baøo cuûa 5 oâ lôùn / 5) x 104 (soá teá baøo/ ml)

Taï 56 Ngoïc Tuyeát Minh

Thöû nghieäm phaân laäp vaø nuoâi caáy teá baøo ung thö coå töû cung

Hình 23: Caùc vò trí xaùc ñònh soá teá baøo treân phoøng ñeám

1. KEÁT QUAÛ KHAÛO SAÙT KHAÛ NAÊNG TAÙCH TEÁ BAØO UNG THÖ COÅ TÖÛ CUNG BAÈNG MAÙY LAÉC ÔÛ BA NOÀNG ÑOÄ TRYPSIN KHAÙC NHAU Baûng 2: Thoâng tin veà nguoàn maãu

Chaån ñoaùn giai ñoaïn Tuoåi ngöôøi cho maãu Thôøi ñieåm phaãu thuaät Thôøi ñieåm tieán haønh thí nghieäm

Maãu 1 IIA 77 8 giôø 5 phuùt 13 giôø 30 phuùt

Maãu 2 IIA 58 8 giôø 30 phuùt 13giôø 30 phuùt

Maãu 3 IIB 60 9 giôø 5 phuùt 13 giôø 30 phuùt

Baûng 3: Maät ñoä teá baøo ung thö coå töû cung taïi caùc thôøi ñieåm khuaáy Thôøi gian khuaáy (phuùt) 30 60

Taï 57 Ngoïc Tuyeát Minh

Maät ñoä teá baøo (STBx104/ml) Maãu 1 khuaáy vôùi Maãu 2 khuaáy vôùi Maãu 3 khuaáy vôùi Trypsin 0,125% Trypsin 0,25% Trypsin 0,5% 6 11 15 10 21 35

Thöû nghieäm phaân laäp vaø nuoâi caáy teá baøo ung thö coå töû cung

90 120

15 26

28 37 59

60

Maät ñoä teá baøo (STBx104)

47 59

47

50 35

37

40 28

26

30

60 phuù t

21 20

15 11

10 10

30 phuù t

15

90 phuù t 120 phuù t

6

0 Maã u 1

Maã u 2

Maã u 3

Bieåu ñoà 1: Maät ñoä teá baøo ung thö coå töû cung thu ñöôïc theo thôøi gian laéc

Baûng 2 vaø bieåu ñoà 1 cho thaáy: -

Khi ta caét maãu moâ thaønh nhöõng maõnh nhoû, khaûo saùt maät ñoä teá baøo thu ñöôïc baèng caùch söû duïng maùy laéc vôùi 3 noàng ñoä trypsin khaùc nhau (0,125%, 0,25%, 0,5%). Vôùi ba noàng ñoä treân, sau khi laéc 120 phuùt maät ñoä teá baøo thu ñöôïc chöa ñeán möùc cao nhaát. Ñieàu naøy cho thaáy raèng vieäc söû duïng maùy laéc taùc ñoäng ñeán söï taùch rôøi caùc teá baøo phaûi toán moät khoaûng thôøi gian khaù daøi, seõ aûnh höôûng ñeán thôøi gian thí nghieäm.

-

Do ñoù chuùng toâi ñaõ tieán haønh khaûo saùt cuõng vôùi ba noàng ñoä trypsin treân baèng phöông phaùp khuaáy töø ôû nhieät ñoä 37oC.

2. KEÁT QUAÛ KHAÛO SAÙT KHAÛ NAÊNG TAÙCH TEÁ BAØO UNG THÖ COÅ TÖÛ CUNG BAÈNG MAÙY KHUAÁY TÖØ ÔÛ 37OC VÔÙI BA NOÀNG ÑOÄ TRYPSIN KHAÙC NHAU Baûng 4: Thoâng tin veà nguoàn maãu Chaån ñoaùn giai ñoaïn Tuoåi ngöôøi cho maãu Thôøi ñieåm phaãu thuaät

Taï 58 Ngoïc Tuyeát Minh

Maãu 1 IB 57 8 giôø 15 phuùt

Maãu 2 IIA 68 8 giôø 20 phuùt

Maãu 3 IIB 48 8 giôø 30 phuùt

Thöû nghieäm phaân laäp vaø nuoâi caáy teá baøo ung thö coå töû cung

Thôøi ñieåm tieán haønh thí nghieäm

13 giôø 5 phuùt

13giôø 5 phuùt

13 giôø 5 phuùt

Baûng 5: Maät ñoä teá baøo ung thö coå töû cung taïi caùc thôøi ñieåm khuaáy Thôøi gian khuaáy (phuùt)

