Gri-2006-913.pdf

ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΚΤΗΝΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ

ΣΥΜΒΟΛΗ ΣΤΗ ΜΕΛΕΤΗ ΤΟΥ ΘΕΡΑΠΕΥΤΙΚΟΥ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΟΣ ΚΑΙ ΤΗΣ ΑΣΦΑΛΕΙΑΣ ΤΗΣ ΑΜΦΟΤΕΡΙΚΙΝΗΣ Β ΣΤΗ ΣΥΜΠΤΩΜΑΤΙΚΗ ΛΕΪΣΜΑΝΙΩΣΗ ΤΟΥ ΣΚΥΛΟΥ (Leishmania infantum) ΚΑΙ Η ΕΠΙΔΡΑΣΗ ΤΗΣ, ΜΕ Η ΧΩΡΙΣ ΕΝΑΛΑΠΡΙΛΗ, ΣΤΗ ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑ ΤΩΝ ΝΕΦΡΩΝ

ΧΡΗΣΤΟΣ Κ. ΚΟΥΤΙΝΑΣ ΚΤΗΝΙΑΤΡΟΣ ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ

ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ, 2006

ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΚΤΗΝΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΣΥΜΒΟΛΗ ΣΤΗ ΜΕΛΕΤΗ ΤΟΥ ΘΕΡΑΠΕΥΤΙΚΟΥ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΟΣ ΚΑΙ ΤΗΣ ΑΣΦΑΛΕΙΑΣ ΤΗΣ ΑΜΦΟΤΕΡΙΚΙΝΗΣ Β ΣΤΗ ΣΥΜΠΤΩΜΑΤΙΚΗ ΛΕΪΣΜΑΝΙΩΣΗ ΤΟΥ ΣΚΥΛΟΥ (Leishmania infantum) ΚΑΙ Η ΕΠΙΔΡΑΣΗ ΤΗΣ, ΜΕ Η ΧΩΡΙΣ ΕΝΑΛΑΠΡΙΛΗ, ΣΤΗ ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑ ΤΩΝ ΝΕΦΡΩΝ

ΧΡΗΣΤΟΣ Κ. ΚΟΥΤΙΝΑΣ ΚΤΗΝΙΑΤΡΟΣ

ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ ΠΟΥ ΕΚΠΟΝΗΘΗΚΕ ΣΤΗΝ ΚΛΙΝΙΚΗ ΤΩΝ ΖΩΩΝ ΣΥΝΤΡΟΦΙΑΣ (ΜΟΝΑΔΑ ΠΑΘΟΛΟΓΙΑΣ) ΤΗΣ ΚΤΗΝΙΑΤΡΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗΣ ΤΟΥ ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟΥ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟΥ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ

ΕΠΤΑΜΕΛΗΣ ΕΠΙΤΡΟΠΗ Καθηγητής

Τ. Ράλλης

Επιβλέπων

Καθηγητής

Γ. Κουνενής

Μέλος Συμβουλευτικής Επιτροπής

Αν. Καθηγητής

Ν. Ρουμπιές

Μέλος Συμβουλευτικής Επιτροπής

Καθηγητής

Σ. Φρύδας

Μέλος

Αν. Καθηγήτρια

Μ. Κουτσοβίτη – Παπαδοπούλου

Μέλος

Επικ. Καθηγήτρια

Ζ. Πολυζοπούλου

Μέλος

Λέκτορας

Κ. Αδαμαμά – Μωραΐτου

Μέλος

2

ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΠΡΟΛΟΓΟΣ...................................................................................................................... 5 ΜΕΡΟΣ ΠΡΩΤΟ .............................................................................................................. 9 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΚΗ ΑΝΑΣΚΟΠΗΣΗ............................................................................. 9 A. Η ΛΕΙΣΜΑΝΙΩΣΗ ΣΤΟ ΣΚΥΛΟ............................................................................. 9 1. Εισαγωγή ................................................................................................................... 9 2. Επιζωοτιολογικά στοιχεία ...................................................................................... 11 3. Παθογένεια............................................................................................................... 13 4. Κλινική εικόνα και πρόγνωση ............................................................................... 16 5. Αιματολογικές και βιοχημικές διαταραχές στο αίμα........................................... 20 6. Διαγνωστικές μέθοδοι............................................................................................. 22 Παρασιτολογική εξέταση (άμεση μικροσκόπηση) ................................................. 22 Ορολογικές μέθοδοι ................................................................................................. 23 Μοριακές μέθοδοι (αλυσιδωτή αντίδραση της πολυμεράσης ή PCR).................. 25 Άλλες μέθοδοι........................................................................................................... 27 B. ΑΝΤΙΛΕΙΣΜΑΝΙΑΚΑ ΦΑΡΜΑΚΑ........................................................................ 27 Αμφοτερικίνη Β........................................................................................................... 35 Γ. Η ΣΠΕΙΡΑΜΑΤΟΝΕΦΡΙΤΙΔΑ ΣΤΗ ΛΕΙΣΜΑΝΙΩΣΗ ΤΟΥ ΣΚΥΛΟΥ ........... 40 1. Τύποι νεφρικών αλλοιώσεων ................................................................................. 41 2. Ρυθμός σπειραματικής διήθησης (ΡΣΔ) ............................................................... 43 3. Σπειραματική πρωτεϊνουρία και εκτίμηση του βαθμού της............................... 45 4. Αναστολείς του μετατρεπτικού ενζύμου της αγγειοτασίνης (εναλαπρίλη) και σπειραματική πρωτεϊνουρία ...................................................................................... 51 ΜΕΡΟΣ ΔΕΥΤΕΡΟ ........................................................................................................ 55 ΔΙΚΗ ΜΑΣ ΕΡΕΥΝΑ..................................................................................................... 55 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ................................................................................................ 55 1. Κριτήρια συμμετοχής των ζώων στη μελέτη ....................................................... 55 2. Στοιχεία ταυτότητας, ιστορικό και συνθήκες διαβίωσης των ζώων κατά τη διάρκεια της μελέτης .................................................................................................. 56 3. Σχεδιασμός της μελέτης ......................................................................................... 59 4. Φάρμακα που χρησιμοποιήθηκαν στη μελέτη ..................................................... 66 Αμφοτερικίνη Β (AmB) .......................................................................................... 66 Αλλοπουρινόλη ........................................................................................................ 68 Εναλαπρίλη.............................................................................................................. 69 5. Κλινική εξέταση ...................................................................................................... 69 6. Αιματολογικές και βιοχημικές εξετάσεις .............................................................. 71 7. Παρασιτολογική εξέταση για Leishmania sp. σε επιχρίσματα από ιστούς ........ 73 8. Ορολογικές εξετάσεις για Leishmania sp.............................................................. 74 9. Εξέταση με την αλυσιδωτή αντίδραση της πολυμεράσης (PCR) για την ανίχνευση της Leishmania sp. .................................................................................... 75 10. Άλλες ορολογικές και κυτταρολογικές - παρασιτολογικές εξετάσεις............... 77 11. Ανάλυση και καλλιέργεια ούρων ......................................................................... 78 12. Λόγος πρωτεϊνών/κρεατινίνης στα ούρα (Up/c) ................................................. 79 13. Κάθαρση εξωγενούς κρεατινίνης......................................................................... 81 14. Στατιστική ανάλυση ............................................................................................. 83 3

ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ........................................................................................................ 87 ΠΡΩΤΟ ΣΚΕΛΟΣ ΤΗΣ ΜΕΛΕΤΗΣ ........................................................................... 87 Κλινική ανταπόκριση στη θεραπεία με αμφοτερικίνη Β ........................................ 87 Μεταβολές των αιματολογικών και βιοχημικών παραμέτρων στον ορό του αίματος ύστερα από τη θεραπεία με αμφοτερικίνη Β.............................................. 89 Παρασιτολογική ανταπόκριση στη θεραπεία με αμφοτερικίνη Β (κυτταρολογική, ορολογική, μοριακή) ................................................................................................... 92 Κυτταρολογική εξέταση σε οπό λεμφογαγγλίου και το μυελό των οστών ............. 92 Ορολογική εξέταση με IFAT ................................................................................... 93 Μοριακή εξέταση με PCR στο μυελό των οστών................................................... 93 ΔΕΥΤΕΡΟ ΣΚΕΛΟΣ ΤΗΣ ΜΕΛΕΤΗΣ....................................................................... 94 Διάρκεια θεραπείας με αμφοτερικίνη Β.................................................................... 94 Ρυθμός σπειραματικής διήθησης (ΡΣΔ) ................................................................... 95 Συγκέντρωση της κρεατινίνης στον ορό του αίματος.............................................. 96 Συγκέντρωση του αζώτου ουρίας στον ορό του αίματος (SUN)............................. 97 Συγκέντρωση του φωσφόρου (P) στον ορό του αίματος ......................................... 98 Ευρήματα από την ανάλυση και την καλλιέργεια των ούρων ................................ 99 Λόγος πρωτεϊνών/κρεατινίνης (Up/c)...................................................................... 102 Συγκέντρωση των λευκωματινών στον ορό του αίματος ...................................... 103 Συγκέντρωση της χοληστερόλης στον ορό του αίματος........................................ 104 Ανεπιθύμητες ενέργειες της θεραπείας με αμφοτερικίνη Β .................................. 105 ΣΥΖΗΤΗΣΗ.................................................................................................................. 107 ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ ..................................................................................................... 137 ΠΕΡΙΛΗΨΗ................................................................................................................... 139 SUMMARY ................................................................................................................... 149 ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ ΠΙΝΑΚΩΝ.......................................................................................... 157 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ .......................................................................................................... 185

4

ΠΡΟΛΟΓΟΣ

Η λεϊσμανίωση από τη Leishmania infantum είναι ίσως σήμερα το συχνότερο στην πράξη λοιμώδες νόσημα του σκύλου στην Ελλάδα, τις άλλες παραμεσόγειες χώρες της Ευρώπης και την Πορτογαλία. Παρά τον πολυσυστηματικό χαρακτήρα και την ποικιλομορφία στην κλινική εικόνα δεν υπάρχει αμφιβολία ότι η σοβαρότερη κλινική εκδήλωση της νόσου είναι η χρόνια σπειραματονεφρίτιδα που κατά κανόνα συνοδεύεται από πρωτεϊνουρία διήθησης και η οποία συχνότατα οδηγεί σε χρόνια νεφρική ανεπάρκεια ή/και νεφρωσικό σύνδρομο και μοιραία στο θάνατο του ζώου. Τα θεραπευτικά πρωτόκολλα που εφαρμόζονται στην πράξη για τη λεϊσμανίωση του σκύλου, αν και συχνά οδηγούν στην κλινική ίαση του ζώου, σπάνια εξουδετερώνουν το πρωτόζωο με αποτέλεσμα οι υποτροπές να είναι συχνές και η ανάγκη για νέα λεϊσμανιοκτόνα φάρμακα ή θεραπευτικά σχήματα, μεγάλη. Σκοπός της μελέτης αυτής είναι: α) η αξιολόγηση του θεραπευτικού αποτελέσματος σε κλινικό και παρασιτολογικό επίπεδο και της ασφάλειας ενός σταθερού δοσολογικού σχήματος της αμφοτερικίνης Β με τη μορφή του εναιωρήματος με λιπίδια σε μεγάλο αριθμό σκύλων με συμπτωματική λεϊσμανίωση, β) η επίδραση της αμφοτερικίνης Β πάνω στην απεκκριτική λειτουργία των νεφρών και το βαθμό πρωτεϊνουρίας στη χρόνια σπειραματονεφρίτιδα της νόσου αυτής σε συνδυασμό ή όχι με τον αναστολέα του μετατρεπτικού ενζύμου της αγγειοτασίνης Ι εναλαπρίλη, και γ) η αξιολόγηση του ευεργετικού αποτελέσματος της εναλαπρίλης, σε συνδυασμό με τη λεϊσμανιοστατική

αλλοπουρινόλη,

πάνω

στις

προηγούμενες

παραμέτρους

σε

μακροχρόνια βάση.

5

Στα σημεία που συνιστούν παγκόσμια πρωτοτυπία της διδακτορικής αυτής διατριβής, αφού προηγουμένως διερευνήθηκε η μέχρι τη στιγμή του σχεδιασμού της σχετική

διεθνής

βιβλιογραφία,

περιλαμβάνονται

η

χρησιμοποίηση

σταθερού

δοσολογικού σχήματος της αμφοτερικίνης Β σε μεγάλο αριθμό σκύλων με συμπτωματική λεϊσμανίωση, η συστηματική εκτίμηση του κλινικού (βαθμολόγηση) και αντιλεϊσμανιακού αποτελέσματος (κυτταρολογική εξέταση, ορολογική εξέταση, PCR) και της ασφάλειας του φαρμάκου, η εκτίμηση της επίδρασης του φαρμάκου πάνω στην απεκκριτική λειτουργία των νεφρών και το βαθμό πρωτεϊνουρίας στη χρόνια σπειραματονεφρίτιδα

της

λεϊσμανίωσης

του

σκύλου

και

η

εκτίμηση

του

νεφροπροστατευτικού και αντιπρωτεϊνουρικού αποτελέσματος της εναλαπρίλης, στη νεφρίτιδα αυτή. Η μελέτη χωρίζεται σε δύο σκέλη. Στο πρώτο διερευνήθηκε η αντιλεϊσμανιακή δράση της αμφοτερικίνης Β στη λεϊσμανίωση του σκύλου, σε κλινικό, εργαστηριακό και παρασιτολογικό επίπεδο, και στο δεύτερο η επίδρασή της, σε συνδυασμό ή όχι με την εναλαπρίλη, πάνω στη νεφρική λειτουργία και την πρωτεϊνουρία της χρόνιας σπειραματονεφρίτιδας που η νόσος αυτή συχνά προκαλεί. Το πρώτο μέρος της διδακτορικής διατριβής περιλαμβάνει σχετικά σύντομη βιβλιογραφική ανασκόπηση της λεϊσμανίωσης του σκύλου, των αντιλεϊσμανιακών φαρμάκων, με ιδιαίτερη έμφαση στην αμφοτερικίνη Β, της χρόνιας νεφρίτιδας της νόσου αυτής και της δράσης των αναστολέων του μετατρεπτικού ενζύμου της αγγειοτασίνης Ι πάνω στην πρωτεϊνουρία των σπειραματοπαθειών, με ιδιαίτερη έμφαση στην εναλαπρίλη. Στο δεύτερο μέρος περιγράφονται τα υλικά και οι μέθοδοι που χρησιμοποιήθηκαν και τα αποτελέσματα των διαφόρων εξετάσεων που διαμορφώθηκαν

6

ανάλογα με τα σκέλη της μελέτης, για να ακολουθήσει η συζήτηση των αποτελεσμάτων με βάση τα μέχρι σήμερα διεθνή επιστημονικά δεδομένα, η εξαγωγή των ανάλογων συμπερασμάτων, η περίληψη, το παράρτημα πινάκων και οι βιβλιογραφικές πηγές. Η έρευνα αυτή πραγματοποιήθηκε στην Κλινική των Ζώων Συντροφιάς (Μονάδα Παθολογίας) της Κτηνιατρικής Σχολής του Α.Π.Θ. με την καθοδήγηση του επιβλέποντα καθηγητή κ. Τ. Ράλλη, τον οποίο και ευχαριστώ θερμά για την πολύτιμη και κάθε είδους βοήθεια και συμπαράστασή του καθόλη τη διάρκεια της μελέτης. Θερμές ευχαριστίες θα ήθελα επίσης να απευθύνω στα άλλα δύο μέλη της Τριμελούς Συμβουλευτικής Επιτροπής, καθηγητή της Φαρμακολογίας κ. Γ. Κουνενή και αναπληρωτή καθηγητή του Διαγνωστικού Εργαστηρίου κ. Ν. Ρουμπιέ (Κτηνιατρική Σχολή, Α.Π.Θ.) για τις επιστημονικές και όχι μόνο συμβουλές τους και την άμεση ανταπόκρισή τους οποτεδήποτε προέκυπτε κάποιο πρόβλημα κατά την εκπόνηση της διδακτορικής διατριβής. Σημαντική ήταν επίσης η βοήθεια της λέκτορα κ. Α. Φυτιάνου στην πραγματοποίηση του βιοχημικού μέρους της μελέτης, την οποία και ευχαριστώ ιδιαίτερα. Θα ήθελα επίσης να ευχαριστήσω τον αναπληρωτή καθηγητή της Επιδημιολογίας του Τμήματος Κτηνιατρικής του Πανεπιστημίου Θεσσαλίας κ. Λ. Λεοντίδη για τη βοήθεια στη στατιστική επεξεργασία των αποτελεσμάτων και τον επίκουρο καθηγητή του Τμήματος Κτηνιατρικής του Πανεπιστημίου Θεσσαλίας κ. Χ. Μπιλίνη για την πραγματοποίηση των εξετάσεων με PCR. Επιπλέον, ευχαριστώ τον επίκουρο καθηγητή του Τμήματος Κτηνιατρικής του Πανεπιστημίου Θεσσαλίας κ. Μ. Σαριδομιχελάκη και τον λέκτορα της Κλινικής των Ζώων Συντροφιάς (Μονάδα Παθολογίας), της

7

Κτηνιατρικής Σχολής του Α.Π.Θ., κ. Μ. Μυλωνάκη για την επιστημονική τους υποστήριξη και τις πολύτιμες συμβουλές τους. Ιδιαίτερες ευχαριστίες απευθύνω στο διευθυντή της Αιματολογικής Κλινικής του Θεαγένειου Νοσοκομείου ιατρό - αιματολόγο κ. Κ. Ζέρβα για την ανεκτίμητη επιστημονική του συμβολή, όπως επίσης και στον στρατιωτικό κτηνίατρο κ. Χ. Χατζηγιαννάκη για την ηθική του υποστήριξη. Ευχαριστώ επίσης τους φίλους, κτηνιάτρους και υποψήφιους διδάκτορες της Κλινικής των Ζώων Συντροφιάς (Μονάδα Παθολογίας) κκ. Θεόδωρο Πετανίδη και Ουρανία Φαρμάκη για την ανιδιοτελή και πολύτιμη συμμετοχή τους στην πραγματοποίηση του κλινικού μέρους της μελέτης και τους μετεκπαιδευόμενους κτηνιάτρους στην Κλινική των Ζώων Συντροφιάς (Μονάδα Παθολογίας) που μου συμπαραστάθηκαν με κάθε τρόπο. Τους ζωοκόμους της ίδιας Κλινικής κκ. Σ. Ζησόπουλο και Κ. Κλωνή ευχαριστώ για την περιποίηση και φροντίδα των υπό θεραπεία σκύλων της μελέτης. Θερμά επίσης ευχαριστώ το Ίδρυμα Κρατικών Υποτροφιών που με στήριξε οικονομικά. Στους γονείς μου και τον αδερφό μου εκφράζω τη βαθειά μου ευγνωμοσύνη για την πολύπλευρη υποστήριξη και συνδρομή τους σε όλες τις δύσκολες στιγμές. Από τον πρόλογο αυτό δε θα μπορούσα να παραλείψω να εκφράσω τις θερμές μου ευχαριστίες στον καθηγητή της Κλινικής των Ζώων Συντροφιάς (Μονάδα Παθολογίας), και θείο μου Αλέξανδρο Φ. Κουτίνα. Η αμέριστη συμπαράστασή του, η ανιδιοτελής προσφορά της επιστημονικής του αυθεντίας και η αγάπη του αποτέλεσαν τη βάση για την ολοκλήρωση της προσπάθειας αυτής, την οποία και του αφιερώνω.

8

ΜΕΡΟΣ ΠΡΩΤΟ

ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΚΗ ΑΝΑΣΚΟΠΗΣΗ

A. Η ΛΕΙΣΜΑΝΙΩΣΗ ΣΤΟ ΣΚΥΛΟ

1. Εισαγωγή

Η λεϊσμανίωση στο σκύλο προκαλείται από το ενδοκυτταρικό πρωτόζωο που ανήκει στο γένος

Leishmania (φύλο Sarcomastigophora, τάξη Kinetoplastida,

οικογένεια Trypanosomatidae) (Kassai και συν. 1998). Στο βιολογικό κύκλο του παρασίτου αυτού υπεισέρχονται δύο εξελικτικές μορφές, η προμαστιγοφόρος και η αμαστιγοφόρος (Lainson και Shaw 1987). Τα 30 περίπου είδη του γένους Leishmania, που έχουν βρεθεί σε διάφορες περιοχές της γης, εκτός από την Ωκεανία (World Health Organization 1990), μπορεί να μολύνουν τον άνθρωπο, το σκύλο, άγρια είδη της οικογένειας των Canidae (π.χ. αλεπού, τσακάλι), το άλογο, το πρόβατο, τη γάτα και διάφορα είδη τρωκτικών, πτηνών και ερπετών (Van der Lugt και συν. 1992, Barnes και συν. 1993, Slappendel και Ferrer 1998, Ozon και συν. 1998). Η προκαλούμενη πολυσυστηματική νόσος στο σκύλο, όπως εμφανίζεται στις παραμεσόγειες χώρες και την Πορτογαλία, οφείλεται στη L. infantum, ενώ η αντίστοιχη της Κεντρικής και Νότιας Αμερικής στη γενετικά ταυτόσημη L. chagasi (Slappendel και Ferrer 1998, Mauricio και συν. 1999, Baneth 2005).

9

Η μετάδοση της L. infantum γίνεται με τις σκνίπες του γένους Phlebotomus sp. στην Ευρώπη, Ασία και Αφρική και Lutzomyia sp. στην Αμερική (World Health Organization 1990, Ferrer 1992, Baneth 2005). Στα είδη των σκνιπών που βρέθηκαν στην Ελλάδα περιλαμβάνονται τα Phlebotomus neglectus, P. perfiliewi, P. sergenti, P. tobbi, P. simici, P. papatasi, P. balcanicus, P. alexandri, P. mascitti, Sergentomyia dentate, S. minuta και S. theodori (Leger και συν. 1988, World Health Organization 1990, Chaniotis και συν. 1994, Papadopoulos και Tselentis 1994, Χαραλαμπίδης 1998) η δραστηριότητα των οποίων διαρκεί από τις αρχές Μαΐου μέχρι το τέλος Νοεμβρίου (Chaniotis και συν. 1994). Στους ενδιάμεσους αυτούς ξενιστές το παράσιτο αντιπροσωπεύεται από την προμαστιγοφόρο μορφή, που έχει μήκος 10-15 μm και κινείται με τη βοήθεια μαστιγίου μήκους 20 μm (Molyneux και Killick- Kendrick 1987). Ύστερα από τον ενοφθαλμισμό τους στο δέρμα του τελικού ξενιστή από τις θηλυκές σκνίπες, οι προμαστιγοφόρες μορφές φαγοκυτταρώνονται από τα αντιγονοπαρουσιαστικά κύτταρα του Langerhans (επιδερμίδα), από τα δενδριτικά κύτταρα (χόριο) και από τα μακροφάγα κύτταρα στα οποία μεταπίπτουν στην ωοειδή αμαστιγοφόρο μορφή (2-5 μm x 1,5-2 μm), που χαρακτηρίζεται από την παρουσία του ραβδοειδή κινητοπλάστη, ενός πλούσιου σε DNA μιτοχόνδριο (Χαραλαμπίδης 1998). Οι αμαστιγοφόρες μορφές πολλαπλασιάζονται με απλή διαίρεση μέχρι τη ρήξη των παρασιτούμενων κυττάρων για να φαγοκυτταρωθούν στη συνέχεια από άλλα μακροφάγα κύτταρα· η όλη διαδικασία επαναλαμβάνεται κάθε 12 - 24 ώρες (Chang και συν. 1985, Mehlhorn και Piekarski 1985, Molyneux και KillickKendric 1987, Bray και Alexander 1987, Alexander και Russel 1992). Οι θηλυκές σκνίπες με τη σειρά τους μολύνονται όταν, κατά τη μύζηση αίματος από μολυσμένους ή άρρωστους από λεϊσμανίωση σκύλους, προσλάβουν τις αμαστιγοφόρες μορφές, που θα

10

μετατραπούν σε προμαστιγοφόρες μορφές στον πεπτικό σωλήνα και θα μεταναστεύσουν στο φάρυγγα και τα στοματικά μόρια για να ακολουθήσει νέος ενοφθαλμισμός σε άλλους σκύλους, ανθρώπους ή ενδεχομένως άλλα είδη ζώων (Killick – Kendrick 1990, Ferrer 1992). Η κάθετη και απευθείας μετάδοση του παρασίτου κατά την κυοφορία και τη μετάγγιση αίματος, αντίστοιχα, είναι αρκετά σπάνιες (Bravo και συν. 1993, Slappendel και Ferrer 1998, Owens και συν. 2001, Baneth 2005) αν και σχετικά πρόσφατη επιδημιολογική μελέτη στην Ισπανία έδειξε ότι υπάρχει εντυπωσιακή αύξηση της συχνότητας της νόσου μεταξύ των χρηστών ηρωΐνης, και ιδιαίτερα εκείνων που είναι φορείς του HIV (Cruz και συν. 2002). Η L. infantum έχει επίσης απομονωθεί από το πεπτικό σύστημα του κρότωνα Rhipicephalus sanguineus, χωρίς όμως να έχει εξακριβωθεί ο ρόλος του στη μετάδοσή της. Τέλος, δεν μπορεί να αποκλειστεί η πιθανότητα της άμεσης μετάδοσης μέσω των ανοιχτών τραυμάτων και των δερματικών ελκών (Ferrer 1992, Kontos και Koutinas 1993, Bravo και συν. 1993, Slappendel και Ferrer 1998, Owens και συν. 2001, Baneth 2005).

2. Επιζωοτιολογικά στοιχεία

Η λεϊσμανίωση του σκύλου (ΛΣ) είναι ενζωοτικού χαρακτήρα λοιμώδες νόσημα των παραμεσογειακών χωρών και της Πορτογαλίας, στις οποίες έχουν απομονωθεί τα είδη L. infantum, L. tropica και L. major (Belazzoug 1992). Αν και η λεϊσμανίωση του ανθρώπου που οφείλεται στη L. infantum (σπλαχνική και δερματική μορφή) εμφανίζεται πολύ σπανιότερα απ’ ό,τι στο σκύλο (π.χ. 1/100.000 ανθρώπους στη Ν. Γαλλία), το

11

γεγονός ότι πολλοί ασθενείς εξακολουθούν να μη δηλώνονται στις νομιατρικές υπηρεσίες, παρά τη σχετική νομοθεσία, φαίνεται να υποβαθμίζει τη συχνότητά της (Σαρόγλου 2001). Δεν υπάρχει αμφιβολία ότι ο σκύλος, που είναι η κύρια πηγή της L. Infantum, υπεισέρχεται άμεσα στην επιδημιολογία της αντίστοιχης νόσου του ανθρώπου (ζωοανθρωπονόσος) σε πολλές περιοχές του πλανήτη (World Health Organization 1990). Σε εκτεταμένες οροεπιζωοτιολογικές έρευνες που έγιναν στην Ισπανία, τη Γαλλία, την Ιταλία και την Πορτογαλία υπολογίστηκε ότι ο αριθμός των μολυσμένων σκύλων ανέρχεται στα 2,5 περίπου εκατομμύρια (Moreno και Alvar 2002). Επίσης, υπάρχουν πολλά εκατομμύρια μολυσμένων σκύλων στη Νότια Αμερική και έχουν αναφερθεί υψηλά ποσοστά μόλυνσης σε ορισμένες περιοχές της Βραζιλίας (Baneth 2005). Στην Ελλάδα και τις άλλες παραμεσόγειες χώρες η ΛΣ είναι το συχνότερο πρωτοζωϊκό νόσημα του σκύλου αφού το ποσοστό των ορολογικά ή/και PCR θετικών ζώων ενδέχεται να προσεγγίζει το 80% (Berrahal και συν. 1996, Zaffaroni και συν. 1999, Dereure και συν. 1999, Sideris και συν. 1999, Χαραλαμπίδης και Διάκου 1999, Solano – Gallego και συν. 2001a, Leontides και συν. 2002). Τα σχετικά χαμηλά ποσοστά μόλυνσης που είχαν αναφερθεί στο παρελθόν (1-42%) πιθανόν να οφείλονταν στην αδυναμία των ορολογικών δοκιμών να ανιχνεύσουν τα μολυσμένα αλλά όχι οροθετικά ζώα (Leontides και συν. 2002, Baneth 2005). Αν και τα περισσότερα περιστατικά σε σκύλους που έχουν διαπιστωθεί στη Βόρεια και Κεντρική Ευρώπη είναι το αποτέλεσμα μόλυνσης κατά την προσωρινή παραμονή των ιδιοκτητών τους (π.χ. τουρισμός) στις ενζωοτικές περιοχές της Νότιας κυρίως Ευρώπης (Slappendel και Ferrer 1998, Trees και Shaw 1999), η ύπαρξη αυτόχθονων εστιών της L. infantum πιθανόν να ευθύνεται για την πρόσφατη αύξηση των περιστατικών της νόσου στις βόρειες χώρες (Baneth 2005).

12

3. Παθογένεια

Κάτω από φυσικές συνθήκες, οι θηλυκές σκνίπες ενοφθαλμίζουν μικρό αριθμό προμαστιγοφόρων μορφών (100 – 1000) στο σκύλο, που είναι όμως αρκετός για την πρόκληση της νόσου στα ευαίσθητα ζώα. Αν και τα περισσότερα παράσιτα εξουδετερώνονται από τους παράγοντες του συμπληρώματος, μικρός αριθμός τους καταφέρνει να επιβιώσει επιστρατεύοντας διάφορους μηχανισμούς άμυνας (Ferrer 2002). Οι προμαστιγοφόρες μορφές, μετά την είσοδό τους στο δέρμα του σκύλου, προσκολλούνται γρήγορα πάνω στην κυτταρική μεμβράνη των κυττάρων του Langerhans (επιδερμίδα), των δενδριτικών και των μακροφάγων κυττάρων (χόριο), κυρίως μέσω των τύπου Ι (CR1, CD35) και τύπου ΙΙΙ (CR3, CD11b/CD18) υποδοχέων του συμπληρώματος. Μετά τη διεργασία της φαγοκυττάρωσης, που ακολουθεί εκείνη της προσκόλλησης, οι κινητές προμαστιγοφόρες μορφές μετατρέπονται στις ακίνητες αμαστιγοφόρες μέσα στα φαγολυσοσωμάτια. Η μη αποδόμηση του πρωτόζωου μέσα στα φαγολυσοσωμάτια έχει αποδοθεί στην πρωτεολυτική δράση της γλυκοπρωτεΐνης gp63 (Solbach και Laskay 2000). Ο ενοφθαλμισμός του παρασίτου στο δέρμα προκαλεί τοπική φλεγμονή στην αρχική φάση της οποίας συμμετέχουν τα ουδετερόφιλα και τα εωσινόφιλα με την ταυτόχρονη παρουσία των φυσικών φονικών κυττάρων (NK cells), για να εμφανιστούν στη συνέχεια τα μακροφάγα και τα λεμφοκύτταρα (Cotran και συν. 1999). Στα ευαίσθητα ζώα το παράσιτο, μέσα σε λίγες ώρες από τον ενοφθαλμισμό, διασπείρεται από το χόριο στα λεμφογάγγλια, το σπλήνα και το μυελό των οστών, ενώ στα ανθεκτικά

13

παραμένει εντοπισμένο στο δέρμα και ενδεχομένως τα επιχώρια λεμφογάγγλια, όπου τα ΝΚ κύτταρα περιορίζουν τη διασπορά του παρασίτου, παράγοντας, ύστερα από προηγούμενη διέγερσή τους με λεϊσμανιακά αντιγόνα, γρήγορα και μαζικά IFN-γ και IL12 (Belkaid και συν. 2000, Solback και Laskay 2000). Στο 30 - 50% των σκύλων, που ζουν στις ενζωοτικές περιοχές της νόσου, έχει διαπιστωθεί ότι η ενδοδερμική αντίδραση στη λεϊσμανίνη είναι θετική, γεγονός που υποδηλώνει ότι η βασική ανοσολογική τους απάντηση είναι κυτταρικού τύπου (Cabral και συν. 1998, Cardoso και συν. 1998, Ferrer 1999). Η καθυστερημένου τύπου αυτή αντίδραση παρατηρείται στους ανθεκτικούς απέναντι στη νόσο σκύλους που έχουν εκτεθεί στο παράσιτο, ενώ απουσιάζει σ’ εκείνους που προσκομίζονται με βαρειά κλινική εικόνα (Pinelli και συν. 1995, Solano – Gallego και συν. 2000, Solano – Gallego και συν. 2001a). Η ανοσολογική απάντηση του κάθε σκύλου προφανώς επηρεάζεται όχι μόνο από κληρονομικούς παράγοντες αλλά και από τις αντιπηκτικές, αγγειοδιασταλτικές και ανοσορρυθμιστικές (μαξαδιλάνη) ουσίες που ενοφθαλμίζονται στο δέρμα από τις σκνίπες τη στιγμή της αιμομύζησης. Με τον τρόπο αυτό καθορίζεται αν η L. infantum θα εξουδετερωθεί, θα παραμείνει σε λανθάνουσα μορφή ή θα προκαλέσει κλινική νόσο σε κάποια στιγμή της ζωής του σκύλου (Ribeiro 1989, Solano – Gallego και συν. 2000, Day 2005). Στην πρώτη περίπτωση παράγονται Th1 βοηθητικά λεμφοκύτταρα που απελευθερώνουν προστατευτικές κυτταροκίνες (IFN-γ, IL-12, TNF-a), που με τη σειρά τους ενεργοποιούν τα μακροφάγα για την εξουδετέρωση του παρασίτου κυρίως μέσω της παραγωγής ελεύθερων ριζών Ο2- και μονοξειδίου του αζώτου (ΝΟ) (Pinelli και συν. 1994, Pinelli και συν. 1999, Ferrer 2002, Baneth 2005). Στη δεύτερη περίπτωση

14

ενεργοποιούνται τα Th2 λεμφοκύτταρα τα οποία μέσω της απελευθέρωσης των ιντερλευκινών IL-4, IL-5, IL-6, IL-10 και IL-13, ευνοούν τον ανεξέλεγκτο πολλαπλασιασμό του παρασίτου και τη διέγερση της χυμικής ανοσίας (IgG αντισώματα) (Slappendel και Ferrer 1998, Pinelli και συν. 1999, Baneth 2005). Επισημαίνεται ότι η ενεργοποίηση των παραπάνω μηχανισμών έχει εξακριβωθεί στα ποντίκια και τον άνθρωπο (Reiner 1994, Pinelli και συν. 1994, Kemp και συν. 1996), ενώ στους συμπτωματικούς σκύλους συμπεραίνεται έμμεσα από τη μειωμένη παραγωγή των IFN-γ και ΤNF-α και του αριθμού των CD4+ ή/και CD8+ λεμφοκυττάρων (Pinelli και συν. 1994, Bourdoiseau και συν. 1997, Cabral και συν. 1998, Moreno και συν. 1999, Pinelli και συν. 1999, Ferrer 2002). Παράλληλα, η ενεργοποίηση των Β-λεμφοκυττάρων οδηγεί στην υπερπαραγωγή IgG αντισωμάτων, τα οποία ευθύνονται για το σχηματισμό ανοσοσυμπλόκων στο αίμα ή τα όργανα – στόχους (Ferrer 1999, Pinelli και συν. 1999). Η εναπόθεση των ανοσοσυμπλόκων στα τελευταία και η φλεγμονή που ακολουθεί φαίνεται να εξηγούν τις παθολογικές εκείνες καταστάσεις που χαρακτηρίζουν την κλινική εικόνα της νόσου όπως για παράδειγμα η αγγειίτιδα, η δερματίτιδα, η πολυμυΐτιδα, η πολυαρθρίτιδα, η ραγοειδίτιδα και η σπειραματονεφρίτιδα (Ferrer 1992, Koutinas και συν. 1993, Koutinas και συν. 1999b, Slappendel και Ferrer 1998, Vamvakidis και συν. 2000). Στους ευαίσθητους σκύλους, τα συμπτώματα και οι αλλοιώσεις της νόσου εμφανίζονται σε διάστημα που κυμαίνεται από 3 μήνες μέχρι 7 χρόνια (Slappendel και Ferrer 1998). Στα όργανα του λεμφοποιητικού συστήματος οι περιοχές των Τλεμφοκυττάρων υποπλάσσονται, σε αντίθεση με εκείνες των Β-λεμφοκυττάρων και των αντιγονοπαρουσιαστικών ιστιοκυττάρων και των μακροφάγων που υπερπλάσσονται,

15

γεγονός που εξηγεί τη γενικευμένη λεμφογαγγλιομεγαλία και την ηπατοσπληνομεγαλία (Guarga και συν. 2000). Μετά τη διασπορά της L. infantum στους περισσότερους ιστούς και όργανα, προκαλείται κοκκιωματώδης φλεγμονή στην οποία ο αριθμός των παρασίτων ποικίλλει σε μεγάλο βαθμό (Buracco και συν. 1988, Engwerda και Kaye 2000). Η ευαισθησία ή ανθεκτικότητα των σκύλων στη ΛΣ φαίνεται ότι προκαθορίζεται γενετικά (Baneth 2005). Στην ισπανική φυλή Ibizan hound η συχνότητα εμφάνισης της συμπτωματικής μορφής είναι χαμηλότερη απ’ ό,τι στις άλλες φυλές επειδή η ανοσολογική απάντηση των ζώων της φυλής αυτής είναι κυρίως κυτταρικού τύπου (Solano – Gallego και συν. 2000). Τα αποτελέσματα μελέτης πάνω στον πολυμορφισμό του γονιδίου NRAMP1 του σκύλου, που κωδικοποιεί την παραγωγή πρωτεΐνης – φορέα του σιδήρου για τον έλεγχο του ρυθμού της ενδοφαγολυσοσωματικής διαίρεσης του παρασίτου, και την ενεργοποιήση των μακροφάγων, φαίνεται να δείχνουν ότι στους ευαίσθητους στη L. infantum σκύλους το γονίδιο αυτό είναι μεταλλαγμένο (Altet και συν. 2002). Σε ενζωοτικές περιοχές της ΛΣ στη Βραζιλία, ο τύπου ΙΙ γενότυπος DLA – DRB1, ο οποίος στο σκύλο αντιπροσωπεύεται από το αλληλόμορφο γονίδιο του MHC-II, έχει συνδεθεί με την προδιάθεση κλινικής εκδήλωσης της νόσου (Quinell και συν. 2003).

4. Κλινική εικόνα και πρόγνωση

Η ΛΣ είναι πολυσυστηματικό νόσημα που έχει χρόνια εξέλιξη και εκδηλώνεται με πληθώρα παθολογικών καταστάσεων και κλινικών συνδρόμων (Ciaramella και συν. 1997, Slappendel και Ferrer 1998, Koutinas και συν. 1999a). Μέχρι σήμερα δεν έχει

16

αναφερθεί προδιάθεση ως προς το φύλο, το μέγεθος ή την ηλικία των σκύλων, με πιθανή εξαίρεση τα κυνάρια στα οποία η νόσος εμφανίζεται σπάνια, πιθανότατα λόγω του μεγάλου χρόνου επώασης (Ferrer 1992). Στη νόσο αυτή φαίνεται ότι τελικά μπορούν να προσβληθούν όλα σχεδόν τα όργανα και συστήματα του οργανισμού (Ferrer και συν. 1988, Nieto και συν. 1996, Slappendel και Ferrer 1998, Vinuelas και συν. 2001). Στα συχνότερα αίτια προσκόμισης για εξέταση των άρρωστων σκύλων περιλαμβάνονται η μείωση της όρεξης, η προοδευτική απώλεια του σωματικού βάρους, η εύκολη κόπωση, οι δερματικές και οφθαλμικές αλλοιώσεις, η χωλότητα, η χρόνια νεφρική ανεπάρκεια και η επίσταξη (Ciaramella και συν. 1997, Koutinas και συν. 1999a). Στο δέρμα προκαλούνται αποφολιδωτική δερματίτιδα, άτονα έλκη (χείλη πτερυγίων αυτιών, οστέινες προεξοχές ή σημεία συμπίεσης, βλεννογονοδερματικά όρια), δερματικά οζίδια ή πλάκες, φλυκταινώδης δερματίτιδα, υπερκεράτωση των πελματικών φυμάτων ή/και του ακρορρινίου, παρονυχία και ονυχογρύπωση που εμφανίζονται μεμονωμένα ή σε διάφορους συνδυασμούς (Koutinas και συν. 1993, Ferrer 1999). Σπάνια μπορεί να προκληθεί και άσηπτη οζώδης υποδερματίτιδα ή οζίδια στους ορατούς βλεννογόνους (Font και συν. 1996). Η συχνότερη στην πράξη αποφολιδωτική δερματίτιδα, που εκδηλώνεται με υποτρίχωση – αλωπεκία, ερύθημα ή υπερχρωμία, ψωριόμορφη ή/και πιτυρόμορφη φολίδωση, εφελκίδωση, ξηροδερμία και ξηροτριχία, συνηθέστερα εντοπίζεται στην κεφαλή, τα πτερύγια των αυτιών και τα άκρα (Koutinas και συν. 1993, Koutinas και συν. 1999a). Στις

εξίσου

συχνές

παθολογικές

καταστάσεις

από

τους

οφθαλμούς

περιλαμβάνονται η βλεφαρίτιδα, ο φλέγμονας της οφθαλμικής κόγχης, η κοκκιωματώδης επιπεφυκίτιδα, η ξηρή κερατοεπιπεφυκίτιδα, η πρόσθια ραγοειδίτιδα, το γλαύκωμα

17

κλειστής γωνίας, η αποκόλληση και ατροφία του αμφιβληστροειδή χιτώνα και η πανοφθαλμίτιδα (Pena και συν. 2000, Roze 2002). Οι αλλοιώσεις αυτές προκαλούνται κυρίως από την εναπόθεση ανοσοσυμπλόκων στα διάφορα ανατομικά στοιχεία του οφθαλμού (Slappendel 1988, Ferrer 1992, Garcia – Alonso και συν. 1996). Η περιφερική λεμφογαγγλιομεγαλία είναι ίσως το συχνότερο εύρημα της κλινικής εξέτασης (Koutinas και συν. 1999a, Ferrer 1999), ενώ η ηπατομεγαλία και η σπληνομεγαλία παρατηρούνται σπανιότερα, προφανώς επειδή δε γίνονται εύκολα αντιληπτές κατά την ψηλάφηση της κοιλιακής κοιλότητας (Koutinas και συν. 1999a). Πυρετός διαπιστώνεται συνήθως στην οξεία μορφή της νόσου, που εμφανίζεται στο 5% περίπου των άρρωστων σκύλων και κλινικά μοιάζει αρκετά με την αντίστοιχη μορφή της μονοκυτταρικής ερλιχίωσης και της πιροπλάσμωσης (Ciaramella και συν. 1997, Koutinas και συν. 1999a). Η προοδευτική απώλεια του σωματικού βάρους, που μπορεί να οδηγήσει σε απίσχνανση ή καχεξία, δε συνοδεύεται συνήθως από παράλληλη μείωση της όρεξης, ενώ όταν συνδυάζεται

με

κατάπτωση,

μυϊκή αδυναμία,

πολυουρία/πολυδιψία

και

σποραδικούς εμέτους τις περισσότερες φορές υποδηλώνει την εγκατάσταση χρόνιας νεφρικής ανεπάρκειας (Koutinas και συν. 1999a, Baneth 2005, Plevraki και συν. 2006). Στις συνήθεις κλινικές εκδηλώσεις περιλαμβάνονται η συμμετρική ατροφία των μασητήριων μυών, που έχει διαπιστωθεί ότι οφείλεται σε χρόνια πολυμυΐτιδα (Vamvakidis

και

συν.

2000),

και

η

επίσταξη,

που

οφείλεται

στη

χρόνια

λεμφοπλασμοκυτταρική ή/και κοκκιωματώδη ρινίτιδα, με ή χωρίς διαβρώσεις και έλκη σε συνδυασμό με τη θρομβοκυτταροπενία ή/και τη θρομβοκυτταροπάθεια που

18

αποδίδεται στη συνδυασμένη δράση της παραπρωτεϊναιμίας και της αζωθαιμίας (Juttner και συν. 2001, Πετανίδης Θ.: προσωπική επικοινωνία, 2005). Ορισμένα ζώα παρουσιάζουν χωλότητα και δυσκολία στην ανέγερση και μετακίνηση εξαιτίας της πολυαρθρίτιδας, της οστεομυελίτιδας, της ονυχογρύπωσης – παρονυχίας ή της υπερκεράτωσης – εξέλκωσης των πελματικών φυμάτων (Slappendel 1988, Koutinas και συν. 1993, Spreng 1993, Wolschrijn και συν. 1996, Buracco και συν. 1988, Koutinas και συν. 1999a). Ακόμη λιγότερα είναι τα ζώα εκείνα που εμφανίζουν υποδόρια οιδήματα και ύδρωπες λόγω της έντονης πρωτεϊνουρίας (νεφρωσικό σύνδρομο) ή της αγγειίτιδας από ανοσοσύμπλοκα (Κουτίνας Α.: προσωπική επικοινωνία 2006). Η χρόνια ηπατίτιδα, η χρόνια κολίτιδα και η εστιακή εντερίτιδα, που κλινικά εκδηλώνονται σχετικά σπάνια, πιθανότατα προκαλούνται από την άμεση δράση του παρασίτου στα μακροφάγα κύτταρα του ήπατος και τα επιθηλιακά κύτταρα του βλεννογόνου του εντέρου, αντίστοιχα (Ferrer και συν. 1991, Ferrer 1992, Valladares και συν. 1997, Koutinas και συν. 1999a, Rallis και συν. 2005). Στα ακόμα σπανιότερα κλινικά σύνδρομα και παθολογικές καταστάσεις, που έχουν κατά κάποιο τρόπο συνδεθεί παθογενετικά με τη L. infantum, περιλαμβάνονται ο καρδιακός επιπωματισμός (Font και συν. 1993), η φυλλώδης πέμφιγα (Ginel και συν. 1993), η οξεία παγκρεατίτιδα (Carrasco και συν. 1997), η μηνιγγίτιδα (Vinuelas και συν. 2001) και ο υποθυρεοειδισμός (Cortese και συν. 1999). Η πρόγνωση στη ΛΣ εξαρτάται από την έκταση και το βαθμό έντασης των αλλοιώσεων στα διάφορα όργανα κατά τη στιγμή της διάγνωσης. Η αντιλεϊσμανιακή θεραπεία τις περισσότερες φορές βελτιώνει σε μεγάλο βαθμό την κλινική εικόνα και περιορίζει ή αναστέλλει την εξέλιξη της νόσου. Επειδή όμως δεν επιτυγχάνεται, παρά

19

μόνο σε μικρό ποσοστό, μόνιμη παρασιτολογική ίαση, η διακοπή της θεραπείας αυτής συχνά προκαλεί κλινικές υποτροπές (Baneth και συν. 2005). Εξαίρεση αποτελούν τα ζώα εκείνα που εμφανίζουν 3ου σταδίου νεφρική ανεπάρκεια (ουραιμικό σύνδρομο) στα οποία η πρόγνωση είναι εκ προοιμίου δυσμενής (Koutinas και συν. 1999a). Το ίδιο φαίνεται ότι ισχύει για τους σκύλους εκείνους που προσκομίζονται με κίρρωση του ήπατος (από χρόνια ηπατίτιδα), χρόνια οστεοαρθρίτιδα (από πολυαρθρίτιδα) ή γλαύκωμα κλειστής γωνίας (από ραγοειδίτιδα) (Koutinas και συν. 1999a).

