Jurnal_milsasolvadiana.docx

Produksi Dan Karakterisasi Enzim Protease Isolat Bacillus sp Sebagai Kandidat Probiotik Dari Hutan Mangrove Desa Marga Sari Lampung Timur [Production and Characterization of Enzyme Protease Isolate Bacillus sp as a Probiotic Candidate of The Forest Mangrove from Marga Sari Village, West Lampung] Sumardi, Salman Farisi, Chiristina Nugroho Ekowati, Milsa Solva Diana E-mail: [email protected] ABSTRAK

Penelitian ini dilakukan untuk mengetahui produksi dan karakterisasi enzim protease dari isolat Bacillus sp (UJ131) yang diisolasi dari kawasan hutan mangrove Desa Marga Sari Lampung Timur. Uji aktivitas enzim dilakukan secara kualitatif dan kuantitatif. Tujuan penelitian ini adalah menentukan produksi optimum enzim dan mengamati karakterisasi enzim meliputi penentuan suhu dan pH optimum, pengaruh beberapa ion logam serta penentuan Km dan Vmaks. Dari hasil percobaan diketahui bahwa enzim protease dihasilkan pada waktu produksi optimum 18 jam yang menghasilkan aktivitas protease sebanyak 0,09 U/ml. Suhu optimum enzim ini yaitu pada suhu 50 oC yang menghasilkan aktivitas sebesar 0,08 U/ml. Enzim protease ini mempuyai kondisi optimum pada pH 5 dengan nilai aktivitas 0,09 U/ml. Semua ion logam (Ca2+, Mn2+, Cu2+, Mg2+) berfungsi sebagai inhibitor kecuali ion Fe3+ yang berfungsi sebagai aktivator pada konsentrasi 1 mM dan 5 mM. EDTA dengan konsentrasi 1 mM dan 5 mM berfungsi sebagai inhibitor pada enzim protease isolat UJ131. Nilai Vmaks enzim protease 0,33 U/ml sedangkan Km senilai 4,59 mg/ml substrat, enzim ini mempunyai afinitas yang tinggi terhadap substrat. Kata kunci: Bacillus sp, Protease, Hutan Mangrove, Bakteri Proteolitik, Probiotik.

Pendahuluan Munculnya penyakit di lingkungan perairan, hal ini menyebabkan menurunnya hasil produksi. Tingginya tingkat mortalitas udang budidaya diduga disebabkan oleh infeksi virus maupun bakteri patogen (Ali,2009). Menurut data Balai Besar Riset Sosial Ekonomi Kelautan dan Perikanan (BBRSEKP) jumlah produksi udang pada tahun 2011 adalah 113,251 ton namun setiap tahunnya menurun hingga 83,177 ton pada tahun 2014. Hal sama juga dilaporkan oleh data Badan Pusat Statistik (BPS) (2016)

Indonesia, produksi budidaya perairan laut di provinsi Lampung pada tahun 2011 sebanyak 1.151 ton lalu tahun 2016 menjadi 1.159 ton. Pada saat budidaya ini ditemukan banyak kendala berupa infeksi patogen baik bakteri ataupun virus. Kerugian ekonomi yang ditimbulkan oleh infeksi mikroorganisme patogen ini sangat besar hingga mencapai US$ 3 miliar per tahun (Subasinghe et al., 2001) dan menurunkan jumlah produksi di seluruh dunia (Hill, 2005). Kematian massal pada unit budidaya udang dilain pihak semakin nyata pada saat intensifikasi budidaya udang windu mengalami masa keemasan

dengan masuknya berbagai penyakit virus antara lain Yellow Head Diseases (YHD), White Spot Syndrome Virus (WSSV) dan Taura Syndrome Virus (TSV) (Direktorat Jenderal Perikanan Budidaya, 2003). Dari berbagai penyakit tersebut, Indonesia setidaknya telah kehilangan berbagai pendapatan baik domestik maupun devisa negara. Kehilangan penghasilan dari budidaya udang yang terserang White Spot Syndrome Virus (WSSV) dari tahun 1990sampai saat ini mencapai US$ 300.000/tahun (Direktorat Jenderal Perikanan Budidaya, 2003).. Untuk itu dilakukan pencegahan menggunakan probiotik.