30 60

Maät ñoä teá baøo (STBx104/ml) Maãu 1 khuaáy vôùi Maãu 2 khuaáy vôùi Maãu 3 khuaáy Trypsin 0,125% Trypsin 0,25% vôùi Trypsin 0,5% 13 27 35 22 30 82

90 120

27 30

60 47

82

90

Maät ñoä teá baøo (STBx104)

67 43

80 67

70

60

60

47

50 40 30 20

22

27 30

27 30

43 35

30 phuù t 60 phuù t 90 phuù t 120 phuù t

13

10 0 Maã u 1

Maã u 2

Maã u 3

Bieåu ñoà 2: Maät ñoä teá baøo ung thö coå töû cung thu ñöôïc theo thôøi gian khuaáy Baûng 4 vaø bieåu ñoà 2 cho thaáy: -

Maãu 1: khi khuaáy vôùi trypsin 0,125%, sau 120 phuùt khuaáy maät ñoä teá baøo khoâng ñaït ñeán möùc cao nhaát, ñieàu naøy seõ aûnh höôûng ñeán thôøi gian thí nghieäm.

-

Maãu 2: khi khuaáy vôùi trypsin 0,25%, sau 90 phuùt khuaáy maät ñoä teá baøo ñaït ñeán möùc cao nhaát. ÔÛ noàng ñoä trypsin 0,25%, tyû leä teá baøo soáng laø 98%.

-

Maãu 3: khi khuaáy vôùi trypsin 0,5%, sau 60 phuùt maät ñoä teá baøo ñaït ñeán möùc cao nhaát, tyû leä teá baøo soáng laø 85%.

Qua keát quaû treân chuùng toâi choïn noàng ñoä trypsin 0,25%. Maëc duø thôøi gian khuaáy ñeå ñaït ñöôïc maät ñoä teá baøo laø 90 phuùt nhöng tyû leä teá baøo soáng cao.

Taï 59 Ngoïc Tuyeát Minh

Thöû nghieäm phaân laäp vaø nuoâi caáy teá baøo ung thö coå töû cung

3. KEÁT QUAÛ KHAÛO SAÙT KHAÛ NAÊNG TAÙCH TEÁ BAØO UNG THÖ COÅ TÖÛ CUNG ÔÛ NOÀNG ÑOÄ TRYPSIN 0,25% Baûng 6: Thoâng tin veà nguoàn maãu Maãu 1 Maãu 2 Chaån ñoaùn giai ñoaïn IIB IIA Tuoåi ngöôøi cho maãu 55 56 Thôøi ñieåm phaãu 8 giôø 15 phuùt 8 giôø 30 phuùt thuaät Thôøi ñieåm tieán haønh 13 giôø 30 phuùt 13giôø 30 phuùt thí nghieäm

Maãu 3 IIB 76 9 giôø 10 phuùt 13 giôø 30 phuùt

Baûng 7: Maät ñoä teá baøo ung thö coå töû cung taïi caùc thôøi ñieåm khuaáy Maät ñoä teá baøo (STBx104/ml) Thôøi gian khuaáy (phuùt) Maãu 1 Maãu 2 Maãu 3 30 13 95 15 60 24 113 35 90 120

37 23

168 137

180

59 46

168

Maät ñoä teá baøo (STBx104)

160 137

140 113

120

30 phuù t

95

100

60 phuù t

80

59

60

37

40 20

24 13

35 23

46

90 phuù t 120 phuù t

15

0 Maã u 1

Maã u 2

Maã u 3

Bieåu ñoà 3: Maät ñoä teá baøo ung thö coå töû cung thu ñöôïc theo thôøi gian khuaáy Baûng 6 vaø bieåu ñoà 3 cho thaáy: -

Khi khuaáy vôùi noàng ñoä trypsin 0,25% ôû ba maãu 1, 2, 3, sau 90 phuùt maät ñoä teá baøo ñeàu ñaït ñeán möùc cao nhaát, tyû leä teá baøo soáng laø 95% - 98%.