5. Αιματολογικές και βιοχημικές διαταραχές στο αίμα

Στις συχνότερες αιματολογικές διαταραχές περιλαμβάνονται η ορθόχρωμη – ορθοκυτταρική αναιμία που δεν είναι αναγεννητική και πιθανότατα οφείλεται στη χρόνια φλεγμονή ή/και τη χρόνια νεφρική ανεπάρκεια. Αναιμία επίσης μπορεί να εμφανιστεί λόγω οξείας ή χρόνιας απώλειας αίματος (π.χ. επίσταξη) και σπανιότερα λόγω μυελοκαταστολής ή αιμόλυσης (Slappendel 1988, Koutinas και συν. 1999a, Lobetti 2002, Baneth 2005). Στην παθογένεια της τελευταίας φαίνεται ότι υπεισέρχονται ανοσολογικοί μηχανισμοί (π.χ. αυτοαντισώματα, ανοσοσύμπλοκα) αφού σε περιστατικά της νόσου με αιμολυτική αναιμία η δοκιμή κατά Coomb τις περισσότερες φορές είναι θετική και στο αίμα ανιχνεύονται αντιπυρηνικά αντισώματα (Baneth και συν. 2005). Τα ανοσοσύμπλοκα ενδέχεται να περιέχουν και κρυοσφαιρίνες που ευθύνονται για την αιμοσυγκόλληση στα αγγεία των ακροτελεύτιων σημείων του σώματος (π.χ. ουρά, δάκτυλοι, χείλη πτερυγίων των αυτιών), εφόσον τα ζώα εκτεθούν στο ψύχος, με

20

αποτέλεσμα την πρόκληση ισχαιμικής νέκρωσης (Slappendel και Greene 1990). Εξίσου συχνή είναι και η θρομβοκυτταροπενία που πιστεύεται ότι οφείλεται στα κυκλοφορούντα ανοσοσύμπλοκα, τον εγκλωβισμό των αιμοπεταλίων στο σπλήνα, τα αντιαιμοπεταλιακά αντισώματα ή σπανιότερα τη μυελοκαταστολή (Baneth 2005). Σε μικρό αριθμό περιστατικών μπορεί επίσης να εμφανιστεί λευκοκυττάρωση (Ciaramella και συν. 1997, Koutinas και συν. 1999a) ή λευκοπενία (Slappendel 1988). Η πολυκλωνική ή πολύ σπανιότερα οι μονοκλωνικές β ή γ και δικλωνικές β και γ υπερσφαιριναιμίες, ευθύνονται για την υπερπρωτεϊναιμία (πολυκλωνική – δικλωνική) και ενδεχομένως το σύνδρομο του υπεριξώδους (Groulade και Person 1987, Baneth και συν. 2005). Η πολυκλωνική υπερσφαιριναιμία είναι ίσως το συχνότερο εργαστηριακό εύρημα στη ΛΣ (Baneth 2005, Baneth και συν. 2005). Η συχνή μείωση του λόγου λευκωματινών/σφαιρινών στον ορό του αίματος βασικά αποδίδεται στη συνυπάρχουσα υπολευκωματιναιμία που οφείλεται στην έντονου βαθμού πρωτεϊνουρία από τη χρόνια σπειραματονεφρίτιδα και σπανιότερα στη μακροχρόνια μείωση της όρεξης ή τη χρόνια ηπατική ανεπάρκεια από τη χρόνια ηπατίτιδα (Slappendel 1988, Ciaramella και συν. 1997, Koutinas και συν. 1999a, Rallis και συν. 2005). Από τα άλλα βιοχημικά ευρήματα στον ορό του αίματος συχνότερα παρατηρούνται υπερκρεατινιναιμία, αύξηση της συγκέντρωσης του αζώτου ουρίας, υπερφωσφαταιμία και διαταραχές των ηλεκτρολυτών ή/και της οξεοβασικής ισορροπίας, που υποδηλώνουν την εγκατάσταση χρόνιας νεφρικής ανεπάρκειας (Ciaramella και συν. 1997, Slappendel και Ferrer 1998, Koutinas και συν. 1999a, Baneth 2005). Τέλος, μπορεί να διαπιστωθεί, αν και σπανιότερα, αύξηση της δραστηριότητας των ηπατικών ή/και των

21

μυϊκών ενζύμων (Ciaramella και συν. 1997, Koutinas και συν. 1999a, Vamvakidis και συν. 2000).

6. Διαγνωστικές μέθοδοι

Παρά την υψηλή συχνότητα εμφάνισης της ΛΣ στις περιοχές όπου ενδημεί, η διάγνωση συχνά είναι δύσκολη λόγω του μεγάλου αριθμού ασυμπτωματικών ζώων (αρχικό στάδιο της νόσου, μακρά περίοδος επώασης), του μη παθογνωμονικού χαρακτήρα της κλινικής εικόνας και των πολλών άτυπων κλινικών μορφών της (Blavier και συν. 2001, Solano – Gallego και συν. 2001b, Gradoni 2002, Lamothe 2002). Για την εργαστηριακή επιβεβαίωση έχουν χρησιμοποιηθεί κατά καιρούς και εξακολουθούν να χρησιμοποιούνται διάφορες παρασιτολογικές, ορολογικές, μοριακές, καλλιεργητικές, ξενοδιαγνωστικές, ιστοπαθολογικές, ανοσοϊστοχημικές και ανοσολογικές μέθοδοι από τις οποίες μόνο οι τρεις πρώτες εφαρμόζονται συχνά στην κλινική πράξη (Σαριδομιχελάκης και Κουτίνας, 2002).

Παρασιτολογική εξέταση (άμεση μικροσκόπηση)

Επειδή η άμεση μικροσκοπική εξέταση για την ανεύρεση των αμαστιγοφόρων μορφών του παρασίτου σε βαμμένα με τη μέθοδο Giemsa επιχρίσματα από οπό λεμφογαγγλίου ή μυελό των οστών είναι εξαιρετικά ειδική (100%) και ταυτόχρονα εύκολη και ανέξοδη, χρησιμοποιείται ως μέθοδος αναφοράς από αρκετούς ερευνητές,

22

ιδιαίτερα στους συμπτωματικούς σκύλους (Gradoni 2002, Saridomichelakis και συν. 2005a). Σε σχετικά πρόσφατη μελέτη διαπιστώθηκε ότι η ευαισθησία της μεθόδου μπορεί να φτάσει το 93% για τα λεμφογάγγλια και το 88% για το μυελό των οστών, ύστερα από τη μικροσκοπική εξέταση 1000 οπτικών πεδίων (x1000) (Saridomichelakis και συν. 2005a).

Χαμηλότερη

ευαισθησία

παρουσιάζει

η

μικροσκοπική

εξέταση

παρασκευασμάτων από το αρθρικό υγρό, το σπλήνα, το ήπαρ και το περιφερικό αίμα (Slappendel and Ferrer 1998, Abranches και συν. 1991). Στα κυριότερα μειονεκτήματα της άμεσης μικροσκοπικής εξέτασης σε οπό λεμφογαγγλίου ή μυελό των οστών περιλαμβάνονται η χαμηλή ευαισθησία στους ασυμπτωματικούς ιδιαίτερα σκύλους, η ύπαρξη μεγάλου αριθμού σκύλων (>50%) με χαμηλό παρασιτικό φορτίο, ο χρονοβόρος χαρακτήρας της και η επαρκής εξοικείωση και εμπειρία του εξεταστή (Gradoni 2002, Ciaramella και συν. 1997, Saridomichelakis και συν. 2005a).

Ορολογικές μέθοδοι

Με τις μεθόδους αυτές ανιχνεύονται τα ειδικά κατά της L. infantum αντισώματα στον ορό του αίματος των μολυσμένων σκύλων. Σε αντίθεση με τη Βόρεια και Νότια Αμερική, στην οποία οι διασταυρούμενες αντιδράσεις με πρωτόζωα συγγενικά προς αυτά του γένους Leishmania (π.χ. Trypanosoma cruzi, T. rangeli) περιορίζουν αρκετά την ειδικότητα των ορολογικών δοκιμών (Grosjean και συν. 2003), στην Ευρώπη η πιθανότητα αυτή είναι απειροελάχιστη, με αποτέλεσμα η ειδικότητά τους να προσεγγίζει το 100% (Gradoni 2002). Η ευαισθησία των ορολογικών μεθόδων είναι χαμηλή (41%) τους πρώτους μήνες από τη μόλυνση των σκύλων με τη L. infantum (Baneth και συν.

23

2005) ή ενδεχομένως στα περιστατικά εκείνα που εμφανίζουν εντοπισμένες δερματικές αλλοιώσεις (Lamothe 2002) ενώ με την πάροδο του χρόνου αυξάνει στο 93 – 100% (Baneth και συν. 2005). Τα συμπτωματικά ζώα σπάνια μόνο μπορεί να βρεθούν οροαρνητικά (π.χ. τελικό στάδιο χρόνιας νεφρικής ανεπάρκειας, καχεξία) σε αντίθεση με τα ασυμπτωματικά, περιορίζοντας έτσι σημαντικά την αξιοπιστία των ορολογικών μεθόδων όταν χρησιμοποιούνται σε επιζωοτιολογικές έρευνες (Leontides και συν. 2002, Solano-Gallego και συν. 2001a). Η ευαισθησία επηρεάζεται και από τον τύπο του αντιγόνου που χρησιμοποιείται, τη μέθοδο και το όριο του θετικού τίτλου που έχει θεσπίσει το συγκεκριμένο εργαστήριο (Ciaramella και Corona 2003, Gradoni 2002). Επισημαίνεται ότι τελευταία έχει αξιολογηθεί θετικά η χρησιμοποίηση στην ELISA του αντιγόνου rK39 (Scalone και συν. 2002). Όπως προαναφέρθηκε, η ευαισθησία των παραπάνω μεθόδων είναι μεγαλύτερη στους συμπτωματικούς σκύλους, χωρίς όμως να έχει βρεθεί αντιστοιχία μεταξύ του τίτλου των αντισωμάτων και του βαθμού έντασης της κλινικής εικόνας (Ciaramella και Corona 2003, Σαριδομιχελάκης και Κουτίνας 2002), πιθανότατα λόγω του μεγάλου χρονικού διαστήματος που παρεμβάλλεται μεταξύ της μόλυνσης και της ανίχνευσης των αντισωμάτων στον ορό του αίματος (Gradoni 2002). Εξαιτίας της διατήρησης του θετικού τίτλου αντισωμάτων στον ορό του αίματος για αρκετούς μήνες ή χρόνια μετά την παρασιτολογική ίαση του ζώου, η αξία των ορολογικών μεθόδων στην εκτίμηση του θεραπευτικού αποτελέσματος είναι περιορισμένη, ενώ πάντοτε υπάρχει η πιθανότητα κλινικής υποτροπής ακόμη και μετά την αρνητικοποίηση του τίτλου αντισωμάτων (Ciaramella και Corona 2003, Slappendel και Ferrer 1998).

24

Οι ευρύτατα χρησιμοποιημένες στην πράξη ανοσοχρωματογραφικές μέθοδοι του εμπορίου έχουν αμφισβητηθεί από αρκετούς ερευνητές, κυρίως λόγω της έλλειψης επιστημονικών δεδομένων που να επιβεβαιώνουν την αξιοπιστία τους (Σαριδομιχελάκης και Κουτίνας 2002, Gradoni 2002). Σε πρόσφατη μελέτη στην οποία αξιολογήθηκε η διαγνωστική αξία πέντε τέτοιων εμπορικών μεθόδων, η ειδικότητα ήταν ικανοποιητική ενώ η ευαισθησία τους κυμαινόταν μεταξύ 35 και 76%, γεγονός που προφανώς μειώνει την αξιοπιστία τους (Mancianti και συν. 2002). Για το λόγο αυτό η εκτίμηση του αποτελέσματος των μεθόδων αυτών πρέπει να συνδυάζεται με την κλινική – εργαστηριακή εικόνα του ζώου και το αποτέλεσμα της παρασιτολογικής εξέτασης με άμεση μικροσκόπηση ή/και PCR (Σαριδομιχελάκης και Κουτίνας 2002). Στις συνηθέστερα χρησιμοποιούμενες ορολογικές μεθόδους περιλαμβάνονται ο έμμεσος ανοσοφθορισμός (IFAT), η ανοσοενζυμική δοκιμή (ELISA), η dot ELISA, η ανταγωνιστική ELISA, η άμεση συγκόλληση (DAT), η έμμεση αιμοσυγκόλληση (IHAT) και το ανοσοαποτύπωμα Western με ευαισθησία που αγγίζει το 100%, τουλάχιστον για τις πλέον χρησιμοποιούμενες στην πράξη IFAT και ELISA (Martin-Sanchez και συν. 2001, Σαριδομιχελάκης και Κουτίνας 2002, Scalone και συν. 2002, Ciaramella και Corona 2003).

Μοριακές μέθοδοι (αλυσιδωτή αντίδραση της πολυμεράσης ή PCR)

Τα τελευταία χρόνια η PCR, με την οποία ανιχνεύεται το DNA του παρασίτου, αποτελεί τη μέθοδο εκλογής για τη διαπίστωση των μολυσμένων αλλά ασυμπτωματικών σκύλων, την επιβεβαίωση της κλινικής διάγνωσης στα περιστατικά εκείνα στα οποία οι

25

ορολογικές δοκιμές και οι παρασιτολογικές εξετάσεις είναι αρνητικές και την επιβεβαίωση ή όχι της παρασιτολογικής ίασης μετά την αντιλεϊσμανιακή θεραπεία (Saridomichelakis και συν. 2005a, Solano – Gallego και συν. 2001b). Από τα πολλά πρωτόκολλα PCR, που στοχεύουν στην ανίχνευση διαφόρων γονιδίων – στόχων της L. infantum, στην πράξη συνηθέστερα χρησιμοποιούνται το rRNA γονίδιο, ο εσωτερικός εκχωρητής της ριβοσωματιακής οπερόνης και οι υψηλής αντιγραφής αλληλουχίες του DNA του κινητοπλάστη (Lachaud και συν. 2002). Το είδος των βιολογικών υλικών που χρησιμοποιούνται συχνότερα στην PCR (αίμα, δέρμα, οπός λεμφογαγγλίου, μυελός των οστών), φαίνεται ότι επηρεάζει την ευαισθησία της, όπως επίσης ο τρόπος εξαγωγής του DNA και το είδος των χρησιμοποιούμενων αντιδραστηρίων (Roura και συν. 1999a, Reithinger και συν. 2000, Lachaud και συν. 2001, Solano – Gallego και συν. 2001b). Συγκεκριμένα, στο περιφερικό αίμα η ευαισθησία της PCR στην αρχή της μόλυνσης προσεγγίζει το 88% ενώ με την πάροδο του χρόνου και τον περιορισμό του παρασίτου στους ιστούς πέφτει στο 50 – 70% (Lachaud και συν. 2001, Baneth και συν. 2005). Αντίθετα, στον οπό λεμφογαγγλίου και το μυελό των οστών η ευαισθησία της κυμαίνεται από 98,7% μέχρι 100% και από 63,6% μέχρι 100%, αντίστοιχα (Deplazes και συν. 1998, Roura και συν. 1999b, Leontides και συν. 2002, Saridomichelakis και συν. 2005a). Η επίσης υψηλή ευαισθησία της μεθόδου στις βιοψίες από το δέρμα και τον επιπεφυκότα (Berrahal και συν 1996, Solano – Gallego και συν. 2001b) συνήθως επιτρέπει την άμεση και ασφαλή διάγνωση των κλινικών περιστατικών στην πράξη. Εφόσον το δείγμα δεν έχει επιμολυνθεί, η ειδικότητα της PCR μπορεί να φτάσει το 100% επειδή δεν έχουν παρατηρηθεί διασταυρούμενες αντιδράσεις (Roura και συν. 1999b).

26

Άλλες μέθοδοι

Η καλλιέργεια δειγμάτων από το αίμα ή τους ιστούς σε ειδικά υποστρώματα, ο ενοφθαλμισμός

σε

ποντίκια,

οι

ξενοδιαγνωστικές

τεχνικές

και

ο

in

vitro

πολλαπλασιασμός των λεμφοκυττάρων του περιφερικού αίματος είναι μερικές από τις μεθόδους

εκείνες

που

χρησιμοποιούνται

κυρίως

στην

έρευνα.

Αντίθετα,

η

ιστοπαθολογική και ανοσοϊστοχημική εξέταση σε βιοψίες από το δέρμα ή άλλους ιστούς και η ενδοδερμική δοκιμή με λεϊσμανίνη χρησιμοποιούνται και στην καθημερινή διάγνωση των κλινικών περιστατικών (Alvar και συν. 1994, Pinelli και συν. 1994, Ashford και συν. 1995, Ferrer 1997, Bourdoiseau και συν. 1998, Gradoni 2002). Η ανίχνευση του παρασίτου με την ιστοπαθολογική εξέταση δεν είναι ευκολότερη από την κυτταρολογική στα διάφορα επιχρίσματα (Wunderlin και Pospischil 1992, Koutinas και συν. 1993, Bourdoiseau και συν. 1998). Τέλος, στην ενδοδερμική δοκιμή με λεϊσμανίνη εκτιμάται ο βαθμός της κυτταρικής ανοσολογικής απάντησης των μολυσμένων σκύλων στη Leishmania sp. και συνήθως είναι θετική στους ασυμπτωματικούς και αρνητική στους συμπτωματικούς σκύλους (Pinelli και συν. 1994, Cardoso και συν. 1998, Gradoni 1999).

B. ΑΝΤΙΛΕΪΣΜΑΝΙΑΚΑ ΦΑΡΜΑΚΑ

Αν και η χρησιμοποίηση των διαφόρων αντιλεϊσμανιακών φαρμάκων στη ΛΣ τις περισσότερες φορές οδηγεί σε κλινική ίαση, η πλήρης εξουδετέρωση του παρασίτου δεν επιτυγχάνεται παρά μόνο σε μικρό ποσοστό (Ferrer 1997, Slappendel και Ferrer 1998,

27

Baneth και Shaw 2002). Το γεγονός αυτό, σε συνδυασμό με τη συχνή εμφάνιση κλινικών υποτροπών και τον κίνδυνο μετάδοσης της L. infantum στον άνθρωπο, ιδιαίτερα σε ανοσοκατασταλμένα άτομα, θα μπορούσαν να συνηγορήσουν στη μαζική θανάτωση των μολυσμένων σκύλων για την εκρίζωση της νόσου από μια περιοχή (Slappendel και Ferrer 1998, Miles και συν. 1999), όπως εξάλλου προτείνεται και από τον Παγκόσμιο Οργανισμό Υγείας και τη νομοθεσία της Ελλάδας (World Health Organization 1984, βλ. Σαριδομιχελάκης και Κουτίνας 2002). Ωστόσο, η πληθώρα των ζωικών ειδών που αποτελούν τη δεξαμενή της L. infantum στη φύση και ο σχετικά μεγάλος αριθμός των μολυσμένων

σκύλων

που

είναι

ορολογικά

αρνητικοί,

περιορίζουν

την

αποτελεσματικότητα του μέτρου αυτού αντιμετώπισης της νόσου, όπως άλλωστε έχει διαπιστωθεί και σε άλλες χώρες (Dietze και συν. 1997). Στην Ελλάδα, ένα τέτοιο μέτρο θα ήταν επιπλέον ηθικά και κοινωνικά απαράδεκτο εξαιτίας του μεγάλου αριθμού των αδέσποτων ζώων. Μέχρι σήμερα η γενίκευση της χρήσης διαφόρων εντομοαπωθητικών ουσιών (π.χ. δελταμεθρίνη, περμεθρίνη) και η θεραπεία των συμπτωματικών σκύλων δεν έχουν καταφέρει να μειώσουν σε ικανοποιητικό βαθμό τη συχνότητα εμφάνισης της ΛΣ (Baneth και Shaw 2002), αν και εξακολουθούν να παραμένουν οι μοναδικοί τρόποι περιορισμού της νόσου. Για τους παραπάνω λόγους στις χώρες της Νότιας Ευρώπης προτείνεται η θεραπεία όχι μόνο των συμπτωματικών αλλά και των ασυμπτωματικών σκύλων με στόχο την εξουδετέρωση του παρασίτου, ύστερα από προηγούμενη ενημέρωση του ιδιοκτήτη ως προς τις πιθανότητες επίτευξης παρασιτολογικής ίασης και τη διάρκεια, το κόστος και τις ανεπιθύμητες ενέργειες της θεραπευτικής αγωγής (Slappendel και Ferrer 1998, Σαριδομιχελάκης και Κουτίνας 2002, Baneth και Shaw 2002).

28

Στη θεραπεία της ΛΣ έχουν χρησιμοποιηθεί κατά κύριο λόγο, και εξακολουθούν να χρησιμοποιούνται, η αντιμονιούχος μεγλουμίνη, το στιβογλυκονικό νάτριο, η πενταμιδίνη, η αλλοπουρινόλη, η παρομομυκίνη (αμινοσιδίνη) και η αμφοτερικίνη Β (Baneth και Shaw 2002, Noli και Auxilia 2005). Η αποτελεσματικότητα της ταυτόχρονης χορήγησης διαφόρων ανοσορυθμιστικών ουσιών όπως η ιντερφερόνη – γ, η λεβαμιζόλη και η ιντερλευκίνη – 12 δεν έχει αποδειχθεί με σωστά σχεδιασμένες μελέτες (Slappendel και Ferrer 1998). Αντιμονιούχος μεγλουμίνη. Η αντιλεϊσμανιακή αυτή ουσία αναστέλλει τη δράση των ενζύμων που καταλύουν την οξείδωση του γλυκογόνου και των λιπαρών οξέων στο παράσιτο (Baneth και Shaw 2002). Η βιοδιαθεσιμότητα της αντιμονιούχου μεγλουμίνης είναι υψηλή όταν χορηγείται υποδόρια (92,2%) ή ενδομυϊκά (91,7%), ενώ μεγάλο μέρος απεκκρίνεται από τους νεφρούς μέσα σε 9 ώρες από την χορήγησή της (Valladares και συν. 1996). Υπάρχει και η λιποσωμική μορφή της αντιμονιούχου μεγλουμίνης, που είναι εξίσου αποτελεσματική, αλλά ακριβότερη (Valladares και συν. 2001). Η συνιστώμενη δόση της αντιμονιούχου μεγλουμίνης είναι 75 mg/kg ΣΒ, δύο φορές την ημέρα, για 3 – 4 εβδομάδες, υποδόρια (Valladares και συν. 1998), αν και κατά καιρούς έχουν προταθεί διάφορα θεραπευτικά πρωτόκολλα με δόσεις που κυμαίνονται από 20 – 200 mg/kg ΣΒ, υποδόρια, ενδομυϊκά ή ενδοφλέβια, κάθε 12 – 48 ώρες και με διάρκεια θεραπείας που κυμαίνεται από 10 μέχρι 40 ημέρες, καθώς και συνδυασμοί του φαρμάκου με αλλοπουρινόλη ή παρομομυκίνη (Gradoni και συν. 1988, Gramiccia και συν. 1992, Ferrer 1997, Slappendel και Teske 1997, Roura και συν. 1997, Ginel και συν. 1998, Oliva και συν. 1998, Valladares και συν. 1998, Denerolle και Bourdoiseau 1999, Mendez 1999, Roura και συν. 1999b). Στο επικρατέστερο στην πράξη θεραπευτικό πρωτόκολλο η

29

αντιμονιούχος μεγλουμίνη χορηγείται υποδόρια στη δόση των 100 mg/kg ΣΒ κάθε 24 ώρες για 3 – 4 εβδομάδες (Baneth και Shaw 2002, Noli και Auxilia 2005). Η κλινική αποτελεσματικότητα της αντιμονιούχου μεγλουμίνης κυμαίνεται από 25 – 100%, χωρίς όμως να επιτυγχάνεται παρασιτολογική ίαση στην πλειονότητα των περιστατικών με αποτέλεσμα την εμφάνιση υποτροπών σε ποσοστό από 70 - 100%, λίγους μήνες μέχρι 1 χρόνο μετά τη λήξη της θεραπείας (Bergeaud 1988, Slappendel 1988, Deplazes και συν. 1992, Slappendel και Teske 1997, Oliva και συν. 1998, Riera και συν. 1999, Denerolle και Bourdoiseau 1999). Εξαίρεση ίσως αποτελούν τα θεραπευτικά πρωτόκολλα στα οποία το φάρμακο χορηγήθηκε μέχρι 25 εβδομάδες (ποσοστό υποτροπών 15%), με τη λιποσωμική της μορφή (μηδενικό ποσοστό υποτροπών) ή κάθε δεύτερη ημέρα για 6 εβδομάδες (ποσοστό υποτροπών 32%) (Denerolle 1996, Denerolle και Bourdoiseau 1999, Valladares και συν. 2001). Η εμφάνιση ανθεκτικών στελεχών της L. infantum απέναντι στην αντιμονιούχο μεγλουμίνη λόγω υποδοσίας, βραχυχρόνιας θεραπείας ή/και επαναλαμβανόμενων θεραπειών έχει περιορίσει τη χρήση της τα τελευταία χρόνια κυρίως για λόγους δημόσιας υγείας (Gramiccia και συν. 1992, Baneth και Shaw 2002). Στις ανεπιθύμητες ενέργειές της περιλαμβάνονται το άλγος, η ανάπτυξη ινώδους συνδετικού ιστού ή/και η δημιουργία αποστήματος, κυρίως στο σημείο της ενδομυϊκής ένεσης, η νεφροτοξικότητα, οι γαστρεντερικές διαταραχές, η κατάπτωση – λήθαργος, οι οφθαλμικές αλλοιώσεις, η πολυνευροπάθεια, η κοκκιωματώδης δερματίτιδα, το καθυστερημένης εμφάνισης μυϊκό άλγος, η δυσκαμψία των αρθρώσεων, η αναφυλακτική αντίδραση και η περιφλεβίτιδα – θρομβοβλεβίτιδα σε περίπτωση ατυχήματος κατά την ενδοφλέβια ένεση (Slappendel και Ferrer 1998, Denerolle και Bourdoiseau 1999, Baneth και Shaw 2002).

30

Στιβογλυκονικό νάτριο. Αν και ο τρόπος δράσης και η κλινική αποτελεσματικότητά του είναι παρόμοιες με εκείνες της αντιμονιούχου μεγλουμίνης, η συχνή εμφάνιση ανεπιθύμητων ενεργειών και η ανάπτυξη ανθεκτικών στελεχών της L. infantum λόγω της ευρείας χρήσης στο παρελθόν έχουν περιορίσει σημαντικά τη συμμετοχή του στη θεραπεία της ΛΣ (Poli και συν. 1997, Slappendel και Ferrer 1998). Αλλοπουρινόλη. Η αντιλεϊσμανιακή δράση της ουσίας αυτής, που είναι ανάλογο της υποξανθίνης, εκφράζεται με το μεταβολισμό της σε ανάλογο της ινοσίνης, που ενσωματώνεται στο RNA της Leishmania sp. και αναστέλλει τη σύνθεση των πρωτεϊνών της (Plumb 2005, Baneth 2005). Αν και η αλλοπουρινόλη αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό της L. infantum (λεϊσμανιοστατική δράση), η χρησιμοποίησή της στη ΛΣ ως μονοθεραπεία έχει γενικευτεί επειδή χορηγείται από το στόμα, έχει χαμηλό κόστος και προκαλεί ελάχιστες ανεπιθύμητες ενέργειες (Baneth και Shaw 2002). Η δόση κυμαίνεται από 15 – 30 mg/kg ΣΒ, κάθε 12 – 24 ώρες, από το στόμα, για μεγάλο χρονικό διάστημα ή εφόρου ζωής, ανεξάρτητα από το αν χορηγείται μόνη της ή σε συνδυασμό με άλλα αντιλεϊσμανιακά φάρμακα (Cavaliero και συν. 1999, Denerolle και Bourdoiseau 1999, Moritz και συν. 1999, Koutinas και συν. 2001, Baneth και Shaw 2002). Αν και η κλινική αποτελεσματικότητα του φαρμάκου σε γενικές γραμμές είναι παρόμοια με εκείνη της αντιμονιούχου μεγλουμίνης (30 – 100%), η πιθανότητα παρασιτολογικής ίασης είναι πολύ περιορισμένη (Slappendel και Teske 1997, Koutinas και συν. 2001) με αποτέλεσμα τη διατήρηση του τίτλου αντισωμάτων σε σχετικά υψηλά επίπεδα ακόμη και ύστερα από μακροχρόνια θεραπεία (Cavaliero και συν. 1999). Επίσης, ο χρόνος επιβίωσης ζώων με ΛΣ αλλά χωρίς νεφρική ανεπάρκεια ήταν ανεξάρτητος από το αν στη θεραπεία χρησιμοποιήθηκε αλλοπουρινόλη ή αντιμονιούχος μεγλουμίνη (Slappendel και Teske

31

1997). Η χορήγηση αλλοπουρινόλης στη δόση των 20 mg/kg ΣΒ, μία φορά το 24ωρο, για μία εβδομάδα κάθε μήνα, αν και μείωσε τη συχνότητα εμφάνισης των μελλοντικών υποτροπών σε σκύλους στους οποίους είχε προηγηθεί με επιτυχία η θεραπεία με αντιμονιούχο μεγλουμίνη και αλλοπουρινόλη (Ginel και συν. 1998), απέτυχε να περιορίσει το ποσοστό μόλυνσης σε σκύλους που ζουν σε ενζωοτικές περιοχές (Saridomichelakis και συν. 2005b). Η σημαντικότερη ανεπιθύμητη ενέργεια της αλλοπουρινόλης είναι η εμφάνιση ξανθινικής κρυσταλλουρίας ή/και ουρολιθίασης (Baneth και Shaw 2002, Plumb 2005) ενώ σύμφωνα με πρόσφατη μελέτη που έγινε στην Κλινική μας δε φαίνεται να επηρεάζει την απεκκριτική λειτουργία του νεφρού ή την εξέλιξη των αλλοιώσεων της χρόνιας νεφρίτιδας στη ΛΣ (Plevraki και συν. 2006). Αντιμονιούχος μεγλουμίνη και αλλοπουρινόλη. Ο συνδυασμός των αντιλεϊσμανιακών αυτών φαρμάκων έχει αποδειχθεί ότι είναι ανεκτός από το σκύλο, έχει καλύτερο και ταχύτερο κλινικό αποτέλεσμα, μειώνει περισσότερο την πιθανότητα μελλοντικών υποτροπών και ελαττώνει το κόστος επειδή περιορίζει τη δόση και τη διάρκεια της θεραπείας με αντιμονιούχο μεγλουμίνη (Denerolle και Bourdoiseau 1999, Baneth και Shaw 2002). Αν και τα ποσοστά παρασιτολογικής ίασης που έχουν αναφερθεί δε διαφέρουν από αυτά της θεραπείας με το καθένα από τα φάρμακα ξεχωριστά (Baneth και Shaw 2002), το ποσοστό μόλυνσης των υπεύθυνων σκνιπών (φλεβοτόμοι) κατά τη διάρκεια της θεραπείας με το παραπάνω σχήμα ήταν χαμηλότερο (Alvar και συν. 1994). Παρομομυκίνη. Η παρομομυκίνη ή αμινοσιδίνη ανήκει στα αμινογλυκοσιδικά αντιβιοτικά, παράγεται από το μύκητα Streptomyces rimosus και διαταράσσει τη λειτουργία των ριβοσωματίων του παρασίτου με αποτέλεσμα τη μείωση ή την αναστολή της σύνθεσης των πρωτεϊνών του (Oliva και συν. 1998). Το κλινικό αποτέλεσμα της

32

θεραπείας με παρομομυκίνη στη δόση των 3,5 - 5 mg/kg ΣΒ κάθε 12 – 24 ώρες, ενδομυϊκά ή υποδόρια, για 3 – 4 εβδομάδες ήταν παρόμοιο (33 – 100%) με εκείνο της αντιμονιούχου μεγλουμίνης (Oliva και συν. 1998, Poli και συν. 1997). Η αύξηση της δόσης του φαρμάκου αύξησε τη συχνότητα εμφάνισης και τον αριθμό των ανεπιθύμητων ενεργειών, χωρίς όμως παράλληλα να βελτιώνει το αντιλεϊσμανικό αποτέλεσμα (Persechino και συν. 1994, Vexenat και συν. 1998a). Στις κυριότερες ανεπιθύμητες ενέργειες της παρομομυκίνης περιλαμβάνονται η νεφροτοξικότητα, που μπορεί να παρατηρηθεί ακόμη και στη συνιστώμενη αντιλεϊσμανιακή δοσολογία (Baneth και Shaw 2002), και η κώφωση (Poli και συν. 1997). Αλκυλοφωσφοχολίνες. Η μιλτεφοσίνη (εξαδεκακυκλοφωσφοχολίνη), που χορηγείται από το στόμα, ενεργοποιείται στην κυτταρική μεμβράνη και συσσωρεύεται μέσα στα μακροφάγα κύτταρα (Baneth και Shaw 2002). Εκτός από την άμεση αντιλεϊσμανιακή της δράση, η μιλτεφοσίνη ενεργοποιεί τα Τ-λεμφοκύτταρα και τα μακροφάγα και αυξάνει την παραγωγή μικροβιοκτόνων ελεύθερων ριζών οξυγόνου και μονοξειδίου του αζώτου από τα τελευταία (Murray και Delph- Etienne 2000). Παρά τα εντυπωσιακά θεραπευτικά αποτελέσματα που διαπιστώθηκαν με τη χρησιμοποίηση της μιλτεφοσίνης στις λεϊσμανιώσεις του ανθρώπου και του ποντικού (Sundbar και συν. 1999), η χορήγησή της στη ΛΣ συνοδεύτηκε από την εμφάνιση πολλών και σοβαρών ανεπιθύμητων ενεργειών που φαίνεται να αποκλείουν τη μελλοντική χρησιμοποίησή της στο ζωικό αυτό είδος (Baneth και Shaw 2002). Τελευταία, στη θεραπεία της ΛΣ δοκιμάζεται μια χημικά συγγενής με τη μιλτεφοσίνη αλκυλοφωσφοχολίνη (λιποσωμική ολεϊκή φωσφοχολίνη) που φαίνεται να είναι καλώς ανεκτή από το σκύλο (Baneth και Shaw 2002).

33

Διάφορα άλλα αντιλεϊσμανιακά φάρμακα. Τα αντιπρωτοζωϊκά φάρμακα πενταμιδίνη, βουπαρβακόνη και μετρονιδαζόλη, τα αντιμυκητιακά κετοκοναζόλη, ιτρακοναζόλη, φλουκοναζόλη

και

τερμπιναφίνη

και

τα

αντιβακτηριδιακά

σπειραμυκίνη

και

ενροφλοξασίνη έχουν χρησιμοποιηθεί σε κλινικά περιστατικά και ερευνητικά θεραπευτικά πρωτόκολλα στη ΛΣ, μόνα τους ή σε διάφορους συνδυασμούς, χωρίς όμως ιδιαίτερη επιτυχία ως προς την παρασιτολογική ίαση και ανεξάρτητα από το ποσοστό της κλινικής ίασης, τις υποτροπές και τις ανεπιθύμητες ενέργειες (D’ Ambrosio και συν. 1986, Vexenat και συν. 1998b, Gangneux και συν. 1999, Rhalem και συν. 1999, Baneth και Shaw 2002, Lasri και συν. 2003, Biancardi και συν. 2004, Pennisi και συν. 2005). Σε πρόσφατη μετανάλυση (Noli και Auxilia 2005) της θεραπευτικής αξίας όλων των παραπάνω αντιλεϊσμανιακών φαρμάκων στη ΛΣ (L. infantum) που βασίστηκε στη μέθοδο των ενδεικτικών στοιχείων και περιλάμβανε σχεδόν όλες τις μέχρι σήμερα δημοσιευμένες κλινικές μελέτες, διαπιστώθηκε ότι το αποτελεσματικότερο σχήμα είναι ο συνδυασμός της αντιμονιούχου μεγλουμίνης (100 mg/kg ΣΒ, κάθε 24 ώρες, για τουλάχιστον 3 – 4 εβδομάδες) με την αλλοπουρινόλη (10 mg/kg ΣΒ, κάθε 12 ώρες, για 6 μήνες). Στην ίδια μελέτη, η πενταμιδίνη (4 mg/kg ΣΒ, δύο φορές την εβδομάδα, ενδομυϊκά) και η αμινοσιδίνη (5 mg/kg ΣΒ, κάθε 12 ώρες, για 3 – 4 εβδομάδες, υποδόρια) διαπιστώθηκε ότι είναι μέτρια αποτελεσματικές, ενώ μόνη της η αλλοπουρινόλη, η αμφοτερικίνη Β, η βουπαρβακόνη, η κετοκοναζόλη, η ενροφλοξασίνη και οι συνδυασμοί με μετρονιδαζόλη – σπειραμυκίνη ή μετρονιδαζόλη – ενροφλοξασίνη ελάχιστα ή καθόλου αποτελεσματικές.

34

Αμφοτερικίνη Β

Η αμφοτερικίνη Β (AmB), που ανήκει στα πολυενικά μακρολίδια, παράγεται από τον ακτινομύκητα Streptomyces nodosus και χρησιμοποιείται κυρίως ως αντιμυκητιακό φάρμακο, αν και η λεϊσμανιοκτόνος δράση της έχει καθιερώσει τη συμμετοχή της στην αντιλεϊσμανιακή θεραπεία του ανθρώπου (Mishra και συν. 1994, Laguna και συν. 1999) και του σκύλου (Lamothe 1999, Lamothe 2001, Oliva και συν. 1995, Cortadellas 2003). Το μόριο της AmB αποτελείται από έναν δακτύλιο μακρολιδικής λακτόνης με 37 άτομα άνθρακα, η μία πλευρά του οποίου είναι υδρόφιλη και η άλλη υδρόφοβη (Rubin 1986). Πρόκειται για κιτρινόχρωμη σκόνη, που αν και αδιάλυτη στο νερό και σε άνυδρα αλκοολικά διαλύματα, γίνεται υδατοδιαλυτή όταν ενωθεί με το δεσοξυχολικό νάτριο (Plumb 2005). Επειδή η AmB είναι ευαίσθητη στις υψηλές θερμοκρασίες και το φως, πρέπει να διατηρείται στο ψυγείο (αδιάλυτη σκόνη, διαλύματα). Η διάλυσή της γίνεται απαραίτητα με ενέσιμο δισαπεσταγμένο νερό επειδή ο φυσιολογικός ορός ευνοεί το σχηματισμό ιζημάτων. Στο εμπόριο, εκτός από την υδατοδιαλυτή AmΒ (Fungizone®, Squibb-Meyers), κυκλοφορούν η λιποσωμική μορφή (Ambisome® - NeXstar), το σύμπλεγμα με λιπίδια (Abelcet® - The Liposome Co) και το σε κολλοειδή κατανομή χοληστερυλοθειϊκό σύμπλεγμα (Amphotec® - Sequus Pharmaceuticals) (Plotnick 2000, Plumb 2005). Η AmB δεσμεύοντας τις στερόλες που αποτελούν τα δομικά στοιχεία της κυτταρικής μεμβράνης των ευαίσθητων μικροοργανισμών, μεταβάλλει τη διαπερατότητά της στο ενδοκυτταρικό κάλιο και τις άλλες ενδοκυτταρικές ουσίες που εξέρχονται στον εξωκυττάριο χώρο, και προκαλεί το θάνατό τους (Plotnick 2000). Αν και η δράση της

35

AmB εστιάζεται κυρίως στην εργοστερόλη της κυτταρικής μεμβράνης των μυκήτων και ορισμένων πρωτόζωων όπως η Leishmania sp. και η Naegleria sp., η έστω και περιορισμένη ικανότητά της να δεσμεύει τη χοληστερόλη στις κυτταρικές μεμβράνες των θηλαστικών ευθύνεται, ως προς ένα βαθμό τουλάχιστον, για την τοξικότητά της (Rubin 1986, Grooters και Taboada 2003). Στους άλλους μηχανισμούς δράσης της AmB πιθανότατα περιλαμβάνονται η υπεροξείδωση των λιπιδίων και η αναστολή της λειτουργίας των ενζύμων της κυτταρικής μεμβράνης και της διεργασίας της ενδοκυττάρωσης (Plotnick 2000). Η AmB χορηγείται σχεδόν αποκλειστικά ενδοφλέβια επειδή η ενδομυική ένεση προκαλεί άλγος και φλεγμονή ενώ η απορρόφησή της από το γαστρεντερικό σωλήνα είναι πολύ μικρή (Plumb 2005). Μετά την ενδοφλέβια ένεση το 90 – 95% της AmB συνδέεται με πρωτεΐνες του πλάσματος του αίματος, κατανέμεται ελάχιστα στο πάγκρεας, τους μυς, τα οστά, το υδατοειδές και το εγκεφαλονωτιαίο υγρό (Plumb 2005, Baneth 2005, Rubin 1986), απεκκρίνεται από τους νεφρούς και μπορεί να ανιχνευθεί στα ούρα ακόμη και 7 εβδομάδες μετά το τέλος της θεραπείας (Plumb 2005). Στις συχνότερες ανεπιθύμητες ενέργειες της AmB περιλαμβάνονται η ανορεξία, ο έμετος, η υποκαλιαιμία, ο μυϊκός τρόμος κατά την ενδοφλέβια χορήγηση, ο πυρετός, η νεφροτοξικότητα και η περιφλεβίτιδα – θρομβοφλεβίτιδα σε περίπτωση εξωαγγειακής ένεσης (Maddux και Barriere 1980, Rubin 1986, Plumb 2005). Η νεφροτοξικότητα της AmB οφείλεται στη μεταβολή της διαπερατότητας της κυτταρικής μεμβράνης των λείων μυϊκών ινών των απαγωγών αρτηριδίων του νεφρικού σωματίου με αποτέλεσμα την αύξηση της ενδοκυττάριας συγκέντρωσης των ιόντων ασβεστίου που διεγείρουν την παραγωγή αγγειοσυσταλτικών εικοσανοειδών (Sawaya και συν. 1995, Plotnic 2000). Η

36

προκαλούμενη αγγειοσυστολή ευθύνεται για τη μείωση του ρυθμού σπειραματικής διήθησης (ΡΣΔ) και την αύξηση της συγκέντρωσης του αζώτου ουρίας και της κρεατινίνης στον ορό του αίματος (Greene και συν. 1984, Sawaya και συν. 1995, Wolf και Troy 1995). Ταυτόχρονα, η τοξική δράση της AmB μπορεί να επεκταθεί στα επιθηλιακά κύτταρα των νεφρικών σωληναρίων που τελικά εκφυλίζονται και νεκρώνονται (Rubin 1986, Wolf και Troy 1995, Deray 2002, Baneth και Shaw 2002). Η υπερέκκριση ιόντων χλωρίου από τα επιθηλιακά κύτταρα στον αυλό των εγγύς σπειροειδών σωληναρίων, επιδεινώνει τη μείωση του ΡΣΔ μέσω του μηχανισμού της σωληναριοσπειραματικής

παλίνδρομης

αλληλορύθμισης

(Rubin

1986).

Οι

προκαλούμενες νεφρικές αλλοιώσεις και η νεφρική ανεπάρκεια που ακολουθεί είναι συχνότερες και βαρύτερες όταν η δόση σε κάθε θεραπευτική συνεδρία είναι υψηλή και στους ήδη νεφροπαθείς σκύλους (Plumb 2005). Σε ορισμένα ζώα προκαλείται νεφροτοξίκωση ακόμη και όταν η AmB χορηγείται στη χαμηλότερη δυνατή θεραπευτική δόση, γεγονός που υποδηλώνει ιδιοσυγκρασική αντίδραση (Plotnick 2000). Σε κάθε περίπτωση, η απεκκριτική λειτουργία του νεφρού επανέρχεται σταδιακά στα φυσιολογικά επίπεδα, ακόμη και ύστερα από αρκετούς μήνες μετά τη διακοπή της χορήγησης του φαρμάκου (Plotnick 2000, Plumb 2005). Τέλος, η πιθανότητα εγκατάστασης μη αναστρέψιμων νεφρικών αλλοιώσεων αυξάνει επικίνδυνα σε ζώα που εμφανίζουν νεφρική ανεπάρκεια πριν από την έναρξη της θεραπείας (Plumb 2005). Για να περιοριστεί η νεφροτοξικότητα της AmB έχουν κατά καιρούς προταθεί η ενδοφλέβια χορήγηση μαννιτόλης (0,5 – 1 g/kg ΣΒ), φουροσεμίδης (5 mg/kg ΣΒ), δοπαμίνης (3 – 10 μg/kg/min), διττανθρακικού νάτριου (1 – 2 mmol/kg ΣΒ) ή/και φυσιολογικού ορού αμέσως πριν από κάθε θεραπευτική συνεδρία (Rubin 1986, Greene

37

1998, Plotnick 2000). Στον άνθρωπο έχει αποδειχτεί ότι ο φυσιολογικός ορός δίνει το καλύτερο προστατευτικό αποτέλεσμα (Sawaya και συν. 1995). Η νεφροτοξικότητα της AmB μπορεί επίσης να περιοριστεί με τη χρησιμοποίηση των λιπιδικών μορφών της στις οποίες η απελευθέρωση των μακρομοριακών μικυλλίων, μετά την ενδοκυττάρωσή τους από τα κύτταρα του συστήματος μακροφάγων - μονοκυττάρων, εστιάζεται σχεδόν αποκλειστικά στα σημεία της φλεγμονής, ενώ ταυτόχρονα η συγκέντρωση του φαρμάκου στο πλάσμα του αίματος παραμένει χαμηλή (Olsen και συν. 1991, Szoka και Tang 1993, Mehta και συν. 1994, Plotnick 2000). Με τον ίδιο τρόπο φαίνεται ότι δρα η ανάμιξη της AmB με γαλάκτωμα λιπιδίων παρεντερικής διατροφής (π.χ. Intralipid®), που έχει δοκιμαστεί στη θεραπεία της γενικευμένης μονιλλίωσης (Candida albicans) και της λεϊσμανίωσης (L. infantum, L. donovani) σε ποντίκια του εργαστηρίου (Kirsh και συν. 1988, Souza και Campa 1999), και σε κλινικά περιστατικά λεϊσμανίωσης του ανθρώπου (Caillot και συν. 1993, Thakur 1994, Sundar και συν. 2000) και του σκύλου (Oliva και συν. 1995, Lamothe 2001, Cortadellas 2003). Σε πρόσφατες μελέτες που έγιναν σε ποντίκια (L. infantum) αλλά και σε περιστατικά ΛΣ, η δεσοξυχολική AmB θερμαινόταν στους 70 – 80ο C για 15 – 20 min με σκοπό το σχηματισμό συσσωματωμάτων που συμπεριφέρονται όπως τα μεγαλομοριακά μικύλλια των λιπιδικών μορφών, ώστε να εξασφαλίζεται υψηλότερη δοσολογία σε μικρότερο χρονικό διάστημα χωρίς να αυξηθεί ο κίνδυνος ανεπιθύμητων ενεργειών και να μειωθεί η θεραπευτική δράση της (Petit και συν. 1999, Bau και συν. 2003, Lamothe και συν. 2002). Στη ΛΣ, η AmB έχει χρησιμοποιηθεί μέχρι σήμερα σε 5 κλινικές μελέτες που στόχευαν στην αξιολόγηση του θεραπευτικού της αποτελέσματος (Oliva και συν. 1995, Lamothe 1997, Lamothe 2001, Cortadellas 2003) ή όχι μόνο σ’αυτήν (Moreno και συν.