Rhizopus, Mucor, Endothia and Aspergillus (Ward et al., 2009). Usaha pemberian isolat isolat Bacillus sp yang terbaik berasal dari lingkungan alaminya seperti hutan mangrove. Hanya saat ini belum banyak kajian ilmiah mengenai enzim proteolitik dari isolat Bacillus sp sebagai kandidat probiotik yang bersumber dari hutan mangrove di desa Marga Sari Lampung Timur. Oleh karena itu perlu dilakukan penelitian untuk mengetahui karakteristik enzim protease yang dihasilkan dari isolat Bacillus sp tersebut. Bahan dan Metode

Pencegahan penyakit dengan probiotik memiliki keunggulan dibandingkan cara – cara pengendalian yang lainnya, di antaranya adalah : (1) menekan pertumbuhan bakteri pathogen termasuk diantaranya bakteri vibrio dan (2) mampu memperbaiki kualitas air (Moriarty,1998). Beberapa peneliti ilmiah telah melakukan penelitian untuk mencari manfaat dari penggunaan probiotik di sektor budiya perikanan ((Fadilah et al. 2012), bioremediasi kualitas air (Muliani et al., 2008), efisiensi pada pakan (Murdianto, 2015). Pakan udang dan ikan mengandung protein sebaanyak untuk meningkatkan penggunaan pakan yang efisien tersebut maka diperlukan beberapa mikroba probiotik yang menghasilkan enzim protease. Beberapa mikroorganisme yang telah diketahui sebagai penghasil protease untuk aplikasi komersial adalah Bacillus, Lactobacillus, Pyrococcus, Termonospora

a. Isolat Bakteri Isolat yang digunakan adalah Bacillus sp dengan kode isolat UJI31 yang diisolasi dari udang Pasir di kawasan hutan mangrove. Isolat UJI31 terlebih dahulu diuji secara kualitatif menggunakan media SWC-Agar (Sea Water Complete) yang terdiri dari ,5 gr bacto pepton, 0,1 gr yeast extract, 0,3 ml gliserol,75 l air laut, 25 ml aquadest, 1,5 gr agar dan 1 gr skim milk. b. Optimasi Waktu Produksi Enzim Protease Pembuatan media produksi Protease dilakukan dengan cara membuat media starter telebih dahulu. Media starter diperoleh melalui media SWC (Sea Water Complete) yang terdiri dari 0,5 gr bacto pepton, 0,1 gr yeast extract, 0,3 ml gliserol,75 l air laut, 25 ml aquadest selanjutnya ditambah 1-3 ose isolat Bacillus sp. Selajutnya diinkubasi kedalam shaker incubator selama 24 jam dengan kecepatan 120 rpm pada

suhu ruang. Kemudian 5 ml media starter ditambahkan kedalam media produksi SWC (0,5 gr bacto pepton, 0,1 gr yeast extract, 0,3 ml gliserol,75 l air laut, 25 ml aquadest dan 0,25 gr skim milk) dan diinkubasi kedalam shaker incubator masing masing selama 6, 12, 18, 24, 30, 36 jam dengan kecepatan 120 rpm pada suhu ruang. Sample disentrifugasi dengan kecepatan 10000 rpm selama 15 menit pada suhu 4 oC untuk mendapatkan natan dan supernatan. Supernatan inilah yang akan digunakan untuk uji aktivitas serta karakterisasi enzim protease.

tirosin per menit pada kondisi optimum pegukuran (Ace,2011). Hasil 1. Uji Kualitatif Pada uji kualitatif ini terlihat bahwa isolat UJ131 menghasilkan zona bening disekitar koloni bakteri. Hal ini menunjukkan bahwa isolat UJI31 merupakan bakteri proteolitik atau mampu menghasilkan enzim protease (Gambar 1).

c. Karakterisasi Protease

Gambar 1. Isolat UJI31 2. Optimasi Waktu Produksi Hasil waktu produksi optimum protease dari isolat Bacillus sp Hutan Mangrove Lampung Tiur dilihat pada Gambar 2. Isolat Bacillus sp yang diisolasi dari kawasan hutan Mangrove Lampung Timur mempunyai aktivtas tertigggi pada jam ke -18 (Gambar 2). aktivitas protease (U/ml)