Taï 60 Ngoïc Tuyeát Minh

Thöû nghieäm phaân laäp vaø nuoâi caáy teá baøo ung thö coå töû cung

-

Chuùng toâi ñaõ khaéc phuïc khuyeát ñieåm veà thôøi gian khuaáy baèng caùch tieán haønh thí nghieäm khuaáy vôùi noàng ñoä trypsin 0,25%, vaø theâm vaøo EDTA (chaát neàn giuùp cho taùc ñoäng trypsin leân söï taùch caùc teá baøo coù hieäu quaû vaø nhanh hôn) vôùi tyû leä EDTA:Trypsin laø 1:4.

4. KEÁT QUAÛ KHAÛO SAÙT KHAÛ NAÊNG TAÙCH TEÁ BAØO UNG THÖ COÅ TÖÛ CUNG BAÈNG PHÖÔNG PHAÙP KHUAÁY TÖØ GIA NHIEÄT VÔÙI NOÀNG ÑOÄ TRYPSIN 0,25% + EDTA 0,02%. Baûng 8: Thoâng tin veà nguoàn maãu Chaån ñoaùn giai ñoaïn Tuoåi ngöôøi cho maãu Thôøi ñieåm phaãu thuaät Thôøi ñieåm tieán haønh thí nghieäm

Maãu 1 IIA 41 8 giôø 50 phuùt 14 giôø 00 phuùt

Maãu 2 IB 55 9 giôø 00 phuùt 14 giôø 00 phuùt

Maãu 3 IB 44 9 giôø 15 phuùt 14 giôø 00 phuùt

Baûng 9: Maät ñoä teá baøo ung thö coå töû cung taïi caùc thôøi ñieåm khuaáy Maät ñoä teá baøo (STBx104/ml) Thôøi gian khuaáy (phuùt) Maãu 1 Maãu 2 Maãu 3 15 28 11 13 30 38 23 25 45 60 90

Taï 61 Ngoïc Tuyeát Minh

48 64 54

33 36 27

29 35 31

Thöû nghieäm phaân laäp vaø nuoâi caáy teá baøo ung thö coå töû cung

70

64

Maät ñoä teá baøo (STBx104)

60

54 48

50

30

15 phuù t

38

40

33

28

23

20

36

35 27

25

29

31

45 phuù t 60 phuù t

13

11

30 phuù t

90 phuù t

10 0 Maã u 1

Maã u 2

Maã u 3

Bieåu ñoà 4: Maät ñoä teá baøo ung thö coå töû cung thu ñöôïc theo thôøi gian khuaáy Baûng 9: Thoâng tin veà nguoàn maãu

Chaån ñoaùn giai ñoaïn Tuoåi ngöôøi cho maãu Thôøi ñieåm phaãu thuaät Thôøi ñieåm tieán haønh thí nghieäm

Maãu 4 IIB 51 8 giôø 30 phuùt 14 giôø 00 phuùt

Maãu 5 IIB 52 9 giôø 15 phuùt 14 giôø 00 phuùt

Maãu 6 IB 50 9 giôø 30 phuùt 14 giôø 00 phuùt

Baûng 10: Maät ñoä teá baøo ung thö coå töû cung taïi caùc thôøi ñieåm khuaáy Thôøi gian khuaáy (phuùt) 15 30 45 60 90

Taï 62 Ngoïc Tuyeát Minh

Maãu 4 122 153

Maät ñoä teá baøo (STBx104/ml) Maãu 5 66 92

Maãu 6 14 16

180 235 201

142 188 145

23 36 32

Thöû nghieäm phaân laäp vaø nuoâi caáy teá baøo ung thö coå töû cung

Maät ñoä teá baøo (STBx104)

250

235 201

200

188

180 153

150

142

15 phuù t

145

30 phuù t

122

45 phuù t

92

100

60 phuù t

66 50 14 16

23

36 32

90 phuù t

0 Maã u 4

Maã u 5

Maã u 6

Bieåu ñoà 5: Maät ñoä teá baøo ung thö coå töû cung thu ñöôïc theo thôøi gian khuaáy Baûng 11: Thoâng tin veà nguoàn maãu

Chaån ñoaùn giai ñoaïn Tuoåi ngöôøi cho maãu Thôøi ñieåm phaãu thuaät Thôøi ñieåm tieán haønh thí nghieäm

Maãu 7 IIA 38 8 giôø 45 phuùt 14 giôø 00 phuùt

Maãu 8 IIB 56 9 giôø 25 phuùt 14 giôø 00 phuùt

Maãu 9 IIA 43 9 giôø 35 phuùt 14 giôø 00 phuùt

Baûng 12: Maät ñoä teá baøo ung thö coå töû cung taïi caùc thôøi ñieåm khuaáy Thôøi gian khuaáy (phuùt) 15 30 45 60 90