38

1999). Αναλυτικότερα, η υδατοδιαλυτή δεσοξυχολική AmB χρησιμοποιήθηκε από τον Lamothe (1997) σε 39 περιστατικά στη συνολική δόση των 2 - 16 mg/kg ΣΒ, αφού προηγουμένως διαιρέθηκε σε δόσεις των 0,5 – 0,8 mg/kg ΣΒ, και δόθηκε 2- 3 φορές την εβδομάδα για 2 – 10 συνολικά εβδομάδες· το ποσοστό κλινικής ίασης στην περίπτωση αυτή έφτασε το 93%. Οι Oliva και συν. (1995) χρησιμοποίησαν σε 13 περιστατικά της νόσου λιποσωμική AmB (Ambisome®, Vestar), και πέτυχαν τη μερική ή πλήρη κλινική ίαση στο 61,5% των ζώων με συνολική δόση που κυμάνθηκε από 12 - 15 mg/kg ΣΒ. Τέλος, το εναιώρημα της δεσοξυχολικής AmB με γαλάκτωμα λιπιδίων παρεντερικής διατροφής (Intralipid®) της δικής μας μελέτης χρησιμοποιήθηκε σε δύο κλινικές μελέτες (Lamothe 2001, Cortadellas 2003) (βλέπε Συζήτηση). Στη λεϊσμανίωση του ανθρώπου η AmB έχει χρησιμοποιηθεί συχνά στη Νότια Ευρώπη (L. infantum) και στην Ινδία (L. donovani) (Sundar και συν. 2002, Syriopoulou και συν. 2003, Laguna και συν. 2003, Cascio και συν. 2004). Στην Νότια Ευρώπη, στην οποία το κόστος της θεραπείας συνήθως δεν αποτελεί αποτρεπτικό παράγοντα στην επιλογή της φαρμακοτεχνικής μορφής της AmB, η λιποσωμική AmB χρησιμοποιείται κυρίως σε παιδιά και ανοσοκατασταλμένους ασθενείς ή ασθενείς με AIDS, σε δόση που κυμαίνεται από 3 – 10 mg/kg ΣΒ, κάθε 24 ώρες, ενδοφλέβια ή ενδοπεριτοναϊκά, για 2 – 10 ημέρες με πολύ υψηλά ποσοστά κλινικής ίασης (>95%) (Minodier και συν. 2003, Syriopoulou και συν. 2003, Cascio και συν. 2004). Παρά το εντυπωσιακό κλινικό αποτέλεσμα, η παρασιτολογική ίαση των ασθενών, εκεί όπου αξιολογήθηκε με βάση την PCR και την κυτταρολογική εξέταση επιχρισμάτων από το μυελό των οστών, ήταν ανάλογη της συνολικής δόσης και κυμαινόταν από 0 – 42% (Syriopoulou και συν. 2003, Laguna και συν. 2003). Στην Ινδία, όπου η παραδοσιακή θεραπεία με στιβογλυκονικό

39

νάτριο και αντιμονιούχο μεγλουμίνη δεν είναι πλέον αποτελεσματική λόγω της ανάπτυξης ανθεκτικών στελεχών της L. donovani, η χρησιμοποίηση της λιποσωμικής AmB, αν και δαπανηρή, έχει πλέον καθιερωθεί στις ενζωοτικές περιοχές της νόσου (Sundar και συν. 2000, Olliaro και συν. 2005). Για να μειωθεί το κόστος της θεραπείας η χορήγηση ακόμη και μίας μόνο δόσης των 5 mg/kg ΣΒ λιποσωμικής AmB (Ambisome®) έχει δώσει υψηλά ποσοστά κλινικής (> 90%) και παρασιτολογικής ίασης (94,6%), η επιβεβαίωση της οποίας στηρίχθηκε στην κυτταρολογική εξέταση επιχρισμάτων από το μυελό των οστών (Thakur και συν. 1996, Sundar και συν. 2001, Sundar και συν. 2003, Sundar και συν. 2004). Τέλος, στη λεϊσμανίωση του ανθρώπου από L. donovani ή L. infantum έχει χρησιμοποιηθεί και το εναιώρημα της AmB (Fungizone®) με γαλάκτωμα λιπιδίων παρεντερικής διατροφής (Intralipid® 10% - 20%) της παρούσης μελέτης, με αποτέλεσμα την κλινική και παρασιτολογική ίαση σε ποσοστό από 98,6 ως 100 % (Thakur 1994, Herbrecht και συν. 1996, Sundar και συν. 2000).

Γ. Η ΣΠΕΙΡΑΜΑΤΟΝΕΦΡΙΤΙΔΑ ΣΤΗ ΛΕΙΣΜΑΝΙΩΣΗ ΤΟΥ ΣΚΥΛΟΥ

Η χρόνια σπειραματονεφρίτιδα της ΛΣ συνήθως εκδηλώνεται με ασυμπτωματική πρωτεϊνουρία, χρόνια νεφρική ανεπάρκεια και πολύ σπανιότερα με νεφρωσικό σύνδρομο (Ferrer 1992, Koutinas και συν. 1999b, Zatelli και συν. 2003). Η χρόνια νεφρική ανεπάρκεια αποτελεί την κυριότερη αιτία θανάτου των ζώων με τη συμπτωματική μορφή της ΛΣ (Slappendel 1988, Kontos και Koutinas 1993, Koutinas και συν. 1999a, Koutinas και συν. 1999b).

40

1. Τύποι νεφρικών αλλοιώσεων

Στη ΛΣ εκτός από τη σπειραματονεφρίτιδα από ανοσοσύμπλοκα, μπορεί να παρατηρηθεί διαμεσοσωληναριακή νεφρίτιδα και πολύ σπανιότερα αμυλοείδωση του νεφρού (Poli και συν. 1991, Zatelli και συν. 2003, Costa και συν. 2003, Plevraki και συν. 2006). Η σπειραματονεφρίτιδα είναι κυρίως μεμβρανώδους μεσαγγειοϋπερπλαστικού ή μεμβρανοϋπερπλαστικού τύπου (Poli και συν. 1991, Nieto και συν. 1992, Koutinas και συν. 1999b, Zatelli και συν. 2003), ενώ έχουν αναφερθεί και λίγα περιστατικά με σπειραματοπάθεια των ελάχιστων αλλοιώσεων και με εστιακή σπειραματονεφρίτιδα ή σπειραματοσκλήρυνση (Nieto και συν. 1992, Plevraki και συν. 2006). Σε σχετική έρευνα που έγινε στην Ελλάδα, ο μεμβρανοϋπερπλαστικός τύπος διαπιστώθηκε στο 42,9% και ο μεσαγγειοϋπερπλαστικός στο 14,3% των περιστατικών (Koutinas και συν. 1999b). Η μεμβρανώδης σπειραματονεφρίτιδα (σπειραματοπάθεια) ήταν ο συχνότερος τύπος των νεφρικών αλλοιώσεων στην έρευνα των Benderitter και συν. (1988) ενώ σε μελέτη που έγινε στη χώρα μας παρατηρήθηκε στο 35,7% των περιστατικών (Koutinas και συν. 1999b). Σε πρόσφατη έρευνα που έγινε στην Ιταλία, ο μεμβρανοϋπερπλαστικός τύπος της σπειραματονεφρίτιδας βρέθηκε στο 29,3%, ο μεσαγγειοϋπερπλαστικός στο 21,9% και o μεμβρανώδης στο 26,8% των 41 σκύλων που βρέθηκαν θετικοί στη L. infantum (Zatelli και συν. 2003). Στη μελέτη αυτή διαπιστώθηκε ότι το 95,1% των σκύλων παρουσίαζε μη εκλεκτική σπειραματική πρωτεϊνουρία που αποτελούνταν από λευκωματίνες, τρανσφερίνη και ανοσοσφαιρίνες G, ενώ στο 4,9% η πρωτεϊνουρία ήταν μικτή χωρίς όμως να βρεθεί οποιοσδήποτε συσχετισμός μεταξύ του βαθμού έντασης και

41

του ιστολογικού τύπου της σπειραματονεφρίτιδας. Σε πρόσφατη μελέτη που έγινε στην Ελλάδα

σε

39

ζώα

με

συμπτωματική

ΛΣ

(Plevraki

και

συν.

2006),

ο

μεσαγγειοϋπερπλαστικός τύπος διαπιστώθηκε στο 64,1%, ο μεμβρανοϋπερπλαστικός στο 33,3% ενώ η σπειραματοπάθεια των ελαχίστων αλλοιώσεων μόνο στο 7,7% των ζώων. Ιστολογικές αλλοιώσεις διαμεσοσωληναριακής νεφρίτιδας παρατηρήθηκαν σε όλα τα ζώα, αν και ο βαθμός έντασής τους διέφερε. Στην ίδια μελέτη, οι αλλοιώσεις της σπειραματονεφρίτιδας ήταν σημαντικά εντονότερες στα ζώα εκείνα που παρουσίαζαν πρωτεϊνουρία,

χωρίς

όμως

πρωτεϊνών/κρεατινίνης

στο

σπειραματονεφρίτιδας.

Τέλος,

να

βρεθεί

συσχετισμός

ούρο

(Up/c)

και

ζώα

με

τον

του

μεταξύ

ιστολογικού

μεμβρανοϋπερπλαστικό

του

λόγου

τύπου

της

τύπο

της

σπειραματονεφρίτιδας παρουσιάζουν πρωτεϊνουρία ανάλογη με το βαθμό έντασης των αλλοιώσεων και της κλινικής εικόνας (Poli και συν. 1991, Nieto και συν. 1992), και επιπλέον φαίνεται να εμφανίζουν συχνότερα χρόνια νεφρική ανεπάρκεια (Plevraki και συν. 2006). Χρόνια διαμεσοσωληναριακή νεφρίτιδα παρατηρείται στην πλειονότητα των περιστατικών με ΛΣ, ανεξάρτητα από την εμφάνιση ή όχι πρωτεϊνουρίας (Poli και συν. 1991, Koutinas και συν. 1999b, Plevraki και συν. 2006). Στις σπειραματονεφρίτιδες μπορεί να προκληθεί διάμεσοσωληναριακή νεφρίτιδα μέσω πολλαπλών μηχανισμών που μέχρι σήμερα δεν έχουν διερευνηθεί σε όλες τους τις λεπτομέρειες (Polzin και συν. 2005). Σ’ αυτούς περιλαμβάνονται η σπειραματική πρωτεϊνουρία, η ισχαιμία των σπειροειδών σωληναρίων λόγω μείωσης της ροής του αίματος που απάγεται από τα νεφρικά σωμάτια, η απώλεια της ανοσολογικής ανοχής, η απελευθέρωση φλεγμονικών μεταβιβαστών από τα προσβεβλημένα αγγειώδη σπειράματα, η εναπόθεση αλάτων

42

φωσφορικού ασβεστίου και η αυξημένη παραγωγή αμμωνίας (Nath 1998). Είναι επίσης γνωστό

ότι

σε

ορισμένα

πειραματικά

πρότυπα

σπειραματονεφρίτιδας,

τα

γλυκοκορτικοστεροειδή ή άλλα ανοσοκατασταλτικά φάρμακα μπορούν να βελτιώσουν τις διαμεσοσωληναριακές αλλοιώσεις, αλλά όχι εκείνες των αγγειωδών σπειραμάτων (Noronha και συν. 2002).

2. Ρυθμός σπειραματικής διήθησης (ΡΣΔ)

Ο ΡΣΔ είναι ίσως ο καλύτερος τρόπος εκτίμησης της απεκκριτικής λειτουργίας του νεφρού που αν και πολύ ευκολότερα γίνεται με τη μέτρηση της συγκέντρωσης της κρεατινίνης και του αζώτου ουρίας στον ορό του αίματος (Finco 1995a, DiBartola 2000). Ωστόσο, οι βιοχημικές αυτές παράμετροι επηρεάζονται από πολλούς παράγοντες, που μεταξύ των άλλων μπορεί να προκαλέσουν προνεφρική ή μετανεφρική αζωθαιμία. Εξάλλου στις διάφορες νεφροπάθειες αζωθαιμία παρατηρείται όταν καταστραφεί τουλάχιστον το 75% των νεφρώνων (Bush 1991, Finco 1995a, DiBartola 2000). Η κάθαρση διαφόρων ουσιών από τους νεφρούς, που αντιπροσωπεύει τον όγκο του πλάσματος του αίματος από τον οποίο απομακρύνονται με τα ούρα ανά min, θεωρείται η πλέον αξιόπιστη και αντικειμενικότερη ίσως μέθοδος εκτίμησης του ΡΣΔ (Finco 1995a, Finco 1995b, Verlander 1997, DiBartola 2000). Ο υπολογισμός γίνεται με βάση τον τύπο: ΡΣΔ = UV x UC / PC, όπου PC (mg/ml) είναι η συγκέντρωση της ουσίας – δείκτη στο πλάσμα του αίματος, UC (mg/ml) η συγκέντρωσή της στα ούρα και UV (ml/min) ο όγκος των ούρων που παράγονται ανά min (Finco 1995a, Verlander 1997, DiBartola 2000). Αν και ο καλύτερος δείκτης θεωρείται ότι είναι η ινουλίνη (Gleadhill

43

και συν. 1995, Verlander 1997, DiBartola 2000), επειδή η μέτρησή της συχνά παρουσιάζει τεχνικές δυσκολίες (Finco και συν. 1993, Gleadhill και συν. 1995), καλή εναλλακτική λύση είναι η ενδογενής κρεατινίνη επειδή η συγκέντρωσή της στον ορό του αίματος παραμένει σχετικά σταθερή κατά τη διάρκεια του 24ώρου (Finco 1995a, DiBartola 2000). Βασικό όμως μειονέκτημα της μεθόδου αυτής είναι η ταυτόχρονη μέτρηση και άλλων χρωμογόνων ουσιών στον ορό του αίματος (Finco 1995a). Το πρόβλημα ωστόσο αυτό ξεπερνάται με την κάθαρση της εξωγενούς κρεατινίνης, ύστερα από την υποδόρια ή ενδοφλέβια ένεσή της και τη συλλογή των ούρων που παράγονται σε διάστημα 20 min ή ενός 24ώρου (Finco 1995a, DiBartola 2000). Επειδή το αποτέλεσμα της μεθόδου αυτής επηρεάζεται σημαντικά από το βαθμό ενυδάτωσης του ζώου, είναι απαραίτητη η ελεύθερη πρόσβασή του στο νερό ή η χορήγηση νερού με τη βοήθεια οισοφαγικού καθετήρα (Tabaru και συν. 1993, Finco 1995a). Οι φυσιολογικές τιμές του ΡΣΔ στο σκύλο ποικίλουν ανάλογα με τη μεθοδολογία που έχει κατά καιρούς εφαρμοστεί από διάφορους ερευνητές (Bovee και Joyce 1979, Finco και συν. 1981, Finco και συν. 1993). Με τη μέθοδο της εξωγενούς κάθαρσης της κρεατινίνης, που έγινε σε 10 φυσιολογικούς σκύλους, η μέση τιμή και σταθερή απόκλιση του ΡΣΔ υπολογίστηκε στο 4,09 ± 0,52 ml/min/kg ΣΒ (Finco και συν. 1981), ενώ όταν η ίδια μέθοδος εφαρμόστηκε στην Κλινική μας σε 8 κλινικά υγιείς σκύλους της φυλής Beagle, οι αντίστοιχες τιμές ήταν 4,55 ± 1,041 ml/min/Κg ΣΒ (Plevraki και συν. 2006).

44

3. Σπειραματική πρωτεϊνουρία και εκτίμηση του βαθμού της

Στις πρωτεΐνες που ανιχνεύονται στα ούρα των φυσιολογικών σκύλων βασικά περιλαμβάνονται οι μικρού μοριακού βάρους λευκωματίνες του πλάσματος (40 – 60%), η βλεννοπρωτεΐνη Tamm – Horsfall, που εκκρίνεται από τα επιθηλιακά κύτταρα των ουροφόρων σωληναρίων και οι ανοσοσφαιρίνες (IgG, IgA) που εκκρίνονται από το βλεννογόνο της ουροφόρου οδού (Lulich και Osborne 1990, Finco 1995a). Η παθολογική πρωτεϊνουρία οφείλεται σε διάφορες παθολογικές καταστάσεις του οροποιητικού συστήματος (αληθής) ή άλλων οργάνων και συστημάτων (ψευδής) (Grauer 2005). Η αληθής πρωτεϊνουρία διακρίνεται σε νεφρική και της ουροφόρου οδού· η τελευταία συνήθως οφείλεται σε φλεγμονή ή αιμορραγίες της κάτω ουροφόρου οδού η επιβεβαίωση των οποίων στηρίζεται, μεταξύ των άλλων, στην εξέταση του ιζήματος των ούρων (π.χ. ουρολιθίαση, νεοπλάσματα, ουρολοίμωξη) (Grauer 2005). Στο σκύλο, οι σπειραματοπάθειες, οι σπειραματονεφρίτιδες και πολύ σπανιότερα η αμυλοείδωση του νεφρού ευθύνονται κατά κύριο λόγο για τη νεφρική πρωτεϊνουρία (σπειραματική πρωτεϊνουρία) (Lulich και Osborne 1990, Hurley και Vaden 1995, Finco 1995c). Νεφρική όμως πρωτεϊνουρία μπορεί, αν και λιγότερο συχνά, να προκληθεί από φλεγμονώδεις (π.χ. πυελονεφρίτιδα) ή διηθητικές (π.χ. αδενοκαρκίνωμα) νεφροπάθειες και από διαταραχές της επαναρρόφησης των χαμηλομοριακών πρωτεϊνών (< 69 kD) του πρόουρου από τα νεφρικά σωληνάρια, όπως για παράδειγμα στην οξεία σωληναριακή νέκρωση και το σύνδρομο Fanconi (Grauer 2005). Η σπειραματική πρωτεϊνουρία, που είναι πολύ συχνό εργαστηριακό εύρημα στη ΛΣ (Poli και συν. 1991, Koutinas και συν. 1999b, Zatelli και συν. 2003, Zini και συν.

45

2004, Plevraki και συν. 2006), συμβάλλει ουσιαστικά στην επιδείνωση των αλλοιώσεων της σπειραματονεφρίτιδας και την πρόκληση διαμεσοσωληναριακής νεφρίτιδας με αποτέλεσμα την εγκατάσταση νεφρικής νόσου τελικού σταδίου, τη σοβαρή διαταραχή της λειτουργίας των νεφρών και τελικά το θάνατο του ζώου (Finco και συν. 1999, Jacob και συν. 2005, Polzin και συν. 2005). Το ίδιο αποδεικνύεται από ανάλογες μελέτες που έγιναν σε ανθρώπους (Iseki και συν. 2003) και επίμυες (Wapstra και συν. 1996). Η επιδείνωση των νεφρικών αλλοιώσεων προκαλείται μέσω της τοξικής δράσης των πρωτεϊνών στο μεσάγγειο, της υπερφόρτισης των νεφρικών σωληναρίων με πρωτεΐνες, της τοξικότητας της τρανσφερίνης και της υπερπαραγωγής φλεγμονικών χημειοκινών (π.χ. MCP-1, RANTES) και αγγειοκινητικών ουσιών (π.χ. ενδοθηλίνη – 1), του φλεγμονικού χαρακτήρα των χαμηλομοριακών λιπιδίων και του σχηματισμού κυλίνδρων στον αυλό των νεφρικών σωληναρίων (Burton και συν. 1999, Pizoni και Remuzzi 2001). Στις συνέπειες της συνεχιζόμενης πρωτεϊνουρίας περιλαμβάνονται το υπόδοριο οίδημα και οι ύδρωπες, η αρτηριακή υπέρταση, η αρτηριακή θρομβοεμβολή, η υπερλιπιδαιμία, η προδιάθεση για βακτηριδιακές λοιμώξεις, η καταβολή της θρεπτικής κατάστασης και των μυϊκών μαζών, η μείωση του σωματικού βάρους, οι μεταβολές της φαρμακοκινητικής διαφόρων ουσιών και οι ορμονικές διαταραχές (Abrass 1997, Grauer 2005). Στους πρωτεϊνουρικούς σκύλους, μεγαλύτερη σημασία φαίνεται ότι έχουν οι τέσσερις πρώτες από τις παραπάνω παθολογικές καταστάσεις (Vaden 2005). Αναλυτικότερα, το υποδόριο οίδημα και οι ύδρωπες, που χαρακτηρίζουν κλινικά το νεφρωσικό σύνδρομο, προκαλούνται από το συνδυασμό της πτώσης της κολλοειδοοσμωτικής πίεσης του πλάσματος του αίματος από την υπολευκωματιναιμία (< 1,5 g/100 ml για το σκύλο) και της πρωτογενούς κατακράτησης του νατρίου (Abrass 1997, Vaden 2005). Αρτηριακή

46

υπέρταση διαπιστώνεται στο 84% των σκύλων που πάσχουν από διάφορες σπειραματοπάθειες (Gowgill 1991). Η παθογένειά της αποδίδεται στη συνέργεια μεταξύ πρωτογενούς κατακράτησης του νατρίου, ενεργοποίησης του συστήματος ρενίνη – αγγειοτασίνη – αλδοστερόνη, μειωμένης παραγωγής αγγειοδιασταλτικών ουσιών από τους νεφρούς (μονοξείδιο του αζώτου) και αυξημένης ανταπόκρισης στις φυσιολογικά παραγόμενες αγγειοσυστολικές ουσίες. (Abrass 1997, Grauer 2005). Η αρτηριακή θρομβοεμβολή, που είναι η χειρότερη από προγνωστική άποψη, αλλά και στη θεραπευτική αντιμετώπιση, επιπλοκή της σπειραματικής πρωτεϊνουρίας, έχει βρεθεί στο 13% των σκύλων με σπειραματοπάθειες (Center και συν. 1987, Cook και Cowgill 1996). Η ιδιαίτερα συχνή πνευμονική θρομβοεμβολή τις περισσότερες φορές παρατηρείται στις σπειραματοπάθειες εκείνες (π.χ. μεμβρανώδης σπειραματοπάθεια, αμυλοείδωση) που προκαλούν έντονου βαθμού πρωτεϊνουρία

(Vaden 2005). Η

υπερπηκτικότητα του αίματος που οδηγεί σε θρομβοεμβολή, εκτός από τη σημαντική απώλεια της χαμηλομοριακής αντιθρομβίνης ΙΙΙ (ΑΤ ΙΙΙ) με τα ούρα, πιθανότατα οφείλεται στη συμμετοχή και άλλων παραγόντων όπως η υπολευκωματιναιμία και η υπερχοληστερολαιμία (υπερσυσσώρευση αιμοπεταλίων), η θρομβοκυττάρωση, η υπερινωδογοναιμία και ενδεχομένως η αύξηση της συγκέντρωσης ή της δραστηριότητας της α2 – μακροσφαιρίνης, της α2 – αντιπλασμίνης, των κυτταροκινών που αυξάνουν την πηκτικότητα του αίματος και τη δραστηριότητα των παραγόντων πήξης V, VII, VIII και X (Green και Kabel 1982, Green και συν. 1985, Abrass 1997). Υπερχοληστερολαιμία βρέθηκε στο 79% σκύλων με σπειραματονεφρίτιδα (Center και συν. 1987), στην οποία εκτός από την ολική χοληστερόλη, αυξάνει και η συγκέντρωση των VLDL και LDL στο αίμα (Wheeler και συν. 1994). Στην παθογένεια

47

της υπερλιπιδαιμίας, που αποτελεί διαγνωστικό στοιχείο του νεφρωσικού συνδρόμου, φαίνεται να υπεισέρχονται η υπολευκωματιναιμία, οι μεταβολές του καταβολισμού των λιπιδίων και η απώλεια του οροσοβλεννοειδούς με τα ούρα (Abrass 1997, Wheeler και συν. 1994). Υπάρχουν σαφείς ενδείξεις ότι η παρατεταμένη υπερλιπιδαιμία προκαλεί αλλοιώσεις

στο

αγγειώδες

σπείραμα

(αύξηση

της

μεσάγγειας

ουσίας

–

σπειραματοσκλήρυνση) και τα ουροφόρα σωληνάρια μέσω της LDL (Abrass 1997). Έμμεση απόδειξη του γεγονότος αυτού είναι η διαπίστωση σπειραματοπάθειας σε γάτες με έλλειψη της λιποπρωτεϊνικής λιπάσης και στη φυλή Miniature schnauzer με ιδιοπαθή υπερλιπιδαιμία (Thompson και συν. 1989, Vaden 2005). Στις σπειραματονεφρίτιδες η θεραπευτική στρατηγική περιλαμβάνει την εξουδετέρωση της υποκείμενης νόσου ή παθολογικής κατάστασης, αν και εφόσον αυτό είναι δυνατόν, τη μείωση της πρωτεϊνουρίας και την αντιμετώπιση της ουραιμίας, του δευτερογενή υπερπαραθυρεοειδισμού, της υποκαλιαιμίας, της αρτηριακής υπέρτασης, της αναιμίας και της υπασβεστιαιμίας (Vaden 2005, Polzin και συν. 2005). Αν και η μείωση του βαθμού της πρωτεϊνουρίας φαίνεται να αντανακλά τη θετική ανταπόκριση της σπειραματονεφρίτιδας στη θεραπευτική αγωγή, σε ορισμένες περιπτώσεις μπορεί να υποδηλώνει επιδείνωση, εφόσον συνοδεύεται από μείωση της απεκκριτικής λειτουργίας του νεφρού (Jaenke και Allen 1986, Grauer 2005). Συγκεκριμένα, με την προοδευτική εξέλιξη της σπειραματονεφρίτιδας, σε πολλούς από τους προσβλημένους νεφρώνες εγκαθίσταται σπειραματοσκλήρυνση που συνεπάγεται δραστική μείωση ή αναστολή της διήθησης των πρωτεϊνών από τα αγγειώδη σπειράματα (D’Amico και Bazi 2003). Αν και στους υπόλοιπους λειτουργικούς νεφρώνες, που υπερτρέφονται αντισταθμιστικά, αυξάνει η ενδοσπειραματική πίεση και η μη εκλεκτική διήθηση των πρωτεϊνών, ο βαθμός

48

πρωτεϊνουρίας συνεχώς μειώνεται όσο η σπειραματονεφρίτιδα μεταπίπτει προοδευτικά σε νεφρική νόσο τελικού σταδίου (Grauer 2005). Η ποσοτική εκτίμηση της πρωτεϊνουρίας στο σκύλο γίνεται με τον προσδιορισμό του λόγου πρωτεϊνών / κρεατινίνης (Up/c) σε τυχαίο δείγμα ούρων ή τη μέτρηση των πρωτεϊνών στα ούρα που συλλέγονται κατά τη διάρκεια ενός 24ώρου (Hurley και Vaden 1995, Finco 1995c), αφού προηγουμένως επιβεβαιωθεί ότι είναι συνεχιζόμενη με τρεις τουλάχιστον ημιποσοτικές εξετάσεις (θολωσιμετρική μέθοδος κατά Heller ή του σουλφοσαλικυλικού οξέος) σε τυχαίο δείγμα ούρων, κάθε 15 ημέρες (Lees 2004, Grauer 2005). Ο λόγος Up/c, που είναι ευαίσθητη, γρήγορη και αξιόπιστη μέθοδος, βασίζεται στο συσχετισμό της ποσότητας των πρωτεϊνών και της κρεατινίνης των ούρων όταν η απεκκριτική λειτουργία των νεφρών είναι σταθερή (White και συν. 1984, Center και συν. 1985, Grauer και συν. 1985). Ο Up/c δεν επηρεάζεται από τον όγκο, το ειδικό βάρος και το pH των ούρων, την ώρα συλλογής του δείγματος, τη διάρκεια της νηστείας που προηγήθηκε, το είδος της τροφής ή το φύλο του ζώου (White και συν. 1984, Center και συν. 1985, Grauer και συν. 1985). Το τυχαίο δείγμα λαμβάνεται με κυστοκέντηση, για την αποφυγή επιμόλυνσής του με εκκρίσεις από την ουρήθρα ή τη γεννητική οδό. Ο υπολογισμός της απώλειας των πρωτεϊνών στα ούρα του 24ώρου εξαρτάται από τη μέθοδο μέτρησης της κρεατινίνης και των πρωτεϊνών στα ούρα (Lulich και Osborne 1990, Grauer 2005). Η εκτίμηση του βαθμού πρωτεϊνουρίας θεωρείται ότι είναι αξιόπιστη σε σκύλους που πάσχουν από χρόνια και όχι οξεία νεφρική ανεπάρκεια (Lulich και Osborne 1990). Σήμερα, φυσιολογική θεωρείται η κάτω του 0,5 τιμή του Up/c στα ούρα του σκύλου, με

49

συνεχή τάση για μείωση, ενώ όταν ξεπερνά το 2 αποτελεί σαφή ένδειξη ότι πρόκειται για σπειραματοπάθεια (Lees 2004, Grauer 2005). Όταν η τιμή του λόγου βρίσκεται μεταξύ 0,5 και 1 θα πρέπει να προσδιορίζεται η συγκέντρωση των λευκωματινών σε δείγμα ούρων με μεθόδους στις οποίες χρησιμοποιούνται ειδικά για το σκύλο αντισώματα (ERD – HealthScreen; Heska). Με τη μέθοδο αυτή, η συγκέντρωση των λευκωματινών στα ούρα φυσιολογικών σκύλων δε θα πρέπει να ξεπερνά το 1 mg/100 ml (Lees 2004), ενώ όταν βρίσκεται μεταξύ 1 mg/100 ml και 30 mg/100 ml χαρακτηρίζεται ως μικρολευκωματινουρία (Grauer 2005). Η μέτρηση των πρωτεϊνών στα ούρα του 24ώρου είναι ίσως η καλύτερη μέθοδος εκτίμησης της πρωτεϊνουρίας (Adams και συν. 1992, Finco 1995c), αν και απαιτεί τη συλλογή τους με την τοποθέτηση του ζώου σε μεταβολικό κλωβό ή με πολλαπλούς καθετηριασμούς της ουροδόχου κύστης (Grauer και συν. 1985, Finco 1995c). Οι προϋποθέσεις αυτές κάνουν τη μέθοδο δαπανηρή, χρονοβόρα και κοπιώδη, ενώ παράλληλα αυξάνουν τον κίνδυνο πρόκλησης ουρολοίμωξης (Grauer και συν. 1985). Οι περισσότερες μελέτες έχουν δείξει ότι η 24ωρη απώλεια πρωτεϊνών με τα ούρα σε κλινικά υγιείς σκύλους δεν ξεπερνά τα 15 mg/kg ΣΒ (Biewenga και συν. 1983, White και συν. 1984, Center και συν. 1985, Grauer και συν. 1985). Με την ηλεκτροφόρηση των πρωτεϊνών των ούρων (ποιοτική μέθοδος), που γίνεται με τη βοήθεια του Sodium Dodecyl Sulfate – Agarose Gel (SDS –AGE) η πρωτεϊνουρία μπορεί να διαφοροποιηθεί σε σπειραματική, σωληναριακή ή μικτή (Zaragosa και συν. 2003, Zini και συν. 2004). Όμως, εξακολουθούν να υπάρχουν αντικρουόμενες απόψεις ως προς το συσχετισμό μεταξύ ιστολογικού τύπου και έντασης των αλλοιώσεων της σπειραματονεφρίτιδας και του είδους – βαθμού έντασης της

50

πρωτεϊνουρίας, (Zaragoza και συν. 2003, Zatelli και συν. 2003, Zini και συν. 2004). H ευαισθησία

και

ειδικότητα

της

μεθόδου

αυτής

στην

πρόβλεψη

παρουσίας

σπειραματοπάθειας στο σκύλο ήταν 100% και 92,6%, αντίστοιχα, χωρίς όμως να μπορεί να προβλεφθεί ο ιστολογικός της τύπος σε αντίθεση με τις έντονου βαθμού αλλοιώσεις τη διαμεσοσωληναριακής νεφρίτιδας (Zini και συν. 2004).

4. Αναστολείς του μετατρεπτικού ενζύμου της αγγειοτασίνης (εναλαπρίλη) και σπειραματική πρωτεϊνουρία

Στη σπειραματονεφρίτιδα η αντισταθμιστική υπερπαραγωγή αγγειοτασίνης ΙΙ αυξάνει την ενδοσπειραματική πίεση που μπορεί να οδηγήσει σε μη ανατάξιμες αλλοιώσεις των νεφρικών σωματίων (Weber και συν. 1991). Η αγγειοτασίνη ΙΙ και άλλες αγγειοκινητικές ουσίες (π.χ. βραδυκινίνη) επηρεάζουν σημαντικά την αιμοδυναμική ισορροπία και απεκκριτική λειτουργία των νεφρών, χωρίς όμως να προκαλούνται ανάλογες αιμοδυναμικές μεταβολές στα άλλα όργανα του σώματος (Lulich και συν. 1996). Οι αναστολείς του μετατρεπτικού ενζύμου της αγγειοτασίνης Ι ή ΑΜΕΑ (π.χ. εναλαπρίλη, βεναζεπρίλη, ραμιπρίλη, λισινοπρίλη) βασικά μειώνουν το ρυθμό της προοδευτικής καταστροφής των αγγειωδών σπειραμάτων (σπειραματοσκλήρυνση) μέσω της εκλεκτικής μείωσης της αντίστασης των απαγωγών αρτηριδίων και στη συνέχεια της πτώσης της ενδοσπειραματικής πίεσης, ανεξάρτητα από το αν η συστημική αρτηριακή πίεση είναι φυσιολογική ή αυξημένη (Lulich και συν. 1996, Song και συν. 2003, Kim και συν. 2003).

51

Η αντιπρωτεϊνουρική και νεφροπροστατευτική (ΡΣΔ, κυκλοφορία αίματος στους νεφρούς, σπειραματοσκλήρυνση, διαμεσοσωληναριακή ίνωση) δράση των ΑΜΕΑ στις διάφορες σπειραματοπάθειες, έχει αποδοθεί και σε άλλους μηχανισμούς όπως ο περιορισμός της υπερπλασίας και υπερτροφίας των μεσάγγειων (Brown και συν. 1993), ο περιορισμός της αύξησης της μεσάγγειας ουσίας και της εναπόθεσης ανοσοσυμπλόκων στο μεσάγγειο χώρο (Hebert και συν. 1997), ο περιορισμός της απώλειας της θεϊικής ηπαράνης στο βασικό πέταλο των αγγειωδών σπειραμάτων (Reddi και συν. 1991), η μείωση του μεγέθους των πόρων των τριχοειδών αγγείων του αγγειώδους σπειράματος (Morelli και συν. 1990, Wiegmann και συν. 1992), η αύξηση του καταβολισμού των λιποπρωτεϊνών (Grauer και συν. 2000) και η αναστολή εναπόθεσης ινώδη συνδετικού ιστού στο νεφρικό παρέγχυμα (Epstein 2001) και της αποδόμησης της βραδυκινίνης (Hutchison και συν. 1995, Heller και συν. 1997). Στις μη διαβητικές σπειραματοπάθειες του ανθρώπου, εξίσου ικανοποιητική μείωση της πρωτεϊνουρίας, εκτός από τους ΑΜΕΑ προκαλεί η χορήγηση αποκλειστών ή ανταγωνιστών του τύπου Ι υποδοχέα της αγγειοτασίνης ΙΙ (ΑΥΑ) (Woo και Lau 2001, Kim και συν. 2003, Dillon 2004). Ακόμη μεγαλύτερη μείωση της πρωτεϊνουρίας έχει διαπιστωθεί ότι επιτυγχάνεται με την ταυτόχρονη χορήγηση των φαρμάκων αυτών, το νεφροπροστατευτικό αποτέλεσμα των οποίων επιτελείται μέσω της επιβράδυνσης του ρυθμού της σπειραματοσκλήρυνσης (Ferrari και συν. 2002, Song και συν. 2003). Απ’ ό,τι γνωρίζουμε οι ΑΥΑ δεν έχουν δοκιμαστεί, μόνοι τους ή μαζί με ΑΜΕΑ σε σκύλους με πρωτεϊνουρικές νεφροπάθειες. Η εναλαπρίλη, που πρωτοχρησιμοποιήθηκε και εξακολουθεί να χρησιμοποιείται ευρύτατα στην κτηνιατρική πράξη, είναι υπόλευκη κρυσταλλική και σχετικά ευδιάλυτη

52

στο νερό σκόνη, η οποία στο ήπαρ μετατρέπεται στο δραστικό της μεταβολίτη εναλαπριλάτη (Boothe 2001). Όπως αναφέρθηκε παραπάνω γενικά για τους ΑΜΕΑ, η εναλαπριλάτη ανταγωνίζεται την αγγειοτασίνη Ι στη σύνδεσή της με το μετατρεπτικό ένζυμό της (ΜΕΑ) αποτρέποντας το σχηματισμό της βιολογικά ενεργού αγγειοτασίνης ΙΙ (Allen και συν. 1987, Plumb 2005). Με τον τρόπο αυτό μειώνεται η σύνθεση της αγγειοτασίνης ΙΙ και στη συνέχεια η έκκριση της αλδοστερόνης και η συγκέντρωση της ρενίνης στο αίμα (Plumb 2005). Ενώ με την προκαλούμενη αγγειοδιαστολή η εναλαπριλάτη μειώνει τη συστημική αρτηριακή πίεση, στους νεφρούς εστιάζεται στη νεφρική αρτηρία και τα απαγωγά αρτηρίδια των νεφρικών σωματίων με αποτέλεσμα τη μείωση της ενδοσπειραματικής πίεσης και την αύξηση της ροής του αίματος στους νεφρώνες (Boothe 2001). Η βιοδιαθεσιμότητα της εναλαπρίλης, όταν χορηγείται από το στόμα, έχει υπολογιστεί στο 60% περίπου και ο χρόνος ημίσειας ζωής της είναι δύο περίπου ώρες, αν και συνήθως αυξάνεται στη χρόνια νεφρική ανεπάρκεια και τη συμφορητική καρδιακή ανεπάρκεια (Plumb 2005). Για τον περιορισμό της πρωτεϊνουρίας στις διάφορες σπειραματοπάθειες του σκύλου η προτεινόμενη δόση της εναλαπρίλης είναι 0,5 mg/kg ΣΒ, κάθε 12 ή 24 ώρες (Grauer και DiBartola 2000). Στην κλινική πράξη το αντιπρωτεϊνουρικό αποτέλεσμα της εναλαπρίλης ήταν ικανοποιητικό στην κληρονομική νεφρίτιδα σκύλων της φυλής Samoyed (Grodecki και συν. 1997) και την ιδιοπαθή μεμβρανώδη ή μεμβρανοϋπερπλαστική σπειραματονεφρίτιδα του σκύλου (Grauer και συν. 2000). Μείωση του βαθμού πρωτεϊνουρίας διαπιστώθηκε επίσης και σε 4 σκύλους με ΛΣ ύστερα από ταυτόχρονη θεραπεία με εναιώρημα AmB με λιπίδια και βεναζεπρίλη (Cortadellas 2003).

53

Τέλος, στις κυριότερες ανεπιθύμητες ενέργειες της εναλαπρίλης στο σκύλο περιλαμβάνονται η ανορεξία, ο έμετος και η διάρροια ενώ σπανιότερα μπορεί να παρατηρηθούν

αρτηριακή

υπόταση,

νεφρική

αζωθαιμία,

υπερκαλιαιμία

και

αναφυλακτική αντίδραση (Boothe 2001, Plumb 2005).

54

ΜΕΡΟΣ ΔΕΥΤΕΡΟ

ΔΙΚΗ ΜΑΣ ΕΡΕΥΝΑ

ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ

1. Κριτήρια συμμετοχής των ζώων στη μελέτη

Για τη συμμετοχή τους στη μελέτη, οι σκύλοι θα έπρεπε να πληρούν τα παρακάτω κριτήρια:

1. Να εμφανίζουν συμπτώματα συμβατά με εκείνα της ΛΣ, η διάγνωση της οποίας επιβεβαιώθηκε με ειδικές για τη Leishmania sp. ορολογικές και παρασιτολογικές εξετάσεις. 2. Να μην εμφανίζουν οξεία ή χρόνια νεφρική ανεπάρκεια, ανεξάρτητα του σταδίου της (χαμηλό ειδικό βάρος ούρων – πολυουρία, αζωθαιμία, ουραιμικό σύνδρομο). 3. Να μην πάσχουν ταυτόχρονα από άλλα νοσήματα που θα μπορούσαν να προκαλέσουν αλλοιώσεις στους νεφρούς. 4. Να είναι ορολογικά (spot ELISA) αρνητικοί για Ehrlichia canis και Dirofilaria immitis και κυτταρολογικά (μικροσκοπική εξέταση χρωματισμένων με Giemsa επιχρισμάτων από τη στοιβάδα των λευκών αιμοσφαιρίων – αιμοπεταλίων του αιματοκρίτη [buffy coat]) επίσης αρνητικοί για Ehrlichia canis, Babesia canis και

55

Hepatozoon canis που συχνά προκαλούν ασυμπτωματική λοίμωξη – νόσο στους σκύλους της χώρας μας. 5. Η καλλιέργεια για βακτηρίδια σε δείγμα ούρων που λαμβανόταν με κυστοκέντηση να είναι αρνητική. 6. Να μην τους έχει χορηγηθεί κανενός είδους αντιλεϊσμανιακή αγωγή, τουλάχιστον τους τελευταίους 6 μήνες. 7. Να έχουν ολοκληρώσει τη θεραπεία με AmB.

2. Στοιχεία ταυτότητας, ιστορικό και συνθήκες διαβίωσης των ζώων κατά τη διάρκεια της μελέτης

Στην έρευνα αυτή χρησιμοποιήθηκαν 56 συνολικά σκύλοι με συμπτωματική ΛΣ αφού προηγουμένως εξασφαλίστηκε η συγκατάθεση των ιδιοκτητών τους. Τα ζώα προσκομίστηκαν στην Κλινική των Ζώων Συντροφιάς (Μονάδα Παθολογίας) της Κτηνιατρικής Σχολής του Α.Π.Θ. από το Σεπτέμβριο του 2001 μέχρι τον Ιούνιο του 2004. Οι 36 σκύλοι ήταν αρσενικοί (64,3%) και οι 20 θηλυκοί (35,7%), χωρίς κανένας από αυτούς να είναι στειρωμένος. Οι 45 από αυτούς (80,4%) ανήκαν σε 17 διαφορετικές αμιγείς φυλές, οι 4 ήταν μιγάδες (7,1%), ενώ στους υπόλοιπους 7 (12,5%) ο προσδιορισμός της φυλής ήταν αδύνατος. Η ηλικία τους κυμαινόταν από 0,6 μέχρι 9 χρόνια (μέσος όρος: 4,2 χρόνια) και το σωματικό τους βάρος από 9,5 μέχρι 45 kg (μέσος όρος: 22,9 kg) (Πίνακας 1). Όλα τα ζώα εμβολιάζονταν κάθε χρόνο για τη νόσο του Carré, τη λοιμώδη ηπατίτιδα, τη λεπτοσπείρωση, την παρβοεντερίτιδα και τη λύσσα και

56

τους χορηγούνταν ευρέος φάσματος ανθελμινθικά φάρμακα σε τακτά χρονικά διαστήματα. Τα κύρια αίτια προσκόμισης των ζώων στην Κλινική για εξέταση ήταν οι δερματικές αλλοιώσεις (34/56 – 60,7%), η εύκολη κόπωση (28/56 – 50%), η προοδευτική απώλεια του σωματικού βάρους (28/56 – 50%), η μείωση της όρεξης ή η ανορεξία (23/56 – 41,1%), οι οφθαλμικές αλλοιώσεις (12/56 – 21,4%), η χωλότητα (7/56 – 12,5%), η επίσταξη (6/56 - 10,7%), το ρινικό έκκριμα (5/56 – 8,9%) και η διάρροια (2/56 – 3,6%). Επισημαίνεται ότι σε 6 από τους 56 σκύλους (10,7%), η ΛΣ διαγνώστηκε στα πλαίσια της προληπτικής κλινικής και εργαστηριακής εξέτασης. Καθόλη τη διάρκεια της θεραπείας με AmB οι 40 από τους 56 συνολικά σκύλους (71,4%) διατηρούνταν σε ευρύχωρα κλουβιά των κτιριακών εγκαταστάσεων της Κλινικής των Ζώων Συντροφιάς (Μονάδα Παθολογίας) όπου τους δινόταν καθημερινά η δυνατότητα άσκησης στον προαύλιο χώρο. Τα ζώα διατρέφονταν με ξηρού τύπου κοινή βιομηχανοποιημένη τροφή για σκύλους και είχαν ελεύθερη πρόσβαση στο νερό. Οι υπόλοιποι 16 σκύλοι προσκομίζονταν από τους ιδιοκτήτες τους στην Κλινική μόνο τις ημέρες που γινόταν η ενδοφλέβια χορήγηση της AmB και διατρέφονταν με τον ίδιο τύπο τροφής. Μετά την ολοκλήρωση της θεραπείας με AmB, που διήρκησε από 22 μέχρι 60 ημέρες, μόνο 3 από τους 56 σκύλους παρέμειναν στην Κλινική μέχρι το τέλος της μελέτης. Στα υπόλοιπα 53 ζώα η συνέχιση της θεραπείας με αλλοπουρινόλη, με ή χωρίς την προσθήκη εναλαπρίλης, για 5 επιπλέον μήνες γινόταν από τους ιδιοκτήτες στο σπίτι.

57

Πίνακας 1. Στοιχεία ταυτότητας των ζώων που χρησιμοποιήθηκαν στη μελέτη α/α*

Φύλο

Ηλικία σε χρόνια

ΣΒ (kg)

1 2 3 4

English pointer Doberman pinscher Juras des Alpes Boxer

Φυλή

♀ ♂ ♂ ♂

4,5 5,5 2,5 3

22 35 25 24

5 •• 6

Groenendal Ακαθόριστη

♀ ♀

1 0,6

36 20

7• 8 9 10 11 12 13

Ελληνικός ιχνηλάτης ή Γκέκας Ελληνικός ιχνηλάτης Labrador retriever German shepherd μιγάς Ακαθόριστη English setter English setter

♂ ♀ ♂ ♂ ♂ ♀ ♂

2 3,5 8 4 5 5,5 5

17 17,5 35 35 12 16 20

14 • 15 16

Ελληνικός ιχνηλάτης German shepherd μιγάς Ακαθόριστη

♀ ♂ ♀

4 2 3

17 29 43

17 •

Ελληνικός ιχνηλάτης

♀

1,5

17

18 • 19 20 21 22 23

German shorthaired pointer Ακαθόριστη Ελληνικός ιχνηλάτης English pointer Rottweiler English setter

♀ ♂ ♀ ♀ ♂ ♂

4 7 4 1 1,5 4

19 32 19 15 45 22

24 •• 25 26 27

Golden retriever Pit – bull μιγάς German shepherd μιγάς Ελληνικός ποιμενικός

♂ ♀ ♂ ♂

2,5 3 7,5 5

25 18 28,5 26

28 •• 29

German shepherd Ακαθόριστη

♂ ♂

4 3

40 22

30 •

Ελληνικός ιχνηλάτης

♂

4,5

13,5

31 •• 32

Ελληνικός ιχνηλάτης Siberian husky

♀ ♀

3 8

18,8 16

33 •• 34 35 36 37

Brittany spaniel Ακαθόριστη Ελληνικός ιχνηλάτης Ελληνικός ιχνηλάτης Doberman pinscher

♂ ♂ ♀ ♂ ♂

3 5 6 4 4,5

13,5 9,5 16,5 14,8 35,5

38 • 39 40

Doberman pinscher Irish setter Old English sheepdog

♀ ♂ ♂

6,5 4 4

33,5 27 22

41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56

Ελληνικός ιχνηλάτης Ελληνικός ιχνηλάτης Ακαθόριστη Ελληνικός ιχνηλάτης Brittany spaniel Ελληνικός ιχνηλάτης Ελληνικός ιχνηλάτης Ελληνικός ιχνηλάτης Ελληνικός ιχνηλάτης Ελληνικός ιχνηλάτης English pointer Doberman pinscher Doberman pinscher English setter Groenendal English setter

♂ ♂ ♂ ♀ ♂ ♀ ♂ ♂ ♂ ♂ ♀ ♂ ♀ ♂ ♂ ♂

4 6 9 3 4 5 6 4 2,5 3,5 3 4 4 5 8 4

18 22 18 15 16 19,6 17 17 21 16,5 17 32 26 21 31,5 20

58

* Τα ζώα με α/α από 1 μέχρι και 23 περιλήφθηκαν στην ομάδα Α, από 24 μέχρι και 40 στην ομάδα Β και από 41 μέχρι και 56 στην ομάδα Γ.