Karakterisasi protease meliputi uji aktivitas suhu optimum 20-70 oC. Menguji pengaruh pH dengan kisaran pH 4-12. Satu seri buffer pH 0,05M yang berbeda, yakni: pH 4,5 (buffer sitrat), pH 6,7 (buffer fosfat), pH 8,9 (buffer tris-HCl), pH 10,11,12 (buffer glisin-NaOH). Uji pengaruh ion logam logam Ca2+, Mn2+, Cu2+ . Mg2+, Fe3+ dan senyawa inhibitor asam etilen diamintetraasetat (EDTA) dengan konsentrasi 1 Mm dan 5 Mm. Pegukuran Km dan Vmaks dilakukan dengan menguji konsetrasi substrat 0%, 1%, 1,5%, 2%, 2,5% dan 3%. Pada setiap karakterisasi, dilakukan uji aktivitas protease diukur dengan metode Bergmeyer dan Grassl (1983), dengan menggunakan substrat kasein Hammerstein (b/v) yang dispektrofotometer pada panjang gelombang 578 nm. Produk yang dihasilkan dinyatakan dalam U/ml. Satu unit aktivitas protease didefinisikan sebagai jumlah enzim yang dapat menghasilkan satu mikromol produk

0.12 0.10 0.08 0.06 0.04 0.02 0.00 -0.02 6

12

18 24 Jam Ke-

Gambar 2. Waktu Optimum Produksi

30

36

mempunyai aktivitas tertinggi pada pH 5 (Gambar 4).

10%

8% 6% 4% 2%

16% 12% 8%

1 Mm

4%

5 Mm

0%

0% 20

30

40 suhu

50

60

70

Aktivitas Protease

Gambar 5. Pengaruh Ion logam dan EDTA

Gambar 3. Pengaruh Suhu

Pengaruh ion logam Ca2+, Mn2+, Cu2+ . Mg2+, Fe2+ serta inhibitor spesifik EDTA terhadap aktivitas isolat Bacillus sp hutan mangrove terlihat pada gambar 5.Semua ion logam yang ditambahkan pada uji aktivitas protease berfungsi sebagai inhibitor kecualiion logam Fe2+ (5 Mm) yang berfungsi sebagai aktivator (Gambar 5).

10% 8% 6% 4% 2% 0% 4

Ion Logam

(oC)

4. Pengaruh PH

Aktivitas Protease Relatif (%)

20%

5

6

7

8 9 Variasi pH

10

11

12

6. Kinetika Enzim (Km dan Vmaks) 30.0

Aktivitas Protease

y = 7.841x + 15.479 R² = 0.1876

Gambar 4. Pengaruh pH pH mempunyai peranan penting terhadap aktivitas suatu enzim. Kondisi lingkungan enzim harus sesuai dengan karakter enzim sehingga enzim dapat bekerja secara optimum dan mencapai hasil yang maksimum. Isolat Bacillus sp dari Hutan magrove Lampung Timur yang telah diukur aktivitasnya dalam rentang pH 4-12

1/V

Aktivitas Protease Relatif (%)

Setiap enzim memiliki aktivitas maksimum yang berbeda. Enzim protease isolat UJ131 optimum pada suhu 50 oC (Gambar 3).

5. Penaruh Ion Logam sebagai Aktivator dan Inhiitor spesifik terhadap Aktivitas Enzim Protease

Aktivitas ProteaseRelatif (%)