Taï 63 Ngoïc Tuyeát Minh

Maãu 7 38 55

Maät ñoä teá baøo (STBx104/ml) Maãu 8 35 68

Maãu 9 25 43

69 86 67

85 104 92

68 78 59

Thöû nghieäm phaân laäp vaø nuoâi caáy teá baøo ung thö coå töû cung

120 104

Maät ñoä teá baøo (STBx104)

100 80

69

85

78

67

15 phuù t

68

68

59

55

60 40

92

86

43

38

35

30 phuù t 45 phuù t 60 phuù t

25

90 phuù t

20 0 Maã u 7

Maã u 8

Maã u 9

Bieåu ñoà 6: Maät ñoä teá baøo ung thö coå töû cung thu ñöôïc theo thôøi gian khuaáy

Baûng 13: Thoâng tin veà nguoàn maãu Maãu 10 IIA 56 10 giôø 10 phuùt 14 giôø 30 phuùt

Chaån ñoaùn giai ñoaïn Tuoåi ngöôøi cho maãu Thôøi ñieåm phaãu thuaät Thôøi ñieåm tieán haønh thí nghieäm

Maãu 11 IB 45 9 giôø 30 phuùt

Maãu 12 IIB 57 9 giôø 45 phuùt

14 giôø 30 phuùt

14 giôø 30 phuùt

Baûng 14: Maät ñoä teá baøo ung thö coå töû cung taïi caùc thôøi ñieåm khuaáy Thôøi gian khuaáy (phuùt) 15 30 45 60 90

Taï 64 Ngoïc Tuyeát Minh

Maät ñoä teá baøo (STBx104/ml) Maãu 10 Maãu 11 Maãu 12 37 13 50 42 26 72 53 69 49

35 41 29

88 125 97

Thöû nghieäm phaân laäp vaø nuoâi caáy teá baøo ung thö coå töû cung

140

125

Maät ñoä teá baøo (STBx104)

120 97

100

88

80 60 40

72

69

37

42

53

49 26

35

30 phuù t 45 phuù t

50

41

15 phuù t

60 phuù t

29

90 phuù t

13

20 0 Maã u 10

Maã u 11

Maã u 12

Bieåu ñoà 7: Maät ñoä teá baøo ung thö coå töû cung thu ñöôïc theo thôøi gian khuaáy

Baûng 15: Thoâng tin veà nguoàn maãu

Chaån ñoaùn giai ñoaïn Tuoåi ngöôøi cho maãu Thôøi ñieåm phaãu thuaät Thôøi ñieåm tieán haønh thí nghieäm

Maãu 13 IIA 49 8 giôø 15 phuùt

Maãu 14 IIB 49 9 giôø 30 phuùt

Maãu 15 IIB 69 8 giôø 45 phuùt

13 giôø 30 phuùt

13 giôø 30 phuùt

13 giôø 30 phuùt

Baûng 16: Maät ñoä teá baøo ung thö coå töû cung taïi caùc thôøi ñieåm khuaáy Thôøi gian khuaáy (phuùt) 15 30 45 60 90

Taï 65 Ngoïc Tuyeát Minh

Maãu 13

Maät ñoä teá baøo (STBx104/ml) Maãu 14

Maãu 15

27 35

78 92

62 86

59 79 62

123 158 119

99 120 102

Thöû nghieäm phaân laäp vaø nuoâi caáy teá baøo ung thö coå töû cung

158

160

Maät ñoä teá baøo (STBx104)

140

123

120

99

92

100

27

15 phuù t 30 phuù t 45 phuù t

62

62

59

60

102

86

78

79

80

40

120

119

60 phuù t

35

90 phuù t

20 0 Maã u 13

Maã u 14

Maã u 15

Bieåu ñoà 8: Maät ñoä teá baøo ung thö coå töû cung thu ñöôïc theo thôøi gian khuaáy

Baûng 17: Thoâng tin veà nguoàn maãu

Chaån ñoaùn giai ñoaïn Tuoåi ngöôøi cho maãu Thôøi ñieåm phaãu thuaät Thôøi ñieåm tieán haønh thí nghieäm