• Ζώα που δεν προσκομίστηκαν από τους ιδιοκτήτες τους για εξέταση στο χρόνο 2 της μελέτης.

•• Ζώα στα οποία δε χορηγήθηκε αλλοπουρινόλη επειδή παρουσίαζαν παρασιτολογική ίαση στο χρόνο 1 της μελέτης.

3. Σχεδιασμός της μελέτης

Η μελέτη αυτή, που για κάθε περιστατικό ολοκληρωνόταν σε διάστημα 6 με 7 μηνών, περιλάμβανε δύο σκέλη. Στο πρώτο σκέλος εκτιμήθηκε το αποτέλεσμα της θεραπευτικής αγωγής με AmB, αναφορικά με την κλινική εικόνα, τις εργαστηριακές εξετάσεις και την παρασιτολογική ίαση των 56 σκύλων που παρουσίαζαν τη συμπτωματική μορφή της ΛΣ. Επιπλέον καταγράφηκαν οι τυχόν ανεπιθύμητες ενέργειές της, εκτός από εκείνες που είχαν σχέση με τη νεφρική λειτουργία. Για το σκοπό αυτό στο χρόνο 0 (24 ώρες πριν από την έναρξη της θεραπείας με AmB) και στο χρόνο 1 (3 ημέρες μετά τη λήξη της θεραπείας με AmB, ανεξάρτητα από τη χρονική της διάρκεια στο κάθε ζώο), βαθμολογούνταν η ένταση της συμπτωματολογίας εκείνων των παθολογικών καταστάσεων που ήταν συμβατές με την κλινική εικόνα της ΛΣ, ύστερα από λεπτομερή και προσεκτική κλινική εξέταση. Στους ίδιους επίσης χρόνους γινόταν η συνήθης αιματολογική (ολικό αίμα) και βιοχημική

59

εξέταση (ορός αίματος), με εξαίρεση τους δείκτες της νεφρικής λειτουργίας (κρεατινίνη, άζωτο ουρίας, φωσφόρος), μικροσκοπική εξέταση επιχρισμάτων από οπό λεμφογαγγλίου και ερυθρό μυελό των οστών ύστερα από παρακέντηση (μέτρηση παρασιτικού φορτίου), εξέταση με PCR σε δείγμα από μυελό των οστών (ανίχνευση πυρηνικών οξέων του παρασίτου) και ορολογικός έλεγχος με τη μέθοδο IFAT (προσδιορισμός τίτλου των ειδικών αντισωμάτων κατά της L. infantum). Τέλος, καθόλη τη διάρκεια της θεραπείας και ειδικότερα πριν από κάθε συνεδρία με AmB, τα ζώα ελέγχονταν για τυχόν εμφάνιση ανεπιθύμητων ενεργειών από τη χρήση του φαρμάκου. Στο δεύτερο σκέλος της έρευνας εκτιμήθηκε η επίδραση της AmB σε συνδυασμό ή όχι με την εναλαπρίλη πάνω στην απεκκριτική λειτουργία των νεφρών και το βαθμό της πρωτεϊνουρίας. Και πάλι στους χρόνους 0 και 1 μετρούνταν οι συγκεντρώσεις του αζώτου ουρίας, της κρεατινίνης και του φωσφόρου στον ορό του αίματος, προσδιοριζόταν ο ρυθμός σπειραματικής διήθησης (ΡΣΔ) με τη μέθοδο της εξωγενούς κάθαρσης της κρεατινίνης, υπολογιζόταν ο λόγος πρωτεϊνών / κρεατινίνης (Up/c) σε τυχαίο δείγμα ούρων (κυστοκέντηση), ύστερα από προηγούμενο προσδιορισμό της συγκέντρωσής τους σ’ αυτό και τέλος γινόταν ανάλυση και των ούρων στην υπόλοιπη ποσότητα του ίδιου δείγματος (μέτρηση ειδικού βάρους, εμβάπτιση χρωματομετρικής ταινίας, ημιποσοτικός έλεγχος πρωτεϊνουρίας με την κατά Heller θολωσιμετρική μέθοδο, μικροσκοπική εξέταση του ιζήματος). Για το δεύτερο σκέλος της έρευνας, οι 56 σκύλοι χωρίστηκαν από την αρχή (χρόνος 0) στις παρακάτω 3 ομάδες με βάση την παρουσία (θετική κατά Heller θολωσιμετρική δοκιμή, Up/c > 0,5) ή την απουσία πρωτεϊνουρίας διήθησης και την καθημερινή χορήγηση ή όχι εναλαπρίλης σε συνδυασμό με την AmB:

60

♦ Ομάδα Α (n: 23): σκύλοι που δεν παρουσίαζαν κανενός τύπου πρωτεϊνουρία και τους χορηγήθηκε μόνο AmB (Πίνακας 2). ♦ Ομάδα Β (n: 17): σκύλοι που παρουσίαζαν πρωτεϊνουρία διήθησης και στους οποίους χορηγήθηκε μόνο AmB (Πίνακας 3). ♦ Ομάδα Γ (n: 16): σκύλοι που παρουσίαζαν και πάλι πρωτεϊνουρία διήθησης, στους οποίους εκτός από την AmB χορηγήθηκε και εναλαπρίλη (Πίνακας 4). Επισημαίνεται ότι ο διαχωρισμός των πρωτεϊνουρικών σκύλων στις ομάδες Β και Γ ήταν τυχαιοποιημένη αφού βασίστηκε στην προτεραιότητα προσκόμισής τους στην Κλινική. Στους παρακάτω 3 πίνακες (Πίνακες 2, 3, 4) απεικονίζεται λεπτομερώς η κλινική εικόνα του καθενός από τους σκύλους ξεχωριστά με την παρουσίαση των παθολογικών εκείνων καταστάσεων που χαρακτηρίζουν τη ΛΣ.

61

Πίνακας 2: Κλινική εικόνα των σκύλων της ομάδας Α κατά την έναρξη της μελέτης (χρόνος 0) Σκύλοι (n=23) A1 A2 Α3 Α4 A5 A6 Α7 A8 Α9 A10 A11 Α12 Α13 A14 Α15 Α16 A17 A18 Α19 A20 Α21 A22 A23

1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. 19.

Παθολογικές καταστάσεις που έχουν σχέση με τη ΛΣ 1, 2, 3, 5, 6, 7, 9, 12, 13 1, 2, 3, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 12 1, 2, 3, 4, 5, 6 1, 2, 3, 4, 5, 7, 10, 11, 14 1, 2, 3, 4, 5, 7, 10 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 1, 2, 3, 4, 5, 7, 8, 15 1, 10, 11, 16 1, 2, 3, 4, 6, 10 2, 8, 9, 13 1, 3, 4, 9, 11, 15 1 1, 2, 4, 5, 7, 8 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 13, 15, 16, 17 1, 2, 3, 4, 5, 6, 10, 11, 14, 18 1 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 19 1, 2, 3, 4, 5 1, 2, 3, 4, 5, 7, 8 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10, 11, 14 1, 2, 3, 4, 5, 6, 9 4

Λεμφογαγγλιομεγαλία (21/23 - 91,3%) Υπερκεράτωση ακρορρινίου (18/23 - 78,3%) Βλεφαρίτιδα (17/23 - 73,9%) Αποφολιδωτική δερματίτιδα (17/23 - 73,9%) Υπερκεράτωση πελματικών φυμάτων (16/23 - 69,6%) Επιπεφυκίτιδα (11/23 - 47,8%) Ονυχογρύπωση (11/23 - 47,8%) Κακή θρεπτική κατάσταση ή απίσχνανση (10/23 - 43,5%) Ατροφία μασητηρίων μυών (10/23 - 43,5%) Επιπολής ή εν τω βάθει βακτηριδιακή δερματίτιδα (7/23 - 30,4%) Δερματικά έλκη (6/23 - 26,1%) Ραγοειδίτιδα (3/23 - 13%) Κερατίτιδα (3/23 - 13%) Παρονυχία (3/23 - 13%) Σπληνομεγαλία (3/23 - 13%) Πολυαρθρίτιδα (2/23 - 8,7%) Ηπατομεγαλία (1/23 - 4,3%) Ελκώδης στοματίτιδα (1/23 - 4,3%) Επίσταξη (1/23 - 4,3%)

62

Πίνακας 3: Κλινική εικόνα των σκύλων της ομάδας Β κατά την έναρξη της μελέτης (χρόνος 0) Σκύλοι (n=17) B1 B2 Β3 Β4 B5 B6 Β7 B8 Β9 B10 B11 Β12 Β13 B14 Β15 Β16 B17

1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. 19. 20.

Παθολογικές καταστάσεις που έχουν σχέση με τη ΛΣ 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 13, 14, 20 1, 2, 3, 4, 5, 7, 9, 10 1, 2, 6, 7, 8, 10, 11 1, 3, 4, 5, 6, 7, 8 1, 11 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 13, 15, 18 2, 3, 4, 7, 10, 12 1, 3, 4, 5, 9 1, 2, 7, 9, 12, 17, 19 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 13, 15, 16 1, 2, 3, 4, 5, 6, 16 1, 2, 7, 10 1, 4 1, 2, 3, 4, 5, 6, 12 1, 2, 3, 5, 6, 8, 9, 14, 17 1, 2, 6, 8, 9 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 11

Λεμφογαγγλιομεγαλία (16/17 - 94,1%) Ατροφία μασητηρίων μυών (13/17 - 76,5%) Υπερκεράτωση πελματικών φυμάτων (11/17 - 64,7%) Ονυχογρύπωση (11/17 - 64,7%) Υπερκεράτωση ακρορρινίου (10/17 - 58,8%) Επιπεφυκίτιδα (10/17 - 58,8%) Κακή θρεπτική κατάσταση ή απίσχνανση (10/17 - 58,8%) Βλεφαρίτιδα (8/17 - 47,1%) Αποφολιδωτική δερματίτιδα (8/17 - 47,1%) Δερματικά έλκη (6/17 - 35,3%) Επιπολής ή εν τω βάθει σταφυλοκοκκική δερματίτιδα (4/17 - 23,5%) Δερματικά οζίδια (3/17 – 17,6%) Ηπατομεγαλία (3/17 - 17,6%) Κερατίτιδα (2/17 - 11,8%) Σπληνομεγαλία (2/17 - 11,8%) Ραγοειδίτιδα (2/17 - 11,8%) Πολυαρθρίτιδα (2/17 - 11,8%) Παρονυχία (1/17 - 5,9%) Επίσταξη (1/17 - 5,9%) Υποδόριοι όγκοι (1/17 - 5,9%)

63

Πίνακας 4: Κλινική εικόνα των σκύλων της ομάδας Γ κατά την έναρξη της μελέτης (χρόνος 0) Σκύλοι (n=16) Γ1 Γ2 Γ3 Γ4 Γ5 Γ6 Γ7 Γ8 Γ9 Γ10 Γ11 Γ12 Γ13 Γ14 Γ15 Γ16

1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. 19. 20.

Παθολογικές καταστάσεις που έχουν σχέση με τη ΛΣ 1, 4, 7 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 14 1, 2, 7, 9, 11 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 12, 16, 17, 18, 19 1, 2, 3, 5, 6, 9, 10, 12, 13, 15 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 14, 15 1, 2, 4, 6, 11 2, 6, 9, 10, 13 1, 2, 3 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 18 1, 2, 3, 4, 5, 9, 12 1, 4, 7, 8, 17 1, 2, 3, 11, 16, 20 1, 3, 4, 5, 7, 8 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10, 11, 19

Λεμφογαγγλιομεγαλία (15/16 - 93,8%) Υπερκεράτωση πελματικών φυμάτων (13/16 - 81,3%) Βλεφαρίτιδα (11/16 - 68,8%) Κακή θρεπτική κατάσταση ή απίσχνανση (11/16 - 68,8%) Επιπεφυκίτιδα (9/16 - 56,3%) Ονυχογρύπωση (9/16 - 56,3%) Ατροφία μασητηρίων μυών (8/16 - 50%) Αποφολιδωτική δερματίτιδα (8/16 - 50%) Υπερκεράτωση ακρορρινίου (8/16 - 50%) Ραγοειδίτιδα (4/16 - 25%) Επίσταξη (4/16 - 25%) Επιπολής ή εν τω βάθει σταφυλοκοκκική δερματίτιδα (4/16 - 25%) Κερατίτιδα (2/16 - 12,5%) Ηπατομεγαλία (2/16 - 12,5%) Σπληνομεγαλία (2/16 - 12,5%) Πολυαρθρίτιδα (2/16 - 12,5%) Ελκώδης στοματίτιδα (2/16 - 12,5%) Δερματικά έλκη (2/16 - 12,5%) Παρονυχία (2/16 - 12,5%) Δερματικά οζίδια (1/16 - 6,3%)

64

Κατά τη σύγκριση μεταξύ των 3 ομάδων ως προς την κατανομή των δύο φύλων, την ηλικία, τη φυλή και το σωματικό βάρος των ζώων δε βρέθηκαν σημαντικές διαφορές στο χρόνο 0. Όλες οι προαναφερθείσες εργαστηριακές εξετάσεις του δεύτερου σκέλους της μελέτης επαναλήφθηκαν 5 μήνες μετά το τέλος της θεραπείας με AmB (χρόνος 2). Στο χρονικό αυτό διάστημα συνεχίστηκε η χορήγηση της εναλαπρίλης στα ζώα της ομάδας Γ ενώ παράλληλα δόθηκε αλλοπουρινόλη από το στόμα στα ζώα και των 3 ομάδων. Στο σημείο όμως αυτό θα πρέπει να αναφερθεί ότι 4/23 (17,4%) σκύλοι της ομάδας Α (Α7, Α14, Α17, Α18) και 2/17 (11,8%) της ομάδας Β (Β7, Β15) δεν επαναπροσκομίστηκαν από τους ιδιοκτήτες τους στην προγραμματισμένη εξέταση του χρόνου 2 (Πίνακας 1). Στις συγκρίσεις του χρόνου 1 με το χρόνο 2 δε συμπεριλήφθηκαν και 5 επιπλέον σκύλοι (Α5, Β1, Β5, Β8, Β10) στους οποίους δε χορηγήθηκε αλλοπουρινόλη αφού διαπιστώθηκε ότι στο χρόνο 1 είχε επιτευχθεί παρασιτολογική ίαση με βάση το αρνητικό αποτέλεσμα της παρασιτολογικής εξέτασης στο λεμφογάγγλιο και το μυελό των οστών, καθώς και της PCR (Πίνακας 1). Αντίθετα, στους υπόλοιπους 51 (91,1%) σκύλους (ομάδα Α: 22, ομάδα Β: 13, ομάδα Γ: 16) η αλλοπουρινόλη χορηγήθηκε επειδή στο χρόνο 1 όχι μόνο δεν είχαν απαλλαγεί πλήρως από το πρωτόζωο (μη επίτευξη παρασιτολογικής ίασης) αλλά οι περισσότεροι από αυτούς (47/51 – 92,2%) παρουσίαζαν βελτίωση, στασιμότητα ή επιδείνωση της κλινικής τους εικόνας και όχι κλινική ίαση. Με βάση τα παραπάνω στοιχεία, στις συγκρίσεις των εργαστηριακών παραμέτρων του δεύτερου σκέλους της έρευνας μεταξύ των ομάδων Α, Β και Γ, στο χρόνο 2 τελικά περιλήφθηκαν 45 συνολικά ζώα (ομάδα Α: 18, ομάδα Β: 11, ομάδα Γ: 16) ενώ στους χρόνους 0 και 1 περιλήφθηκαν 56 ζώα (ομάδα Α: 23, ομάδα Β: 17, ομάδα Γ:

65

16). Σε κάθε περίπτωση, οι συγκρίσεις μεταξύ των χρόνων 1 και 2 γίνονταν σε 45 ζώα, ενώ εκείνες μεταξύ των χρόνων 0 και 1 σε 56 ζώα. Οι συγκρίσεις των δεικτών της πρωτεϊνουρίας (Up/c, λευκωματίνες, χοληστερόλη) σε όλους τους χρόνους έγιναν μόνο μεταξύ των ομάδων Β και Γ. Τέλος, η σύγκριση της παρασιτολογικής ανταπόκρισης στη θεραπεία με AmB (κυτταρολογική, ορολογική και εξέταση με PCR) επεκτάθηκε και μεταξύ των χρόνων 1 και 2 στα 45 ζώα στα οποία χορηγήθηκε αλλοπουρινόλη.

4. Φάρμακα που χρησιμοποιήθηκαν στη μελέτη

Αμφοτερικίνη Β (AmB)

Και στους 56 σκύλους χρησιμοποιήθηκε η υδατοδιαλυτή δεσοξυχολική AmB (Fungizone®, Squibb) στη δόση των 1,5 mg/kg ΣΒ κάθε 3-4 ημέρες (δύο φορές την εβδομάδα) μέχρι τη συμπλήρωση της συνολικής δόσης των 12 mg/kg ΣΒ (Lamothe 2001, Cortadellas 2003) σε 8 θεραπευτικές συνεδρίες. Η συνολική διάρκεια της θεραπείας με AmB κυμάνθηκε από 22 μέχρι 60 ημέρες, ανάλογα με το βαθμό της πρόσκαιρης διαταραχής της απεκκριτικής λειτουργίας των νεφρών του καθενός από τους σκύλους. Απαραίτητη προϋπόθεση πριν από κάθε χορήγηση AmB ήταν η συγκέντρωση της κρεατινίνης στον ορό του αίματος να μην υπερβαίνει τα 2,5 mg/100 ml (Lamothe 2001, Cortadellas 2003). Σε αντίθετη περίπτωση, η χορήγηση αναβαλλόταν για να συνεχιστεί την επόμενη προγραμματισμένη συνεδρία με την προϋπόθεση ότι μέχρι τότε η

66

συγκέντρωση της κρεατινίνης είχε υποχωρήσει κάτω από το παραπάνω όριο. Εφόσον η υπερκρεατινιναιμία εξακολουθούσε να υφίσταται για περισσότερες από 4 συνεχόμενες συνεδρίες, η θεραπευτική προσπάθεια με AmB διακόπτονταν οριστικά και το ζώο αποκλειόταν από τη μελέτη. Αυτό διαπιστώθηκε σε 3 μόνο ζώα που τελικά δεν περιλήφθηκαν στη μελέτη. Πριν από κάθε συνεδρία παρασκευαζόταν λιπόφιλο διάλυμα AmB από το εμπορικό σκεύασμα. Αναλυτικότερα, η ανασύσταση της λυοφιλοποιημένης σκόνης (50 mg) γινόταν στον περιέκτη - φιαλίδιο με την προσθήκη 10 ml δισαπεσταγμένου και αποστειρωμένου νερού. Στη συνέχεια το διάλυμα αυτό μεταφερόταν σε αποστειρωμένο περιέκτη των 50 ml που περιείχε 10 ml σκευάσματος γαλακτοποιημένων λιπιδίων για παρεντερική διατροφή (Intralipid 10%®, Fresenius) και 30 ml δισαπεσταγμένου και αποστειρωμένου νερού ώστε η τελική συγκέντρωση της AmB να είναι 1 mg/ml. Ακολουθούσε καλή ανακίνηση του περιέκτη για 15 περίπου min για την όσο το δυνατόν πληρέστερη ομοιογενοποίηση του εναιωρήματος (Lamothe 2001). Επειδή το τελευταίο πρέπει να χορηγείται αυστηρά ενδοφλέβια, τοποθετούνταν πλαστικός ενδοφλέβιος καθετήρας 18 – 20 G (Abbocath®, Abbot) στην κεφαλική φλέβα, ανάλογα με το μέγεθος του ζώου, ύστερα από κούρεμα του τριχώματος και επιμελημένη αντισηψία του δέρματος. Στον καθετήρα προσαρμοζόταν συσκευή ροής πολλαπλών κατευθύνσεων (3way stopcock) και το σύστημα σταθεροποιούνταν με συγκολλητικές ταινίες, αποστειρωμένες γάζες και καθηλωτικό επίδεσμο. Ακολουθούσε η έκπλυση του καθετήρα με ηπαρινισμένο φυσιολογικό ορό (5.000 U θειικής ηπαρίνης/L) και η σύνδεσή του με συσκευή χορήγησης υγρών. Λίγο πριν από την ένεση του εναιωρήματος της AmB προκαλούνταν έντονη διούρηση, αρχικά με την ενδοφλέβια έγχυση φυσιολογικού ορού

67

στη δόση των 50 ml/kg ΣΒ για 40 min και αμέσως μετά με τη χορήγηση διαλύματος μαννιτόλης 20% στη δόση των 10 ml/kg ΣΒ για 15 min. Στη συνέχεια, ο ανάλογος με το ΣΒ του ζώου όγκος του εναιωρήματος της AmB χορηγούταν ενδοφλέβια μέσα σε 20 με 30 min. Τα ζώα καθόλη τη διάρκεια της χορήγησης παρακολουθούνταν για τυχόν εμφάνιση ανεπιθύμητων ενεργειών. Η ανάμιξη της AmB με γαλάκτωμα λιπιδίων σε συνδυασμό με την πρόκληση διούρησης σκοπό είχαν να περιορίσουν, όσο το δυνατόν περισσότερο, τη νεφροτοξικότητα της υδατοδιαλυτής μορφής του φαρμάκου. Τέλος, ο ενδοφλέβιος καθετήρας αφαιρούνταν ύστερα από προηγούμενη έκπλυσή του με ηπαρινισμένο ορό. Όλες οι συνεδρίες γίνονταν στο νοσηλευτήριο της Κλινικής και οι σκύλοι που παρέμειναν σ’ αυτή (n: 40) παρακολουθούνταν τρεις φορές την ημέρα για τυχόν εμφάνιση ανεπιθύμητων ενεργειών της AmB. Στους ιδιοκτήτες των ζώων που επέστρεφαν στο σπίτι ύστερα από κάθε συνεδρία (n: 16) συστηνόταν η συχνή παρακολούθησή τους για τον ίδιο ακριβώς λόγο.

Αλλοπουρινόλη

Στους σκύλους των οποίων η μικροσκοπική εξέταση των επιχρισμάτων από οπό λεμφογαγγλίου και μυελό των οστών ή/και η PCR ήταν θετική ως προς τη Leishmania sp. (n: 51) μετά το τέλος της θεραπείας με AmB, χορηγήθηκε από το στόμα αλλοπουρινόλη (Zylapour®, Farmanic) στη δόση των 10 mg/kg ΣΒ κάθε 12 ώρες (Koutinas και συν 2001) για διάστημα 5 περίπου μηνών, που σηματοδοτούσε και το τέλος της έρευνας (χρόνος 2).

68

Εναλαπρίλη

Στα ζώα της ομάδας Γ (n:16) που παρουσίαζαν ασυμπτωματική πρωτεϊνουρία χορηγήθηκε από το στόμα εναλαπρίλη (Renitec®, Searle) στη δόση των 0,5 mg/kg ΣΒ κάθε 24 ώρες (Grauer και συν. 2000), όχι μόνο κατά τη διάρκεια της θεραπείας με AmB (χρόνος 1) αλλά και εκείνης με αλλοπουρινόλη (χρόνος 2). Ο ΑΜΕΑ αυτός δόθηκε για να διαπιστωθεί αν μπορεί να μειώσει το βαθμό πρωτεϊνουρίας στη χρόνια σπειραματονεφρίτιδα της ΛΣ και κατά δεύτερο λόγο αν μπορεί να επηρεάσει ευνοϊκά τον ΡΣΔ.

5. Κλινική εξέταση

Η κλινική εξέταση, που γινόταν σε καθένα από τους 56 σκύλους ξεχωριστά, περιλάμβανε τη θερμομέτρηση, την επισκόπηση των ορατών βλεννογόνων, την ακρόαση της καρδιάς και των πνευμόνων, τη λήψη του σφυγμού, την ψηλάφηση των υποδόριων λεμφογαγγλίων, και των οργάνων της κοιλιακής κοιλότητας και τον έλεγχο του δέρματος και των οφθαλμών. Στα συμβατά με τη ΛΣ κλινικά ευρήματα, που διαπιστώθηκαν λίγο πριν από την έναρξη της θεραπείας με AmB (χρόνος 0), περιλαμβάνονταν, σε φθίνουσα σειρά ως προς τη συχνότητα εμφάνισης, η περιφερική λεμφογαγγλιομεγαλία (52/56 92,9%), η υπερκεράτωση των πελματικών φυμάτων (40/56 - 71,4%), η βλεφαρίτιδα (36/56 - 64,3%), η υπερκεράτωση του ακρορρινίου (36/56 - 64,3%), η αποφολιδωτική δερματίτιδα (33/56 - 58,9%), η κακή θρεπτική κατάσταση ή απίσχνανση (31/56 - 55,4%), 69

η ατροφία των μασητήριων μυών (31/56 - 55,4%), η ονυχογρύπωση (31/56 - 55,4%), η επιπεφυκίτιδα (30/56 - 53,6%), η επιπολής ή εν τω βάθει σταφυλοκοκκική δερματίτιδα ως επιπλοκή των δερματικών αλλοιώσεων της νόσου (15/56 - 26,8%), τα δερματικά έλκη (14/56 - 25%), η ραγοειδίτιδα (9/56 - 16,1%), η κερατίτιδα (7/56 - 12,5%), η σπληνομεγαλία (7/56 - 12,5%), η ηπατομεγαλία (6/56 - 10,7%), η πολυαρθρίτιδα (6/56 10,7%), η επίσταξη (6/56 - 10,7%), η παρονυχία (6/56 - 10,7%), τα δερματικά οζίδια (4/56 - 7,1%), η ελκώδης στοματίτιδα (3/56 - 5,4%) και οι υποδόριοι όγκοι λόγω πυοκοκκιωματώδους - κοκκιωματώδους υποδερματίτιδας (1/56 - 1,8%) (Πίνακες 2, 3, 4). Η βαθμολόγηση της έντασης καθεμιάς από τις παραπάνω παθολογικές καταστάσεις έγινε υποκειμενικά από δύο διαφορετικούς εξεταστές με βάση την κλίμακα 0 – 3 (0: απουσία, 1: ήπιου βαθμού, 2: μέτριου βαθμού, 3: έντονου βαθμού) και το τελικό αποτέλεσμα

διαμορφώθηκε

από

το

μέσο

όρο

των

δύο

εκτιμήσεων,

χωρίς

στρογγυλοποίηση. Ο βαθμός έντασης της συνολικής κλινικής εικόνας του καθενός από τους 56 σκύλους υπολογίστηκε με βάση το άθροισμα του βαθμού έντασης των επιμέρους παθολογικών καταστάσεων που συνυπήρχαν σε διάφορους αριθμούς και συνδυασμούς. Για το πρώτο σκέλος της μελέτης η βαθμολόγηση της έντασης της συνολικής κλινικής εικόνας έγινε στους χρόνους 0 και 1, οι οποίοι στη συνέχεια συγκρίθηκαν μεταξύ τους για το καθένα ζώο ξεχωριστά προκειμένου τελικά να εξακριβωθεί πόσα από αυτά παρουσίαζαν κλινική ίαση, στατιστικά σημαντική βελτίωση, στασιμότητα ή ενδεχομένως επιδείνωση της κλινικής εικόνας. Η κλινική βελτίωση θεωρήθηκε καλή και πολύ καλή όταν ο βαθμός έντασης της συνολικής κλινικής εικόνας μειωνόταν > 50-75% και > 75%, αντίστοιχα.

70

6. Αιματολογικές και βιοχημικές εξετάσεις

Οι συνήθεις στην κλινική πράξη αιματολογικές και βιοχημικές εξετάσεις έγιναν και στους 56 σκύλους, στους χρόνους 0 και 1 της μελέτης (πρώτο σκέλος). Στο χρόνο 2 μετρήθηκαν μόνο οι συγκεντρώσεις των βιοχημικών δεικτών της νεφρικής λειτουργίας (άζωτο ουρίας, κρεατινίνη, φωσφόρος), καθώς και εκείνες των ολικών πρωτεϊνών, των λευκωματινών και της χοληστερόλης (δεύτερο σκέλος της μελέτης). Η αιμοληψία γινόταν από τη σφαγίτιδα φλέβα με σύριγγα των 10 ml και βελόνα 21 G ύστερα από καλή αντισηψία. Για την αιματολογική εξέταση 2 ml του αίματος τοποθετούνταν σε φιαλίδιο που περιείχε αιθυλενοδιαμινοτετραοξικό κάλιο ως αντιπηκτικό (PotassiumEDTA, Sarstedt). Η μέτρηση γινόταν σε αυτόματο αναλυτή (QBC Vet Autoread®, IDEXX) στον οποίο προσδιορίζονταν ο αιματοκρίτης (%), η συγκέντρωση της αιμοσφαιρίνης (g/100 ml) και ο αριθμός των λευκών αιμοσφαιρίων (μl-1) και των αιμοπεταλίων (μl-1). Για τις βιοχημικές και ορολογικές εξετάσεις τα υπόλοιπα 8 ml του δείγματος από το περιφερικό αίμα τοποθετούνταν σε σύριγγα – σωληνάριο χωρίς αντιπηκτικό (SΜonovette®, Sarstedt, Germany) και φυγοκεντρούνταν στις 3000 στροφές/min για 20 min ώστε να διαχωριστεί ο ορός από το πήγμα. Από τη συνολική ποσότητα του ορού (2,5 – 3 ml), τα 1,5 ml που προορίζονταν για τις βιοχημικές εξετάσεις τοποθετούνταν σε φιαλίδιο eppendorf και φυλάσσονταν στην ψύξη (+4o C) για 3 – 4 ημέρες, ενώ η υπόλοιπη ποσότητα διατηρούνταν στην κατάψυξη (-20o C) μέχρι να γίνουν οι ορολογικές εξετάσεις (6 – 8 μήνες). Στον ορό μετρούνταν με χρωματομετρικές μεθόδους οι

71

συγκεντρώσεις των ολικών πρωτεϊνών (Weiscliselbaum 1946), των λευκωματινών (Doumas και συν. 1971) και του ανόργανου φωσφόρου (P) (Boltz και Lueck 1958). Η συγκέντρωση των σφαιρινών υπολογιζόταν με την αφαίρεση των λευκωματινών από τις ολικές πρωτεΐνες, προκειμένου να υπολογιστεί στη συνέχεια ο λόγος λευκωματινών / σφαιρινών (λόγος Λ/Σ). Ο προσδιορισμός της συγκέντρωσης της κρεατινίνης γινόταν με κινητική χρωματομετρική μέθοδο (Bartles και συν. 1972), ενώ το άζωτο ουρίας (BUN), η γλυκόζη, η χοληστερόλη, τα τριγλυκερίδια και η ολική χολερυθρίνη με ενζυματικές χρωματομετρικές μεθόδους (Jendrassik και Grof 1938, Fawcett και Scott 1960, Barham και Trinder 1972, Roeschlam 1974, Fossati και Prencipe 1982). Η δραστηριότητα της αλκαλικής φωσφατάσης (ALP), της αλανινοαμινοτρανσφεράσης (ALT), της κρεατινικής φωσφοκινάσης (CK) και της γαλακτικής δεϋδρογονάσης (LDH) προσδιοριζόταν με ενζυματικές κινητικές μεθόδους (Schlebusch και συν. 1974, Thefeld και συν. 1974, Horder και συν. 1991, Bais και Philcox 1994). Όλες οι παραπάνω μετρήσεις γίνονταν σε φασματοφωτόμετρο τύπου Hitachi U-2000. H μέτρηση του νατρίου (Na) και του καλίου (Κ) γινόταν σε φλογοφωτόμετρο (Flame Photometer 410, Sherwood) και του ασβεστίου (Ca) σε φασματοφωτόμετρο ατομικής απορρόφησης (Analyst 100, Perkin – Elmer Co) σύμφωνα με τις οδηγίες των κατασκευαστών. Ως τιμές αναφοράς για όλες τις παραπάνω βιοχημικές παραμέτρους χρησιμοποιούνταν αυτές που θεσπίστηκαν από το Διαγνωστικό Εργαστήριο της Κτηνιατρικής Σχολής του Α.Π.Θ. Για την αποφυγή σφάλματος από την προσωρινή και έντονη αζωθαιμία που συνήθως ακολουθεί τη χορήγηση της AmB, η μέτρηση των βιοχημικών δεικτών της νεφρικής λειτουργίας (κρεατινίνη, BUN, P) γινόταν σε δείγμα αίματος που λαμβανόταν 5 – 7 ημέρες μετά την τελευταία χορήγηση της AmB (χρόνος 1).

72

7. Παρασιτολογική εξέταση για Leishmania sp. σε επιχρίσματα από ιστούς

Για την παρασιτολογική εξέταση σε οπό λεμφογαγγλίου παρακεντούταν το αριστερό προωμοπλατιαίο λεμφογάγγλιο με βελόνα 21 G και γινόταν αναρρόφηση με σύριγγα 10 ml για να επιστρωθεί στη συνέχεια το υλικό που λαμβανόταν σε αντικειμενοφόρο πλάκα με άλλη αντικειμενοφόρο (squash technique). Για τη λήψη δείγματος ερυθρού μυελού των οστών γινόταν μυελοκέντηση με ειδική βελόνα τύπου Rosenthal 16 G (Acufirm®, Germany) η οποία προωθούνταν περιστροφικά μέχρι να φθάσει μέσα στη σπογγώδη ουσία της λαγόνιας άκανθας, ύστερα από καλή χειρουργική προετοιμασία του πεδίου και τοπική αναισθησία με διάλυμα λιδοκαΐνης 2% (3-5 ml/ζώο). Στη συνέχεια αναρροφούνταν 0,5 ml ερυθρού μυελού με σύριγγα των 10 ml η οποία περιείχε 0,25 ml διαλύματος EDTA 1%. Μικρή ποσότητα του υλικού επιστρωνόταν σε αντικειμενοφόρο πλάκα ενώ το υπόλοιπο τοποθετούνταν σε φιαλίδιο με EDTA και φυλαγόταν στην κατάψυξη (-20ο C) προκειμένου να εξεταστεί αργότερα με τη μοριακή μέθοδο PCR. Η χρώση των επιχρισμάτων, και στις δύο περιπτώσεις, γινόταν με τη μέθοδο Giemsa, για να εξεταστούν στη συνέχεια σε κοινό μικροσκόπιο (x1000) μέχρι την ολοκλήρωση 1000 οπτικών πεδίων ή την ανεύρεση έστω και μίας αμαστιγοφόρου μορφής της Leishmania sp. Και στους δύο ιστούς, η εκτίμηση του παρασιτικού φορτίου γινόταν με βάση την ημιποσοτική κλίμακα 0-6 (0: απουσία παρασίτων στα 1000 οπτικά πεδία, 1: 1-10 παράσιτα/1000 πεδία, 2: 1-10 παράσιτα/100 πεδία, 3: 1 – 10 παράσιτα/10

73

πεδία, 4: 1-10 παράσιτα/πεδίο, 5: 11-100 παράσιτα/πεδίο και 6: >100 παράσιτα/πεδίο) σύμφωνα με τους Chulay και Bryceson (1983). Οι εξετάσεις αυτές γίνονταν στους χρόνους 0, 1 και 2.

8. Ορολογικές εξετάσεις για Leishmania sp.

Όλα τα ζώα ελέχθηκαν ορολογικά με τη μέθοδο του έμμεσου ανοσοφθορισμού (IFAΤ) όχι μόνο στο χρόνο 0 αλλά και στους χρόνους 1 και 2 της μελέτης. Για το σκοπό αυτό χρησιμοποιήθηκαν τα αντιδραστήρια και η μεθοδολογία της εταιρείας AVICO (FluoLeish®, Bvt, Biovetotest Diagnostic Veterinaire, France). Αναλυτικότερα, στα βοθρία των αντικειμενοφόρων πλακών του εμπορίου που περιείχαν υλικό καλλιέργειας του παρασίτου επιστρώθηκαν 10 μl διαλύματος από κάθε δείγμα ορού αραιωμένου 1/50, 1/100, 1/200, 1/400, 1/800, 1/1600, 1/3200, 1/6400 και 1/12800 με ρυθμιστικό διάλυμα (PBS - Βiochrom®, Dulbecco, Germany). Στη συνέχεια, οι αντικειμενοφόρες πλάκες στέγνωναν σε θερμοκρασία δωματίου και σε αυξημένη σχετικά υγρασία και τοποθετούνταν σε επωαστικό κλίβανο (37ο C) για 30 min. Ακολουθούσε η εμβάπτισή τους σε περιέκτη με το παραπάνω ρυθμιστικό διάλυμα και απιονισμένο νερό, με συνεχή ανακίνηση για 5 min, που επαναλαμβανόταν άλλη μια φορά, στέγνωμα σε θερμοκρασία δωματίου και τοποθέτηση σε κάθε βοθρίο 20 μl του ειδικού συζεύγματος (Antidog IgG®, Sigma) αραιωμένου 1:32 σε PBS. Οι αντικειμενοφόρες πλάκες επωάζονταν και πάλι στην ίδια θερμοκρασία για το ίδιο χρονικό διάστημα και επαναλαμβάνονταν οι εμβαπτίσεις. Μετά το στέγνωμα, τοποθετούταν στην επιφάνειά τους σταγόνα γλυκερίνης και καλυπτρίδα και στη συνέχεια εξετάζονταν σε σκοτεινό θάλαμο σε μικροσκόπιο

74

υπεριώδους ακτινοβολίας (x400). Η μεγαλύτερη αραίωση του ορού στην οποία φθόριζαν οι προμαστιγοφόρες μορφές του παρασίτου αποτελούσε τον τίτλο των ειδικών αντισωμάτων.

Επισημαίνεται

ότι

για

την

εκτίμηση

κάθε

δείγματος

ορού

χρησιμοποιούνταν ένας αρνητικός και ένας θετικός μάρτυρας. Τέλος, ως χαμηλότερος θετικός τίτλος με βάση την παραπάνω μέθοδο επιλέχθηκε ο 1/50.

9. Εξέταση με την αλυσιδωτή αντίδραση της πολυμεράσης (PCR) για την ανίχνευση της Leishmania sp.

Η ανίχνευση του ειδικού τμήματος του DNA (rRNA) της Leishmania sp. με τη μοριακή μέθοδο PCR γινόταν στο Εργαστήριο Μικροβιολογίας και Παρασιτολογίας, του Τμήματος Κτηνιατρικής του Πανεπιστημίου Θεσσαλίας, σε δείγμα από το μυελό των οστών των ζώων που συμμετείχαν στις συγκρίσεις των χρόνων 0, 1 και 2 της μελέτης. Για την εκχύλιση του DNA του παρασίτου χρησιμοποιήθηκε η εμπορική μέθοδος IsoQuick® (ORCA Research Inc, Bothel, USA). Αναλυτικότερα, σε αποστειρωμένο φιαλίδιο eppendorf, τοποθετούνταν 100 μl του δείγματος, 100 μl κυτταρολυτικού διαλύματος εκχύλισης και 400 μl ρυθμιστικού διαλύματος. Το μίγμα αναδευόταν σε ειδική συσκευή για 10 sec, τοποθετούνταν σε υδατόλουτρο θερμοκρασίας 65ο C για 10 min και σε θερμοκρασία δωματίου για άλλα 5 min, για να αναδευτεί και πάλι για 10 sec και να φυγοκεντρηθεί στις 12000 στροφές/min για 5 min. Το υπερκείμενο υγρό μεταφερόταν σε άλλο φιαλίδιο eppendorf, το οποίο ύστερα από προσθήκη 500 μl διαλύματος εκχύλισης, φυγοκεντρούνταν και πάλι στις 12000 στροφές/min για 5 min. Το νέο υπερκείμενο υγρό τοποθετούνταν σε φιαλίδιο eppendorf μαζί με οξικό νάτριο που

75

είχε όγκο ίσο με το 1/10 του υγρού, και διάλυμα ισοπροπυλικής αλκοόλης σε όγκο ίσο με το άθροισμα των δύο παραπάνω. Ύστερα από τη φυγοκέντρηση του μίγματος (12000 στροφές/min x 10 min) και την απόρριψη του υπερκείμενου υγρού προσθέτονταν στο ίζημα (DNA) 1 ml διαλύματος αιθανόλης 75% για να ακολουθήσει νέα φυγοκέντρηση (12000 στροφές/min x 5 min), απόρριψη του υπερκείμενου υγρού και προσθήκη 100 μl νερού απαλλαγμένου από ένζυμα που διασπούν το RNA (Rnase – free water). Το μίγμα αυτό χρησιμοποιούνταν αμέσως ή αποθηκευόταν στους -20ο C για μελλοντική χρήση. Το DNA, που είχε ληφθεί από την εκχύλιση του μυελού των οστών, χρησιμοποιούνταν ως πρότυπο προκειμένου να πολλαπλασιαστεί το τμήμα εκείνο του γονιδιώματος που κωδικοποιεί το ριβοσωματικό RNA της Leishmania sp. Για το σκοπό αυτό, χρησιμοποιήθηκαν 2 μl 10x ρυθμιστικού διαλύματος PCR (Gibco BRL), 1 mmol MgCl2 (Gibco BRL), 2,5 mmol μίγματος τριφωσφορικών δεοξυριβονουκλεοτιδίων (Gibco BRL), 0,15 U Tag DNA πολυμεράσης (Gibco BRL), 30 pmol/μl από τους εκκινητές

T2

(5’-CGGCTTCGCACCATGCGGTG-3’)

και

Β4

(5’-

ACATCCCTGCCCACATACGC-3’) (MWG, Biotech, Germany) και νερό απαλλαγμένο από ένζυμα που διασπούν το RNA, συνολικού όγκου 20 μl. Το μίγμα παρέμενε ακάλυπτο στο χώρο παρασκευής για 15 min, πριν την έναρξη του πολλαπλασιασμού. Ο θετικός και ο αρνητικός μάρτυρας, το μίγμα των υλικών χωρίς την προσθήκη του πρότυπου DNA (τυφλό δείγμα) και τα προς εξέταση δείγματα τοποθετούνταν σε αυτόματο ηλεκτρονικό θερμοκυκλοποιητή. Στην αρχή τα δείγματα παρέμεναν σε θερμοκρασία 96ο C για 5 min, ενώ στη συνέχεια ο κάθε κύκλος, από τους 40 συνολικά, περιλάμβανε την παραμονή στους 96ο C για 30 sec, στους 56ο C για 30 sec και στους 72ο C για 20 sec.

76

Η εμφάνιση του τελικού προϊόντος της PCR γινόταν σε γέλη αγαρόζης 2% που τοποθετούνταν σε σύστημα οριζόντιας ηλεκτροφόρησης. Προηγουμένως, για κάθε 10 μl πολλαπλασιασμένου DNA προσθέτονταν 2 μl κυανού της βρωμοφαινόλης και το μίγμα τοποθετούνταν στη γέλη με μικροπιπέτα μαζί με 10 μl μάρτυρα μοριακών βαρών (base pair ladder, 100 bp, 100 Gibco BRL). Η ηλεκτροφόρηση διαρκούσε 30 min σε τάση 100 V και ακολουθούσε η έκθεση της γέλης στην υπεριώδη ακτινοβολία για να απεικονιστεί το τμήμα αντιγραφής. Το δείγμα θεωρούνταν θετικό όταν το μοριακό μέγεθος του προϊόντος της PCR ήταν ίδιο με εκείνο του DNA του θετικού μάρτυρα (250 ζεύγη βάσεων) (Minodier και συν. 1997). Στην αρχή, η ειδικότητα της PCR ελέγχθηκε σε δείγματα από το μυελό των οστών 8 σκύλων – πειραματοζώων φυλής Beagle που είχαν εισαχθεί από τη B. Ευρώπη, είχαν ηλικία ενός χρόνου και ήταν ορολογικά και παρασιτολογικά αρνητικοί στη L. infantum. Επιπλέον, μαζί με κάθε ομάδα δειγμάτων από τους 56 σκύλους της μελέτης εξεταζόταν ένας θετικός (θετικό αντιγόνο Leishmania sp., Εθνική Σχολή Δημόσιας Υγείας), ένας αρνητικός (σκύλος – πειραματόζωο φυλής Beagle) μάρτυρας και ένα «τυφλό» δείγμα που περιείχε όλα τα υλικά της μεθόδου, εκτός από το πρότυπο DNA της L. infantum. Τέλος, επισημαίνεται ότι η εκχύλιση του μυελού των οστών και ο πολλαπλασιασμός του DNA γίνονταν σε διαφορετικούς χώρους (Sharp 2000).

10. Άλλες ορολογικές και κυτταρολογικές - παρασιτολογικές εξετάσεις

Στο χρόνο 0, όλα τα ζώα ελέγχθηκαν ορολογικά για τυχόν παρουσία αντισωμάτων κατά της Ehrlichia canis και αντιγόνων των ενήλικων θηλυκών σκωλήκων

77

της Dirofilaria immitis με ανοσοενζυμικές μεθόδους του εμπορίου (ELISA Immunocomb® Ehrlichia, Biogal, Israel – Canine Heartworm Snap® PF, IDEXX). Τα αποτελέσματα αξιολογήθηκαν με βάση τις οδηγίες της κάθε εταιρείας. Επίσης στο χρόνο 0 για τον έλεγχο της παρουσίας μοριδίων της Ehrlichia canis, μεροζωϊδίων της Babesia canis και γαμετοκυττάρων του Hepatozoon canis εξετάζονταν στο μικροσκόπιο επιχρίσματα από τη στοιβάδα των λευκών αιμοσφαιρίων – αιμοπεταλίων του αιματοκρίτη (buffy coat). Συγκεκριμένα, μικρή ποσότητα ολικού αίματος που είχε ληφθεί με το αντιπηκτικό EDTA τοποθετούταν σε σωλήνα αιματοκρίτη τύπου Wintrobe και φυγοκεντρούταν στις 3000 στροφές/min για 20 min. Μετά την απόρριψη του υπερκείμενου πλάσματος με πιπέτα Pasteur, υλικό από τη στοιβάδα των λευκών αιμοσφαιρίων - αιμοπεταλίων λαμβανόταν με δεύτερη πιπέτα και επιστρωνόταν σε αντικειμενοφόρο πλάκα. Το επίχρισμα βαφόταν με τη μέθοδο Giemsa και εξεταζόταν προσεκτικά σε κοινό μικροσκόπιο (x1000). Τα αποτελέσματα των εξετάσεων αυτών (κυτταρολογική, ορολογικές) έδειξαν ότι κανένας από τους 56 σκύλους της μελέτης δεν ήταν θετικός σε οποιονδήποτε από τους παραπάνω μικροοργανισμούς (βλέπε κριτήρια ένταξης).