3. Pengaruh Suhu

25.0 20.0 15.0 10.0 5.0 0.0

-12

-7

1/Vmaks

-2

3 1/S

Gambar 6. Kurva Lineweaver-Burk Enzim Protease

Dari persamaan Lineweaver-Burk diperoleh harga Vmaks enzim protease 0,330 U/ml sedangkan Km senilai 4,598 mg/ml substrat (Gambar 6). Pembahasan Waktu produksi optimum setiap enzim berbeda-beda dan mempunyai karakter tersendiri. Isolat UJ131 memiliki aktivitas optimum pada jam ke-18. Hal ini mempunyai arti bahwa aktivitas protease sangat optimum jika diinkubasi selama 18 jam. Pada akhir waktu produksi enzim, terjadi penurunan aktivitas proteolitik yang dapat terjadi karena berkurangnya jumlah substrat yang akan menghambat pembentukan kompleks enzim substrat dan perubahan struktur enzim yang akan menyebabkan penurunan laju katalitik. Akibat perubahan struktur enzim, sisi aktif enzim mengalami perubahan bentuk sehingga tidak dapat digunakan secara baik dalam mengikat substrat (Yunita, 2012). Kemungkinan lain adalah kebutuhan bakteri akan nutrisi asam amino sudah terpenuhi, atau sel-sel bakteri mulai mengalami lisis yang dilanjutkan dengan fase kematian (Yuniati, 2015). Aktivitas protease dari isolat UJ131 menghasilkan aktivitas sebesar 0,09 U/ml. Hasil ini lebih tinggi jika dibandingkan dengan peelitian Inten (2015) yang melaporkan aktivitas protease tertinggi dari tanah hutan mangrove mencapai 1,2 x 10-4 U/mL pada waktu inkubasi 9 jam. Berdasarkan penelitian Yuniati (2015), aktivitas proteolitik dari isolat Bacillus sp. B1 yang diisolasi dari rizosfer tanaman sawi menunjukkan aktivitas optimumnya pada waktu produksi 30 jam. Nilai aktivitas enzim yang diperoleh pada penelitian ini masih jauh lebih rendah dibandingkan dengan aktivitas enzim protease Bacillus

sp. Ve1 yang memiliki aktivitas protease maksimum sebesar 397 U/mL pada media gelatin cair (Patel dkk., 2004). Sementara itu, Nilegaonkar dkk. (2006) melaporkan bahwa enzim protease Bacillus cereus MCM B-326 yang diisolasi dari kulit kerbau memiliki aktivitas maksimum sebesar 126,87 U/mL pada media pati kedelai. Suatu enzim akan memiliki aktivitas yang semakin tinggi jika suhu eksternal semakin dinaikkan hinga mencapai aktivitas maksimum. Namun, Jika kenaikan suhu semakin dilakukan ketika enzim mencapai fase maksimum hal ini akan menyebabkan protein dalam enzim akan terdenaturasi yang menyebabkan penurunan aktivitas enzim hingga kembali ke fase minimum. Pada suhu 20 oC dan 30 oC aktivitas protease sebesar 0,01 U/ml. Nilai tersebut paling rendah dibandingkan aktivitas pada suhu yang lain. Aktivitas tertinngi terjadi pada perlakuan suhu 50 oC dengan nilai sebesar 0,08 U/ml. Oleh karena itu, temperature 50 oC merupakan suhu maksimum produksi protease dari isolat Bacillus sp hutan mangrove. Meskipun aktivitas protease pada suhu 60 oC tetap ada namu sangat rendah. Hal ini diakibatkan enzim protease telah mencapai fase maksimum. Yati (2011) melaporkan Bacillus licheniformis mempunyai aktivitas optimum pada suhu 60 oC. Yandri (2007) juga melaporkan aktivitas enzim protease hasil pemurnian dari Bacillus subtilis ITBCCB148 optimum pada suhu 60 oC enzim protease hasil pemurnian berdasarkan gambar tersebut 60 oC, dengan aktivitas 0,91 U/mL. Selain suhu, pH juga mempengaruhi aktivitas enzim. Aktivitas protease pada pH 5 terlihat dari gambar 4 yang memiliki

nilai aktivitas protease sebesar 0,09 U/ml. Selanjutnya pada pH 6 hingga 12 aktivtas protease menurun di rentang nilai 0,01 dan 0,02 U/ml. Penurunan aktivitas protease dapat disebabkan karena pH yang sudah tidak optimum di rentang pH 6-12. Sehingga dapat dikatakan bahwa kondisi pH maksimum protease isolat Bacillus dari hutan mangrove ada pada pH 5. Pada penelitian Novita (2006) melaporkan bahwa isolat Bacillus amyloliquefaciens NRRL B-14396 memiliki aktivitas optimum pada pH 7,5. Begitu pula Bacillus subtillis yang diisolasi dari terasi samarinda mempunyai pH optimum 8,5 (Yati, 2014). Perubahan pH yang ekstrim, enzim dapat mengalami denaturasi akibat gangguan terhadap berbagai interaksi non kovalen yang menjaga kestabilanstruktur 3 dimensi enzim (Hames dan Hooper, 2000)