Maãu 16 IB 49 9 giôø 15 phuùt

Maãu 17 IIB 49 9 giôø 30 phuùt

Maãu 18 IIA 69 9 giôø 40 phuùt

13 giôø 30 phuùt

13 giôø 30 phuùt

13 giôø 30 phuùt

Baûng 18: Maät ñoä teá baøo ung thö coå töû cung taïi caùc thôøi ñieåm khuaáy Thôøi gian khuaáy (phuùt) 15 30 45 60 90

Taï 66 Ngoïc Tuyeát Minh

Maãu 16 17 22

Maät ñoä teá baøo (STBx104/ml) Maãu 17 33 56

Maãu 18 20 42

23 39 29

75 91 79

58 72 67

Thöû nghieäm phaân laäp vaø nuoâi caáy teá baøo ung thö coå töû cung

100

91

Maät ñoä teá baøo (STBx104)

90 75

80

79 72

70 50

20

42

39

40 30

58

56

60

17

29

22 23

67

33

15 phuùt 30 phuùt 45 phuùt 60 phuùt

20

90 phuùt

10 0 Maã u 16

Maã u 17

Maã u 18

Bieåu ñoà 9: Maät ñoä teá baøo ung thö coå töû cung thu ñöôïc theo thôøi gian khuaáy

Baûng 19: Thoâng tin veà nguoàn maãu

Chaån ñoaùn giai ñoaïn Tuoåi ngöôøi cho maãu Thôøi ñieåm phaãu thuaät Thôøi ñieåm tieán haønh thí nghieäm

Maãu 19 IIA 60 8 giôø 15 phuùt 13 giôø 30 phuùt

Maãu 20 IIA 41 8 giôø 20 phuùt 13 giôø 30 phuùt

Maãu 21 IB 64 8 giôø 35 phuùt 13 giôø 30 phuùt

Baûng 20: Maät ñoä teá baøo ung thö coå töû cung taïi caùc thôøi ñieåm khuaáy Thôøi gian khuaáy (phuùt) 15 30 45 60 90

Taï 67 Ngoïc Tuyeát Minh

Maãu 19 22 38

Maät ñoä teá baøo (STBx104/ml) Maãu 20 38 42

Maãu 21 12 26

69 89 72

73 98 79

39 40 32

Thöû nghieäm phaân laäp vaø nuoâi caáy teá baøo ung thö coå töû cung

98

100

89

Maät ñoä teá baøo (STBx104)

90

79

80

69

70

73

72

15 phuù t

60 50

38

40 30

38

30 phuù t

42

39 40

32

26

22

20

45 phuù t 60 phuù t 90 phuù t

12

10 0 Maã u 19

Maã u 20

Maã u 21

Bieåu ñoà 10: Maät ñoä teá baøo ung thö coå töû cung thu ñöôïc theo thôøi gian khuaáy.

Baûng 21: Thoâng tin veà nguoàn maãu Chaån ñoaùn giai ñoaïn Tuoåi ngöôøi cho maãu Thôøi ñieåm phaãu thuaät Thôøi ñieåm tieán haønh thí nghieäm

Maãu 22 IIA 70 8 giôø 45 phuùt 14 giôø 30 phuùt

Maãu 23 IB 45 9 giôø phuùt 14 giôø 30 phuùt

Maãu 24 IB 57 9 giôø 10 phuùt 14 giôø 30 phuùt

Baûng 22: Maät ñoä teá baøo ung thö coå töû cung taïi caùc thôøi ñieåm khuaáy Thôøi gian khuaáy (phuùt) 15 30 45 60 90

Taï 68 Ngoïc Tuyeát Minh

Maãu 22

Maät ñoä teá baøo (STBx104/ml) Maãu 23

Maãu 24

39 55

15 28

14 23

79 96 87

35 44 32

28 38 29

Thöû nghieäm phaân laäp vaø nuoâi caáy teá baøo ung thö coå töû cung

96

100

87

Maät ñoä teá baøo (STBx104)

90

79

80 70 50 40

15 phuù t

55

60

30 phuù t

44

39 28

30

35

15

20

45 phuù t

38

32 23

28

29

14

60 phuù t 90 phuù t

10 0 Maã u 22

Maã u 23

Maã u 24

Bieåu ñoà 11: Maät ñoä teá baøo ung thö coå töû cung thu ñöôïc theo thôøi gian khuaáy

Baûng 23: Thoâng tin veà nguoàn maãu Maãu 25 IB 44 8 giôø 15 phuùt 14 giôø 30 phuùt

Chaån ñoaùn giai ñoaïn Tuoåi ngöôøi cho maãu Thôøi ñieåm phaãu thuaät Thôøi ñieåm tieán haønh thí nghieäm