11. Ανάλυση και καλλιέργεια ούρων

Δείγμα ούρων, που είχε όγκο 10 ml, λαμβανόταν άσηπτα με σύριγγα των 10 ml και βελόνα 21 G από κάθε σκύλο με κυστοκέντηση, πριν από τον προσδιορισμό του ΡΣΔ με τη μέθοδο της εξωγενούς κάθαρσης της κρεατινίνης. Τρία ml του δείγματος τοποθετούνταν σε πλαστικό δοκιμαστικό σωλήνα και φυλάσσονταν στην κατάψυξη (-20ο

78

C) μέχρι να μετρηθεί η συγκέντρωση των πρωτεϊνών και της κρεατινίνης για τον υπολογισμό του λόγου Up/c (7-14 ημέρες). Στα 4 ml του δείγματος μετρούνταν το ειδικό βάρος των ούρων με ιατρικό διαθλασίμετρο (Clinical refractometer, Shuco, Co) σε θερμοκρασία δωματίου και ελεγχόταν το pH και η τυχόν παρουσία γλυκόζης, κετονικών σωμάτων, χολερυθρίνης, ουροχολινογόνου, πρωτεϊνών, αίματος και αιμοσφαιρίνης με ειδική χρωματομετρική ταινία εμβάπτισης (Combur-10-test®, Boehringer Manheim). Επιπλέον, γινόταν εκτίμηση της πρωτεϊνουρίας ημιποσοτικά με την κατά Heller θολωσιμετρική μέθοδο ύστερα από φυγοκέντρηση του δείγματος των 4 ml στις 1500 στροφές/min για 5 min (Hurley και Vaden 1995, Finco 1995c). Στην απευθείας μικροσκοπική εξέταση του ιζήματος ελέγχονταν η παρουσία αιματουρίας (ερυθρά αιμοσφαίρια >6/οπτικό πεδίο, x400), κυλινδρουρίας (κύλινδροι >2/οπτικό πεδίο, x100), πυουρίας (πυοσφαίρια >6/οπτικό πεδίο, x400) και σημαντικής βακτηριδιουρίας (x400) (DiBartola 2000). Τρία ml από το αρχικό δείγμα των ούρων αποστέλλονταν, το αργότερο σε 60 min, σε μικροβιολογικό εργαστήριο για καλλιέργεια για αερόβια βακτηρίδια στους χρόνους 0, 1 και 2.

12. Λόγος πρωτεϊνών/κρεατινίνης στα ούρα (Up/c)

Ο λόγος Up/c προσδιορίστηκε και στις τρεις ομάδες (Α, Β, Γ) στους χρόνους 0, 1 και 2. Η μέτρηση της συγκέντρωσης των πρωτεϊνών στα ούρα γινόταν με τη μέθοδο Coomassie Brilliant Blue G-250 (CBB) ύστερα από απόψυξη του δείγματος και τη φυγοκέντρησή του στις 1500 στροφές/min για 5 min. Το αντίστοιχο αντιδραστήριο

79

παρασκευαζόταν με την προσθήκη 100 mg CΒB (Coomassie brilliant blue G-250, cat. No. 115444 Merck, Darmstadt, C.I. 42655) σε 50 ml αιθανόλης 95% και μετά από τη θέρμανση και καλή ανάδευση στους 50ο C μέχρι να διαυγαστεί το διάλυμα, προσθέτονταν 500 ml διαλύματος Η3PO4 (100 ml H3PO4, 15 mol/l σε 500 ml δισαπεσταγμένου νερού) και στη συνέχεια συμπληρώνονταν με δισαπεσταγμένο νερό μέχρι το 1 L. Ακολουθούσε η προσθήκη 8 – 10 g πυριτικής γης (Celite no. 545, BDH Chemicals, England, Prod 15284) και καλή ανάδευση για 6 ώρες. Το αντιδραστήριο παρέμενε για 24 ώρες στην ψύξη (4ο C) προκειμένου στη συνέχεια να διηθηθεί δύο φορές με χάρτινα φίλτρα Whatman no. 1 (Whatman Lab Products, Inc., Clifton, NJ 070141) (Lott και συν. 1983). Για την παρασκευή του πρότυπου διαλύματος πρωτεϊνών αναμιγνύονταν 25 mg λευκωματίνης (Βovine albumin, Sigma) και 25 mg σφαιρίνης (Bovine γ-globulins from Cohn fraction II, III, Sigma) βόειας προέλευσης, μέσα σε δοκιμαστικό σωλήνα με δισαπεσταγμένο νερό έτσι ώστε η τελική συγκέντρωση του συνόλου των πρωτεϊνών να είναι 1g/100 ml. Στη συνέχεια γίνονταν διαδοχικές αραιώσεις με δισαπεσταγμένο νερό προκειμένου η συγκέντρωση των ολικών πρωτεϊνών στα διαλύματα που προέκυπταν να είναι 100, 75, 50, 20, και 10 mg/100 ml. Ακολουθούσε ανάμιξη 5 ml CBB με 100 μl καθενός από τα πρότυπα διαλύματα με δισαπεσταγμένο νερό (τυφλό δείγμα) ή με το δείγμα των ούρων και μέτρηση της απορρόφησης σε μήκος κύματος 595 nm σε φασματοφωτόμετρο τύπου Hitachi U-2000. Για να εξασφαλιστεί η αξιοπιστία της μεθόδου, η συγκέντρωση των πρωτεϊνών στο δείγμα των ούρων δεν έπρεπε να υπερβαίνει τα 100 mg/100 ml. Σε αντίθετη περίπτωση γινόταν αραίωση σε αυτό και η τελική συγκέντρωση των πρωτεϊνών αναγόταν στην αρχική αραίωση (Lott και συν.

80

1983). Η κρεατινίνη μετρούνταν σε αραιωμένα δείγματα ούρων (1:20) με την κινητική χρωματομετρική

μέθοδο

που

εφαρμοζόταν

και

στον

ορό

του

αίματος,

σε

φασματοφωτόμετρο τύπου Hitachi U-2000.

13. Κάθαρση εξωγενούς κρεατινίνης

Προκειμένου να υπολογιστεί ο ΡΣΔ, στη δοκιμή αυτή υποβλήθηκαν τα ζώα των ομάδων Α, Β και Γ και στους τρεις χρόνους της μελέτης. Αν και η δοκιμή κάθαρσης της εξωγενούς

κρεατινίνης

δε

χρειάζεται

να

γίνεται

εφόσον

διαπιστώνεται

υπερκρεατινιναιμία (Finco 1995a, DiBartola 2000), στη μελέτη αυτή και για λόγους καθαρά συγκριτικούς, περιλήφθηκαν και τέτοιου είδους ζώα στους χρόνους 1 (34/56 – 60,7%) και 2 (7/45 – 15,6%). Σύμφωνα με τη μέθοδο αυτή, διάλυμα κρεατινίνης (Creatinine Merck, Germany) που παρασκευαζόταν με δισαπεσταγμένο και αποστειρωμένο νερό (25 mg/ml), χορηγούνταν υποδόρια στη δόση των 75 mg/kg ΣΒ σε σκύλους με ΣΒ μεγαλύτερο των 20 kg και στη δόση των 100 mg/kg ΣΒ σ’ εκείνους με ΣΒ ίσο ή μικρότερο των 20 kg. Ακολουθούσε η μέσω οισοφαγικού καθετήρα χορήγηση ποσότητας νερού που ήταν ίση με το 3% του ΣΒ του ζώου και αμέσως μετά η τοποθέτηση και καθήλωση στην ουρήθρα καθετήρα ουρήθρας αρσενικού σκύλου (Buster dog catheters, Kruuse Denmark), κατάλληλης διαμέτρου, προκειμένου η ουροδόχος κύστη να κενωθεί πλήρως μέσα σε 40 min από την υποδόρια ένεση του διαλύματος της κρεατινίνης. Τα ούρα αναρροφούνταν με σύριγγα των 20 ml και στη συνέχεια η κύστη ξεπλενόταν καλά με αποστειρωμένο

81

νερό μέσω της σύριγγας και του καθετήρα. Αμέσως μετά λαμβανόταν δείγμα αίματος (3 ml) για τη μέτρηση της συγκέντρωσης της κρεατινίνης στον ορό του αίματος ενώ 20 min αργότερα επαναλαμβανόταν η κένωση και έκπλυση της ουροδόχου κύστης και προσδιοριζόταν ο όγκος των παραγόμενων ούρων, δείγμα των οποίων (3 ml) διατηρούνταν στην ψύξη (4ο C) για τη μέτρηση της συγκέντρωσης της κρεατινίνης μέσα στις επόμενες λίγες ημέρες. Λόγω της προσθήκης αποστειρωμένου νερού για τις πλύσεις, ο πραγματικός όγκος των ούρων που παράγονταν στα 20 min υπολογιζόταν με βάση τον τύπο: όγκος ούρων (ml) = συνολικός όγκος υγρών που αναρροφήθηκαν – όγκος αποστειρωμένου νερού (ml). Στο τέλος των 20 min γινόταν δεύτερη αιμοληψία για τη μέτρηση και πάλι της συγκέντρωσης της κρεατινίνης. Για να εξασφαλιστεί η αξιοπιστία της μεθόδου η διαδικασία της κένωσης – έκπλυσης – αιμοληψίας επαναλαμβανόταν για τρίτη φορά ύστερα από άλλα 20 min και το τελικό αποτέλεσμα για τη συγκέντρωση της κρεατινίνης στον ορό του αίματος και τα ούρα ήταν ο μέσος όρος των δύο μετρήσεων. Η κάθαρση της εξωγενούς κρεατινίνης υπολογιζόταν με βάση τον τύπο: Κ(ml/min) = [Σ(mg/ml) x O (ml/min)] / Π (mg/ml), όπου Κ: κάθαρση της κρεατινίνης, Σ: μέσος όρος των δύο μετρήσεων της συγκέντρωσης της κρεατινίνης στα ούρα (60 και 80 min μετά την υποδόρια ένεση), Ο: όγκος των παραγόμενων ούρων ανά min, Π: μέσος όρος των τριών μετρήσεων της συγκέντρωσης της κρεατινίνης στον ορό του αίματος. Επισημαίνεται ότι η μέτρηση της συγκέντρωσης της κρεατινίνης στον ορό του αίματος και τα ούρα γινόταν σύμφωνα με τις μεθόδους που έχουν αναφερθεί. Θα πρέπει επίσης να τονιστεί ότι για την αποφυγή σφάλματος στον υπολογισμό του ΡΣΔ από την προσωρινή υπερκρεατινιναιμία που συνήθως ακολουθεί τη χορήγηση AmB, η δοκιμή της εξωγενούς κάθαρσης της κρεατινίνης γινόταν 5 – 7 ημέρες μετά την τελευταία

82

χορήγηση του φαρμάκου. Τέλος, ως τιμές αναφοράς για το αποτέλεσμα της παραπάνω δοκιμής (>3,6 ml/min/kg ΣΒ) υιοθετήθηκαν εκείνες που υπολογίστηκαν σε 8 φυσιολογικούς σκύλους – πειραματόζωα, φυλής Beagle και ηλικίας ενός χρόνου στα πλαίσια προηγούμενης μελέτης που έγινε στην ίδια Κλινική και στην οποία εφαρμόστηκε ακριβώς η ίδια μεθοδολογία (Plevraki και συν. 2006).

14. Στατιστική ανάλυση

Πριν από την έναρξη της θεραπείας ελέγχθηκε η ομοιογένεια των 3 ομάδων ως προς το φύλο και τις κλινικές εκδηλώσεις με το χ2 test του Pearson ή, όπου δεν ίσχυαν οι προϋποθέσεις εφαρμογής τους, η ακριβής δοκιμή του Fisher. Η ηλικία και το σωματικό βάρος ελέγχθηκαν με τη δοκιμή της ανάλυσης της διακύμανσης (ANOVA). Η μεταξύ των ομάδων ομοιογένεια στη συχνότητα καταγραφής των παθολογικών καταστάσεων ελέγχθηκε με την ακριβή δοκιμή του Fisher, ενώ η ομοιογένεια στην ένταση των παθολογικών καταστάσεων ελέγχθηκε μεταξύ των ομάδων με την προσημική δοκιμή των διατάξεων του Wilcoxon (Wilcoxon signed rank test). Τέλος, η ομοιογένεια στη συχνότητα καταγραφής των μεταβολών των αιματολογικών παραμέτρων ελέγχθηκε μεταξύ των ομάδων με το χ2 test του Pearson ή, όπου δεν ίσχυαν οι προϋποθέσεις εφαρμογής του, με την ακριβή δοκιμή του Fisher. Οι μέσες τιμές των αιματολογικών παραμέτρων συγκρίθηκαν μεταξύ των ομάδων με τη δοκιμή της ανάλυσης της διακύμανσης, ενώ οι πολλαπλές συγκρίσεις έγιναν με τη δοκιμή του Tukey.

83

Πρώτο σκέλος της μελέτης

Στην αρχή συγκρίθηκε ο συνολικός αριθμός των παθολογικών εκδηλώσεων που καταγράφηκαν και ο συνολικός βαθμός έντασης της κλινικής εικόνας στο σύνολο των ζώων (n=56) μεταξύ της χρονικής στιγμής 0 και 1 με το t-test για συγκρίσεις κατά ζεύγη. Στη συνέχεια εκτιμήθηκε η μεταβολή στη συχνότητα κάθε εργαστηριακού ευρήματος μεταξύ της χρονικής στιγμής 0 και 1 με τη δοκιμή συμμετρίας του Mc Nemar ή τη δοκιμή της περιθώριας ομοιογένειας για τη μεταβολή του αριθμού των λευκών αιμοσφαιρίων. Η μεταβολή στις μέσες τιμές των εργαστηριακών παραμέτρων μεταξύ των χρόνων 0 και 1 εκτιμήθηκε με το t-test για συγκρίσεις κατά ζεύγη. Η ένταση παρασιτισμού των λεμφογαγγλίων και του μυελού των οστών καθώς και το αποτέλεσμα της IFAT συγκρίθηκε μεταξύ των χρόνων 0 και 1 και 1 και 2 με την προσημική δοκιμή των διατάξεων του Wilcoxon.

Δεύτερο σκέλος της μελέτης

Η μεταξύ των ομάδων σύγκριση της μέσης διάρκειας της θεραπείας έγινε με τη δοκιμή του Tukey ενώ αυτή του μέσου αριθμού των θεραπευτικών συνεδριών που αναβλήθηκαν έγινε με τη μη παραμετρική δοκιμή ανάλυσης της διακύμανσης κατά Kurskal-Wallis. Η μεταξύ των χρόνων και των ομάδων σύγκριση των τιμών του ΡΣΔ και του ειδικού βάρους των ούρων καθώς και των συγκεντρώσεων της κρεατινίνης, του αζώτου ουρίας και του φωσφόρου έγινε με τη δοκιμή της ανάλυσης της διακύμανσης για

84

επαναλαμβανόμενες μετρήσεις (repeated measures ANOVA). Με την ίδια δοκιμή εκτιμήθηκε η σημαντικότητα της μεταβολής του λόγου Up/c και των συγκεντρώσεων των λευκωματινών και της χοληστερόλης μεταξύ των χρόνων και των ομάδων. Τέλος, η μεταξύ των τριών ομάδων σύγκριση για την εμφάνιση ανεπιθύμητων ενεργειών έγινε με την ακριβή δοκιμή του Fisher.

Όλες οι συγκρίσεις έγιναν στα λογισμικά StatXact for Windows (ver. 4) και SAS for Windows (ver 8.1). Η σημαντικότητά τους ελέγχθηκε στο 5% (P<0,05).

85

86

ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ

ΠΡΩΤΟ ΣΚΕΛΟΣ ΤΗΣ ΜΕΛΕΤΗΣ Κλινική ανταπόκριση στη θεραπεία με αμφοτερικίνη Β Από τα 56 ζώα που συμπεριλήφθηκαν στη μελέτη μείωση του αριθμού των παθολογικών καταστάσεων που είχαν κλινική συνάφεια με τη ΛΣ διαπιστώθηκε σε 49 (87,5%), αύξηση σε 4 (7,1%) και στασιμότητα σε 3 (5,4%). Ο αριθμός των παθολογικών καταστάσεων στο χρόνο 0 της μελέτης κυμαινόταν από 1 – 14 (διάμεσος: 7) ενώ στο χρόνο 1 από 0 – 12 (διάμεσος: 5). Η μείωση αυτή μεταξύ των χρόνων 0 και 1 ήταν σημαντική (P<0,0001) (Πίνακας 5). Με βάση το βαθμό έντασης της συνολικής κλινικής εικόνας, βελτίωση παρουσίασαν 48/56 (85,7%) ζώα, επιδείνωση 3/56 (5,4%) ενώ σε 5/56 (8,9%) διαπιστώθηκε πλήρης ίαση. Αναλυτικότερα, η βελτίωση της κλινικής εικόνας θεωρήθηκε καλή σε 22/56 (39,3%) και πολύ καλή σε 12/56 (21,4%) ζώα. Ο βαθμός έντασης της κλινικής εικόνας στο χρόνο 0 κυμαινόταν από 1 – 24 (διάμεσος: 9) και στο χρόνο 1 από 0 – 15,5 (διάμεσος: 5). Στη σύγκριση μεταξύ των δύο χρόνων στο σύνολο των ζώων διαπιστώθηκε ότι η μείωση αυτή ήταν σημαντική (P<0,0001) (Πίνακας 5 – Πίνακες Ι ως VI Παραρτ.).

87

Πίνακας 5: Συνολικός αριθμός των παθολογικών καταστάσεων που χαρακτηρίζουν τη ΛΣ (L. infantum), βαθμός έντασης της συνολικής κλινικής εικόνας και κλινική αποτελεσματικότητα της θεραπείας με αμφοτερικίνη Β σε 56 κλινικά περιστατικά της νόσου α/α σκύλων 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56

Συνολικός αριθμός παθολογικών καταστάσεων Χρόνος 0 Χρόνος 1 9 8 10 7 10 5 6 6 9 5 7 2 9 5 8 6 4 0 6 1 4 1 6 2 1 2 6 4 13 8 10 6 1 0 10 7 5 2 7 6 11 10 7 3 1 0 12 9 8 5 7 3 7 0 2 0 14 8 6 2 5 2 7 3 12 7 7 6 4 4 2 1 7 4 9 5 5 4 10 6 3 6 9 6 5 6 8 6 14 12 10 5 10 3 5 1 5 5 3 2 12 11 7 6 5 6 6 1 6 2 11 8

Βαθμός έντασης του συνόλου της κλινικής εικόνας Χρόνος 0 Χρόνος 1 14 11 12 4,5 13,5 6,5 9,5 7 17 5 9 1,5 12 5 11 6,5 5 0 8 1 2,5 1 7 2 1 2 8 5 18 8,5 17 6 2 0 9 6 4,5 2 9 6 14 11 10 3 2 0 18 10 13 6 12 3 5 0 2 0 24 8 7 3 5 2 9 2 15 7 10,5 6 5 4,5 2,5 1 8 4 10 3,5 6 4 15 6 3 7 13 5 7 8 9 6 21 15 10 5 15 3 6 2 7 5 3 2 22 15,5 10 7 8 7 5,5 1 8 2 16 10

Κλινικό αποτέλεσμα της θεραπείας με αμφοτερικίνη Β Βελτίωση Βελτίωση Βελτίωση Βελτίωση Βελτίωση Βελτίωση Βελτίωση Βελτίωση Κλινική ίαση Βελτίωση Βελτίωση Βελτίωση Επιδείνωση Βελτίωση Βελτίωση Βελτίωση Κλινική ίαση Βελτίωση Βελτίωση Βελτίωση Βελτίωση Βελτίωση Κλινική ίαση Βελτίωση Βελτίωση Βελτίωση Κλινική ίαση Κλινική ίαση Βελτίωση Βελτίωση Βελτίωση Βελτίωση Βελτίωση Βελτίωση Βελτίωση Βελτίωση Βελτίωση Βελτίωση Βελτίωση Βελτίωση Επιδείνωση Βελτίωση Επιδείνωση Βελτίωση Βελτίωση Βελτίωση Βελτίωση Βελτίωση Βελτίωση Βελτίωση Βελτίωση Βελτίωση Βελτίωση Βελτίωση Βελτίωση Βελτίωση

88

Μεταβολές των αιματολογικών και βιοχημικών παραμέτρων στον ορό του αίματος ύστερα από τη θεραπεία με αμφοτερικίνη Β

Μεταξύ των χρόνων 0 και 1 μειώθηκε σημαντικά ο αριθμός των σκύλων που παρουσίαζαν αναιμία, θρομβοκυτταροπενία, υπερπρωτεϊναιμία, υπολευκωματιναιμία και υπερσφαιριναιμία και μείωση του λόγου Λ/Σ (Πίνακας 6). Στην ίδια σύγκριση των απόλυτων τιμών για κάθε αιματολογική παράμετρο, σημαντική αύξηση διαπιστώθηκε στον αιματοκρίτη, τη συγκέντρωση της αιμοσφαιρίνης και τον αριθμό των αιμοπεταλίων (Πίνακας 7). Ως προς τις βιοχημικές παραμέτρους οι συγκεντρώσεις των ολικών πρωτεϊνών και των σφαιρινών μειώθηκαν σημαντικά ενώ εκείνες των λευκωματινών καθώς και ο λόγος Λ/Σ αυξήθηκαν σημαντικά (Πίνακας 8). Οι υπόλοιπες αιματολογικές και βιοχημικές παράμετροι δεν παρουσίασαν οποιαδήποτε σημαντική μεταβολή ύστερα από τη θεραπεία με AmB.

89

Πίνακας 6: Αριθμός και εκατοστιαία αναλογία των αξιολογότερων μεταβολών των αιματολογικών και βιοχημικών παραμέτρων μεταξύ των χρόνων 0 και 1 της μελέτης σε 56 σκύλους με συμπτωματική ΛΣ Αιματολογικές και βιοχημικές διαταραχές

Χρόνος 0 n (%)

Χρόνος 1 n (%)

P

Αναιμία Λευκοπενία Λευκοκυττάρωση Θρομβοκυτταροπενία Υπερπρωτεϊναιμία Υπολευκωματιναιμία Υπερσφαιριναιμία Μείωση του λόγου Λ/Σ Υπερχοληστερολαιμία Υπερτριγλυκεριδαιμία Αύξηση δραστηριότητας ALP Αύξηση δραστηριότητας ALT Αύξηση δραστηριότητας CK Αύξηση δραστηριότητας LDH Υπασβεστιαιμία Υπερκαλιαιμία Υπερνατριαιμία Υπονατριαιμία

43 (76,8%) 2 (3,6%) 5 (8,9%) 21 (37,5%) 36 (64,3%) 30 (53,6%) 47 (83,9%) 51 (91,1%) 8 (14,3%) 7 (12,5%) 14 (25%) 14 (25%) 7 (12,5%) 15 (26,8%) 8 (14,3%) 1 (1,8%) 5 (8,9%) 10 (17,9%)

20 (35,7%) 1 (1,8%) 4 (7,1%) 8 (14,3%) 22 (39,3%) 13 (23,2%) 35 (62,5%) 42 (75%) 3 (5,4%) 12 (21,4%) 14 (25%) 8 (14,3%) 5 (8,9%) 8 (14,3%) 4 (7,1%) 2 (3,6%) 1 (1,8%) 0

<0,0001* 0,72 0,72 0,0029* 0,001* 0,0002* 0,0013* 0,0067* 0,095 0,16 1 0,18 0,48 0,07 0,2 0,32 N/A N/A

* Στατιστικά σημαντική διαφορά Ν/Α: δεν ήταν δυνατή η στατιστική επεξεργασία

90

Πίνακας 7: Διάμεσος και εύρος τιμών των παραμέτρων της αιματολογικής εξέτασης σε 56 σκύλους με συμπτωματική ΛΣ στους χρόνους 0 και 1 της μελέτης Αιματολογικές παράμετροι

Διάμεσος (εύρος τιμών) Χρόνος 0 Χρόνος 1 Αιματοκρίτης (%) 32,4 39 (20,4 – 45,6) (22,7 – 50,2) Αιμοσφαιρίνη 11,6 13,4 (7,1 – 15,7) (8,2 – 17,4) (g/100 ml) Αριθμός 9300 10350 (4600 – 24600) (5800 – 22900) λευκοκυττάρων/μl Αριθμός 249500 295000 (52000 – 403000) (67000 – 555000) αιμοπεταλίων/μl * Στατιστικά σημαντική διαφορά

P <0,0001*

Τιμές αναφοράς 37 – 55%

<0,0001*

12 – 18 g/100 ml

0,53

6000 - 16900 /μl

<0,0001*

175000 – 500000 /μl

Πίνακας 8: Διάμεσος και εύρος τιμών των παραμέτρων της βιοχημικής εξέτασης στο ορό του αίματος σε 56 σκύλους με συμπτωματική ΛΣ στους χρόνους 0 και 1 της μελέτης Βιοχημικές παράμετροι Ολικές πρωτεΐνες (g/100 ml) Λευκωματίνες (g/100 ml) Σφαιρίνες (g/100 ml) Λόγος λευκωματινών/σφαιρινών Γλυκόζη (mg/100 ml) Χοληστερόλη (mg/100 ml) Τριγλυκερίδια (mg/100 ml) Ολική χολερυθρίνη (mg/100 ml) Αλκαλική φωσφατάση (U/L) Αλανινοαμινοτρανσφεράση (U/L) Κρεατινική φωσφοκινάση (U/L) Γαλακτική δεϋδρογονάση (U/L) Ασβέστιο (mEq/l) Κάλιο (mEq/l) Νάτριο (mEq/l)

Διάμεσος (εύρος τιμών) Χρόνος 0 Χρόνος 1 8,55 7,45 (6 – 12) (5,9 – 12,9) 2,8 3,1 (1,6 – 4) (1,9 – 3,8) 5,4 4,2 (3,3 – 9,6) (2,5 – 10,3) 0,5 0,75 (0,25 – 1,06) (0,25 – 1,36) 97,5 100 (65 – 120) (70 – 149) 184,5 205 (92 – 342) (67 – 310) 100 123,5 (32 – 320) (22- 650) 0,3 0,3 (0,25 – 0,4) (0,27 – 0,39) 83,5 84 (15 – 720) (31 – 620) 22,5 28 (10 – 190) (10 – 160) 63,5 58,5 (22 – 334) (15 – 1250) 76,5 78,5 (15 – 950) (12 – 1400) 10 10,2 (7,6 – 11) (8 – 11) 4,4 4,5 (3,6 – 5,9) (3,8 – 6,5) 145 146 (140 – 180) (138 – 160)

P <0,0001*

Τιμές αναφοράς 5,4 – 7,8 g/100 ml

<0,0001*

2,9 – 4 g/100 ml

<0,0001*

2,44–3,92 g/100 ml

<0,0001*

0,88–1,36

0,12

76–150 mg/100 ml

0,27

114 – 286 mg/100 ml

0,07

18–186 mg/100 ml

0,5

0,27–0,42 mg/100 ml

0,47

15–124 U/L

0,17

8–38 U/L

0,75

< 140 U/L

0,64

< 140 U/L

0,14

9,3–11,6 mEq/l

0,25

3,4–5,1 mEq/l

0,73

< 153 mEq/l

* Στατιστικά σημαντική διαφορά

91

Παρασιτολογική ανταπόκριση στη θεραπεία με αμφοτερικίνη Β (κυτταρολογική, ορολογική, μοριακή)

Κυτταρολογική εξέταση σε οπό λεμφογαγγλίου και το μυελό των οστών Στο χρόνο 0, αμαστιγοφόρες μορφές της L. infantum, ανεξάρτητα αριθμού, βρέθηκαν στα επιχρίσματα από οπό λεμφογαγγλίου σε 53/56 (94,6%) και σε εκείνα από μυελό των οστών σε 56/56 (100%) σκύλους. Στο χρόνο 1, το πρωτόζωο βρέθηκε στα λεμφογάγγλια σε 8/56 (14,3%) και στο μυελό των οστών σε 23/56 (41,1%) σκύλους. Οι αντίστοιχοι αριθμοί στο χρόνο 2 ήταν 5/45 (11,1%) και 9/45 (20%). Στη σύγκριση μεταξύ των χρόνων 0 και 1 το παρασιτικό φορτίο μειώθηκε σημαντικά και στους δύο ιστούς (P<0,0001) ενώ σ’ εκείνη μεταξύ των χρόνων 1 και 2 η μείωση ήταν σημαντική μόνο για το παρασιτικό φορτίο του μυελού των οστών (P=0,007) (Πίνακας 9 – Πίνακας VII Παραρτ.). Πίνακας 9: Παρασιτικό φορτίο στον οπό λεμφογαγγλίου και το μυελό των οστών 56 σκύλων με συμπτωματική λεϊσμανίωση στους χρόνους 0, 1 και 2 της μελέτης Διάμεσος Είδος ιστού Οπός λεμφογαγγλίου (n:56) Μυελός των οστών (n: 56) Οπός λεμφογαγγλίου (n:45) Μυελός των οστών (n: 45)

Ελάχιστη τιμή

Μέγιστη τιμή

Διάμεσος

Ελάχιστη τιμή

Μέγιστη τιμή

P

3

Χρονος 0 0

5

0

Χρόνος 1 0

4

<0,0001*

4

1

5

0

0

5

<0,0001*

0

Χρονος 1 0

4

0

Χρόνος 2 0

2

0,39

0

0

5

0

0

3

0,007*

* Στατιστικά σημαντική διαφορά

92

Ορολογική εξέταση με IFAT Ενώ όλα τα ζώα (56/56 – 100%) βρέθηκαν θετικά στους χρόνους 0 και 1 της μελέτης, στο χρόνο 2 ορολογικά θετικοί ήταν οι 44/45 (97,8%) σκύλοι. Ωστόσο ο τίτλος των ειδικών αντισωμάτων (IgG) κατά της Leishmania sp. στη σύγκριση μεταξύ των χρόνων 0 και 1 παρουσίασε σημαντική μείωση (P<0,0001). Το ίδιο σημαντική ήταν και η μείωση του τίτλου στη σύγκριση μεταξύ των χρόνων 1 και 2 (P<0,0001) (Πίνακας 10 – Πίνακας VIII Παραρτ.). Πίνακας 10: Διάμεσος, ελάχιστη και μέγιστη τιμή του τίτλου των αντισωμάτων κατά της Leishmania sp. (IFAT) στον ορό του αίματος 56 σκύλων με συμπτωματική ΛΣ στους χρόνους 0, 1 και 2 της μελέτης. Τίτλος αντισωμάτων (IFAT) n: 56 n: 45

Διάμεσος

1/3200 1/1600

Ελάχιστη τιμή

Μέγιστη τιμή

Χρονος 0 1/400 1/12800 Χρονος 1 1/200 1/6400

Διάμεσος

1/1600 1/800

Ελάχιστη τιμή

Χρόνος 1 1/200 Χρόνος 2 0

Μέγιστη τιμή

P

1/6400

<0,0001*

1/6400

<0,0001*

* Στατιστικά σημαντική διαφορά

Μοριακή εξέταση με PCR στο μυελό των οστών

Και οι 56 σκύλοι βρέθηκαν θετικοί στην PCR του μυελού των οστών στο χρόνο 0, ενώ στο χρόνο 1 μόνο 5/56 (8,9%) απ’ αυτούς (A5, B1, B5, B8, B10) έγιναν αρνητικοί, χωρίς όμως η διαφορά να είναι σημαντική (P=0,0625). Στο διάστημα μεταξύ των χρόνων 1 και 2, από τους 45 θετικούς σκύλους αρνητικοί στην PCR έγιναν μόνο 7 (15,5%) αν και η διαφορά ήταν σημαντική (P=0,0156). Συγκεκριμένα, τα ζώα αυτά ήταν τα Α16, Α19, Α23, Β4, Γ5, Γ10, Γ11. Επισημαίνεται ότι οι 4 σκύλοι της ομάδας Β (Β1,

93

Β5, Β8, Β10) που βρέθηκαν αρνητικοί στο χρόνο 1, και στους οποίους δε συνεχίστηκε η θεραπεία κατά της ΛΣ με αλλοπουρινόλη, ξαναέγιναν θετικοί στο χρόνο 2 (Πίνακας IX Παραρτ.).

ΔΕΥΤΕΡΟ ΣΚΕΛΟΣ ΤΗΣ ΜΕΛΕΤΗΣ

Διάρκεια θεραπείας με αμφοτερικίνη Β

Η διάρκεια της θεραπείας κυμάνθηκε από 23 – 53 ημέρες στην ομάδα Α, 24 – 60 στη Β και 22 – 50 στη Γ (Πίνακας 11). Στις μεταξύ των ομάδων συγκρίσεις σημαντική μείωση της διάρκειας της θεραπείας διαπιστώθηκε μόνο στη Γ σε σχέση με τη Β ομάδα (P=0,006). Ο αριθμός των θεραπευτικών συνεδριών που αναβλήθηκαν λόγω αύξησης της συγκέντρωσης της κρεατινίνης στον ορό του αίματος πάνω από 2,5 mg/100 ml κυμάνθηκε από 0 – 7 για τις ομάδες Α και Γ και από 0 – 8 για τη Β, χωρίς να διαπιστωθεί σημαντική διαφορά στις συγκρίσεις μεταξύ των ομάδων, αν και μεταξύ των Γ και Β η διαφορά έτεινε να είναι σημαντική, με την ομάδα Γ να παρουσιάζει το μικρότερο αριθμό θεραπευτικών συνεδριών που τελικά αναβλήθηκαν (P=0,055) (Πίνακας 12). Πίνακας 11: Διάμεσος, ελάχιστη και μέγιστη τιμή της διάρκειας της θεραπείας με αμφοτερικίνη Β στις ομάδες Α, Β και Γ Ομάδες Α (n: 23) Β (n: 17) Γ (n: 16)

Διάρκεια θεραπείας με AmB (ημέρες) Διάμεσος Ελάχιστη τιμή Μέγιστη τιμή 23 53 34 24 60 42 22 50 29

94

Πίνακας 12: Διάμεσος, ελάχιστη και μέγιστη τιμή του αριθμού των θεραπευτικών συνεδριών που αναβλήθηκαν λόγω αύξησης της συγκέντρωσης της κρεατινίνης στον ορό του αίματος (>2,5 mg/100ml) στις ομάδες Α, Β και Γ Ομάδες Α (n=23) Β (n=17) Γ (n=16)

Αριθμός συνεδριών που αναβλήθηκαν Διάμεσος Ελάχιστη τιμή Μέγιστη τιμή 0 7 2 0 8 4 0 7 1

Ρυθμός σπειραματικής διήθησης (ΡΣΔ) Η τιμή του ΡΣΔ στο χρόνο 0 βρισκόταν μέσα στα φυσιολογικά όρια (>3,6 ml/min/kg) σε 15/23 (65,2%) ζώα της ομάδας Α, σε 12/17 (70,5%) της ομάδας Β και 10/16 (62,5%) της ομάδας Γ. Στο χρόνο 1, η τιμή του ΡΣΔ ήταν κάτω από τα φυσιολογικά όρια σε 21/23 (91,3%) ζώα της ομάδας Α, 16/17 (94,1%) της Β και 16/16 (100%) της Γ. Μεταξύ των χρόνων 0 και 1, η μείωση του ΡΣΔ ήταν σημαντική σε όλες τις ομάδες. Στο χρόνο 2, σε 16/18 (88,9%) σκύλους της ομάδας Α, 6/11 (54,5%) της ομάδας Β και 12/16 (75%) της ομάδας Γ η τιμή του ΡΣΔ ήταν φυσιολογική. Μεταξύ των χρόνων 1 και 2 παρατηρήθηκε σημαντική αύξηση του ΡΣΔ σε όλες τις ομάδες. Στις μεταξύ των τριών ομάδων συγκρίσεις, ξεχωριστά για τους χρόνους 0, 1 και 2, σε καμία περίπτωση δε διαπιστώθηκε σημαντική διαφορά (Πίνακας 13 – Πίνακες X, XI, XII Παραρτ.).

95

Πίνακας 13: Διάμεσος, ελάχιστη και μέγιστη τιμή του ΡΣΔ στους χρόνους 0, 1 και 2 της μελέτης και οι μεταξύ τους συγκρίσεις στις ομάδες Α, Β και Γ Ομάδες Διάμεσος Ελάχιστη Μέγιστη Διάμεσος Ελάχιστη Μέγιστη τιμή τιμή τιμή τιμή Χρονος 0 Χρόνος 1 Α (n: 23) Β (n: 17) Γ (n: 16)

4,023 4,141 4,017

Α (n: 18) Β (n: 11) Γ (n: 16)

2,164 2,746 2,154

1,198 1,301 1,79

6,979 7,103 6,276

2,15 2,746 2,154

5,226 3,759 3,66

4,027 3,931 3,917

Χρονος 1 1,4 0,831 1,575

0,462 0,18 1,575

P

5,226 3,759 3,66

<0,0001* <0,0001* <0,0001*

5,65 4,728 4,222

<0,0001* 0,002* 0,0007*

Χρόνος 2 2,75 0,632 1,68

* Στατιστικά σημαντική διαφορά

Συγκέντρωση της κρεατινίνης στον ορό του αίματος

Στο χρόνο 0, η τιμή της κρεατινίνης στον ορό του αίματος βρισκόταν μέσα στα φυσιολογικά όρια (0,9 – 1,3 mg/100 ml) σε όλα τα ζώα και των τριών ομάδων. Όμως στο χρόνο 1 18/23 (78,3%) ζώα της ομάδας Α, 9/17 (52,9%) της ομάδας Β και 7/16 (43,8%) της ομάδας Γ παρουσίασαν υπερκρεατινιναιμία. Στη σύγκριση μεταξύ των χρόνων 0 και 1 διαπιστώθηκε σημαντική αύξηση των τιμών της κρεατινίνης και στις τρεις ομάδες. Στο χρόνο 2, η υπερκρεατινιναιμία εξακολουθούσε να επιμένει σε 2/18 (11,1%) ζώα της ομάδας Α, 3/11 (27,3%) της ομάδας Β και 2/16 (12,5%) της ομάδας Γ. Στη σύγκριση μεταξύ των χρόνων 1 και 2 διαπιστώθηκε ότι η συγκέντρωση της κρεατινίνης μειώθηκε σημαντικά στις ομάδες Α και Γ ενώ δε μεταβλήθηκε στην ομάδα Β. Στις μεταξύ των ομάδων συγκρίσεις, για καθένα από τους χρόνους ξεχωριστά, δε διαπιστώθηκε σημαντική διαφορά (Πίνακας 14 – Πίνακες XIII, XIV, XV Παραρτ.)

96

Πίνακας 14: Διάμεσος, ελάχιστη και μέγιστη τιμή της συγκέντρωσης της κρεατινίνης στον ορό του αίματος (mg/100 ml) στους χρόνους 0, 1 και 2 της μελέτης και οι μεταξύ τους συγκρίσεις στις ομάδες Α, Β και Γ Ομάδες Διάμεσος Ελάχιστη τιμή Χρονος 0 Α (n: 23) 1,1 0,9 Β (n: 17) 1,2 1 Γ (n: 16) 1,2 1 Χρονος 1 Α (n: 18) 1,6 1,1 Β (n: 11) 1,2 1,1 Γ (n: 16) 1,35 1

Μέγιστη Διάμεσος Ελάχιστη τιμή τιμή Χρόνος 1 1,3 1,1 1,6 1,3 1 1,5 1,3 1 1,35 Χρόνος 2 2,7 1 1,15 2,8 1,1 1,2 1,9 0,9 1,2

Μέγιστη τιμή

P

2,7 2,8 1,9

<0,0001*

1,7 5,3 1,8

<0,0001*

0,0002* 0,03*

0,31 0,04 *

* Στατιστικά σημαντική διαφορά

Συγκέντρωση του αζώτου ουρίας στον ορό του αίματος (SUN)

Στο χρόνο 0 της μελέτης, η συγκέντρωση του SUN βρισκόταν μέσα στα φυσιολογικά όρια (9 – 36 mg/100 ml) και στα 56 ζώα. Στο χρόνο 1, η συγκέντρωση της παραμέτρου αυτής αυξήθηκε πάνω από τα φυσιολογικά όρια σε 12/23 (52,2%) ζώα της ομάδας Α, 8/17 (47,1%) της ομάδας Β και 7/16 (43,8%) της ομάδας Γ. Η αύξηση αυτή ήταν σημαντική σε όλες τις ομάδες στη σύγκριση μεταξύ των χρόνων 0 και 1. Στο χρόνο 2, η συγκέντρωση του SUN ήταν πάνω από τα φυσιολογικά όρια σε 1/18 (5,6%) ζώα της ομάδας Α, 1/11 (9,1%) της ομάδας Β και 2/16 (12,5%) της ομάδας Γ. Στη σύγκριση μεταξύ των χρόνων 1 και 2 σημαντική μείωση της τιμής της παραμέτρου αυτής παρατηρήθηκε στις ομάδες Α και Γ. Στις μεταξύ των ομάδων συγκρίσεις για τους χρόνους 0, 1 και 2 ξεχωριστά δε διαπιστώθηκε πουθενά σημαντική διαφορά (Πίνακας 15 – Πίνακες XIII, XIV, XV Παραρτ.).

97

Πίνακας 15: Διάμεσος, ελάχιστη και μέγιστη τιμή της συγκέντρωσης του αζώτου της ουρίας (SUN) στον ορό του αίματος (mg/100 ml) στους χρόνους 0, 1 και 2 της μελέτης και οι μεταξύ τους συγκρίσεις στις ομάδες Α, Β και Γ Ομάδες Διάμεσος Ελάχιστη τιμή Χρονος 0 Α (n: 23) 16 10 Β (n: 17) 20 10 Γ (n: 16) 23 14 Χρονος 1 Α (n: 18) 38,5 19 Β (n: 11) 41 20 Γ (n: 16) 31 21

Μέγιστη Διάμεσος Ελάχιστη τιμή τιμή Χρόνος 1 29 19 38 30 13 33 30 21 31 Χρόνος 2 92 15 21 84 12 22 78 12 21,5

Μέγιστη τιμή

P

92 84 78

<0,0001*

70 121 62

0,0001 *

<0,0001* 0,002 *

0,087 0,0077 *

* Στατιστικά σημαντική διαφορά

Συγκέντρωση του φωσφόρου (P) στον ορό του αίματος

Στο χρόνο 0, η συγκέντρωση του Ρ στον ορό του αίματος ήταν φυσιολογική (2 – 5 mg/100 ml) σε όλα τα ζώα της ομάδας Α αλλά υψηλότερη από το ανώτερο φυσιολογικό όριο σε 3/17 (17,6%) ζώα της Β και 2/16 (12,5%) της Γ. Στο χρόνο 1, υπερφωσφαταιμία παρατηρήθηκε σε 14/23 (60,9%) ζώα της ομάδας Α, 7/17 (41,2%) της Β και 12/16 (75%) της Γ. Στη σύγκριση μεταξύ των χρόνων 0 και 1 η αύξηση της συγκέντρωσης του P ήταν σημαντική μόνο στην ομάδα Α. Στο χρόνο 2, υπερφωσφαταιμία διαπιστώθηκε σε 5/18 (27,8%) ζώα της ομάδας Α, 4/11 (36,4%) της ομάδας Β και 11/16 (68,8%) της ομάδας Γ. Στη σύγκριση μεταξύ των χρόνων 1 και 2 η μείωση της τιμής του φωσφόρου ήταν σημαντική και πάλι στην ομάδα Α. Στις μεταξύ των ομάδων συγκρίσεις για τους χρόνους 0, 1 και 2 ξεχωριστά δε διαπιστώθηκε σημαντική διαφορά (Πίνακας 16 – Πίνακες XVI, XVII, XVIII Παραρτ.).

98

Πίνακας 16: Διάμεσος, ελάχιστη και μέγιστη τιμή της συγκέντρωσης του φωσφόρου στον ορό του αίματος (mg/100 ml) στους χρόνους 0, 1 και 2 της μελέτης και οι μεταξύ τους συγκρίσεις στις ομάδες Α, Β και Γ Ομάδες Διάμεσος Ελάχιστη Μέγιστη Διάμεσος Ελάχιστη Μέγιστη τιμή τιμή τιμή τιμή Χρονος 0 Χρόνος 1 Α (n: 23) 3,8 5 3,8 9,2 4,6 5,3 Β (n: 17) 3,7 6,5 3,6 8,1 4,6 4,9 Γ (n: 16) 3,7 6,5 3,3 7,3 4,6 5,2 Χρονος 1 Χρόνος 2 Α (n: 18) 3,8 9,2 3,9 6 5,6 5 Β (n: 11) 3,6 8,1 3 14,6 5,1 5 Γ (n: 16) 3,3 7,3 3 6,4 5,2 4,8

P 0,0004* 0,15 0,052 0,02* 0,7 0,06

* Στατιστικά σημαντική διαφορά

Ευρήματα από την ανάλυση και την καλλιέργεια των ούρων

Στο χρόνο 0, το ειδικό βάρος των ούρων ήταν φυσιολογικό (>1030) σε όλα τα ζώα της μελέτης. Στο χρόνο 1, σε 21/23 (91,3%) ζώα της ομάδας Α, 16/17 (94,1%) της ομάδας Β και 13/16 (81,3%) της ομάδας Γ το ειδικό βάρος ήταν χαμηλότερο του φυσιολογικού. Στη μεταξύ των χρόνων 0 και 1 σύγκριση διαπιστώθηκε σημαντική πτώση της παραμέτρου αυτής σε όλες τις ομάδες. Στο χρόνο 2, σε 3/18 (16,7%) ζώα της ομάδας Α, σε 2/11 (18,2%) της ομάδας Β και 7/16 (43,6%) της ομάδας Γ το ειδικό βάρος των ούρων εξακολουθούσε να παραμένει χαμηλότερο του φυσιολογικού. Στη σύγκριση μεταξύ των χρόνων 1 και 2 παρατηρήθηκε σημαντική αύξηση του ειδικού βάρους σε όλες τις ομάδες. Στις μεταξύ των ομάδων συγκρίσεις για τον καθένα από τους χρόνους ξεχωριστά δε διαπιστώθηκε σημαντική διαφορά (Πίνακες 17 και 18 – Πίνακες XIX, XX, XXI Παραρτ.).

99

Όπως ήταν επόμενο, στο χρόνο 0 πρωτεϊνουρία με τη κατά Heller θολωσιμετρική μέθοδο διαπιστώθηκε σε όλα τα ζώα των ομάδων Β και Γ αλλά σε κανένα της ομάδας Α. Το ίδιο διαπιστώθηκε και στους χρόνους 1 και 2. Σε κανένα από τα 56 ζώα δεν ανιχνεύθηκαν γλυκόζη, κετονικά σώματα, χολερυθρίνη και ουροχολινογόνο με τη χρωματομετρική ταινία και στους 3 χρόνους της μελέτης. Τα κυριότερα ευρήματα από τη μικροσκοπική εξέταση του ιζήματος των ούρων στο χρόνο 0 ήταν η αιματουρία (ερυθρά αιμοσφαίρια >6/οπτικό πεδίο x400), που παρατηρήθηκε σε 2/23 (8,7%) ζώα της ομάδας Α, 1/17 (5,9%) της ομάδας Β και 2/16 (12,5%) της ομάδας Γ και η υελοκοκκιώδης – κοκκιώδης κυλινδρουρία (κύλινδροι >2/οπτικό πεδίο, x100) που βρέθηκε σε 4/17 (23,5%) ζώα της ομάδας Β και 3/16 (18,8%) της ομάδας Γ. Στο χρόνο 1, μικροσκοπική αιματουρία διαπιστώθηκε σε 1/23 (4,3%) ζώα της ομάδας Α, 2/17 (11,8%) της ομάδας Β και 1/16 (6,3%) της ομάδας Γ, ενώ κυλινδρουρία σε 1/23 (4,3%) της Α, 4/17 (23,5%) της Β και 2/16 (12,5%) της Γ. Στη μεταξύ των χρόνων 0 και 1 σύγκριση δεν παρατηρήθηκε καμία σημαντική μεταβολή ως προς τα παραπάνω ευρήματα. Στο χρόνο 2, 2/11 (18,2%) ζώα της ομάδας Β και 3/16 (18,8%) της ομάδας Γ παρουσίαζαν μικροσκοπική αιματουρία ενώ κυλινδρουρία διαπιστώθηκε σε 2/11 (18,2%) ζώα της ομάδας Β και 2/16 (12,5%) της ομάδας Γ. Στις μεταξύ των χρόνων 1 και 2 συγκρίσεις δε βρέθηκε σημαντική διαφορά για καμία από τις δύο παραπάνω ομάδες. Το ίδιο ισχύει και για τις μεταξύ των τριών ομάδων συγκρίσεις, ξεχωριστά για τους χρόνους 0, 1 και 2. Ξανθινική κρυσταλλουρία διαπιστώθηκε στο ίζημα των ούρων 4 (Α6, Α16, Α22, Β14) από τους 45 συνολικά σκύλους (8,9%) μόνο στο χρόνο 2 (Πίνακες XXII, XXIII, XXIV Παραρτ.).