Selain suhu dan pH, ion logam juga mempengaruhi aktivitas enzim. Ion logam merupakan kofaktor. Kofaaktor digunakan untuk mendukung aktivitas kataltik enzim. Ion logam dapat menjadi aktivator dan juga inhibitor. Ion dapat dikatakan aktivator jika dapat menaikkan aktivitas enzim. Sedangkan dapat mejadi inibitor apabila ion logam tersebut menghambat aktivitas protease yang ditandai dengan menurunnya aktivtas enzim. Pada isolat Bacillus sp UJ131 semua ion logam (Ca2+, Mn2+, Cu2+, Mg2+) bekerja sebagai inhibitor kecuali ion Fe2+ yang bertindak sebagai aktivator baik pada konsentrasi 1 Mm dan 5 Mm. Hal ini dapat dilihat dari grafik (Gambar 5). EDTA mempuyai pengaruh yang signifikan dalam aktivitas protease isolat Bacillus sp UJI131yakni sebagai inhibitor pada semua reaksi. Perbandingan ion logam sebagai inhibitor atau aktivator dapat dilihat dengan

membandingkan setiap aktivitas ion logam dengan kontrol (tanpaion logam). Esti (2009) melaporkan Hasil penelitian menunjukkan bahwa ion logam yang berfungsi sebagai kofaktor protease dari Bacillus sp 31 adalah ion Fe2+. Hal ini berbeda dengan hasil karakterisasi dari Adinarayana et al. (2003) bahwa serin alkalin protease dari B. subtilis PE-11 kofaktornya adalah ion Ca2+, Mg2+ dan Mn2+. Sementara pada protease dari Bacillus sp APR-4 kofaktornya adalah ion Ca2+ dan ion Cu2+ (Kumar dan Bhalla, 2004). Adanya penghambatan ion logam terhadap aktivitas proteaase pada konsentrasi tertentu berkaitan dengan kekuatan ion, dimana kekuatan ion itu sendiri mempengaruhi konformsi atau struktur tiga dimensi dari protein enzim ataau protein substrat (Suhartono,1989). Kinetika enzim merupakan saah satu karakteristik yang dibutuhkan dalam mengkarakter sutu enzim. Kinetika enzim sendiri diartikan sebagai ssetiap konsentrasi substrat yang mempengauhi aktivitas suatu enzim. Dari persamaan Lineweaver-Burk diperoleh harga Vmaks enzim protease 0,330 U/ml sedangkan Km senilai 4,598 mg/ml substrat (Gambar 6). Harga Km lebih besar jika dibandingkan dengan isolaat Bacillus sp 31 yang mempunyai nilai Km sebesar 1.5x10-3 (Esti,2009). Bila dibandingkan dengan serin protease dari Bacillus sp 31 yang mempunyai Vmaks 21,32 U/mg (Esti dan Lina, 2009) kecepatan maksimum protease dari Bacillus sp 31 tergolong rendah.

Kesimpulan Isolat Bacillus sp yang diisolasi dari kawasan hutan mangrove desa Marga Sari

Kabupaten Lampung Timur memiliki aktivitas protease. Karakter enzim protease yang dihasilkan meliputi waktu produksi optimum adalah 18 jam. Enzim protease ini mempuyai pH optimum 5. Suhu optimum enzim ini tergolong termostabil yaitu pada suhu 50 oC. emua ion logam (Ca2+, Mn2+, Cu2+, Mg2+) berfungsi sebagai inhibitor kecuali ion Fe3+ yang

berfungsi sebagai aktivator pada konsentrasi 1 mM dan 5 mM. EDTA dengan konsentrasi 1 mM dan 5 mM berfungsi sebagai inhibitor pada pada enzim protease isolat UJ131. Nilai Vmaks enzim protease 0,33 U/ml sedangkan Km senilai 4,59 mg/ml substrat, enzim ini mempunyai afinitas yang tinggi terhadap substrat.