Maãu 26 IB 58 8 giôø 30 phuùt 14 giôø 30 phuùt

Maãu 27 IB 56 8 giôø 45 phuùt 14 giôø 30 phuùt

Baûng 24: Maät ñoä teá baøo ung thö coå töû cung taïi caùc thôøi ñieåm khuaáy Thôøi gian khuaáy (phuùt) 15 30 45 60 90

Taï 69 Ngoïc Tuyeát Minh

Maãu 25 12 15

Maät ñoä teá baøo (STBx104/ml) Maãu 26 22 28

Maãu 27 14 23

28 35 21

32 39 25

26 37 32

Thöû nghieäm phaân laäp vaø nuoâi caáy teá baøo ung thö coå töû cung

39

40

Maät ñoä teá baøo (STBx104)

35

32

32 28

28

30

26

25

25

21

20 15

37

35

23

22

15 phuù t 30 phuù t

15

14

12

10

45 phuù t 60 phuù t 90 phuù t

5 0 Maã u 25

Maã u 26

Maã u 27

Bieåu ñoà 12: Maät ñoä teá baøo ung thö coå töû cung thu ñöôïc theo thôøi gian khuaáy

Baûng 25: Thoâng tin veà nguoàn maãu Chaån ñoaùn giai ñoaïn Tuoåi ngöôøi cho maãu Thôøi ñieåm phaãu thuaät Thôøi ñieåm tieán haønh thí nghieäm

Maãu 28 IIB 68 8 giôø 30 phuùt 14 giôø 30 phuùt

Maãu 29 IIB 49 8 giôø 20 phuùt 14 giôø 30 phuùt

Maãu 30 IIA 64 8 giôø 45 phuùt 14 giôø 30 phuùt

Baûng 26: Maät ñoä teá baøo ung thö coå töû cung taïi caùc thôøi ñieåm khuaáy Thôøi gian khuaáy (phuùt) 15 30 45 60 90

Taï 70 Ngoïc Tuyeát Minh

Maãu 28 42 58

Maät ñoä teá baøo (STBx104/ml) Maãu 29 38 52

Maãu 30 32 46

67 89 72

73 96 79

59 70 62

Thöû nghieäm phaân laäp vaø nuoâi caáy teá baøo ung thö coå töû cung

96

100

89

Maät ñoä teá baøo (STBx104)

90

79

80

67

70

73

72

59

58

60 50

42

40

70

52

62

15 phuù t 30 phuù t

46

45 phuù t

38 32

60 phuù t

30

90 phuù t

20 10 0 Maã u 28

Maã u 29

Maã u 30

Bieåu ñoà 13: Maät ñoä teá baøo ung thö coå töû cung thu ñöôïc theo thôøi gian khuaáy Caùc keát quaû khaûo saùt khaû naêng taùch teá baøo ung thö coå töû cung baèng phöông phaùp khuaáy töø gia nhieät vôùi noàng ñoä trypsin 0,25% - EDTA 0,02% ñöôïc trình baøy ôû treân cho thaáy: -

Maät ñoä teá baøo taêng daàn trong khoaûng thôøi gian khuaáy töø 15 – 45 phuùt, vaø sau khi khuaáy 60 phuùt maät ñoä teá baøo ñaït möùc cao nhaát. Neáu tieáp tuïc khuaáy thì maät ñoä teá baøo giaûm daàn.

-

Vôùi thôøi gian vaø maät ñoä thu ñöôïc nhö treân coù theå thieát laäp quy trình phuø hôïp ñeå coù theå thu nhaän hoaøn toaøn toång soá löôïng teá baøo. Sau khi khuaáy 30 phuùt tieán haønh thu teá baøo laàn moät, tieáp tuïc ñeå khuaáy tieáp töø 15 phuùt – 30 phuùt cho ñeán khi caùc teá baøo ñöôïc taùch rôøi hoaøn toaøn, tieán haønh thu teá baøo laàn hai. Nhö vaäy vôùi noàng ñoä trypsin laø 0,25% vaø EDTA 0,02% vaø thôøi gian khuaáy töø 15 – 60 phuùt, coù theå thu ñöôïc maät ñoä teá baøo töø 1x105 – 5x106 ñeå tieán haønh nuoâi caáy sô caáp.