100

Οι καλλιέργειες των ούρων για αερόβια βακτηρίδια ήταν αρνητικές σε όλα τα ζώα και στους 3 χρόνους της μελέτης. Πίνακας 17: Αριθμός και εκατοστιαία αναλογία των ζώων εκείνων, των ομάδων Α, Β και Γ που παρουσίαζαν χαμηλό ειδικό βάρος των ούρων (>1012, <1030), ισοσθενουρία και υποσθενουρία στους χρόνους 1 και 2 της μελέτης Ομάδες

Α (n: 18) Β (n: 11) Γ (n: 16)

Ειδικό βάρος >1012, <1030

10 (55,6%) 9 (81,8%) 11 (68,8%)

Ισοσθενουρία Υποσθενουρία (1008 – 1012) (<1008)

Χρονος 1 6 (33,3%)

1 (5,6%)

0

1 (9%)

2 (12,5%)

0

Ειδικό βάρος >1012, <1030

3 (16,7%) 2 (18,2%) 6 (37,5%)

Ισοσθενουρία Υποσθενουρία (1008 – 1012) (<1008)

Χρόνος 2 0

0

0

0

1 (6,3%)

0

Πίνακας 18: Διάμεσος, ελάχιστη και μέγιστη τιμή του ειδικού βάρους των ούρων στους χρόνους 0, 1 και 2 της μελέτης και οι μεταξύ τους συγκρίσεις στις ομάδες Α, Β και Γ Ομάδες Διάμεσος Ελάχιστη Μέγιστη Διάμεσος Ελάχιστη Μέγιστη τιμή τιμή τιμή τιμή Χρονος 0 Χρόνος 1 Α (n: 23) 1030 1055 1004 1050 1035 1017 Β (n: 17) 1030 1052 1007 1039 1035 1020 Γ (n: 16) 1030 1051 1009 1035 1036 1017 Χρονος 1 Χρόνος 2 Α (n: 18) 1004 1030 1020 1054 1016 1039 Β (n: 11) 1007 1039 1016 1052 1020 1037 Γ (n: 16) 1009 1035 1010 1055 1017 1039

P <0,0001* <0,0001* <0,0001* <0,0001* <0,0001* 0,0002*

* Στατιστικά σημαντική διαφορά

101

Λόγος πρωτεϊνών/κρεατινίνης (Up/c)

Ο λόγος Up/c ήταν >1 στα ζώα των ομάδων Β και Γ, που παρουσίαζαν πρωτεϊνουρία. Αντίθετα, σε όλα τα ζώα της ομάδας Α που δεν παρουσίαζαν πρωτεϊνουρία, ο λόγος ήταν <0,5, που υιοθετήθηκε ως η ανώτερη φυσιολογική τιμή (Grauer 2005). Στο χρόνο 0 διαπιστώθηκε ομοιογένεια του λόγου αυτού μεταξύ των πρωτεϊνουρικών ομάδων Β και Γ. Στο χρόνο 1, 15/17 (88,2%) ζώα της ομάδας Β και 14/16 (87,5%) της ομάδας Γ παρουσίασαν μείωση του λόγου, ενώ σε 2/17 (11,8%) ζώα της ομάδας Β και 2/16 (12,5%) της ομάδας Γ αυτός αυξήθηκε. Μόνο σε 2/16 (12,5%) ζώα της ομάδας Γ (Γ1, Γ12), ο λόγος Up/c έπεσε κάτω από το 0,5. Στις συγκρίσεις μεταξύ των χρόνων 0 και 1 η μείωση του λόγου Up/c ήταν σημαντική και στις δύο ομάδες. Στο χρόνο 2, μείωση του λόγου Up/c διαπιστώθηκε σε 6/11 (54,5%) ζώα της ομάδας Β και σε 13/16 (81,3%) της ομάδας Γ, ενώ αύξηση σε 5/11 (45,5%) ζώα της ομάδας Β και 3/16 (18,8%) της ομάδας Γ. Στις συγκρίσεις των τιμών του Up/c μεταξύ των χρόνων 1 και 2 δεν υπήρχε σημαντική διαφορά σε καμία από τις δύο ομάδες. Στις μεταξύ των ομάδων Β και Γ συγκρίσεις για τους χρόνους 1 και 2 ξεχωριστά, επίσης δε διαπιστώθηκε σημαντική διαφορά (Πίνακας 19 – Πίνακες XXV, XXVI Παραρτ.). Πίνακας 19: Διάμεσος, ελάχιστη και μέγιστη τιμή του λόγου πρωτεϊνών/κρεατινίνης (Up/c) στους χρόνους 0, 1 και 2 της μελέτης και οι μεταξύ τους συγκρίσεις στις ομάδες Β και Γ Ομάδες

Β (n: 17) Γ (n: 16)

Διάμεσος

3,67 3,67

Ελάχιστη τιμή

Χρονος 0 1,03 1,15 Χρονος 1 1,43 0,2

Β (n: 11) 2,25 Γ (n: 16) 2,46 * Στατιστικά σημαντική διαφορά

Μέγιστη τιμή

Διάμεσος

33,33 10,62

2,28 2,46

5,21 9,63

2,11 1,27

Ελάχιστη τιμή

Χρόνος 1 1,36 0,2 Χρόνος 2 1,06 0,43

Μέγιστη τιμή

P

5,21 9,63

<0,0001*

11,5 3,78

0,57

0,02*

0,1

102

Συγκέντρωση των λευκωματινών στον ορό του αίματος

Στο χρόνο 0, υπολευκωματιναιμία (φυσιολογικό εύρος λευκωματινών: 2,9 – 4 g/100 ml) βρέθηκε σε 13/17 (76,5%) ζώα της ομάδας Β και 12/16 (75%) της ομάδας Γ. Στο χρόνο 1, η βιοχημική αυτή διαταραχή περιορίστηκε στα 3/17 (17,6%) και 8/16 (50%) ζώα των ομάδων Β και Γ, αντίστοιχα. Στις συγκρίσεις μεταξύ των χρόνων 0 και 1, σημαντική αύξηση της συγκέντρωσης των λευκωματινών παρατηρήθηκε και στις δύο ομάδες. Στο χρόνο 2, υπολευκωματιναιμία παρουσίαζαν μόνο 4/11 (36,4%) ζώα της ομάδας Β και 2/16 (12,5%) της ομάδας Γ. Η σύγκριση μεταξύ των χρόνων 1 και 2 δεν έδειξε σημαντική μεταβολή της συγκέντρωσης των λευκωματινών, σε καμία από τις δύο ομάδες. Τέλος, στις μεταξύ των δύο ομάδων συγκρίσεις επίσης δε διαπιστώθηκε σημαντική διαφορά στους χρόνους 0, 1 και 2 (Πίνακας 20 – Πίνακες XXVII, XXVIII Παραρτ.). Πίνακας 20: Διάμεσος, ελάχιστη και μέγιστη τιμή της συγκέντρωσης των λευκωματινών στον ορό του αίματος (g/100 ml) στους χρόνους 0, 1 και 2 της μελέτης και οι μεταξύ τους συγκρίσεις στις ομάδες Β και Γ Ομάδες

Διάμεσος

Β (n: 17) Γ (n: 16)

2,6 2,6

Β (n: 11) Γ (n: 16)

3,1 2,8

Ελάχιστη τιμή

Χρόνος 0 1,6 2 Χρόνος 1 1,9 2,2

Μέγιστη τιμή

Διάμεσος

3,4 3,1

3,1 2,8

3,5 3,7

3 3,1

Ελάχιστη τιμή

Χρόνος 1 1,9 2,2 Χρόνος 2 2,7 2,7

Μέγιστη τιμή

P

3,5 3,7

<0,0001*

3,3 3,5

0,65

0,006*

0,055

* Στατιστικά σημαντική διαφορά

103

Συγκέντρωση της χοληστερόλης στον ορό του αίματος

Στο χρόνο 0, υπερχοληστερολαιμία (φυσιολογικό εύρος χοληστερόλης: 114 – 286 mg/100 ml) διαπιστώθηκε σε 2/17 (11,8%) ζώα της ομάδας Β και 6/16 (37,5%) της ομάδας Γ, ενώ στο χρόνο 1 σε ένα ζώο από κάθε ομάδα (Β: 5,9%, Γ: 6,3%). Μεταξύ των χρόνων 0 και 1 σε καμία από τις δύο ομάδες δεν παρατηρήθηκε σημαντική μεταβολή της συγκέντρωσης της χοληστερόλης. Στο χρόνο 2, υπερχοληστερολαιμία διαπιστώθηκε σε 2/11 (18,2%) ζώα της ομάδας Β και 3/16 (18,8%) της ομάδας Γ, χωρίς όμως και πάλι να διαπιστωθεί σημαντική μεταβολή στη σύγκριση μεταξύ των χρόνων 1 και 2 σε καμία από τις δύο ομάδες. Τέλος, στις μεταξύ των ομάδων Β και Γ συγκρίσεις για τους χρόνους 0, 1 και 2 ξεχωριστά, δε διαπιστώθηκε σημαντική διαφορά (Πίνακας 21 – Πίνακες XXVII, XXVIII Παραρτ.). Πίνακας 21: Διάμεσος, ελάχιστη και μέγιστη τιμή της συγκέντρωσης της χοληστερόλης στον ορό του αίματος (mg/100 ml) στους χρόνους 0, 1 και 2 της μελέτης και οι μεταξύ τους συγκρίσεις στις ομάδες Β και Γ Ομάδες

Διάμεσος

Β (n: 17) Γ (n: 16)

185 207

Β (n: 11) Γ (n: 16)

220 207

Ελάχιστη τιμή

Χρονος 0 100 95 Χρονος 1 110 130

Μέγιστη τιμή

Διάμεσος

320 342

220 207

280 300

195 203

Ελάχιστη τιμή

Χρόνος 1 110 130 Χρόνος 2 131 103

Μέγιστη τιμή

P

310 300

0,48

340 400

0,86

0,6

0,98

104

Ανεπιθύμητες ενέργειες της θεραπείας με αμφοτερικίνη Β

Στις ανεπιθύμητες ενέργειες που παρατηρήθηκαν σε ορισμένους από τους 56 σκύλους μετά από τη χορήγηση της AmB περιλαμβάνονταν η πολυουρία – πολυδιψία, ο έμετος και ο γενικευμένος μυϊκός τρόμος. Συγκεκριμένα, πολυουρία - πολυδιψία παρουσιάστηκε σε 51/56 (91,1%), έμετος σε 6/56 (10,7%) και μυϊκός τρόμος σε 24/56 (42,9%) ζώα. Στις μεταξύ των τριών ομάδων συγκρίσεις δε διαπιστώθηκαν σημαντικές διαφορές ως προς τον αριθμό των ζώων που παρουσίασαν τις τρεις παραπάνω ανεπιθύμητες ενέργειες. Επισημαίνεται ότι έμετος και γενικευμένος μυϊκός τρόμος παρατηρήθηκαν μόνο κατά τη διάρκεια των θεραπευτικών συνεδριών ενώ πολυουρία – πολυδιψία καθόλο το χρονικό διάστημα της θεραπείας με AmB, η οποία στη συνέχεια υποχώρησε προοδευτικά μετά τη λήξη της (χρόνος 1) (Πίνακας ΧΧΙΧ Παραρτ.).

105

106

ΣΥΖΗΤΗΣΗ

ΠΡΩΤΟ ΣΚΕΛΟΣ ΤΗΣ ΜΕΛΕΤΗΣ

Βασικοί στόχοι της θεραπείας των συμπτωματικών σκύλων στις ενζωοτικές περιοχές της λεϊσμανίωσης του σκύλου (ΛΣ) είναι η βελτίωση της κλινικής εικόνας, σε βαθμό που να εξασφαλίζει καλή ποιότητα ζωής και ταυτόχρονα να ικανοποιεί τον ιδιοκτήτη του ζώου, η κατά το δυνατόν αποκατάσταση των αιματολογικών και βιοχημικών διαταραχών, η εξαφάνιση ή η μείωση της πρωτεϊνουρίας και του τίτλου των ειδικών αντισωμάτων στο αίμα, η ελαχιστοποίηση της πιθανότητας μόλυνσης των φλεβοτόμων στο περιβάλλον του ζώου και ιδιαίτερα η παρασιτολογική ίαση (Gradoni και συν. 1988, Slappendel και Ferrer 1998, Lamothe 1999, Σαριδομιχελάκης και Κουτίνας 2002, Baneth και Shaw 2002). Επιπλέον, η μέσω της αντιλεϊσμανιακής αγωγής διέγερση και διατήρηση της κυτταρικής ανοσίας σε φυσιολογικά επίπεδα (Th1 ανοσολογική ανταπόκριση) μπορεί να θεραπεύσει οριστικά το ζώο και να αποτρέψει την επανεμφάνιση των συμπτωμάτων σε περίπτωση μελλοντικής επαναμόλυνσης (Pinelli και συν. 1995, Vouldoukis και συν. 1996). Δυστυχώς, δεν υπάρχει μέχρι σήμερα αντιλεϊσμανιακό φάρμακο με το οποίο να επιτυγχάνονται οι παραπάνω στόχοι (Baneth και Shaw 2002). Σε πρόσφατη και βασιζόμενη σε ενδείξεις μετανάλυση των περισσότερων κλινικών μελετών πάνω στην αντιλεϊσμανιακή θεραπεία του σκύλου, διαπιστώθηκε ότι ο συνδυασμός της αντιμονιούχου μεγλουμίνης και της αλλοπουρινόλης αποτελούν το θεραπευτικό εκείνο σχήμα με το οποίο επιτυγχάνεται το καλύτερο δυνατό κλινικό και αντιπαρασιτικό αποτέλεσμα και οι λιγότερες υποτροπές (Noli και Auxilia 2005). Στην ίδια ανασκόπηση βρέθηκε ότι η αμινοσιδίνη και η πενταμιδίνη έχουν μέτριο 107

θεραπευτικό αποτέλεσμα ενώ εκείνο της AmB και πολλών άλλων φαρμάκων, που έχουν κατά καιρούς χρησιμοποιηθεί κατά της ΛΣ, είναι πολύ περιορισμένο εως μηδαμινό. Αναφορικά με την αμφοτερικίνη Β (AmB) (λιποσωμική μορφή) στο ίδιο συμπέρασμα φαίνεται να καταλήγει και η μελέτη των Oliva και συν. (1995). Από την άλλη όμως πλευρά, σε πρόσφατες μελέτες προβάλλεται το πολύ καλό κλινικό και αντιλεϊσμανιακό αποτέλεσμα της AmB (εναιώρημα με λιπίδια παρεντερικής διατροφής ή λιπιδική AmB) σε σκύλους με τη φυσική και συμπτωματική μορφή της νόσου (Lamothe 2001, Cortadellas 2003). Με βάση τα παραπάνω, βασικός στόχος του πρώτου σκέλους της διατριβής αυτής ήταν η διαλεύκανση της θεραπευτικής αξίας της AmB στη ΛΣ (κλινική και παρασιτολογική ίαση) και η αξιολόγηση της ασφάλειάς της σε μεγαλύτερο αριθμό κλινικών περιστατικών (n=56) και με όσο το δυνατόν αντικειμενικότερη και λεπτομερέστερη κλινική εκτίμηση και εργαστηριακή διερεύνηση. Ο άλλος λόγος που επιλέχθηκε η AmB είναι η εμφάνιση ανθεκτικών στελεχών της L. infantum στην αντιμονιούχο μεγλουμίνη, ύστερα από μία ή περισσότερες ολοκληρωμένες θεραπευτικές συνεδρίες (Gramiccia και συν. 1992) ή ακόμα και στην πρώτη θεραπευτική προσπάθεια (Faraut – Gambarelli και συν. 1997). Η ανθεκτικότητα αυτή προκαλεί ανησυχία στον ιατρικό κόσμο γιατί έχει άμεση σχέση με τη δημόσια υγεία, αν ληφθεί υπόψη ότι στην Ελλάδα και τις άλλες παραμεσόγειες χώρες της Ευρώπης η αντιμονιούχος μεγλουμίνη είναι το ευρύτερα χρησιμοποιούμενο αντιλεϊσμανιακό φάρμακο στο σκύλο, μόνο του ή σε συνδυασμό με την αλλοπουρινόλη (Baneth και Shaw 2002, Baneth 2005). Απενταντίας, στη σπλαχνική λεϊσμανίωση του ανθρώπου, in vivo μελέτες και η γενικότερη κλινική εμπειρία δεν έχουν δείξει ότι υπάρχει πρόβλημα ανθεκτικών

108

στελεχών της L. infantum και L. donovani απέναντι στην AmB (DiGiorgio και συν. 1999). Επισημαίνεται ότι στην ίδια νόσο η σύγκριση μεταξύ αντιμονιούχου μεγλουμίνης και AmB σε ασθενείς που ήταν μολυσμένοι με HIV δεν έδειξε την ύπαρξη διαφοράς ως προς το θεραπευτικό αποτέλεσμα, τις ανεπιθύμητες ενέργειες, το χρόνο επιβίωσης ή το ελεύθερο συμπτωμάτων χρονικό διάστημα (Laguna και συν. 1999). Η φαρμακοτεχνική μορφή της AmB που χρησιμοποιήθηκε στη μελέτη αυτή (γαλάκτωμα του δεσοξυχολικού νατρίου με λιπίδια παρεντερικής διατροφής) επιλέχτηκε κατά πρώτο λόγο για να μειωθεί η νεφροτοξικότητα, να βελτιωθεί η κατανομή στους προσβλημένους ιστούς, να εισχωρήσει περισσότερο και πληρέστερα στα μακροφάγα κύτταρα και να παραταθεί ο χρόνος διαθεσιμότητάς της στον οργανισμό (Caillot και συν. 1993). Ο δεύτερος λόγος ήταν να μειωθεί σημαντικά το κόστος της θεραπείας αφού η 10 φορές ακριβότερη λιποσωμική μορφή της AmB (Ambisome®) δε φαίνεται να έχει καλύτερο θεραπευτικό αποτέλεσμα και λιγότερες ανεπιθύμητες ενέργειες, τόσο στο σκύλο όσο και στον άνθρωπο (Oliva και συν. 1995, Sundar και συν. 2000). Το ιστορικό, σε συνδυασμό με την κλινική (Πίνακες 2, 3, 4) και εργαστηριακή εικόνα (Πίνακες 6, 7, 8), και των 56 σκύλων της μελέτης αυτής δεν παρουσίαζαν διαφορές σε σύγκριση με τα δεδομένα άλλων κλινικών μελετών πάνω στη ΛΣ, που έχουν γίνει σε άλλες παραμεσόγειες χώρες, συμπεριλαμβανόμενης και της Ελλάδας (Ciaramella και συν. 1997, Koutinas και συν. 1999a, Vamvakidis και συν. 2000, Papadogiannakis και συν. 2005, Plevraki και συν. 2006). Η επιβεβαίωση της νόσου και στα 56 ζώα βασίστηκε στο θετικό τίτλο των ειδικών αντισωμάτων της L. infantum στον ορό του αίματος (IFAΤ), στην ανεύρεση των αμαστιγοφόρων μορφών του πρωτόζωου στη μικροσκοπική εξέταση επιχρισμάτων από οπό λεμφογαγγλίου και μυελό των οστών και στην εξέταση

109

με PCR στο μυελό των οστών (χρόνος 0). Επειδή η ευαισθησία της άμεσης μικροσκοπικής εξέτασης των λεμφογαγγλίων και του μυελού των οστών (αμαστιγοφόρα μορφή), που θεωρείται η «χρυσή σταθερά» στη διάγνωση της ΛΣ (Ferrer 1992, Font 1999), μειώνεται εντυπωσιακά στα ασυμπτωματικά ζώα (Saridomichelakis και συν. 2005a) και σ’ εκείνα που τους γίνεται θεραπεία (Koutinas και συν. 2001, Plevraki και συν. 2006), η επιβεβαίωση της παρασιτολογικής ή όχι ίασης στους χρόνους 1 (τέλος θεραπείας με AmB) και 2 (τέλος θεραπείας με αλλοπουρινόλη) βασίστηκε στην εξέταση με PCR που θεωρείται πολύ περισσότερο ευαίσθητη και εξίσου ειδική διαγνωστική μέθοδος (Ferrer 1997, Roura και συν. 1999b, Koutinas και συν. 2001, Leontides και συν. 2002, Plevraki και συν. 2006). Το κλινικό αποτέλεσμα της θεραπείας με AmB αξιολογήθηκε ως καλό (βελτίωση >50%) στο 37,5%, πολύ καλό (βελτίωση >75%) στο 23,2% και άριστο (κλινική ίαση) στο 8,9% των ζώων. Το συνολικό κλινικό αποτέλεσμα της θεραπευτικής αυτής αγωγής (69,6%) είναι χωρίς αμφιβολία αποδεκτό από τους ιδιοκτήτες των ζώων, συμβατό με τις αρχές της ευζωΐας και ικανοποιητικό από επιστημονική άποψη. Το ποσοστό αυτό είναι σαφώς χαμηλότερο από τα αντίστοιχα (100%) των Lamothe (2001) και Cortadellas (2003) σε ανάλογες κλινικές μελέτες στις οποίες χρησιμοποιήθηκε η ίδια φαρμακοτεχνική μορφή της AmB. Αναλυτικότερα, στην πρώτη από τις μελέτες αυτές, που έγινε σε 17 κλινικά περιστατικά, η δόση της κάθε θεραπευτικής συνεδρίας κυμαινόταν από 1 – 2,5 mg/kg ΣΒ, και χορηγούνταν δύο φορές την εβδομάδα, μέχρι τη συνολική δόση των 10 – 17,7 mg/kg ΣΒ. Το ποσοστό της θετικής κλινικής ανταπόκρισης (καλή – πολύ καλή) αμέσως μετά το τέλος της θεραπείας ήταν 100% (Lamothe 2001). Στη δεύτερη μελέτη, η οποία περιλάμβανε 16 κλινικά περιστατικά, η συνολική δόση της

110

AmB κυμάνθηκε από 9,1 μέχρι 17,5 mg/kg ΣΒ, και διαιρέθηκε σε 8 – 10 θεραπευτικές συνεδρίες των 0,8 – 2,5 mg/kg ΣΒ η καθεμία (Cortadellas 2003). Το ποσοστό των κλινικών υποτροπών στις μελέτες αυτές κυμάνθηκε από 10 – 18,7%, 8 μήνες μέχρι ένα χρόνο μετά το τέλος της θεραπείας. Το χαμηλότερο ποσοστό της θετικής κλινικής ανταπόκρισης στη δική μας μελέτη σε σύγκριση με τις δύο παραπάνω θα μπορούσε να εξηγηθεί λαμβάνοντας υπόψη τα αντικειμενικότερα και αυστηρότερα κριτήρια που θεσπίστηκαν για την εκτίμισή της (βαθμολόγηση κάθε παθολογικής κατάστασης ξεχωριστά από δύο ανεξάρτητους εξεταστές, βαθμολόγηση του συνόλου της κλινικής εικόνας). Αντίθετα, η κλινική εκτίμηση του Lamothe (2001) βασίστηκε μόνο στην υποχώρηση της περιφερικής λεμφογαγγλιομεγαλίας και της αποφολιδωτικής δερματίτιδας ενώ, χειρότερα, ο Cortadellas (2003) αναφέρει κάπως αόριστα ότι διαπιστώθηκε «πλήρης κλινική ίαση», χωρίς όμως να περιγράφει τη μεθοδολογία της κλινικής του εκτίμησης. Στη μελέτη όμως των Oliva και συν. (1995), στην οποία χρησιμοποιήθηκε η λιποσωμική μορφή της AmB (Ambisome®) σε 4 διαφορετικά δοσολογικά σχήματα και σε σύνολο 13 κλινικών περιστατικών, το ποσοστό της θετικής κλινικής ανταπόκρισης (78%) πλησίαζε το δικό μας (69,6%), παρά τα διαφορετικά κριτήρια που χρησιμοποιήθηκαν στην εκτίμηση του κλινικού αποτελέσματος. Στη μελέτη των Moreno και συν. (1999), χρησιμοποιήθηκε η ίδια φαρμακοτεχνική μορφή της AmB σε 4 συνολικά σκύλους με ΛΣ (2 ασυμπτωματικοί, 2 συμπτωματικοί) στη δόση των 25 mg/m2, 3 φορές την εβδομάδα, για δύο εβδομάδες (συνολική δόση: 150 mg/m2). Αν και η σύγκριση με τα δικά μας αποτελέσματα φαίνεται να έχει περιορισμένη αξία λόγω του πολύ μικρού αριθμού των ασθενών ζώων (n=2) και της εξακρίβωσης της παρασιτολογικής ή όχι ίασης με τη μέθοδο της άμεσης

111

μικροσκοπικής εξέτασης επιχρισμάτων από τα λεμφογάγγλια και το μυελό των οστών, το κλινικό, αντιπαρασιτικό και ορολογικό αποτέλεσμα φαίνεται να μη διαφέρει ιδιαίτερα. Τέλος, η κλινική αποτελεσματικότητα της AmB, που διαπιστώθηκε στην παρούσα μελέτη, δε φαίνεται να διαφέρει από άλλες με παρόμοιο σχεδιασμό μελέτες, στις οποίες όμως χρησιμοποιήθηκε η αλλοπουρινόλη (Koutinas και συν. 2001) ή συνδυασμός της με αντιμονιούχο μεγλουμίνη (Denerolle και Bourdoiseau 1999). Η κλινική επιδείνωση που παρατηρήθηκε στο 5,4% των περιστατικών μας (3/56) και δεν αναφέρεται στις άλλες μελέτες με AmB (Oliva και συν. 1995, Lamothe 1997, Lamothe 2001, Cortadellas 2003), βασικά αφορούσε σε μικρό αριθμό παθολογικών καταστάσεων, που είχαν άλλη αιτιολογία (περιστ. Α3: βακτηριδιακή βλεφαρίτιδα – επιπεφυκίτιδα), ήταν το αποτέλεσμα μικροεπέμβασης (περιστ. Γ3: βακτηριδιακή δερματίτιδα στους μυκτήρες λόγω προηγούμενης συρραφής) ή οφειλόταν στην περιορισμένη δυνατότητα καθημερινής άσκησης και πιθανότατα την πρόωρη κλινική εκτίμηση (περιστ. Γ1 και Γ3: ονυχογρύπωση και υπερκεράτωση των πελματικών φυμάτων). Θα ήταν σκόπιμο να τονιστεί ότι όλες οι παραπάνω παθολογικές καταστάσεις ήταν ήπιου βαθμού και υποχώρησαν προοδευτικά. Ως προς την τελική έκβαση των περιστατικών ένα χρόνο μετά το τέλος της μελέτης, και ενώ προφανώς συνεχιζόταν η θεραπεία με αλλοπουρινόλη, τα 35/45 (77,8%), στα οποία ολοκληρώθηκε η μελέτη, παρέμεναν κλινικά υγιή σύμφωνα με τους ιδιοκτήτες τους ή ύστερα από επανεξέτασή τους στην Κλινική. Στους 6 από τους υπόλοιπους 10 σκύλους η κλινική εικόνα επιδεινώθηκε με αποτέλεσμα την ευθανασία ή το θάνατό τους, ενώ για τους υπόλοιπους 4 χάθηκε κάθε επικοινωνία με τους ιδιοκτήτες τους. Τέλος, στα 5 ζώα που βρέθηκαν αρνητικά στην PCR μετά τη λήξη της θεραπείας με

112

AmB (χρόνος 1), μετά το τέλος της μελέτης (χρόνος 2) χορηγήθηκε αλλοπουρινόλη και ένα χρόνο αργότερα παρέμεναν κλινικά υγιή. Οι

συχνές

στη

ΛΣ

αιματολογικές

διαταραχές

(π.χ.

αναιμία,

θρομβοκυτταροπενία) υποχωρούν σχετικά γρήγορα με την αντιλεϊσμανιακή θεραπεία (Denerolle και Bourdoiseau 1999, Koutinas και συν. 2001, Πλευράκη 2003). Το ίδιο έχει διαπιστωθεί και για την υπερπρωτεϊναιμία, που είναι το αποτέλεσμα της πολυκλωνικής ή δικλωνικής υπερσφαιριναιμίας (Slappendel 1988), και την υπολευκωματιναιμία, που συνήθως οφείλεται στην πρωτεϊνουρία διήθησης από τη χρόνια σπειραματονεφρίτιδα (Ciaramella και συν. 1997, Koutinas και συν. 1999a, Plevraki και συν. 2006). Στην παρούσα μελέτη, αν και υπήρξε σημαντική βελτίωση των παραπάνω αιματολογικών και βιοχημικών διαταραχών, οι αντίστοιχες εργαστηριακές παράμετροι δεν επανήλθαν στα φυσιολογικά όρια σε όλα τα ζώα (Πίνακας 6). Κάτι ανάλογο παρατηρήθηκε και στη μελέτη με τη λιποσωμική AmB, αν και η βελτίωση των αιματολογικών και βιοχημικών παραμέτρων συμπεριλήφθηκε στη συνολική αξιολόγηση της κλινικής εικόνας των ζώων (Oliva και συν. 1995). Σε άλλη κλινική μελέτη με 16 συμπτωματικούς σκύλους, η αναιμία, η υπερσφαιριναιμία, η υπερπρωτεϊναιμία και η υπολευκωματιναιμία αναφέρεται ότι υποχώρησαν τελείως, αμέσως μετά τη θεραπεία με λιπιδική AmB (Cortadellas 2003). Στις προηγούμενες μελέτες θεραπείας της ΛΣ με AmB, η παρασιτολογική ίαση εκτιμήθηκε με βάση το αρνητικό αποτέλεσμα της άμεσης μικροσκοπικής εξέτασης σε λεμφογάγγλιο (Οliva και συν. 1995) ή μυελό των οστών (Lamothe 1997, Cortadellas 2003), ή στο αντίστοιχο της εξέτασης με PCR στο μυελό των οστών (Lamothe 2001, Cortadellas 2003). Ο ταυτόχρονος έλεγχος με τις δύο παραπάνω διαγνωστικές μεθόδους και την ορολογική εξέταση με IFAT έγινε για την καλύτερη αξιολόγηση του

113

αντιπαρασιτικού αποτελέσματος της AmB, όπως και σε παρόμοιες μελέτες στην ίδια Κλινική, στις οποίες όμως χορηγήθηκε αλλοπουρινόλη (Koutinas και συν. 2001, Πλευράκη 2003). Μετά το τέλος της θεραπείας με AmB, το ποσοστό της παρασιτολογικής ίασης στους 56 σκύλους με βάση τα αποτελέσματα της άμεσης μικροσκοπικής εξέτασης ήταν 85,7% στα λεμφογάγγλια και 58,9% στο μυελό των οστών. Στη μελέτη των Oliva και συν. (1995) το αντίστοιχο ποσοστό με βάση την μικροσκοπική εξέταση σε λεμφογάγγλιο, δύο μήνες μετά το τέλος της θεραπείας με λιποσωμική AmB, ήταν 15,4%. Η μεγάλη διαφορά με το δικό μας αποτέλεσμα θα μπορούσε ίσως να εξηγηθεί από το διαφορετικό χρόνο ελέγχου του αντιπαρασιτικού αποτελέσματος και όχι στoν αριθμό των οπτικών πεδίων που ελέγχθηκαν, αν ληφθεί υπόψη ότι σε πρόσφατη έρευνα δε βρέθηκε σημαντική διαφορά μεταξύ 1000 και 100 οπτικών πεδίων (x1000) στην άμεση μικροσκοπική εξέταση οπού λεμφογαγγλίου από ζώα με ασυμπτωματική ΛΣ (Saridomichelakis και συν. 2005a). Το παρασιτικό φορτίο των σκύλων αυτών φαίνεται ότι προσεγγίζει εκείνο των συμπτωματικών που υποβλήθηκαν σε αντιλεϊσμανιακή θεραπεία (Koutinas και συν. 2001, Πλευράκη 2003). Στις μελέτες αυτές (αλλοπουρινόλη: 10 mg/kg ΣΒ, από το στόμα, κάθε 12 ώρες) το ποσοστό της παρασιτολογικής ίασης με βάση την ίδια εξέταση στα λεμφογάγγλια και το μυελό των οστών ήταν 46,2% / 46,9% (Koutinas και συν. 2001) και 46,7% / 60% (Πλευράκη 2003), ύστερα από 4 και 6 μήνες θεραπείας, αντίστοιχα. Η μεγάλη διαφορά ως προς το ποσοστό της παρασιτολογικής ίασης με βάση τη μικροσκοπική εξέταση στα λεμφογάγγλια προφανώς μειώνει την ευαισθησία της μεθόδου αυτής αφού επηρεάζεται από την τεχνική λήψης, την ποιότητα του δείγματος και την εμπειρία του εξεταστή. Από την άλλη όμως πλευρά, η σύγκριση με

114

τις άλλες μελέτες στις οποίες χρησιμοποιήθηκε αλλοπουρινόλη μειονεκτεί επειδή η τελευταία είναι λεϊσμανιοστατικό και όχι λεϊσμανιοκτόνο φάρμακο και επειδή οι συγκεντρώσεις των αντιλεϊσμανιακών αυτών ουσιών στους ιστούς είναι διαφορετικές. Εντύπωση προκαλεί η πλήρης παρασιτολογική ίαση (100%) στη μελέτη του Cortadellas (2003), που βασίστηκε στη μικροσκοπική εξέταση του μυελού των οστών αμέσως μετά τη λήξη της θεραπείας (λιπιδική AmB), χωρίς όμως να αναφέρεται ο συνολικός αριθμός των οπτικών πεδίων που ελέγχθηκαν. Στην εργασία των Saridomichelakis και συν. (2005a) αναφέρεται ότι και πάλι η διαφορά στην ευαισθησία της άμεσης μικροσκοπικής εξέτασης του μυελού των οστών στη συμπτωματική ΛΣ δεν ήταν σημαντική στη σύγκριση μεταξύ 100 και 1000 πεδίων. Το χαμηλό ποσοστό παρασιτολογικής ίασης με βάση το αποτέλεσμα της εξέτασης με PCR (8,9%) αμέσως μετά το τέλος της θεραπείας με AmB συμφωνεί με εκείνο των Oliva και συν. (1995) (λιποσωμική AmB), αλλά είναι πολύ χαμηλότερο από το 82,2% και 87,5% των Lamothe (2001) και Cortadellas (2003), αντίστοιχα, ύστερα από PCR στο μυελό των οστών, που όμως έγινε από ένα μέχρι 5 μήνες μετά την τελευταία θεραπευτική συνεδρία με λιπιδική AmB. Στην πρώτη από αυτές (Lamothe 2001), αμέσως μετά τη λήξη της θεραπείας με AmB δόθηκε αλλοπουρινόλη στο δοσολογικό σχήμα των 20 mg/kg ΣΒ, από το στόμα, ημερησίως για 7 ημέρες κάθε μήνα, που θα μπορούσε ενδεχομένως να προλάβει τις υποτροπές (Ginel και συν. 1998, Saridomichelakis και συν. 2005b). Για καθαρά συγκριτικούς λόγους, αν συμπεριληφθούν και τα 7 ζώα της μελέτης μας, στα οποία η PCR βρέθηκε αρνητική στο χρόνο 2 της μελέτης ύστερα από 5 μήνες χορήγησης αλλοπουρινόλης σε καθημερινή βάση (χρόνος 2), το συνολικό ποσοστό της παρασιτολογικής ίασης ανέρχεται στο 21,4%. Επειδή στη ΛΣ η μονοθεραπεία με

115

αλλοπουρινόλη σπάνια οδηγεί σε παρασιτολογική ίαση (Alvar και συν. 1994, Cavaliero και συν. 1999, Koutinas και συν. 2001), το παραπάνω ποσοστό θα πρέπει να αποδοθεί στη δράση της AmB. Η μεγάλη διαφορά, ακόμη και έπειτα από τη «διόρθωση» του ποσοστού της παρασιτολογικής ίασης, με τα πολύ υψηλότερα ποσοστά των άλλων μελετών με λιπιδική AmB (Lamothe 2001: 82,2%, Cortadellas 2003: 87,5%) θα μπορούσε να αποδοθεί στο υψηλό ψευδώς θετικό ποσοστό λόγω της εργαστηριακής «μόλυνσης» του δείγματος στο δικό μας εργαστήριο ή αντίθετα, στο υψηλό ψευδώς αρνητικό ποσοστό, από λήψη ανεπαρκούς δείγματος (π.χ. αιμοβρίθεια μυελού των οστών) στο δικό τους (Serrei Veterinari de Genetica Mollecular, UAB Bella-terra, Barcelona – Spain). Τελευταία, υποστηρίζεται ότι η ευαισθησία της PCR στο μυελό των οστών υπολείπεται εκείνης στο δέρμα και τον επιπεφυκότα ενώ η ευρεία διακύμανση του ποσοστού του ψευδούς θετικού ή αρνητικού αποτελέσματος, οφείλεται στις μεταξύ των εργαστηρίων διαφορές ως προς την τεχνική και τη μεθοδολογία που εφαρμόζονται (Solano – Gallego και συν. 2001b), αφού το αποτέλεσμα μπορεί να επηρεαστεί από τον τρόπο εκχύλισης του DNA, την πηγή του DNA, την επιλογή των εκκινητών και το είδος του ιστού – δείγματος (Lachaud και συν. 2002, Reithinger και συν. 2003, Muller και συν. 2003). Παρά τα αρνητικά αυτά σημεία, η αξιοπιστία της PCR εξακολουθεί να είναι ευρύτατα αποδεκτή από την επιστημονική κοινότητα, όχι μόνο για τη διάγνωση των ορολογικά αρνητικών ή/και ιδιαίτερα των ασυμπτωματικών ζώων (Leontides και συν. 2002), αλλά και για την αξιολόγηση της παρασιτολογικής ίασης ύστερα από αντιλεϊσμανιακή θεραπεία (Manna και συν. 2004) καθώς και για τις επιζωοτιολογικές έρευνες (Lontides και συν. 2002, Lachaud και συν. 2002).

116

Ο τίτλος των ειδικών αντισωμάτων (IFAT) προσδιορίστηκε και στους τρεις χρόνους της μελέτης και η μείωσή του ήταν σημαντική, χωρίς ωστόσο να γίνει αρνητικός τόσο μετά τη θεραπεία με AmB (χρόνος 1) όσο και στο τέλος των 5 μηνών που ακολούθησαν (χρόνος 2). Οι Oliva και συν. (1995) παρακολούθησαν τον τίτλο αυτό 0, 2, 4, 6 και 8 μήνες μετά το τέλος της θεραπείας με λιποσωμική AmB, χωρίς όμως να διαπιστώσουν σημαντική μείωση. Μόνο σε ένα από τα ζώα τους ο τίτλος έγινε αρνητικός 2 μήνες μετά το τέλος της θεραπείας, όπως εξάλλου και στη δική μας περίπτωση (Γ11) μετά όμως το τέλος της θεραπείας με αλλοπουρινόλη (χρόνος 2). Σε ανάλογες κλινικές μελέτες στις οποίες χρησιμοποιήθηκε η αλλοπουρινόλη (Koutinas και συν. 2001, Πλευράκη 2003) ή συνδυασμός της με αντιμονιούχο μεγλουμίνη (Denerolle και Bourdoiseau 1999), η μείωση του τίτλου ήταν σημαντική, χωρίς όμως αυτός να γίνεται αρνητικός στην πλειονότητα των ζώων. Σε άλλη μελέτη, στην οποία και πάλι χορηγήθηκε αλλοπουρινόλη, η τιμή της ειδικής ELISA δε μεταβλήθηκε κατά τη διάρκεια και μετά το τέλος της θεραπείας, και παρέμεινε υψηλή για μεγάλο χρονικό διάστημα μετά την υποχώρηση των συμπτωμάτων (Cavalliero και συν. 1999). Συνεπώς, με τις συνήθεις στην πράξη ορολογικές εξετάσεις (IFAT, ELISA) δεν μπορεί να αξιολογηθεί το κλινικό και αντιλεϊσμανιακό θεραπευτικό αποτέλεσμα, αφού ο τίτλος εξακολουθεί να παραμένει θετικός ακόμη και μετά την κλινική ίαση του ζώου (Gradoni 1999). Στα 5 ζώα που βρέθηκαν αρνητικά με την PCR (περιστ. Α5, Β1, Β5, Β8, Β10) στο χρόνο 1 δε χορηγήθηκε αλλοπουρινόλη μέχρι το τέλος της μελέτης (χρόνος 2). Στο διάστημα όμως των 5 μηνών που μεσολάβησε τα 4 από αυτά (περιστ. Β1, Β5, Β8, Β10) βρέθηκαν και πάλι θετικά στην PCR. Ενώ και τα 5 ζώα εξακολουθούσαν να παραμένουν ορολογικά θετικά και στους δύο χρόνους της μελέτης, μόνο δύο από αυτά (Β1, Β10)

117

παρουσίασαν κλινική επιδείνωση με ταυτόχρονη παρουσία των αμαστιγοφόρων μορφών του παρασίτου στην άμεση μικροσκοπική εξέταση των λεμφογαγγλίων και του μυελού των οστών. Η υποτροπή αυτή θα μπορούσε να αποδοθεί στην επαναμόλυνση των ζώων, αφού είναι γνωστό ότι η κυτταρική ανοσοκαταστολή στη ΛΣ ανακάμπτει μόνο παροδικά ύστερα από θεραπεία με λιπιδική AmB (Moreno και συν. 1999). Στις άλλες μελέτες η νόσος υποτροπίασε ακόμη και σε αρνητικά στην PCR ζώα μετά το τέλος της θεραπείας με λιπιδική AmB (Lamothe 2001, Cortadellas 2003). Αμέσως μετά το τέλος της θεραπείας με AmΒ, και στους 5 σκύλους τοποθετήθηκε περιλαίμιο με δελταμεθρίνη (Scalibor®), η εντομοαπωθητική δράση της οποίας υποστηρίζεται ότι εξασφαλίζει αρκετά ικανοποιητικό προληπτικό αποτέλεσμα (Reithinger και συν. 2001). Επιπλέον, στα ζώα Β1, Β5, Β10, και μεταξύ των χρόνων 1 και 2 της μελέτης, μεσολάβησε η ψυχρή περίοδος (Νοέμβριος – Μάρτιος) κατά την οποία η δραστηριότητα των φλεβοτόμων είναι μηδαμινή (Killick-Kendrick και Killick-Kendrick 1999, Χαραλαμπίδης 1998). Στη ΛΣ, δεν μπορεί να αποκλειστεί η πιθανότητα ψευδώς αρνητικού αποτελέσματος, ιδιαίτερα κατά τον έλεγχο ζώων που υποβλήθηκαν σε αντιλεϊσμανιακή θεραπεία (Lamothe 2001), αφού είναι γνωστό ότι η ευαισθησία της PCR στο μυελό των οστών υστερεί σε σχέση με το δέρμα και τον επιπεφυκότα (Solano-Gallego και συν. 2001b). Όμως, σε ασθενείς με σπλαχνική λεϊσμανίωση (L. donovani), που υποβλήθηκαν σε αντιλεϊσμανιακή θεραπεία με αντιμονιούχα και ιάθηκαν κλινικά, η PCR στα λεμφογάγγλια ήταν αρνητική σε όλα εκείνα τα περιστατικά που δεν παρουσίασαν μελλοντικές υποτροπές (Osman και συν. 1997). Η μη εξουδετέρωση της L. infantum στους οφθαλμούς (Ferrer και συν. 1988, Garcia-Alonso και συν. 1996) στους οποίους η AmB παρουσιάζει ελάχιστη ως μηδαμινή διείσδυση (Rubin 1986) θα μπορούσε να εξηγήσει την υποτροπή, ιδιαίτερα στα

118

περιστατικά Β1 και Β10, τα οποία στη συνέχεια παρουσίασαν κερατίτιδα και ιριδοκυκλίτιδα (ραγοειδίτιδα), αντίστοιχα. Αν και για λόγους ευζωΐας και ιατρικής δεοντολογίας η αλλοπουρινόλη θα έπρεπε να είχε δοθεί και στους 5 PCR-αρνητικούς σκύλους (Lamothe 2001), η περί του αντιθέτου απόφαση ξεκίνησε από την επιθυμία εξακρίβωσης της διάρκειας του αντιπαρασιτικού αποτελέσματος της AmB. Εξάλλου, η κλινική επιδείνωση και παρασιτολογική επαναθετικοποίηση που παρουσίασαν 7/45 (15,6%) και 6/45 (13,3%) ζώα, αντίστοιχα, θα μπορούσε να αποδοθεί στη λεϊσμανιοστατική και όχι λεϊσμανιοκτόνο δράση της αλλοπουρινόλης. Υποτροπές διαπιστώθηκαν και σε ανάλογες κλινικές μελέτες, στις οποίες χρησιμοποιήθηκε μόνο αλλοπουρινόλη (Koutinas και συν. 2001, Πλευράκη 2003). Η συνέχιση της αντιλεϊσμανιακής θεραπείας με αλλοπουρινόλη έγινε για λόγους ευζωΐας και ιατρικής δεοντολογίας επειδή όλοι σχεδόν οι ιδιοκτήτες στους οποίους κοινοποιήθηκε το αποτέλεσμα

της παρασιτολογικής

εξέτασης

επιθυμούσαν τη συνέχιση της θεραπευτικής προσπάθειας. Η ίδια λογική και απαίτηση επέβαλλε τελικά τη μη χρησιμοποίηση εικονικού φαρμάκου (λιπίδια παρεντερικής διατροφής) στην ενδεχόμενη ομάδα μαρτύρων. Όμως, σε μελέτη που έγινε στην ίδια Κλινική με αλλοπουρινόλη (Πλευράκη 2003) δε διαπιστώθηκε κλινική, εργαστηριακή, παρασιτολογική ή παθολογοανατομική βελτίωση στα ζώα της ομάδας του εικονικού φαρμάκου, γεγονός που σαφώς υποδηλώνει ότι η πιθανότητα αυτοΐασης στη ΛΣ είναι ελάχιστη ως μηδαμινή. Άλλος παράγοντας που ενδεχομένως θα μπορούσε να εξηγήσει το χαμηλό ποσοστό της παρασιτολογικής ίασης στην παρούσα μελέτη είναι το δοσολογικό σχήμα της λιπιδικής AmB. Επειδή η κλινική και παρασιτολογική ανταπόκριση στη θεραπεία με