Daftar Pustaka Adinarayana K, Ellaiah P, Prasad DS. 2003. Purification and Partial Characterization of Thermostable Serine Alkaline Protease from a Newly Isolated Bacillus subtilis PE-11. AAPS Pharm Scitech 4: 56-59 Badan Pusat Statistik (BPS) Indonesia . 2016 . Produksi Perikanan Laut yang dijual di TPI. Jakarta. Baehaki, A., Rinto, Budiman, A. 2011. Isolasi dan Karakterisasi Protease dari Bakteri Tanah Indralaya Sumatera Selatan. J. Teknol dan Industri Pangan. 112 : (37-41) Direktorat Jendral Perikanan Budidaya .2003. Makalah Pelatihan Lanjutan Kesehatan Ikan dan Lingkungan, 23 Oktober 2004 di Bogor. Gupta, R., Beg, Q.K., dan Lorenz, P. 2002. Bacterial alkaline proteases: molecular approaches and industrial application. Appl Microbiol Biotechnol. 59:15-32. Gusman, E. dan Firman. 2012.Identifikasi Bakteri Vibrio sp pada Udang Windu (Penaeus monodon) di Tambak Tradisional Kota Tarakan. Jurnal Harpodon Borneo. 5(2): 173-181. Hardianti, IN., Nengah IW., Mayun, LAAIA. 2015. Analisis Potensi Protease Ekstraselluler Tanah Hutan Mangrove Pantai Suwung Kauh Bali.Cakra Kimia. 3(2): 84-90. Jamilah I, A Meryandini, I Rusmana, A Suwanto and NR Mubarik. 2009. Activity of Proteolilytic and Amylolytic Enzymes from Bacillus spp. Isolated from Shrimp Ponds. Journal Microbiology Indonesia 3(2), 67-71. Kamoun AS, A Haddar, NEH Ali, BG Frikha, S Kanoun and M Nasri. 2008. Stability of thermostable alkaline protease from Bacillus licheniformis RP1 in commercial solid laundry detergent formulations.Microbiological Research 163, 299–306. Kosim M. 2010. Pengaruh Suhu Pada Protease Dari Bacillussubtilis. Jurusan Kimia Fakultas Matematika Dan Ilmu Pengetahuan Alam Institut Teknologi Sepuluh Nopember Surabaya. [Skripsi]. Kumar D & Bhalla TC. 2004. Purification and Characterization of a Small Size Protease from Bacillus sp. APR-4. Exp Biol 42: 515-517 Nascimento WCA , MLL Martins. 2006. Studies on the stability of protease from Bacillus sp. And its compatibility with commercial detergent. Brazilian Journal of Microbiology 37, 307-311 Nascimento, W.C.A. and Martins, M.L.L. 2004. Production and properties of an extracellular protease from thermophilic Bacillus sp. Braz J Microbiol. 35: 1–2. Olajuyigbe FM, Ajele JO. 2008. Some properties of extracelullar protease from Bacillus licheniformis Lbbl-1 isolated from ’iru’, a traditionally fermented African locust bean condiment. Glob. J. Biotechnol.Biochem. 3 (1): 42-46. Rahayu, A. G. 2014. Uji Aktivitas dan Aktivitas Spesifik Enzim Selulase dari Tiga Isolat Bacillus sp. Galur Lokal Riau. Skripsi. FMIPA, Universitas Riau, Pekanbaru. Stryer L. 2000. Biokimia; Jilid I. Edisi Empat. Terjemahan M. Shadikin dari Biochemistry (1995). Jakarta: Penerbit Buku Kedokteran. EGC.

Sudaryati, YS. dan Sulistiani. 2014. Karakterisasi Protease Bacillus subtilis A1 InaCCB398 yang Diisolasi dari Terasi Samarinda. Berita Biologi.13 (2) : 203-210 Suganthi, C., Mageswari, A., Karthikeyan, S., Anbalagan, M., Sivakumar, A., dan Gothandam, K.M. 2013. Screening and optimization of protease production from a halotolerant Balcillus licheniformis isolated from saltern sediments. Journal of Genetic Engineering and Biotechnology. 11: 47-52. Tari, C., Genckal, H., dan Tokatl, F. 2005. Optimization of a growth medium using a statistical approach for the production of an alkaline protease from a newly isolated Bacillus sp. L21. Process Biochemistry. 41:659-665. Utarti, E., Nurita, L., Arimurti, S. 2009. Karakterisasi Protease Ekstrak Kasar Bacillus sp 31. Jurnal Ilmu Dasar . 10 : (101-108) Yuniati, R.,Nugroho, TT, Puspita, F.2015. Uji Aktivitas Enzim Protease dari Isolat Bacillus sp Galur Lokal Riau. JOMP FMIPA. 1 :116-122. Yunita, S. P. 2012. Skrining dan Uji Aktivitas Enzim Protease Bakteri dari Limbah Rumah Pemotongan Hewan. Skripsi. Fakultas Sains dan Teknologi, Universitas Airlangga. Jakarta.