-

Moät ñieàu ñaùng chuù yù laø ta thaáy coù söï cheânh leäch maät ñoä teá baøo thu ñöôïc sau khi khuaáy giöõa caùc beänh nhaân theo töøng giai ñoaïn beänh.

-

Sau ñaây laø baûng thoáng keâ maät ñoä teá baøo sau khi khuaáy theo töøng giai ñoaïn:

Giai ñoaïn IB: Baûng 27: Maät ñoä teá baøo cuûa maãu beänh phaãm giai ñoaïn IB thu ñöôïc theo thôøi gian khuaáy Thôøi gian khuaáy

15 phuùt

Taï 71 Ngoïc Tuyeát Minh

30 phuùt

45 phuùt

60 phuùt

90 phuùt

Thöû nghieäm phaân laäp vaø nuoâi caáy teá baøo ung thö coå töû cung

Maãu 2 Maãu 3 Maãu 6 Maãu 11 Maãu 16 Maãu 21 Maãu 23 Maãu 24 Maãu 25

11 13 14 13 17 12 15 14 12

23 25 16 26 22 26 28 23 15

33 29 23 35 23 39 35 28 28

36 35 36 41 39 40 44 38 35

27 31 32 29 29 32 32 29 21

Maãu 26 Maãu 27

22 14

28 23

32 26

39 37

25 32

Giai ñoaïn IIA: Baûng 28: Maät ñoä teá baøo cuûa maãu beänh phaãm giai ñoaïn IIA thu ñöôïc theo thôøi gian khuaáy Thôøi gian 15 phuùt 30 phuùt 45 phuùt 60 phuùt 90 phuùt khuaáy Maãu 1 28 38 48 54 64 Maãu 7 38 55 69 67 86 Maãu 9 25 43 68 59 78 Maãu 10 37 42 53 49 69 Maãu 13 27 35 59 62 79 Maãu 18 20 42 58 67 72 Maãu 19 22 38 69 72 89 Maãu 20 Maãu 22 Maãu 30

38 39 32

42 55 46

73 79 59

98 96 70

79 87 62

Giai ñoaïn IIB: Baûng 29: Maät ñoä teá baøo cuûa maãu beänh phaãm giai ñoaïn IIB thu ñöôïc theo thôøi gian khuaáy Thôøi gian 15 phuùt 30 phuùt 45 phuùt 60 phuùt 90 phuùt khuaáy Maãu 5 66 92 142 145 188 Maãu 8 35 68 85 92 104 Maãu12 50 72 88 97 125 Maãu 14 78 92 123 119 158

Taï 72 Ngoïc Tuyeát Minh

Thöû nghieäm phaân laäp vaø nuoâi caáy teá baøo ung thö coå töû cung

Maãu 15 Maãu 17 Maãu 28 Maãu 29

62 33 42 38

86 56 58 52

99 75 67 73

120 91 89 96

102 79 72 79

Bieän luaän: ƒ Trong ñieàu kieän cho pheùp thí nghieäm chæ coù theå söû duïng caùc maãu sinh thieát cuûa beänh nhaân bò toån thöông ung thö ôû caùc giai ñoaïn beänh IB, IIA, IIB. -

Khi quan saùt caùc teá baøo ñöôïc taùch rôøi trong buoàng ñeám treân kính hieån vi ñieån töû, thaáy raèng vaãn coøn hieän dieän hoàng caàu, teá baøo maùu, baïch caàu … Döïa vaøo ñaëc ñieåm teá baøo ung thö ñöôïc ñeà caäp ôû treân, vaø phaân bieät vôùi caùc teá baøo khaùc khoâng phaûi laø teá baøo ung thö ta coù theå ñeám ñöôïc soá löôïng teá baøo ung thö moät caùch töông ñoái.

-

Ôû baûng 18, 19, vaø 20 ñeàu cho thaáy:

ƒ ÔÛ caùc giai ñoaïn beänh khaùc nhau, maät ñoä teá baøo ñeàu taêng daàn theo thôøi gian khuaáy töø 15 phuùt – 40 phuùt, vaø sau khi khuaáy 60 phuùt maät ñoä teá baøo ñaït möùc cao nhaát, vaø neáu tieáp tuïc khuaáy maät ñoä teá baøo seõ giaûm daàn. ƒ Ngoaøi ra, coù söï cheânh leäch maät ñoä teá baøo giöõa caùc giai ñoaïn, ôû giai ñoaïn IIA maät ñoä teá baøo thu ñöôïc thaáp hôn IIB, vaø maät ñoä teá baøo thu ñöôïc ôû IB thaáp hôn so vôùi IIA vaø IIB. Do caùc baûng thoáng keâ treân chæ ñöôïc thöïc hieän treân soá löôïng maãu haïn cheá, coù theå giaûi thích moät caùch töông ñoái cho söï cheânh leäch treân nhö sau: ƒ ÔÛ giai ñoaïn IB,ï ña soá hieän dieän nhieàu caùc teá baøo vieâm (baïch caàu ña nhaân hay ñôn nhaân), soá löôïng teá baøo ung thö toàn taïi ít vaø khoù phaân bieät vôùi teá baøo khaùc do hình thaùi, caáu truùc baát thöôøng cuûa chuùng chöa bieåu hieän roõ. ƒ ÔÛ giai ñoaïn IIA, IIB soá löôïng teá baøo coù hình thaùi, caáu truùc baát thöôøng hieän dieän nhieàu hôn, tính ña dieän cuûa teá baøo theå hieän roõ hôn vaø giuùp phaân bieät roõ hôn vôùi caùc teá baøo khaùc. Nhaän xeùt: -

Qua quaù trình tieán haønh thí nghieäm vaø caùc keát quaû thu ñöôïc, coù theå ruùt ra keát luaän raèng khi khuaáy maãu ôû nhieät ñoä 37oC vôùi dung dòch Trypsin 0,25% - EDTA 0,02% seõ thu ñöôïc maät ñoä teá baøo nhö mong muoán (1x105 – 5x106).

Taï 73 Ngoïc Tuyeát Minh

Thöû nghieäm phaân laäp vaø nuoâi caáy teá baøo ung thö coå töû cung

-

Tuy nhieân, caùc ñieàu kieän laáy nguoàn maãu, nhöõng sai soùt trong quaù trình tieán haønh thí nghieäm ñaõ moät phaàn naøo ñoù aûnh höôûng ñeán keát quaû thí nghieäm.

TAØI LIEÄU THAM KHAÛO TAØI LIEÄU ÑAÕ ÑÖÔÏC XUAÁT BAÛN 1. Nguyeãn Chaán Huøng (2004), Ung böôùu hoïc noäi khoa, NXB Tp.Hoà Chí Minh. 2. Leâ Ñình Oanh (2001), Beänh hoïc caùc khoái u, NXB Haø Noäi. 3. Phan Kim Ngoïc (2002), Giaùo trình thöïc taäp cô sôû Coâng ngheä sinh hoïc ñoäng vaät, NXB Ñaïi hoïc quoác gia Tp.Hoà Chí Minh. 4. Töø ñieån baùch khoa sinh hoïc (2003), NXB Khoa hoïc Kyõ thuaät. 5. Simon P.Langdon (2003), Cancer cell culture, Human Press. 6. George H. Fried (1999), Theory and problem biology, Mc Graw Hill. TAØI LIEÄU TRUY CAÄP QUA INTERNET 7.

Kwasniewska A, Semczuk M, Sikorski M and Kraczkowski J:Use of the Digene Hybrid Capture System for identification of the human papillomavirus (HPV-human papillomavirus) in women with cervical dysplasia. Przegl Lek 54: 848-850, 1997.

8. Ho GY, Bierman R, Beardsley L, Chang CJ and Burk RD: Natural history of cervicovaginal papillomavirus infection in young women. N Engl J Med 338: 423-428, 1998. 9. Saito J, Hoshiai H and Noda K: Type of human papillomavirus and expression of p53 in elderly women with cervical cancer. Gynecol Obstet Invest 49: 190-193, 2000. 10. Stanley MA (1986): Human cervical epithelium. In webber MM, Sekely LI. 11. Stanley MA, Parkinson EK (1979): Growth requirements of human cervical epithelial cells in culture.Int J Cancer 24.

Taï 74 Ngoïc Tuyeát Minh

Thöû nghieäm phaân laäp vaø nuoâi caáy teá baøo ung thö coå töû cung

12. http//www.google.com.vn/search?q=cache:Yvv6UEJ+method+ identification +cervical+carcinoma+cell. 13. http//www.google.com.vn/search?q= cache +hela. 14. http//www.pubmedcentral.nih/gov/article/rapid+induction+of+senescence+in +human+cervical+carcinoma+cell. 15. http//www.pnas.org/cgi/dol/10.1073=cell+culture+forensics.

Taï 75 Ngoïc Tuyeát Minh