119

AmB στη ΛΣ ενδέχεται να επηρεαστεί από τη συνολική δόση (Oliva και συν. 1995), η συνέχιση των συνεδριών ή η αύξηση της δόσης σε κάθε συνεδρία πιθανόν να βελτίωνε το ποσοστό της παρασιτολογικής ίασης. Η συνολική όμως δόση ήταν μέσα στα συνιστώμενα όρια των 8 – 26 mg/kg ΣΒ (Baneth και Shaw 2002) και επιπλέον, ο μέσος όρος στις άλλες δύο μελέτες με λιπιδική AmB ήταν 12,5 mg/kg ΣΒ (Lamothe 2001) και 13,45 mg/kg ΣΒ (Cortadellas 2003). Στη μελέτη των Oliva και συν. (1995) ο μέσος όρος της συνολικής δόσης της λιποσωμικής AmB ήταν 10,7 mg/kg ΣΒ ενώ σ’ εκείνη του Lamothe (1997) με την υδατοδιαλυτή μορφή της AmB, ήταν 10 mg/kg ΣΒ. Την υιοθέτηση της δόσης των 12 mg/kg ΣΒ επέβαλε η ανάγκη καθιέρωσης ενός αποτελεσματικού θεραπευτικού σχήματος, ανάλογου με εκείνο της συνηθέστερα χρησιμοποιούμενης αντιμονιούχου μεγλουμίνης (100 mg/kg ΣΒ, υποδόρια, ημερησίως, x 3 – 4 εβδομάδες), με συγκεκριμένη διάρκεια (ένας μήνας), μικρότερο κόστος και το σπουδαιότερο, τις λιγότερες δυνατόν ανεπιθύμητες ενέργειες. Το χαμηλό ποσοστό παρασιτολογικής ίασης με τα υφιστάμενα αντιλεϊσμανιακά φάρμακα, που διαπιστώθηκε και στη δική μας έρευνα, σε συνδυασμό με την αμφισβητούμενη αξία των προληπτικών μέτρων (εμβόλια, εντομοαπωθητικά) θα συνηγορούσαν υπέρ της μαζικής θανάτωσης των μολυσμένων σκύλων για την εκρίζωση της νόσου από τις ενζωοτικές περιοχές (Slappendel και Ferrer 1998, Miles και συν. 1999), όπως εξάλλου προτείνεται από τον Παγκόσμιο Οργανισμό Υγείας και τη σχετική ελληνική νομοθεσία (World Health Organization 1984, βλ. Σαριδομιχελάκης και Κουτίνας 2002). Ωστόσο, η συμμετοχή και άλλων ζωικών ειδών στη δεξαμενή της L. infantum στη φύση και ο σχετικά μεγάλος αριθμός των μολυσμένων αλλά ορολογικά αρνητικών (Leontides και συν. 2002) καθώς και των αδέσποτων σκύλων περιορίζουν

120

σημαντικά την αποτελεσματικότητα του μέτρου αυτού αντιμετώπισης της ΛΣ στην Ελλάδα, όπως άλλωστε αποδείχτηκε σε άλλες ενζωοτικές περιοχές που εφαρμόστηκε (Dietze και συν. 1997). Στις χώρες της νότιας Ευρώπης και το Ισραήλ, προτείνεται και εφαρμόζεται σε ευρεία κλίμακα η θεραπεία των συμπτωματικών και ασυμπτωματικών σκύλων με απώτερη επιδίωξη την παρασιτολογική ίαση, οπωσδήποτε ύστερα από προηγούμενη ενημέρωση για τις περιορισμένες πιθανότητες επίτευξης του στόχου αυτού και τη διάρκεια, το κόστος και τις ανεπιθύμητες ενέργειες της θεραπευτικής αγωγής (Slappendel και Ferrer 1998, Σαριδομιχελάκης και Κουτίνας 2002, Baneth και Shaw 2002). Οι ιδιοκτήτες και των 56 σκύλων ενημερώθηκαν πλήρως πάνω σε όλα τα παραπάνω δεδομένα και προβληματισμούς πριν δώσουν τη συγκατάθεσή τους για τη θεραπευτική προσπάθεια με AmB και τη συνέχισή της με αλλοπουρινόλη. Οι ανεπιθύμητες ενέργειες που παρατηρήθηκαν κατά τη διάρκεια της θεραπείας με τη λιπιδική AmB ήταν η πολυουρία – πολυδιψία (91,1%), ο έμετος (10,7%) και ο γενικευμένος μυϊκός τρόμος (42,8%). Θρομβοφλεβίτιδα, μυαλγία και αναφυλακτικές αντιδράσεις, που αναφέρεται ότι συνδέονται με τη χορήγηση της AmB (Maddux και Barriere 1980, Rubin 1986, Plumb 2005), δεν εμφανίστηκαν σε κανέναν από τους 56 σκύλους. Οι Lamothe (2001) και Cortadellas (2003) παρατήρησαν μόνο έμετο ή/και ανορεξία σε 15/19 (78,9%) και 13/16 (81,2%) σκύλους, αντίστοιχα. Στα δικά μας ζώα, ο έμετος εκτός από το σαφώς μικρότερο ποσοστό εμφάνισής τους (10,7%) δε συνοδευόταν από μείωση της όρεξης ή ανορεξία. Αντίθετα, στα ζώα που παρουσίαζαν τη διαταραχή αυτή εξαιτίας της ΛΣ, η όρεξη επανερχόταν αμέσως μετά την έναρξη της θεραπείας με AmB. Οι Οliva και συν. (1995) δε διαπίστωσαν καμία ανεπιθύμητη ενέργεια από τη χορήγηση της λιποσωμικής AmB. Η πολυουρία – πολυδιψία που παρατηρήθηκαν στη

121

μεγάλη πλειονότητα των περιστατικών καθόλη τη διάρκεια της θεραπείας είναι αποτέλεσμα της νεφροτοξικότητας της AmB και οφείλεται στη μείωση της ευαισθησίας της κυτταρικής μεμβράνης των επιθηλιακών κυττάρων των εγγύς σπειροειδών σωληναρίων στη δράση της αντιδιουρητικής ορμόνης (Rubin 1986). Ο γενικευμένος μυϊκός τρόμος πιθανότατα οφειλόταν στην πριν από τη χορήγηση της AmB ενδοφλέβια έγχυση μεγάλης ποσότητας φυσιολογικού ορού (50 ml/kg ΣΒ) και μαννιτόλης (10 mg/kg ΣΒ) που διατηρούνταν σε θερμοκρασία δωματίου (20o C). Το σύμπτωμα αυτό αποδείχθηκε ότι δεν οφειλόταν στον πυρετό (φυσιολογική θερμοκρασία) που εξάλλου διαπιστώθηκε σε ένα μόνο περιστατικό άλλης μελέτης (Lamothe 2001). Ο μεγάλος αριθμός των θεραπευτικών συνεδριών που αναβλήθηκαν (συνολικά 141 συνεδρίες), λόγω της υπερκρεατινιναιμίας (>2,5 mg/100 ml) αύξησε αρκετά τη συνολική διάρκεια της θεραπείας με AmB (μέσος όρος: 36,5 ημέρες). Η ανεπιθύμητη αυτή ενέργεια παρατηρήθηκε μόνο μία φορά στη μελέτη του Lamothe (2001) και 4 σ’ εκείνη του Cortadellas (2003), ενδεχομένως επειδή ξεκίνησαν με λίγο χαμηλότερη δόση (μέσος όρος: 1,2 mg/kg ΣΒ) και την οποία στη συνέχεια αυξομείωναν ανάλογα με τη συγκέντρωση της κρεατινίνης στο ορό του αίματος πριν από κάθε συνεδρία, χωρίς να λαμβάνεται υπόψη το όριο των 2,5 mg/100 ml· επιπλέον, οι συνεδρίες αναβάλλονταν για 10 – 20 ημέρες. Αντίθετα, στη δική μας έρευνα η δόση της κάθε συνεδρίας ήταν σταθερή (1,5 mg/kg ΣΒ), όπως και η ανώτερη επιτρεπόμενη συγκέντρωση της κρεατινίνης (2,5 mg/100 ml), ενώ το μεταξύ των προγραμματισμένων συνεδριών χρονικό διάστημα δεν ξεπερνούσε τις 6 ημέρες. Η αυξημένη νεφροτοξικότητα θα μπορούσε να οφείλεται στο σχετικά γρήγορο ρυθμό της ενδοφλέβιας χορήγησης (20 – 30 min) της AmB, με τη σύριγγα, σε σύγκριση με τη μεγαλύτερη διάρκεια έγχυσης (30 – 60 min) και τη

122

χρησιμοποίηση αντλίας έγχυσης στις προηγούμενες μελέτες. Στον άνθρωπο και το σκύλο, η νεφροτοξικότητα και η εμφάνιση ανεπιθύμητων ενεργειών βρέθηκε ότι ήταν ανάλογες με το ρυθμό χορήγησης της ΑmB (Rubin και συν. 1989, Ellis και συν. 1992). Συγκεκριμένα, το ευεργετικό αποτέλεσμα συνδέεται με τη συνεχή και βραδεία έγχυση του φαρμάκου (Eriksson και συν. 2001). Τέλος, θα ήταν σκόπιμο να αναφερθεί ότι αν και ο αρχικός αριθμός των ζώων της μελέτης ήταν 59, τα 3 από αυτά δεν ολοκλήρωσαν τη θεραπεία, επειδή η υπερκρεατινιναιμία (>2,5 mg/100 ml) επέμενε ακόμη και ύστερα από 4 συνεχόμενες συνεδρίες και ενώ ήδη είχαν λάβει τη συνολική δόση των 3, 4,5 και 6 mg/kg ΣΒ της λιπιδικής AmB. Αν και στα τρία ζώα η συγκέντρωση της κρεατινίνης επανήλθε μέσα στα φυσιολογικά όρια 1 – 2 μήνες μετά τη διακοπή της θεραπείας με AmB, οι ιδιοκτήτες τους δεν επιθυμούσαν τη συνέχιση της θεραπείας με το φάρμακο αυτό απαιτώντας άλλη εναλλακτική λύση. Στη μελέτη του Lamothe (2001) 2 ζώα δεν ολοκλήρωσαν τη θεραπεία λόγω ξαφνικού θανάτου, που ωστόσο δεν επιβεβαιώθηκε ότι οφείλεται στην AmB. Στον άνθρωπο η λιπιδική AmB ήταν λιγότερο νεφροτοξική σε σύγκριση με την υδατοδιαλυτή μορφή, στις πέντε από τις οκτώ μελέτες στις οποίες το φάρμακο δόθηκε για διάφορους θεραπευτικούς λόγους (Moreau και συν. 1992, Chavanet και συν. 1992, Caillot και συν. 1994, Sorkine και συν. 1996, Joly και συν. 1996).

ΔΕΥΤΕΡΟ ΣΚΕΛΟΣ ΤΗΣ ΜΕΛΕΤΗΣ

Ο εκ προοιμίου αποκλεισμός των συχνότερων αρθροποδογενών λοιμωδών και παρασιτικών νοσημάτων του σκύλου στην Ελλάδα (Κοντός και Κουτίνας 1990, Kontos και συν. 1991, Kontos και Koutinas 1997, Polizopoulou και συν. 2000, Mylonakis και 123

συν. 2003), που θα μπορούσαν να προκαλέσουν χρόνια σπειραματονεφρίτιδα από ανοσοσύμπλοκα (Vaden 2005), στηρίχθηκε στο αρνητικό αποτέλεσμα των ορολογικών εξετάσεων (διροφιλαρίωση, μονοκυτταρική από E. canis ερλιχίωση) και της άμεσης μικροσκοπικής εξέτασης του αίματος (buffy coat) και των επιχρισμάτων από λεμφογάγγλια και μυελό των οστών (μονοκυτταρική ερλιχίωση, πιροπλάσμωση, ηπατοζωονόσος). Επιπλέον, και οι 56 σκύλοι είχαν εμβολιαστεί κατά της νόσου του Carré, της λοιμώδους ηπατίτιδας, της λεπτοσπείρωσης, της λύσσας και της παρβοΐωσης και δεν παρουσίαζαν κάποιο άλλο νόσημα ή παθολογική κατάσταση που επίσης θα μπορούσε

να

προκαλέσει

σπειραματονεφρίτιδα

ή

σπειραματοπάθεια,

διαμεσοσωληναριακή νεφρίτιδα ή πρωτεϊνουρία άλλης προέλευσης (Forrester και Lees 1995, Grauer και DiBartola 2000). Αν και η γενικευμένη και συνήθως έντονου βαθμού εν τω βάθει σταφυλοκοκκική δερματίτιδα στο σκύλο μπορεί να προκαλέσει σπειραματονεφρίτιδα από ανοσοσύμπλοκα (Grauer και DiBartola 2000, Vaden 2005) οι σκύλοι με την επιπλοκή αυτή (15/56 – 26,8%) δεν αποκλείστηκαν από τη μελέτη και δεν υποβλήθηκαν σε συστηματική αντιβιοθεραπεία επειδή οι αλλοιώσεις ήταν ήπιου βαθμού και εντοπισμένες και ανταποκρίθηκαν στην τοπική αντισηπτική θεραπεία. Σε αντίθετη περίπτωση θα μεταβαλλόταν η φαρμακευτική ομοιογένεια της μελέτης. Η αυξημένη συχνότητα των βακτηριδιακών λοιμώξεων στη σπλαχνική λεϊσμανίωση του ανθρώπου, και ιδιαίτερα στο ουροποιητικό σύστημα και το δέρμα (Koutinas και συν. 1993, Sarker και συν. 2003) πιθανότατα οφείλεται στην καταστολή της κυτταρικής ανοσίας (Ferrer 1999, Moreno και συν. 1999).

124

Η καλλιέργεια των ούρων για αερόβια βακτηρίδια έγινε και στους 3 χρόνους της μελέτης για να αποκλειστεί η πιθανότητα ασυμπτωματικής ουρολοίμωξης που σύμφωνα με την κλινική μας εμπειρία δεν είναι σπάνια σε περιστατικά με ΛΣ. Η πρόκληση μη νεφρικής πρωτεϊνουρίας σε μια τέτοια περίπτωση θα προκαλούσε σύγχυση ως προς την εκτίμηση της πρωτεϊνουρίας διήθησης που παρουσίαζαν οι ομάδες Β και Γ (Finco 1995c). Το αρνητικό αποτέλεσμα των καλλιεργειών συμφωνούσε με εκείνο της μικροσκοπικής

εξέτασης

του

ιζήματος

των

ούρων

(απουσία

πυουρίας

και

βακτηριδιουρίας). Η διαπίστωση σε ορισμένα ζώα μικροσκοπικής αιματουρίας (χρόνος 0: 5/56 – 8,9%) και υελοκοκκιώδους – κοκκιώδους κυλινδρουρίας (χρόνος 0: 7/56 – 12,5%) ήταν απόλυτα συμβατή με τη σπειραματονεφρίτιδα – διαμεσοσωληναριακή νεφρίτιδα της ΛΣ (Vaden 2005, Plevraki και συν. 2006). Στο σκύλο, μικροσκοπική αιματουρία στη σπειραματονεφρίτιδα εμφανίζεται σπανιότερα απ’ ό,τι στον άνθρωπο (Greenberg 2001) και στην οποία τα ερυθρά αιμοσφαίρια εμφανίζονται παραμορφωμένα (Vaden 2005) όπως διαπιστώθηκε στα ζώα εκείνα που παρουσίαζαν μικροσκοπική αιματουρία. Τέλος, κανένας από τους σκύλους της ομάδας Α δεν παρουσίαζε συμπτώματα ή εργαστηριακά ευρήματα από το αίμα και τα ούρα που να υποδηλώνουν την παρουσία χρόνιας νεφρίτιδας ή νεφροπάθειας γενικότερα, άλλης αιτιολογίας. Στο χρόνο 0, η χαμηλότερη του φυσιολογικού (<3,6 ml/min/kg ΣΒ) τιμή του ΡΣΔ σε 6 σκύλους της ομάδας Α, 4 της Β και 6 της Γ (σύνολο 16), που τελικά ολοκλήρωσαν τη μελέτη, θα μπορούσε να υποδηλώνει αρχόμενη ή υποκλινική νεφρική ανεπάρκεια, χωρίς όμως να αποκλείεται η πιθανή επίδραση του σωματικού βάρους των μεγαλόσωμων σκύλων στον υπολογισμό του ΡΣΔ. Όπως ήταν αναμενόμενο, αμέσως μετά το τέλος της θεραπείας με AmB (χρόνος 1), η τιμή του ΡΣΔ έπεσε κάτω από 3,6

125

ml/min/kg ΣΒ και στα 56 ζώα, προφανώς λόγω της νεφροτοξικής της δράσης. Στο σημείο αυτό θα πρέπει να τονιστεί ότι η απουσία σημαντικής διαφοράς μεταξύ των χρόνων 0 και 1, ως προς την κυλινδρουρία των πρωτεϊνουρικών ομάδων Β και Γ, δείχνει με έμμεσο τρόπο ότι η νεφροτοξική δράση της AmB εκφράστηκε με τη σπειραματική υπέρταση και όχι με την εκφύλιση και νέκρωση των επιθηλιακών κυττάρων των νεφρικών σωληναρίων (Rubin 1986, Wolf και Troy 1995, Deray 2002). Στο τέλος όμως της μελέτης (χρόνος 2), στους 9 από τους 16 παραπάνω σκύλους (56,2%), ο ΡΣΔ επανήλθε στα φυσιολογικά επίπεδα ενώ στους 7/16 (43,8%) εξακολουθούσε να παραμένει χαμηλότερος των 3,6 ml/min/kg ΣΒ. Η μείωση της συγκέντρωσης της κρεατινίνης και του SUN στα ζώα της ομάδας Β, μεταξύ των χρόνων 1 και 2, δεν ήταν σημαντική, αν και στις μεταξύ των ομάδων συγκρίσεις για τους χρόνους αυτούς δε διαπιστώθηκε διαφορά. Η εμφάνιση 2ου σταδίου χρόνιας νεφρικής ανεπάρκειας (αζωθαιμία) στο σκύλο Β17 μπορεί να εξηγήσει τη μη σημαντικότητα της μείωσης καθώς οι τιμές των δύο παραπάνω βιοχημικών παραμέτρων ήταν ιδιαίτερα αυξημένες και στο χρόνο 2. Το πιθανότερο είναι ότι το συγκεκριμένο ζώο παρουσίαζε ήπια και υποκλινική νεφρική ανεπάρκεια, αφού ο ΡΣΔ ήταν κάτω από το φυσιολογικό από το χρόνο 0, που προφανώς επιβαρύνθηκε από τη θεραπεία με AmB, για ιδιοσυγκρασικούς λόγους, όπως και στους 3 άλλους σκύλους που δεν περιλήφθηκαν τελικά στη μελέτη. Η έλλειψη σημαντικής διαφοράς μεταξύ των ομάδων Β και Γ αμέσως μετά το τέλος της θεραπείας με AmB (χρόνος 1) αναφορικά με το ΡΣΔ και τη συγκέντρωση της κρεατινίνης και του SUN στον ορό του αίματος φαίνεται να δείχνει ότι η εναλαπρίλη, στη δόση που χρησιμοποιήθηκε, δεν έπαιξε θετικό ή αρνητικό ρόλο στην απεκκριτική

126

λειτουργία των νεφρών. Το ίδιο διαπιστώθηκε και με την αλλοπουρινόλη (χρόνος 2). Η δόση των 0,5 mg/kg ΣΒ, από το στόμα, ημερησίως, της εναλαπρίλης ήταν η χαμηλότερη από τις προτεινόμενες (Grauer και συν. 2000, Cortadellas 2003). Η εμφάνιση αζωθαιμίας από τη χορήγηση εναλαπρίλης λόγω ενδοσπειραματικής υπότασης που παρατηρείται αρκετά συχνά σε σκύλους με συμφορητική καρδιακή ανεπάρκεια (Kittleson 1998) θα μπορούσε να προκαλέσει σύγχυση πάνω στην αξιολόγηση της νεφροτοξικότητας ή καλύτερα της σπειραματοτοξικότητας της λιπιδικής AmB. Αυτός ήταν και ο λόγος της επιλογής της χαμηλής δόσης της εναλαπρίλης. Θα πρέπει ωστόσο να σημειωθεί ότι η φαρμακευτική αυτή αζωθαιμία στους καρδιοπαθείς σκύλους βασικά οφείλεται στη συνεργική δράση των ΑΜΕΑ με τα διουρητικά φάρμακα (Kittleson 1998), αφού σε μελέτη πάνω στην επίδραση της εναλαπρίλης στο χρόνο επιβίωσης σκύλων με ασυμπτωματική

ενδοκάρδωση

της

μιτροειδούς

βαλβίδας,

δεν

παρατηρήθηκαν

αζωθαιμικά επεισόδια (Atkins και συν. 1999). Ενδιαφέρον προκαλεί η διαπίστωση ότι η αύξηση της συγκέντρωσης του φωσφόρου μεταξύ των χρόνων 0 και 1 ήταν σημαντική στα μη πρωτεϊνουρικά (ομάδα Α) και όχι στα πρωτεϊνουρικά ζώα (ομάδες Β και Γ), όπως επίσης και η μείωσή της στις μεταξύ των χρόνων 1 και 2 συγκρίσεις. Το γεγονός αυτό ίσως να έχει στατιστική εξήγηση αφού κανένα ζώο της ομάδας Α δεν παρουσίαζε υπερφωσφαταιμία (>5 mg/100 ml) στο χρόνο 0, σε αντίθεση με εκείνα των ομάδων Β (3/17 – 17,6%) και Γ (2/16 – 12,5%). Στους σκύλους των τελευταίων αυτών ομάδων η υπερφωσφαταιμία, αν αποκλειστεί το εργαστηριακό σφάλμα, πιθανόν οφειλόταν στην ελαφρά αιμόλυση των δειγμάτων, αφού σε καμία περίπτωση δεν ξεπέρασε το όριο των 6,5 mg/kg ΣΒ και κανένα από τα ζώα δεν παρουσίαζε κλινικές και εργαστηριακές (πλην του ΡΣΔ) ενδείξεις

127

νεφρικής ανεπάρκειας (Bush 1991). Κατά συνέπεια, η σημαντική ή μη σημαντική αυξηση και στη συνέχεια μείωση στα φυσιολογικά όρια της συγκέντρωσης του Ρ προφανώς οφειλόταν στη μείωση της απεκκριτικής λειτουργίας των νεφρών από την AmB. Τέλος, αν και φαίνεται ότι υπάρχει κάποια σχέση μεταξύ της υπερφωσφαταιμίας και της πρωτεϊνουρίας, δεν μπόρεσε να βρεθεί κάποια εξήγηση, παρά τη διεξοδική διερεύνηση της σχετικής βιβλιογραφίας. Στην πρωτεϊνουρική ομάδα Γ (AmB + εναλαπρίλη), η συνολική διάρκεια της θεραπείας με AmB και ο αριθμός των θεραπευτικών συνεδριών ήταν μικρότεροι σε σχέση με τη Β, γεγονός που δείχνει τη μάλλον ήπια νεφροπροστατευτική δράση της εναλαπρίλης, αφού δεν μπόρεσε να αποτρέψει τη νεφροτοξική δράση της AmB στα αγγειώδη σπειράματα, όπως φάνηκε από τη μη σημαντική διαφορά στη μείωση του ΡΣΔ και του ειδικού βάρους των ούρων και στην αύξηση της συγκέντρωσης της κρεατινίνης και της SUN στον ορό του αίματος. Η σημαντική όμως αύξηση του ΡΣΔ και του ειδικού βάρους των ούρων μεταξύ των χρόνων 1 και 2 και στις τρεις ομάδες σε συνδυασμό με τη μη διαπίστωση διαφορών μεταξύ τους δείχνει ότι η θεραπεία με λιπιδική AmB προκαλεί παροδική μείωση της απεκκριτικής λειτουργίας των νεφρών, ανεξάρτητα από την παρουσία πρωτεϊνουρίας ή τη χορήγηση εναλαπρίλης. Ωστόσο, με την υδατοδιαλυτή μορφή της AmB έχουν παρατηρηθεί μόνιμου χαρακτήρα αλλοιώσεις στους νεφρούς (π.χ. σπειραματοσκλήρυνση, διαμεσοσωληναριακή ίνωση), που μειώνουν την απεκκριτική λειτουργία στο σκύλο και τον άνθρωπο (Bell και συν. 1962, Rubin 1986, Deray 2002). Η προσθήκη εναλαπρίλης στην αντιλεϊσμανιακή αγωγή των σκύλων της ομάδας Γ δε μείωσε περισσότερο την πρωτεϊνουρία σε σύγκριση με την ομάδα Β, στην οποία χορηγούνταν μόνο η λιπιδική AmB (χρόνος 1). Κατά συνέπεια, η σημαντική

128

μείωση της πρωτεϊνουρίας στη χρόνια σπειραματονεφρίτιδα της ΛΣ βασικά οφείλεται στην αντιλεϊσμανιακή δράση της AmB μέσω της εντυπωσιακής μείωσης του παρασιτικού φορτίου (αντιγοναιμία L. infantum) και πιθανότατα εκείνης των ολικών πρωτεϊνών και των σφαιρινών στον ορό του αίματος που διαπιστώθηκαν στο χρόνο 1 σε όλες τις ομάδες. Εντύπωση προκαλεί επίσης το γεγονός ότι σε ανάλογη μελέτη με αλλοπουρινόλη το ίδιο ακριβώς παρατηρήθηκε στην ομάδα των σκύλων με ΛΣ και ασυμπτωματική πρωτεϊνουρία (Plevraki και συν. 2006). Η ταυτόχρονη μείωση της απεκκριτικής λειτουργίας των νεφρών και του βαθμού πρωτεϊνουρίας θα μπορούσε να αποδοθεί στην πιθανή εγκατάσταση σπειραματοσκλήρυνσης σε πολλά νεφρικά σωμάτια (D’Amico και Bazi 2003, Zatelli και συν. 2003, Plevraki και συν. 2006), που μπορεί να οδηγήσει σε μείωση του ΡΣΔ (Jaenke και Allen 1986, Grauer 2005) ή στο συνδυασμό της αντιλεϊσμανιακής με την σπειραματοτοξική δράση της AmB, όπως αναφέρθηκε παραπάνω. Η άποψή μας κλίνει υπέρ της δεύτερης εκδοχής, αν ληφθεί υπόψη ότι η απεκκριτική λειτουργία των νεφρών αποκαταστάθηκε προοδευτικά μετά το τέλος της θεραπείας με AmB ακόμη και σε αρκετά από τα ζώα εκείνα (9/16) στα οποία ο ΡΣΔ ήταν παθολογικός πριν από την έναρξη της μελέτης. Στη μελέτη του Cortadellas (2003) με λιπιδική AmB, η ταυτόχρονη χορήγηση βεναζεπρίλης σε συνδυασμό με τροφή χαμηλής περιεκτικότητας σε χλωριούχο νάτριο και πρωτεΐνες (κλινικό σιτηρέσιο για νεφροπαθείς σκύλους), σε 4 ζώα με ΛΣ και μέτριου ως έντονου βαθμού πρωτεϊνουρία (4/4) και αρτηριακή υπέρταση (3/4), μείωσε τον Up/c κάτω από 1 (3/4) και αποκατάστησε την αρτηριακή πίεση στο φυσιολογικό (4/4), δύο εβδομάδες μετά την έναρξη της θεραπείας. Η μη μέτρηση της αρτηριακής πίεσης στα ζώα της παρούσας έρευνας δε θα μπορούσε να χαρακτηριστεί σοβαρή παράλειψη αν

129

ληφθεί υπόψη ότι στον άνθρωπο η επίδραση των ΑΜΕΑ στην ενδοσπειραματική πίεση και τη μείωση της πρωτεϊνουρίας είναι ανεξάρτητη από την αρτηριακή πίεση (Song και συν. 2003, Kim και συν. 2003) και δεν ήταν στους στόχους της μελέτης η διερεύνηση του συσχετισμού αρτηριακής πίεσης, πρωτεϊνουρίας και ΑΜΕΑ. Η μη σημαντική διαφορά της πρωτεϊνουρίας μεταξύ των χρόνων 1 και 2 στις ομάδες Β και Γ αλλά και στη μεταξύ τους σύγκριση στο χρόνο 2, δείχνει ότι η εναλαπρίλη δεν τη βελτιώνει ιδιαίτερα ακόμη και στην περίπτωση που η αντιλεϊσμανιακή θεραπεία συνεχίζεται με αλλοπουρινόλη. Επισημαίνεται ότι σε ζώα με ΛΣ και ασυμπτωματική πρωτεϊνουρία στα οποία χορηγήθηκε μόνο αλλοπουρινόλη και κοινή τροφή για σκύλους (Plevraki και συν. 2006),

σε ζώα με ιδιοπαθή

σπειραματονεφρίτιδα, στα οποία δόθηκε εναλαπρίλη και κλινικό σιτηρέσιο για νεφροπαθείς σκύλους (Grauer και συν. 2000) και σε σκύλους της φυλής Samoyed με κληρονομική νεφρίτιδα στους οποίους χορηγήθηκαν εναλαπρίλη και κοινή τροφή για σκύλους (Grodecki και συν. 1997), διαπιστώθηκε σημαντική μείωση της πρωτεϊνουρίας (λόγος Up/c). Στη δική μας περίπτωση φαίνεται ότι το αντιλεϊσμανιακό αποτέλεσμα της θεραπείας με AmB, που προηγήθηκε (βλέπε απεκκριτική λειτουργία των νεφρών), ήταν τέτοιο ώστε δεν άφησε πολλά περιθώρια για σημαντική παραπέρα μείωση της πρωτεϊνουρίας ύστερα από την προσθήκη εναλαπρίλης. Ίσως θα ήταν ενδιαφέρον να αναφερθεί ότι μόνο σε ένα σκύλο της τελευταίας ομάδας (περιστ. Γ3) η τιμή του Up/c έπεσε κάτω από 0,5 στο χρόνο 2. Στα υπόλοιπα ζώα η πρωτεϊνουρία παρέμεινε παθολογική όπως εξάλλου και στη μελέτη των Plevraki και συν. (2006), ενδεχομένως λόγω της μη ανταπόκρισης της από ανοσοσύμπλοκα σπειραματονεφρίτιδας στην αντιλεϊσμανιακή θεραπεία με AmB και αλλοπουρινόλη.

130

Άλλοι παράγοντες που θα μπορούσαν, συμπληρωματικά ίσως, να εξηγήσουν τη μη σημαντική μείωση της πρωτεϊνουρίας από την εναλαπρίλη είναι η ατομικότητα, ο πολυμορφισμός του γονιδίου MEA, η δόση του φαρμάκου και το είδος της τροφής. Η ιδιοσυγκρασική αντίσταση των ζώων στην αντιπρωτεϊνουρική δράση της εναλαπρίλης είναι ανάλογη με τον τύπο και το βαθμό έντασης των νεφρικών αλλοιώσεων, όπως διαπιστώθηκε σε μελέτη με βάση το πειραματικό πρότυπο νέφρωσης από δοξυρουβικίνη σε επίμυες (Kramer και συν. 2003). Δυστυχώς, στη δική μας περίπτωση δεν υπήρξε ιστοπαθολογική επιβεβαίωση. Πρόσφατα, σε άνδρες με το γενότυπο ID ή ΙΙ του πολυμορφικού γονιδίου ΜΕΑ, που πάσχουν από χρόνιες πρωτεϊνουρικές νεφροπάθειες, βρέθηκε ότι οι ΑΜΕΑ (ραμιπρίλη) δεν απομακρύνουν τον κίνδυνο εξέλιξής τους στο τελικό στάδιο της νεφρικής νόσου και δεν επηρεάζουν σημαντικά την πρωτεϊνουρία και το ΡΣΔ, σε αντίθεση με τις γυναίκες (Ruggenenti και συν. 2000). Αν και στο σκύλο δεν έχουν γίνει ανάλογες έρευνες, δεν μπορεί να αποκλειστεί ένα τέτοιο ενδεχόμενο. Επειδή το αντιπρωτεϊνουρικό αποτέλεσμα της εναλαπρίλης εξαρτάται από τη δοσολογία, όπως αποδείχθηκε σε κλινικές μελέτες με ανθρώπους που έπασχαν από μη διαβητικές νεφροπάθειες και αρτηριακή υπέρταση (Gansevoort και συν. 1994a, Gansevoort και συν. 1994b), η σχετικά χαμηλή δόση των 0,5 mg/kg ΣΒ ημερησίως, που χρησιμοποιήθηκε καθόλη της διάρκεια της μελέτης, θα μπορούσε να εξηγήσει την αποτυχία της φαρμακευτικής αυτής ουσίας να μειώσει περισσότερο την πρωτεϊνουρία. Στη μελέτη των Grauer και συν. (2000) η παραπάνω δόση χορηγήθηκε για έναν μήνα και στη συνέχεια η συχνότητα χορήγησης αυξήθηκε στα 0,5 mg/kg ΣΒ, δύο φορές την ημέρα, στα ζώα εκείνα στα οποία ο Up/c μειώθηκε κάτω από 50%. Αν και αμέσως μετά

131

το τέλος της θεραπείας με AmB (χρόνος 1) αυτό διαπιστώθηκε σε 8/16 (50%) σκύλους της ομάδας Γ, δεν επιχειρήθηκε αύξηση της συχνότητας χορήγησης ή της δόσης της εναλαπρίλης, επειδή στον ίδιο χρόνο ο ΡΣΔ ήταν παθολογικός σε όλα τα ζώα της ίδιας ομάδας και ως εκ τούτου υπήρχε φόβος για την εμφάνιση αζωθαιμίας. Από την άλλη όμως πλευρά, επειδή είναι γνωστό ότι το νεφροπροστατευτικό αποτέλεσμα των ΑΜΕΑ επιτελείται μέσω της μείωσης του βαθμού πρωτεϊνουρίας (Omata και συν. 1999) θα ήταν προτιμότερο να είχε αυξηθεί η δοσολογία της εναλαπρίλης, αφού ο κίνδυνος της αζωθαιμίας περιορίζεται εφόσον δε χορηγούνται και αντιδιουρητικά φάρμακα (π.χ. φουροσεμίδη). Η διατροφή των 33 πρωτεϊνουρικών ζώων (ομάδες Β και Γ) με κοινή βιομηχανοποιημένη τροφή για σκύλους και όχι με κλινικό σιτηρέσιο για νεφροπαθείς σκύλους στην αρχή βασίστηκε στο ότι δε θα ήταν επιθυμητό η χαμηλή σε πρωτεΐνες περιεκτικότητα ενός τέτοιου σιτηρεσίου να μειώσει το βαθμό πρωτεϊνουρίας λόγω συνεργικής δράσης (Ruilope και συν. 1992, de Jong και συν. 1993) και ως εκ τούτου να επηρεάσει το αντιπρωτεϊνουρικό αποτέλεσμα της εναλαπρίλης. Ένας άλλος λόγος που θα μπορούσε να συνηγορήσει υπέρ της μη χρησιμοποίησης τέτοιων τροφών είναι η τυχόν πρόκληση ή επιδείνωση των διαμεσοσωληναριακών αλλοιώσεων και υπερτροφίας του μυϊκού χιτώνα των προσαγωγών αρτηριδίων των νεφρικών σωματίων από τη χαμηλή περιεκτικότητά τους σε χλωριούχο νάτριο, όπως διαπιστώθηκε πρόσφατα σε πειραματική μελέτη με φυσιολογικούς και νεφροπαθείς (νέφρωση από δοξορουβικίνη) επίμυες (Hamming και συν. 2006). Επιπλέον, η ταυτόχρονη χορήγηση AmB και τροφής με χαμηλή περιεκτικότητα σε χλωριούχο νάτριο, αυξάνει την πιθανότητα μείωσης του ΡΣΔ και

της

ροής

του

αίματος

στους

νεφρούς,

μέσω

του

μηχανισμού

της

132

σωληναριοσπειραματικής παλινδρόμησης, και το ενδεχόμενο πρόκλησης ισχαιμικού τύπου αλλοιώσεων στους νεφρούς (Rubin 1986). Η συγκέντρωση των λευκωματινών στον ορό του αίματος αυξήθηκε σημαντικά στα ζώα των ομάδων Β και Γ μεταξύ των χρόνων 0 και 1 (AmB) χωρίς όμως να μεταβληθεί μεταξύ των χρόνων 1 και 2 (αλλοπουρινόλη) ακολουθώντας έτσι την αντίστοιχη μεταβολή του Up/c, σε αντίστροφή όμως πορεία. Η συμμεταβολή αυτή δείχνει ξεκάθαρα ότι η μείωση της πρωτεϊνουρίας αύξησε τη λευκωματιναιμία, όπως διαπιστώθηκε και σε άλλη μελέτη με σκύλους που παρουσίαζαν σπειραματονεφρίτιδα από ΛΣ (Palacio και συν. 1995). Η συγκέντρωση της χοληστερόλης δε μεταβλήθηκε σημαντικά σε καμία από τις πρωτεϊνουρικές ομάδες (Β και Γ) τόσο μεταξύ των χρόνων 0 και 1, όσο και μεταξύ των χρόνων 1 και 2. Σε άλλες μελέτες, υπερχοληστερολαιμία βρέθηκε στο 79% σκύλων με σπειραματονεφρίτιδα (Center και συν. 1987) και στο 86% εκείνων με αμυλοείδωση του νεφρού (DiBartola και συν. 1989), χωρίς όμως να βρεθεί συσχετισμός μεταξύ των συγκεντρώσεων της χοληστερόλης και των λευκωματινών στο αίμα (Cook και Cowgill 1996). Σε πρωτεϊνουρικούς σκύλους με χρόνια σπειραματονεφρίτιδα από ΛΣ, διαπιστώθηκε ότι η υπερχοληστερολαιμία δεν ήταν συχνό εύρημα (Palacio και συν. 1995). Από την άλλη όμως πλευρά, το γεγονός ότι στο σύνολο των ζώων και των δύο ομάδων υπερχοληστερολαιμία παρουσίασε το 24,2% στο χρόνο 0, το 6% στο χρόνο 1 και το 18,5% στο χρόνο 2 φαίνεται να δείχνει ότι η θεραπεία με AmB την επηρεάζει κατά κάποιο τρόπο, πιθανόν μέσω της μείωσης της πρωτεϊνουρίας και της ταυτόχρονης αύξησης της λευκωματιναιμίας. Αν και η παθογένεια της υπερλιπιδαιμίας στο νεφρωσικό σύνδρομο είναι περισσότερο περίπλοκη απ’ ό,τι φαίνεται (Wheeler και Bernard 1994), η

133

βασική αρχή συνίσταται στην αντισταθμιστική αύξηση του ρυθμού σύνθεσης των λιποπρωτεϊνών στο ήπαρ λόγω υπολευκωματιναιμίας, προκειμένου να εξισορροπηθεί η κολοειδοσμωτική πίεση στο αίμα (Abrass 1997). Πάντως το νεφρωσικό σύνδρομο σπάνια μόνο εμφανίζεται σε σκύλους με ΛΣ και πρωτεϊνουρία (Koutinas και συν. 1999a, Koutinas και συν. 2001, Plevraki και συν. 2006), χωρίς όμως να έχει εξακριβωθεί ποια είναι η ανώτερη τιμή του Up/c πάνω από την οποία αυξάνουν σημαντικά οι πιθανότητες εμφάνισης νεφρωσικού συνδρόμου στο σκύλο. Το γεγονός ότι η κατώτερη τιμή της συγκέντρωσης των λευκωματινών στον ορό του αίματος όλων των πρωτεϊνουρικών σκύλων της μελέτης ήταν 1,6 g/100 ml προφανώς εξηγεί τη μη εμφάνιση νεφρωσικού συνδρόμου σε αυτούς και τη μη σημαντικότητα της υπερχοληστερολαιμίας. Συμπερασματικά, και με βάση τη στατιστική ανάλυση των αποτελεσμάτων της μελέτης, η χορήγηση της λιπιδικής AmB, τουλάχιστον στο παραπάνω δοσολογικό σχήμα, σε κλινικά περιστατικά με ΛΣ βελτιώνει την κλινική εικόνα και τις συχνότερες αιματολογικές και βιοχημικές διαταραχές στο αίμα. Παράλληλα, η AmB σε ζώα με ασυμπτωματική πρωτεϊνουρία από τη χρόνια σπειραματονεφρίτιδα της ΛΣ, μειώνει το βαθμό της πρωτεϊνουρίας χωρίς ωστόσο να επηρεάζει την απεκκριτική λειτουργία των νεφρών σε βαθμό που να εγκυμονεί κινδύνους για τη ζωή του ζώου. Η ταυτόχρονη χορήγηση εναλαπρίλης στη δόση που χορηγήθηκε, δεν αυξάνει το αντιπρωτεϊνουρικό αποτέλεσμα της AmB, και δε μεταβάλλει την απεκκριτική λειτουργία των νεφρών. Αν και η AmB μειώνει το παρασιτικό φορτίο και τον τίτλο των ειδικών αντισωμάτων κατά της L. infantum, το ποσοστό της παρασιτολογικής ίασης (εξουδετέρωση του παρασίτου) παραμένει αρκετά χαμηλό. Η συνέχιση της θεραπείας με αλλοπουρινόλη με ή χωρίς εναλαπρίλη, ενώ διατηρεί το θετικό κλινικό αποτέλεσμα της AmB και ενδέχεται να

134

αυξήσει το ποσοστό της παρασιτολογικής ίασης, δε μειώνει περισσότερο την πρωτεϊνουρία. Η χρησιμοποίηση της λιπιδικής AmB προτείνεται ανεπιφύλακτα για τη θεραπεία της ΛΣ εφόσον η αντιμονιούχος μεγλουμίνη, μόνη της ή σε συνδυασμό με την αλλοπουρινόλη, δεν είναι αποτελεσματική ή προκαλεί σοβαρές ανεπιθύμητες ενέργειες. Τέλος, πιστεύουμε ότι η αύξηση της δόσης της εναλαπρίλης σε σκύλους με ασυμπτωματική πρωτεϊνουρία από ΛΣ κατά τη διάρκεια της θεραπείας με λιπιδική AmB, ιδιαίτερα όταν συνδυαστεί με τη διατροφή τους με χαμηλό σε πρωτεΐνες σιτηρέσιο, θα μπορούσε να τη μειώσει σημαντικά ή και να την εξαφανίσει ακόμη, αυξάνοντας έτσι τη νεφροπροστατευτική δράση της.

135

136

ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ

1. Η αμφοτερικίνη Β (AmB) στη φαρμακοτεχνική μορφή του εναιωρήματος με λιπίδια παρεντερικής διατροφής και στη συνολική δόση των 12 mg/kg ΣΒ, κατανεμημένη σε 8 θεραπευτικές συνεδρίες, και χορηγούμενη από 22 μέχρι 60 ημέρες, βελτιώνει σημαντικά την κλινική εικόνα σκύλων με ΛΣ και αποκαθιστά σε σημαντικό βαθμό τις αιματολογικές (αναιμία, θρομβοκυτταροπενία) και τις βιοχημικές (υπολευκωματιναιμία, υπερσφαιριναιμία) διαταραχές. Η δράση της αυτή διατηρείται ή βελτιώνεται περισσότερο εφόσον ακολουθήσει η θεραπεία με αλλοπουρινόλη σε μακροχρόνια βάση. 2. Η AmB μειώνει σημαντικά το παρασιτικό φορτίο (L. infantum) στα λεμφογάγγλια και το μυελό των οστών χωρίς ωστόσο να επιτυγχάνεται παρασιτολογική ίαση παρά μόνο σε μικρό ποσοστό (8,9%) και παροδικά. Η συνέχιση της θεραπείας με αλλοπουρινόλη για 5 – 6 μήνες αυξάνει το ποσοστό της παρασιτολογικής ίασης, αν και σε σχετικά χαμηλά επίπεδα (15,5%). 3. Η μείωση του τίτλου των ειδικών αντισωμάτων κατά της L. infantum είναι σημαντική, χωρίς όμως αυτός να γίνεται αρνητικός, όχι μόνο στο χρονικό διάστημα της θεραπείας με AmB αλλά και ύστερα από 5μηνη συνέχισή της με αλλοπουρινόλη. 4. Η εμφάνιση ανεπιθύμητων ενεργειών είναι παροδική και δεν εγκυμονεί κινδύνους για τη ζωή των υπό θεραπεία σκύλων, ενώ η ταυτόχρονη χορήγηση εναλαπρίλης (0,5 mg/kg ΣΒ, από το στόμα, ημερησίως) μπορεί να μειώσει, αν και

137

περιορισμένα, τη νεφροτοξικότητα της AmB, περιορίζοντας την πιθανότητα εμφάνισης υπερκρεατινιναιμίας (>2,5 mg/100 ml ορού). 5. Η απεκκριτική λειτουργία των νεφρών, αν και επηρεάζεται αρνητικά από την AmB, επανέρχεται στα φυσιολογικά επίπεδα μέσα σε 5 το αργότερο μήνες, ανεξάρτητα από τη συνέχιση της αντιλεϊσμανιακής θεραπείας με αλλοπουρινόλη ή την ταυτόχρονη χορήγηση του αναστολέα του μετατρεπτικού ενζύμου της αγγειοτασίνης Ι, εναλαπρίλης. 6. Ο βαθμός πρωτεϊνουρίας διήθησης, που προκαλείται

από τη χρόνια

σπειραματονεφρίτιδα της ΛΣ, μειώνεται σημαντικά λόγω της αντιλεϊσμανιακής δράσης της AmB ενώ ταυτόχρονα η συγκέντρωση των λευκωματινών στον ορό του αίματος αυξάνεται σημαντικά, χωρίς όμως οι παράμετροι αυτοί να επηρεάζονται σημαντικά από την προσθήκη της εναλαπρίλης ή τη συνέχιση της θεραπείας με αλλοπουρινόλη, με ή χωρίς εναλαπρίλη.

138

ΠΕΡΙΛΗΨΗ

Η λεϊσμανίωση του σκύλου (ΛΣ) στις παραμεσόγειες χώρες οφείλεται στο ενδοκυτταρικό πρωτόζωο Leishmania infantum και σήμερα είναι ίσως το συχνότερο αρθροποδογενές νόσημα στην Ελλάδα. Η μετάδοσή του στο σκύλο, τον άνθρωπο και άλλα είδη ζώων γίνεται με τα νύγματα αιματοφάγων σκνιπών του γένους Phlebotomus sp. Τα όργανα που προσβάλλονται συχνότερα στη νόσο αυτή, συνήθως μέσω της εναπόθεσης ανοσοσυμπλόκων που κυκλοφορούν στο αίμα ή σχηματίζονται επί τόπου προφανώς λόγω της τύπου Th2 ανοσολογικής αντίδρασης (υπερπαραγωγή IgG αντισωμάτων) είναι το δέρμα, οι οφθαλμοί, οι αρθρώσεις και οι νεφροί. Στους τελευταίους

μπορεί

μεσαγγειοϋπερπλαστική,

να

προκληθεί

χρόνια

μεμβρανοϋπερπλαστική,

σπειραματονεφρίτιδα μεμβρανώδης,

των

(π.χ.

ελαχίστων

αλλοιώσεων) που προοδευτικά οδηγεί σε σπειραματοσκλήρυνση και πιθανότατα σε διαμεσοσωληναριακή νεφρίτιδα ή ίνωση με τελικό αποτέλεσμα την εγκατάσταση νεφρικής νόσου τελικού σταδίου και το θάνατο του ζώου. Η πρωτεϊνουρία διήθησης, που είναι ίσως το συχνότερο εργαστηριακό εύρημα σε περιστατικά με ΛΣ, θεωρείται εν μέρει υπεύθυνη για την επιδείνωση της σπειραματονεφρίτιδας. Τη βάση της σημερινής θεραπευτικής αγωγής στη ΛΣ αποτελούν η αντιμονιούχος μεγλουμίνη, η αλλοπουρινόλη, η αμινοσιδίνη και η αμφοτερικίνη Β (AmB), αν και τις περισσότερες φορές δεν επιτυγχάνεται παρασιτολογική ίαση ή μόνιμη μεταβολή της Th2 ανοσολογικής αντίδρασης (αντισώματα) σε Th1 (κυτταρική ανοσία). Το αποτέλεσμα είναι η συχνή εμφάνιση υποτροπών και η εφόρου ζωής χορήγηση αλλοπουρινόλης για τη διατήρηση του ζώου σε ασυμπτωματική κατάσταση. Τα τελευταία χρόνια, τα

139

ενθαρρυντικά θεραπευτικά αποτελέσματα της AmB στη λεϊσμανίωση του ανθρώπου (L. infantum, L. donovani) και η εμφάνιση ανθεκτικών στελεχών της L. infantum στα αντιμονιούχα, αποτέλεσαν το κίνητρο χρησιμοποίησης της αντιμυκητιακής αυτής ουσίας στη ΛΣ, κυρίως με τη μορφή της εμπορικά διαθέσιμης λιποσωμικής AmB (Ambisome®) και του εναιωρήματος της υδατοδιαλυτής AmB (Fungizone®) με λιπίδια παρεντερικής διατροφής (Intralipid®) για να περιοριστεί η νεφροτοξικότητά της, που επιτελείται κυρίως μέσω της αγγειοσυστολής των προσαγωγών και απαγωγών αρτηριδίων των νεφρικών σωματίων και της μείωσης στη συνέχεια του ρυθμού σπειραματικής διήθησης (ΡΣΔ). Οι στόχοι της με προηγούμενο σχεδιασμό, ανοιχτής (πρώτο σκέλος) και τυφλής (δεύτερο σκέλος), αλλά χωρίς εικονικό φάρμακο και φυσιολογικούς μάρτυρες μελέτης αυτής ήταν οι εξής: 1) η αξιολόγηση της αποτελεσματικότητας ως προς την κλινική και παρασιτολογική ίαση και της ασφάλειας ενός σταθερού δοσολογικού σχήματος της AmB, που χορηγούταν ενδοφλέβια στη μη εμπορικά διαθέσιμη φαρμακοτεχνική μορφή του εναιωρήματος με λιπίδια παρεντερικής διατροφής, σε μεγάλο αριθμό σκύλων με συμπτωματική λεϊσμανίωση (Leishmania infantum), 2) η επίδρασή της πάνω στην απεκκριτική λειτουργία των νεφρών και το βαθμό πρωτεϊνουρίας, που επηρεάζονται ή προκαλούνται αντίστοιχα από τη χρόνια σπειραματονεφρίτιδα της ΛΣ, σε συνδυασμό ή όχι με την εναλαπρίλη, και 3) η διερεύνηση της μακροχρόνιας επίδρασης της εναλαπρίλης πάνω στις προηγούμενες παραμέτρους της χρόνιας σπειραματονεφρίτιδας της ΛΣ, σε συνδυασμό με τη λεϊσμανιοστατική αλλοπουρινόλη. Η εναλαπρίλη, που ανήκει στους αναστολείς του μετατρεπτικού ενζύμου της αγγειοτασίνης Ι (ΑΜΕΑ), επιλέχθηκε ως συμπληρωματική θεραπεία εξαιτίας του

140

νεφροπροστατευτικού και αντιπρωτεϊνουρικού αποτελέσματός της στις φυσικές και πειραματικές σπειραματοπάθειες του ανθρώπου, του σκύλου και των ποντικών του εργαστηρίου, που εκφράζεται κυρίως μέσω της αγγειοδιασταλτικής της δράσης στα απαγωγά αρτηρίδια των νεφρικών σωματίων. Η μελέτη περιλάμβανε συνολικά 56 κλινικά περιστατικά ΛΣ, η διάγνωση της οποίας στηρίχθηκε στην ανεύρεση του πρωτόζωου σε επιχρίσματα από οπό λεμφογαγγλίου και μυελό των οστών, την ανίχνευση θετικού τίτλου ειδικών αντισωμάτων στον ορό του αίματος (IFAΤ) και την ειδική για L. infantum εξέταση με PCR. Οι σκύλοι ανήκαν σε 17 διαφορετικές αμιγείς φυλές (n=45), οι 4 ήταν μιγάδες διαφόρων φυλών και οι 7 ήταν ακαθόριστης φυλής. Η ηλικία των ζώων αυτών κυμαινόταν από 0,6 μέχρι 9 χρόνια (μέσος όρος: 4,2 χρόνια), το σωματικό τους βάρος από 9,5 μέχρι 45 kg (μέσος όρος: 22,9 kg) ενώ τα 36 από αυτά ήταν αρσενικά και τα 20 θηλυκά και όλα γεννητικά ακέραια. Η απουσία άλλων νοσημάτων ή παθολογικών καταστάσεων που να προκαλούν σπειραματονεφρίτιδα από ανοσοσύμπλοκα ή γενικότερα σπειραματοπάθεια αποτελούσε απαραίτητη προϋπόθεση για την ένταξη των σκύλων

στις

τρεις

περιλαμβάνονταν

η

ομάδες απουσία

της

μελέτης.

οξείας

ή

Στα χρόνιας

υπόλοιπα νεφρικής

κριτήρια

επιλογής

ανεπάρκειας

και

ασυμπτωματικής ή συμπτωματικής ουρολοίμωξης, η μη υποβολή τους σε οποιαδήποτε αντιλεϊσμανιακή θεραπεία τους τελευταίους 6 μήνες και η ολοκλήρωση της θεραπείας με AmB. Η AmB χορηγήθηκε στη δόση των 1,5 mg/kg ΣΒ, για 8 συνολικά συνεδρίες, στα 23 ζώα της ομάδα Α, που δεν παρουσίαζαν πρωτεϊνουρία (λόγος πρωτεϊνών/κρεατινίνης ή Up/c < 0,5) και στις ομάδες Β και Γ, με 16 και 17 ζώα, αντίστοιχα, που παρουσίαζαν πρωτεϊνουρία διήθησης (Up/c > 1). Στην ομάδα Γ προστέθηκε η εναλαπρίλη στη δόση

141

των 0,5 mg/kg ΣΒ, από το στόμα, ημερησίως. Πριν από κάθε θεραπευτική συνεδρία με AmB μετρούνταν η συγκέντρωση της κρεατινίνης και η χορήγηση πραγματοποιούνταν μόνο όταν αυτή ήταν <2,5 mg/100 ml ΣΒ. Διαφορετικά, το ζώο προσκομιζόταν στην επόμενη προγραμματισμένη συνεδρία για να επαναληφθεί και πάλι η ίδια διαδικασία. Μετά την ολοκλήρωση της θεραπείας με AmB (χρόνος 1) η θεραπευτική προσπάθεια συνεχίστηκε στους σκύλους που βρέθηκαν θετικοί στη L. infantum στην εξέταση με PCR στο μυελό των οστών (n=51) για άλλους 5 μήνες (χρόνος 2), κατά τη διάρκεια των οποίων χορηγούνταν αλλοπουρινόλη στη δόση των 10 mg/kg ΣΒ κάθε 12 ώρες, σε όλες τις ομάδες, και εναλαπρίλη στη δόση των 0,5 mg/kg ΣΒ ημερησίως, και πάλι μόνο στους σκύλους της ομάδας Γ. Σε 6 από τα 51 ζώα η μελέτη δεν μπόρεσε να ολοκληρωθεί επειδή οι ιδιοκτήτες τους δεν τα επαναπροσκόμισαν στο χρόνο 2. Η μελέτη χωρίστηκε σε δύο σκέλη. Στο πρώτο σκέλος, που αφορούσε στο κλινικό και αντιπαρασιτικό αποτέλεσμα καθώς και την ασφάλεια της θεραπείας με AmB, πριν από την έναρξη (χρόνος 0) και αμέσως μετά το τέλος της θεραπείας (χρόνος 1) η κάθε παθολογική κατάσταση του συγκεκριμένου περιστατικού που ήταν συμβατή με την κλινική εικόνα της ΛΣ βαθμολογούνταν ανεξάρτητα από δύο εξεταστές (0: απουσία, 1: ήπιου βαθμού, 2: μέτριου βαθμού, 3: έντονου βαθμού), μετρούνταν οι συνήθεις στην πράξη αιματολογικές και βιοχημικές παράμετροι στο αίμα και γινόταν ανάλυση και καλλιέργεια των ούρων. Η εκτίμηση του παρασιτικού φορτίου στα επιχρίσματα από τα λεμφογάγγλια και το μυελό των οστών (0: απουσία παρασίτων στα 1000 οπτικά πεδία, 1: 1-10 παράσιτα/1000 πεδία, 2: 1-10 παράσιτα/100 πεδία, 3: 1 – 10 παράσιτα/10 πεδία, 4: 1-10 παράσιτα/πεδίο, 5: 11-100 παράσιτα/πεδίο και 6: >100 παράσιτα/πεδίο), η μέτρηση του τίτλου των ειδικών αντισωμάτων στον ορό του αίματος με τη μέθοδο του έμμεσου

142

ανοσοφθορισμού (IFAΤ) και η εξέταση με την αλυσιδωτή αντίδραση της πολυμεράσης (PCR) σε δείγμα από το μυελό των οστών γίνονταν και στους τρεις χρόνους της μελέτης (χρόνοι 0, 1 και 2). Ταυτόχρονα υπολογιζόταν η διάρκεια της θεραπείας σε ημέρες και ο αριθμός των θεραπευτικών συνεδριών που αναβάλλονταν λόγω της υπερκρεατινιναιμίας (>2,5 mg/100 ml). Καθόλη τη διάρκεια της θεραπείας με AmB τα ζώα παρακολουθούνταν για τυχόν εμφάνιση ανεπιθύμητων ενεργειών. Στο δεύτερο σκέλος της μελέτης, στο οποίο εκτιμήθηκε η δράση της AmB και της εναλαπρίλης πάνω στην απεκκριτική λειτουργία του νεφρού και το βαθμό πρωτεϊνουρίας και στους τρεις χρόνους της μελέτης, προσδιορίζονταν οι συγκεντρώσεις της κρεατινίνης, του αζώτου ουρίας (SUN) και του φωσφόρου (P) και τα ζώα υποβάλλονταν στη δοκιμή κάθαρσης της εξωγενούς κρεατινίνης προκειμένου να υπολογιστεί ο ΡΣΔ. Ταυτόχρονα, λαμβάνονταν δείγμα ούρων για καλλιέργεια (αερόβια βακτηρίδια) και γενική ανάλυση. Για την ποσοτική εκτίμηση της πρωτεϊνουρίας, στο ίδιο δείγμα ούρων υπολογιζόταν ο Up/c ενώ παράλληλα μετρούνταν οι συγκεντρώσεις των λευκωματινών και της χοληστερόλης στον ορό του αίματος. Επισημαίνεται ότι 5 επιπλέον ζώα (σύνολο 11) δε συμμετείχαν στις συγκρίσεις του χρόνου 2, επειδή βρέθηκαν αρνητικά στην PCR στο χρόνο 1 και αποφασίστηκε να μη τους χορηγηθεί αλλοπουρινόλη. Οι τρεις ομάδες παρουσίαζαν ικανοποιητική ομοιογένεια ως προς το είδος των συμβατών με τη ΛΣ παθολογικών καταστάσεων και συμπτωμάτων και των αιματολογικών και βιοχημικών (ορός αίματος, ούρα) διαταραχών. Στις μεταξύ των χρόνων 0 και 1 συγκρίσεις του αριθμού των παθολογικών καταστάσεων και του συνολικού βαθμού έντασης της κλινικής εικόνας, η διαφορά ήταν σημαντική και στις δύο

143

περιπτώσεις (P < 0,0001). Με βάση τη συνολική βαθμολογία της κλινικής εικόνας, η ανταπόκριση στη θεραπεία με AmB χαρακτηρίστηκε καλή (βελτίωση > 50%) στο 39,3%, πολύ καλή (βελτίωση > 75%) στο 21,4% των σκύλων και άριστη (πλήρης κλινική ίαση) στο 8,9% των σκύλων. Συνολικά, το θετικό θεραπευτικό αποτέλεσμα, που ήταν αποδεκτό από κάθε άποψη, ανήλθε στο 69,6%. Από τις μεταβολές των αιματολογικών και βιοχημικών παραμέτρων μεταξύ των χρόνων 0 και 1 σημαντικές ήταν μόνο η άνοδος του αιματοκρίτη και του αριθμού των αιμοπεταλίων, η αύξηση της συγκέντρωσης της αιμοσφαιρίνης και των λευκωματινών, η μείωση της συγκέντρωσης των ολικών πρωτεϊνών και των σφαιρινών και η αύξηση του λόγου λευκωματινών/σφαιρινών ή Λ/Σ (Ρ<0,0001). Το παρασιτικό φορτίο στα λεμφογάγγλια και το μυελό των οστών μειώθηκε μεταξύ των χρόνων 0 και 1 (P < 0,0001), ενώ μεταξύ των χρόνων 1 και 2 το ίδιο διαπιστώθηκε μόνο στο μυελό των οστών (P = 0,007). Η πτώση του τίτλου των ειδικών αντισωμάτων ήταν επίσης σημαντική στις μεταξύ των χρόνων 0 και 1 και των χρόνων 1 και 2 συγκρίσεις (P < 0,0001), αλλά μόνο σε ένα από τα 56 ζώα (1,8%) ο τίτλος έγινε αρνητικός στο χρόνο 2 (6,5 μήνες από την έναρξη της μελέτης). Στο χρόνο 1, 5/56 (8,9%) ζώα έγιναν αρνητικά στην PCR ενώ στο χρόνο 2 ο αντίστοιχος αριθμός ήταν 7/45 (15,5%). Επισημαίνεται ότι τα 4 από τα 5 PCR αρνητικά ζώα του χρόνου 1 ξαναέγιναν θετικά στο χρόνο 2. Σημαντική αύξηση του αριθμού των PCR αρνητικών ζώων διαπιστώθηκε μόνο στη μεταξύ των χρόνων 1 και 2 σύγκριση (P=0,0156). Διαφορά στη διάρκεια της θεραπείας με AmB παρατηρήθηκε μόνο μεταξύ των ομάδων Β και Γ (ζώα με πρωτεϊνουρία), με την ομάδα Γ να παρουσιάζει μεγαλύτερη μείωση της συνολικής διάρκειας (P=0,006) και σχεδόν σημαντική τάση για μείωση του

144

αριθμού των συνεδριών που αναβλήθηκαν (P=0,055) σε σύγκριση με την Β ομάδα. Στο χρόνο 0, ο ΡΣΔ ήταν χαμηλότερος του φυσιολογικού (<3,6 ml/min/kg ΣΒ) σε 8/23 (34,8%) ζώα της ομάδας Α, 5/17 (29,4%) της Β και 6/16 (37,5%) της Γ για να μειωθεί και στις τρεις ομάδες μεταξύ των χρόνων 0 και 1 (P<0,0001) ενώ αυξήθηκε στο διάστημα των 5 μηνών που μεσολάβησε μεταξύ των χρόνων 1 και 2 και πάλι σε όλες τις ομάδες (Ρ=0,002 μέχρι <0,0001). Διαφορές όμως μεταξύ των τριών ομάδων δεν παρατηρήθηκαν σε κανέναν χρόνο της μελέτης. Αντίστροφη μεταβολή παρουσίασαν οι συγκεντρώσεις της κρεατινίνης και του SUN, με σημαντική αύξηση μεταξύ των χρόνων 0 και 1 σε όλες τις ομάδες και μείωση μεταξύ των χρόνων 1 και 2 στις ομάδες Α και Γ. Ο φωσφόρος, που βρισκόταν μέσα στα φυσιολογικά όρια σε όλα τα ζώα στο χρόνο 0, παρουσίασε αύξηση μεταξύ των χρόνων 0 και 1 (Ρ=0,0004) και μείωση μεταξύ των χρόνων 1 και 2 (Ρ=0,02) μόνο στην ομάδα Α (ζώα χωρίς πρωτεϊνουρία). Για όλους τους παραπάνω δείκτες ελέγχου της απεκκριτικής λειτουργίας των νεφρών δε βρέθηκε σημαντική διαφορά μεταξύ των ομάδων σε κανέναν από τους τρεις χρόνους. Το ειδικό βάρος των ούρων, που ήταν φυσιολογικό σε όλα τα ζώα στο χρόνο 0 (> 1030), μειώθηκε μεταξύ των χρόνων 0 και 1 (P<0,0001) για να αυξηθεί στη συνέχεια μεταξύ των χρόνων 1 και 2 (P<0,0002) και στις τρεις ομάδες. Οι καλλιέργειες των ούρων για αερόβια βακτηρίδια ήταν αρνητικές και στους τρεις χρόνους της μελέτης ενώ στις συγκρίσεις των ευρημάτων από το ίζημα των ούρων τόσο μεταξύ των τριών ομάδων όσο και μεταξύ των τριών χρόνων δε βρέθηκαν σημαντικές διαφορές. Μείωση του λόγου Up/c διαπιστώθηκε στα ζώα των ομάδων Β και Γ στις συγκρίσεις μεταξύ των χρόνων 0 και 1 (Β ομάδα: P<0,0001, Γ ομάδα: P=0,02), χωρίς όμως να βρεθεί σημαντική διαφορά στις συγκρίσεις μεταξύ των ομάδων αυτών για τον

145

καθένα χρόνο ξεχωριστά. Η παραπέρα όμως μείωση του λόγου Up/c δεν ήταν σημαντική μεταξύ των χρόνων 1 και 2 σε καμία από τις δύο ομάδες. Αντίθετα, η συγκέντρωση των λευκωματινών στον ορό του αίματος παρουσίασε αύξηση και στις δύο ομάδες (Β ομάδα: P<0,0001, Γ ομάδα: P=0,006) μεταξύ των χρόνων 0 και 1 χωρίς και πάλι να συνεχίσει να αυξάνει σημαντικά στο διάστημα μεταξύ των χρόνων 1 και 2. Τέλος, η συγκέντρωση της χοληστερόλης στον ορό του αίματος δεν παρουσίασε σημαντικές διαφορές στις συγκρίσεις μεταξύ των χρόνων 0 και 1 και των χρόνων 1 και 2. Διαφορές μεταξύ των ομάδων δεν παρατηρήθηκαν για καμία από τις παραπάνω βιοχημικές παραμέτρους του αίματος, και στους τρεις χρόνους της μελέτης. Η εμφάνιση των ανεπιθύμητων ενεργειών από τη χορήγηση της AmB (πολυουρία – πολυδιψία, έμετος, μυϊκός τρόμος) δε διέφερε ανάμεσα στα ζώα των τριών ομάδων και είχε παροδικό χαρακτήρα. Τα κυριότερα συμπεράσματα που θα μπορούσαν να προκύψουν από τη μελέτη αυτή είναι τα εξής: 1. Η AmB στη φαρμακοτεχνική μορφή του εναιωρήματος με λιπίδια και στη συνολική δόση των 12 mg/kg ΣΒ, κατανεμημένη σε 8 θεραπευτικές συνεδρίες, βελτιώνει σημαντικά την κλινική εικόνα σε σκύλους με ΛΣ και αποκαθιστά σε σημαντικό βαθμό τις αιματολογικές (αναιμία, θρομβοκυτταροπενία) και τις βιοχημικές (υπολευκωματιναιμία, υπερσφαιριναιμία) διαταραχές. Η δράση της αυτή διατηρείται ή βελτιώνεται περισσότερο όταν ακολουθήσει η χορήγηση αλλοπουρινόλης σε μακροχρόνια βάση. 2. Η AmB μειώνει σημαντικά το παρασιτικό φορτίο (L. infantum) στα λεμφογάγγλια και το μυελό των οστών χωρίς ωστόσο να επιτυγχάνεται παρασιτολογική ίαση

146

παρά μόνο σε μικρό ποσοστό (8,9%) και παροδικά. Η συνέχιση της θεραπείας με αλλοπουρινόλη για 5 – 6 μήνες αυξάνει το ποσοστό της παρασιτολογικής ίασης, αν και σε σχετικά χαμηλά επίπεδα (15,5%). 3. Η εμφάνιση ανεπιθύμητων ενεργειών είναι παροδική και δεν εγκυμονεί κινδύνους για τη ζωή των υπό θεραπεία σκύλων, ενώ η ταυτόχρονη χορήγηση εναλαπρίλης μπορεί να μειώσει, αν και περιορισμένα, τη νεφροτοξικότητα της AmB. 4. Η απεκκριτική λειτουργία των νεφρών, αν και επηρεάζεται αρνητικά από την AmB, επανέρχεται στα φυσιολογικά όρια μέσα σε 5 το αργότερο μήνες, ανεξάρτητα από τη συνέχιση της αντιλεϊσμανιακής θεραπείας με αλλοπουρινόλη ή την ταυτόχρονη χορήγηση εναλαπρίλης. 5. Ο βαθμός πρωτεϊνουρίας διήθησης, που προκαλείται

από τη χρόνια

σπειραματονεφρίτιδα της ΛΣ, μειώνεται σημαντικά με την AmB, χωρίς ωστόσο να επηρεάζεται σημαντικά από την προσθήκη εναλαπρίλης ή τη συνέχιση της θεραπείας με αλλοπουρινόλη, με ή χωρίς εναλαπρίλη.

147

148

Εfficacy and safety of amphotericin B (lipid emulsion) in canine leishmaniosis (Leishmania infantum) and its effect on renal function, along with or without enalapril

Christos K. Koutinas, DVM

Doctoral thesis, 2006

SUMMARY

Canine leishmaniasis (CL), as it appears in the Mediterranean basin, is caused by the intracellular protozoan parasite Leishmania infantum. Today, it is by all means the most common arthropod – borne infectious disease in Greece. Its transmission among various mammalian species is carried out by the bites of blood-sucking sandflies (Phlebotomus sp.), harboring the flagellated promastigotes. The pathogenesis of overt disease should be focused on the overproduction of IgG antibodies against parasitic antigens, assumingly exemplifying a Th2 immune response from the part of the host that may result in the deposition of circulating or in-situ forming immunocomplexes, usually targeting the skin, eyes, joints and kidneys. In the latter, chronic glomerulonephritis (e.g. mesangioproliferative,

membranoproliferative,

membranous,

minimal

change

glomerulopathy) and eventually glomerulosclerosis and tubulointerstitial fibrosis may

149

lead to chronic renal failure, end-stage renal disease and the death of the animal. The resultant proteinuria, one of the most common findings in the laboratory evaluation of CL cases, is partly responsible for the deterioration of glomerular lesions. Meglumine antimoniate, allopourinol, aminosidine and amphotericin B (AmB) are today’s cornerstone in the treatment of CL, though not associated with encouraging results regarding the parasitological cure rate and the definitive switching of Th2 to Th1 immunological response. Consequently, life-long therapy with allopurinol is usually mandatory to avoid clinical relapses. Therapeutic experience with human visceral leishmaniasis and the emergence of resistant L. infantum strains to antimonials have encouraged the use of the antifungal agent AmB in the treatment of CL. The commercially available lipid form (Ambisome®) or the emulsion of its desoxycholate salt with lipids for parenteral nutrition (Fungizone® plus Intralipid®) have been formulated in an attempt to lower the risk of nephrotoxicosis, mainly imposed via glomerular vasoconstriction with a subsequent reduction of glomerular filtration rate (GFR). The goals of this prospective, open label and single-blinded but not placebocontrolled study were the following: 1) the evaluation of the clinical and parasitological efficacy and safety of lipid-formulated AmB in a large number of dogs with symptomatic CL (L. infantum), by applying a standard dosage scheme, 2) its effect on GFR and the level of glomerulonephritis-associated proteinuria, with or without enalapril, and 3) the long-term evaluation of enalapril therapy, with or without allopurinol, on both proteinuria level and GFR. Enalapril is an angiotensin converting enzyme inhibitor (ACEI) with renoprotective properties that has been known to effectively attenuate proteinuria in humans, dogs and laboratory rodents with natural or experimental glomerulonephritis,

150

mainly via its vasodilatory effect on the efferent glomerular arterioles, which opposes that of AmB. A total of 56 dogs with symptomatic CL, confirmed by direct microscopic examination of lymph node and bone marrow aspiration smears (for amastigotes), positive IFAT serology and L. infantum-specific PCR, entered the study. Seventeen different breeds were represented (n=45), while the rest of the animals were either crossbreds (n=4) or mongrels (n=7). Their age ranged from 0.6 to 9 years (mean: 4.2 years), their body weight from 9.5 to 45 kg (mean: 22.9 kg) and 36 of them were intact males and 20 intact females. The inclusion criteria for the animal participation in the study were the prior exclusion of concurrent diseases that are associated with a high prevalence of immunocomplex glomerulonephritis, the absence of acute or chronic renal failure and of clinical or subclinical urinary tract infection, the completion of the therapeutic protocol with AmB and the non-commission of any kind of antileishmanial treatment during the last 6 months. The agent was given intravenously and slowly at the dose of 1.5 mg/kg BW, in 8 therapeutic sessions, in 23 group A dogs without proteinuria (urine protein to creatinine ratio or Up/c < 0.5), and in 16 group B and 17 group C proteinuric animals (Up/c > 1). Moreover, group C dogs were being given enalapril at the daily dose of 0.5 mg/kg BW, per os. Serum creatinine concentration, which was measured just before each AmB session, had to be lower than 2.5 mg/100 ml for the next session to follow; otherwise, it was postponed until the next scheduled session. Upon the completion of the antileishmanial therapy with AmB (time 1), it was continued in 51 still PCR positive dogs with allopurinol, at the dose of 10 mg/kg BW, per os, every 12 hours, for another 5 months (time 2). During the same period of time enalapril was kept being

151

given at the same dosage. Six out of 51 dogs did not complete this part of the study due to their owners’ non-compliance. The study is divided into two parts. In the first part, evaluating the efficacy and safety of AmB, just before (time 0) and at the end of its administration (time 1), all CLcompatible disease conditions or symptoms were scored by two examiners independently (0: absence, 1: mild, 2: moderate, 3: severe) with routine hematology (CBC) and serum biochemistry also performed. At the same time, urine was collected by cystocentesis for urinalysis and bacterial culture. The parasitic load of both lymph nodes and bone marrow was determined semiquantitatively by applying a 6-point scoring system (0: absence of parasites in 1000 oil immersion fields [OIF], 1: 1-10 parasites / 1000 OIF, 2: 1-10 / 100 OIF, 3: 1 – 10 / 10 OIF, 4: 1-10 / OIF, 5: 11-100 / OIF and 6: >100 / OIF) at time 0, 1 and 2 of the study along with IFAT serology for L. infantum and relevant PCR on bone marrow samples for the detection of parasite genomic material. Finally, the total duration of treatment with AmB in days and the number of missing sessions due to hypercreatinemia were recorded accordingly. Any adverse effects observed during therapy with AmB, were also recorded. In the second part of the study, the nephrotoxic effect of AmB on the excretory function of the kidneys at time 0, 1 and 2 was evaluated in all three groups, by measuring creatinine, urea nitrogen (SUN) and phosphorus (P) concentrations as well as GFR, the latter by applying the exogenous creatinine clearance test. At these time points, urine was collected for urinalysis and bacterial culture, the Up/c ratio was calculated and serum albumin and cholesterol concentrations were measured. Five animals, that were PCR

152

negative for L. infantum, were excluded from time 2 evaluation (total number: 11) because they had not been on the allopurinol schedule. There was homogeneity between the three groups regarding the clinical picture and clinicopathological (blood serum, urine) profile. The number of disease conditions or symptoms and total clinical score were significantly lower at the end of the treatment with AmB (time 1 - P < 0.0001). According to the total clinical score, the response to AmB therapy was considered good (> 50% improvement) in 39.3%, very good (> 75% improvement) in 21.4% and excellent (complete cure) in 8.9% of the animals, totaling to an acceptable clinical cure rate as high as 69,6%. Significant hematological and serum biochemical changes, witnessed just after the completion of the therapy with AmB consisted of an increase of packed cell volume, platelet count, hemoglobin and albumin concentrations and albumin to globulin ratio and a decrease of total proteins and globulins in blood serum (P < 0.0001). Lymph node and bone marrow parasitic load decreased between time 0 and 1 (P<0.0001) but only for bone marrow between time 1 and 2 (P = 0.007). Also, IFAT titres decreased significantly between time 0 and 1 and between time 1 and 2 (P < 0.0001) but only 1/56 (1.8%) dog turned seronegative, 6.5 months after the beginning of the treatment with AmB. Five out of 56 (8.9%) dogs became PCR negative at time 1, and 7/45 (15.5%) at time 2. However, 4 of these PCR negative animals became positive again at time 2. The increase of PCR negative dogs was found to be significant only between time 1 and 2 (P = 0.0156). Total duration of therapy with AmB was shorter in group C compared to group B (P = 0.006). Comparing the same groups for the number of postponed sessions there was

153

a borderline significant trend for fewer missing sessions in group C (P = 0.055). At the beginning of the study (time 0), a lower than normal GFR (< 3.6 ml/min/kg BW) was noticed in 8/23 (34.8%) group A, 5/17 (29.4%) group B and 6/16 (37.5%) group C dogs. Its values tended to be significantly decreased between time 0 and 1 (P < 0.0001) only to normalize again between time 1 and 2 (P = 0.002 to <0.0001) in all three groups. When GFR was compared between groups for times 0, 1 and 2, no significant differences could be found. Between time 0 and 1 serum creatinine and SUN concentrations were significantly elevated in all three groups and lowered in groups A and C in the comparison between time 1 and 2. Serum P concentration was normal in all 56 dogs at time 0, to increase between time 0 and 1 only in group A (P = 0.0004) and to decrease between time 1 and 2 also in the same group (P = 0.02). In all these instances the comparison made between the groups for time 0, 1 and 2 did not reveal any significant differences. Urine specific gravity was normal in all animals at time 0 (> 1030) but was decreased between time 0 and 1 (P<0.0001), to increase again between time 1 and 2 (P< 0.0002) in all three groups. Urinary bacterial cultures were negative and urine sediment microscopy results did not differ significantly between the groups for all three time points. In the proteinuric groups B and C, Up/c ratio decreased between time 0 and 1 (group B: P < 0.0001, group C: P=0.02), although there was no significant difference in the comparisons made between the two groups for each of these time points. Upon completion of the study (time 2), Up/c values were not found to change significantly in both groups. Conversely, serum albumin levels did increase between time 0 and 1 (group

154

B: P<0.0001, group C: P=0.006) but this elevation was not significant in the comparison between time 1 and 2 for both groups. Finally, cholesterol concentrations did not vary between time 0 and 1 and 1 and 2 in both groups. No differences could be noted for any of the aforementioned parameters of serum biochemistry, when groups were compared at 0, 1 and 2 time points. Adverse effects (polyuria – polydipsia, vomiting, generalized muscular tremors) were transient, their prevalence being similar among the animals of all three groups. The main conclusions that could be drawn from this study are the following: 1. The

clinical

and

clinicopathological

(anemia,

thrombocytopenia,

hypoalbuminemia, hyperglobulinemia) response of natural CL cases treated with a lipid AmB formulation at the total dose of 12 mg/kg BW, divided into 8 sessions, is good to excellent and may be maintained with life-long administration of allopurinol. 2. Amphotericin B reduces significantly the parasitic load in lymph nodes and bone marrow, but the prevalence of parasitological cure, which is temporary, is quite low (8.9%) and may increase insignificantly (15.5%) when the antileishmanial therapy is continued with allopurinol. 3. Adverse effects are temporary and not life-threatening while concurrent administration of enalapril, at the dose of 0.5 mg/kg BW, per os, daily, may have a limited renoprotective effect, antagonizing AmB nephrotoxicity. 4. Glomerular filtration rate is severely decreased, although it normalizes again within 5 months after the cessation of AmB administration, regardless of the

155

concurrent use of enalapril and the continuation of the antileishmanial therapy with allopurinol alone or in combination with enalapril. 5. The level of glomerulonephritis - induced proteinuria in CL is significantly lowered with the advent of AmB administration but it appears that it is not influenced by the concurrent use of enalapril or the subsequent long-term administration of allopurinol alone or in combination with enalapril.

156

ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ ΠΙΝΑΚΩΝ

157

Πίνακας Ι : Βαθμός έντασης των παθολογικών καταστάσεων που χαρακτηρίζουν τη λεϊσμανίωση του σκύλου στα ζώα της ομάδας Α στο χρόνο 0 της μελέτης Ζώα Παθολογικές καταστάσεις

Α1

Κακή θρεπτική κατάσταση απίσχνανση Βλεφαρίτιδα

0

1

1

0

0

0

2

0,5

0

0

0,5

0

0

2

1

1 3 2,5 3 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1,5

1 0 1 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 2

2 2 2 0 2 0 0 0 0 1 0 0 0 0,5 0 1

1,5 0 1,5 0 1,5 0 0 0 0 0 0 0 0 2 0 2,5

2 0 0 0 2 0 0 0 0 0 0 0 0 3 1 1

1 0 0 0 2 0 0 0 0 0 0 0 0 2 0 1

1 0 1 0 1 0 0 0 0 2 0 0 0 2 0 1

2 0 0 0 2,5 0 1 0 0 0 0 0 0 2,5 0 0,5

0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0

2 0 1 0 2 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1

0 0 0 1 0 0 0 0 0 0,5 0 0 0 0 0 0,5

1 0 0 0 1 0 1 0 0 1 0 0 0 2 1 0

0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

0 0 0 0 2 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1

1 1 2 1 2 1 1 0 0 1 2 0 0 2 0 1

0,5

2

1

0,5

2

1

1

1

0

0

0

0

0

1

1

0,5 0

1 0

1 0

0 0

2 2

1 0

1 0

1 0

0 0

0 0

0 0

0 0

0 0

1 0

0

1

0

0

2

1

0

0

2

1

0

0

0

0

Ραγοειδίτιδα Επιπεφυκίτιδα Κερατίτιδα Λεμφογαγγλιομεγαλία Ηπατομεγαλία Σπληνομεγαλία Δερματικά οζίδια Υποδόριοι όγκοι Ατροφία μασητηρίων μυών Πολυαρθρίτιδα Ελκώδης στοματίτιδα Επίσταξη Αποφολιδωτική δερματίτιδα Δερματικά έλκη Υπερκεράτωση ακρορρινίου Υπερκεράτωση φυμάτων Ονυχογρύπωση

πελματικών

Παρονυχία Επιπολής ή εν τω βάθει βακτηριδιακή δερματίτιδα

Α2

Α3

Α4

Α5

Α6

Α7

Α8

Α9

Α10

Α11

Α12

Α13

Α14

Α15

Α16

Α17

Α18

Α19

Α20

Α21

Α22

Α23

0

0

0,5

0

1

1

0

0

2 0 2 0 3 0 0 0 0 0 0 1 0 2 1 1

0 0 0 0 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

1 0 1 0 1 0 0 0 0 0,5 0 0 1 0,5 0 1,5

1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1

1 0 0 0 2 0 0 0 0 0 0 0 0 2 0 1

1 0 0,5 0 2 0 0 0 0 0,5 0 0 0 2,5 1 2,5

2 0 1 0 2 0 0 0 0 1 0 0 0 2 0 1

0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0

2

0

0,5

0,5

1

0,5

1

0

1 0

0 1

0 0

1,5 0

0 0

1 0

0 0,5

0 0

0 0

0

2

0

0

0

0

1

0

0

Β Α Θ Μ Ο Λ Ο Γ Η Σ Η

158

Πίνακας ΙΙ : Βαθμός έντασης των παθολογικών καταστάσεων που χαρακτηρίζουν τη λεϊσμανίωση του σκύλου στα ζώα της ομάδας Α στο χρόνο 1 της μελέτης Ζώα Παθολογικές καταστάσεις Κακή θρεπτική κατάσταση απίσχνανση Βλεφαρίτιδα

Α1

Α2

Α3

Α4

Α5

Α6

Α7

Α8

Α9

Α10

Α11

Α12

Α13

Α14

Α15

Α16

Α17

Α18

Α19

Α20

Α21

Α22

Α23

Β Α Θ Μ Ο Λ Ο Γ Η Σ Η 0

0,5

0

0

0

0

1

0

0

0

0

0

0

2

1

0

0

0

0

0

1

0

0

0,5 3 3 2 0,5 0 0 0 0 0,5 0 0 0 0 0 0

0,5 0 0,5 0 1 0 0 0 0 0,5 0 0 0 0,5 0 0

1,5 1 2,5 0,5 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1

0,5 0 0,5 0,5 1 0 0 0 0 0 0 0 0 2 0 2,5

1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1

0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0,5 0 0

1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0 0

1 0 1,5 0 0,5 0 0 0 0 0 0 0 0 2 0 0

0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0

1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1

0 1 1 0 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0,5 0 0

1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1

0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

1 0 0,5 0 1 0 0 0 0 0,5 0 0 0 0 0 1,5

0 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1

0,5 0 0 0 2 0 0 0 0 0,5 0 0 0 3 0,5 1,5

1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0

0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

0,5

0

0

0

1

0

0

0,5

0

0

0

0

0

1

1

1

0

0,5

0

1

0,5

0

0

Παρονυχία

1 0

0 0

0 0

0 0

1 0

0 0

1 0

1 0

0 0

0 0

0 0

0 0

0 0

1 0

2 0

1 0

0 0

1 0

0 0

1 0

0,5 0

0 0

0 0

Επιπολής ή εν τω βάθει βακτηριδιακή δερματίτιδα

0

1

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

1

0

0

Ραγοειδίτιδα Επιπεφυκίτιδα Κερατίτιδα Λεμφογαγγλιομεγαλία Ηπατομεγαλία Σπληνομεγαλία Δερματικά οζίδια Υποδόριοι όγκοι Ατροφία μασητηρίων μυών Πολυαρθρίτιδα Ελκώδης στοματίτιδα Επίσταξη Αποφολιδωτική δερματίτιδα Δερματικά έλκη Υπερκεράτωση ακρορρινίου Υπερκεράτωση φυμάτων Ονυχογρύπωση

πελματικών

159

Πίνακας ΙΙΙ : Βαθμός έντασης των παθολογικών καταστάσεων που χαρακτηρίζουν τη λεϊσμανίωση του σκύλου στα ζώα της ομάδας Β στο χρόνο 0 της μελέτης Β1

Ζώα Παθολογικές καταστάσεις Κακή θρεπτική απίσχνανση Βλεφαρίτιδα

κατάσταση

Β2

Β3

Β4

Β5

Β6

Β7

Β8

Β9

Β10

Β11

Β12

Β13

Β14

Β15

Β16

Β17

Β Α Θ Μ Ο Λ Ο Γ Η Σ Η -

1

1

1

0,5

0

1

2

0

1

1

0

1

0

0

0

0

2

Παρονυχία

1 0 2 1 3 1 0 0 2 2 0 0 0 1 0 2 1 1 0

0 0 0 0 2 0 0 0 0 1 0 0 0 2 1 2 2 2 0

1 0 2 0 2 0 0 0 0 1 0 0 0 0 3 0 0 0 0

1 0 1 0 0,5 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0,5 0,5 0

0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

3 0 2 0 2 1 1 0 0 1 0 0 0 3 1 2 2 2 1

0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 0 0 0 1 0 1 1 0

0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 1 1 0

0 0 0 0 2 0 0 1 0 1 1 0 1 2 0 0 0 0 0

2 1 1 0 2 1 1 0 0 1 0 0 0 2 0 1 1 1 0

0 1 0,5 0 2 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 3 1 2 0

0 0 0 0 2 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0

0 0 0 0 1,5 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0

0 0 1 0 2 0 0 1 0 1 0 0 0 0 0 1 1 1 0

0,5 0 1,5 0,5 2 0 0 0 0 1 1 0 0 0,5 0 2 1 0 0

1 0 1 0 2 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0

1 0 2 0 2 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 2 1 2 0

Επιπολής ή εν τω βάθει βακτηριδιακή δερματίτιδα

0

0

2

0

1

2

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

1

Ραγοειδίτιδα Επιπεφυκίτιδα Κερατίτιδα Λεμφογαγγλιομεγαλία Ηπατομεγαλία Σπληνομεγαλία Δερματικά οζίδια Υποδόριοι όγκοι Ατροφία μασητηρίων μυών Πολυαρθρίτιδα Ελκώδης στοματίτιδα Επίσταξη Αποφολιδωτική δερματίτιδα Δερματικά έλκη Υπερκεράτωση ακρορρινίου Υπερκεράτωση πελματικών φυμάτων Ονυχογρύπωση

160

Πίνακας IV : Βαθμός έντασης των παθολογικών καταστάσεων που χαρακτηρίζουν τη λεϊσμανίωση του σκύλου στα ζώα της ομάδας Β στο χρόνο 1 της μελέτης Β1

Ζώα Παθολογικές καταστάσεις Κακή θρεπτική απίσχνανση Βλεφαρίτιδα

κατάσταση

Β2

Β3

Β4

Β5

Β6

Β7

Β8

Β9

Β10

Β11

Β12

Β13

Β14

Β15

Β16

Β17

Β Α Θ Μ Ο Λ Ο Γ Η Σ Η -

1

0

0

0

0

0

1

1

0,5

0

0

0,5

1

0

0

0

1

Παρονυχία

0 0 1 2 1 0 0 0 1 1 0 0 1 0 0 1 1 0 0

0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 2 0

1 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

1 0 1 0 1,5 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0,5 1 0,5 1,5 0

0 0 0 0 0 0 0 0 0 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0

0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0

0 0 0 0 0,5 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0

1 1 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 1 0 0

0 1 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 1 1 0

0 0 0 0 1,5 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1,5 0

0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0

0,5 0 1 0 0,5 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0,5 0 0 0

1 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0

1 0 1 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0

Επιπολής ή εν τω βάθει βακτηριδιακή δερματίτιδα

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

Ραγοειδίτιδα Επιπεφυκίτιδα Κερατίτιδα Λεμφογαγγλιομεγαλία Ηπατομεγαλία Σπληνομεγαλία Δερματικά οζίδια Υποδόριοι όγκοι Ατροφία μασητηρίων μυών Πολυαρθρίτιδα Ελκώδης στοματίτιδα Επίσταξη Αποφολιδωτική δερματίτιδα Δερματικά έλκη Υπερκεράτωση ακρορρινίου Υπερκεράτωση πελματικών φυμάτων Ονυχογρύπωση

161

Πίνακας V : Βαθμός έντασης των παθολογικών καταστάσεων που χαρακτηρίζουν τη λεϊσμανίωση του σκύλου στα ζώα της ομάδας Γ στο χρόνο 0 της μελέτης Γ1

Ζώα Παθολογικές καταστάσεις Κακή θρεπτική απίσχνανση Βλεφαρίτιδα

κατάσταση

Γ2

Γ3

Γ4

Γ5

Γ6

Γ7

Γ8

Γ9

Γ10

Γ11

Γ12

Γ13

Γ14

Γ15

Γ16

Β Α Θ Μ Ο Λ Ο Γ Η Σ Η -

1

1

0

1

2

0

1

1

0

0

2

1

2

0

1

1

Παρονυχία

0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0

2 0 2 0 2 1 0 0 0 1 0 0 0 2 0 0 1 1 0

0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 2 0 0 2 1 0 0

1 0 1 0 2 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0 0 1 1 0

1 0 1 0 2 0 0 0 0 1 1 1 0 3 2 2 1 1 1

1 1 1 1 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0

2 0 1 0 2 1 1 0 0 0 0 0 0 2 0 1 2 2 0

0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 1 2 0

0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 2 1 2 0

1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0

2 1 2 0 2 0 0 0 0 1 0 0 0 3 2 2 2 2 0

2 0 1 0 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 2 1 0 0

0 0 0 0 2 0 0 0 0 2 0 1 0 1 0 0 0 0 0

1 0 0 0 1 0 0 0,5 0 0 1 0 1 0 0 0 1 0 0

1 0 1 0 2 0 0 0 0 1 0 0 0 2 0 0 0 0 0

1 2 2 0 2 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 1 2 2 1

Επιπολής ή εν τω βάθει βακτηριδιακή δερματίτιδα

0

0

0

0

1

1

0

0

0

0

1

1

0

0

0

0

Ραγοειδίτιδα Επιπεφυκίτιδα Κερατίτιδα Λεμφογαγγλιομεγαλία Ηπατομεγαλία Σπληνομεγαλία Δερματικά οζίδια Υποδόριοι όγκοι Ατροφία μασητηρίων μυών Πολυαρθρίτιδα Ελκώδης στοματίτιδα Επίσταξη Αποφολιδωτική δερματίτιδα Δερματικά έλκη Υπερκεράτωση ακρορρινίου Υπερκεράτωση πελματικών φυμάτων Ονυχογρύπωση

162

Πίνακας VI : Βαθμός έντασης των παθολογικών καταστάσεων που χαρακτηρίζουν τη λεϊσμανίωση του σκύλου στα ζώα της ομάδας Γ στο χρόνο 1 της μελέτης Γ1

Ζώα Παθολογικές καταστάσεις Κακή θρεπτική απίσχνανση Βλεφαρίτιδα

κατάσταση

Γ2

Γ3

Γ4

Γ5

Γ6

Γ7

Γ8

Γ9

Γ10

Γ11

Γ12

Γ13

Γ14

Γ15

Γ16

Β Α Θ Μ Ο Λ Ο Γ Η Σ Η -

1

0

0

0

1

0

0

0

0

0

1

0

1

0

0

1

Παρονυχία

0 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 2 0

1 0 1 0 0,5 0 0 0 0 0,5 0 0 0 1 0 0 0 1 0

0 0 0 0 0,5 0 0 0 0 0,5 0 0 0 0 0 2 2 2 0

1 0 1 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 1 0

1 0 1 0 2 0 0 0 0 1 0 0 0 2 1 2 1 1 1

1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0

0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 2 0

0 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0

1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

1 1 1,5 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 2 2 3 0

1,5 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 2 1 0,5 0

1 0 1 0 2 0 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0

1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0

1 2 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 2 0

Επιπολής ή εν τω βάθει βακτηριδιακή δερματίτιδα

1

0

1

0

0

0

0

0

0

0

1

1

0

0

0

0

Ραγοειδίτιδα Επιπεφυκίτιδα Κερατίτιδα Λεμφογαγγλιομεγαλία Ηπατομεγαλία Σπληνομεγαλία Δερματικά οζίδια Υποδόριοι όγκοι Ατροφία μασητηρίων μυών Πολυαρθρίτιδα Ελκώδης στοματίτιδα Επίσταξη Αποφολιδωτική δερματίτιδα Δερματικά έλκη Υπερκεράτωση ακρορρινίου Υπερκεράτωση πελματικών φυμάτων Ονυχογρύπωση

163

Πίνακας VII: Ημιποσοτική εκτίμηση του παρασιτικού φορτίου (L. infantum) σε επιχρίσματα από οπό λεμφογαγγλίου και μυελό των οστών στα 56 ζώα της μελέτης στους χρόνους 0, 1 και 2 Λεμφογάγγλιο / Μυελός των οστών Χρόνος 0 Χρόνος 1 Χρόνος 2

Ζώα Α1 Α2 Α3 Α4 Α5 Α6 Α7 Α8 Α9 Α10 Α11 Α12 Α13 Α14 Α15 Α16 Α17 Α18 Α19 Α20 Α21 Α22 Α23 Β1 Β2 Β3 Β4 Β5 Β6 Β7 Β8 Β9 Β10 Β11 Β12 Β13 Β14 Β15 Β16 Β17 Γ1 Γ2 Γ3 Γ4 Γ5 Γ6 Γ7 Γ8 Γ9 Γ10 Γ11 Γ12 Γ13 Γ14 Γ15 Γ16

0 +4 +3 +1 +4 +4 +3 +3 +3 +2 +3 +2 +3 +3 +3 +3 +4 +4 +3 +3 +2 +4 +3 +5 +4 +3 +3 0 +4 +4 +2 +5 +3 +3 +2 +4 +3 +3 +4 +4 +4 +4 +5 +3 +3 +3 +3 +3 +3 +3 +4 0 +4 +4 +3 +2

+2 +4 +4 +3 +4 +4 +4 +2 +4 +4 +4 +2 +3 +3 +4 +4 +4 +4 +4 +3 +3 +4 +4 +5 +4 +4 +4 +1 +4 +4 +1 +5 +4 +3 +4 +4 +2 +4 +4 +5 +4 +3 +4 +4 +4 +4 +3 +4 +4 +1 +5 +1 +3 +4 +3 +2

0 +3 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 +1 0 0 0 0 0 0 0 0 +4 +1 0 0 +2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 +2 +2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 +1 0 0 0 0 0

0 0 0 0 0 +2 0 +2 0 0 0 0 +2 +1 +1 0 0 +2 0 +1 +1 5 +2 0 0 +2 0 0 +1 0 0 +1 0 0 +1 +2 0 0 0 +2 +3 0 0 0 0 0 +1 0 +2 0 +2 0 0 +2 +2 +1

0 0 +2 0 0 0 * 0 0 0 0 0 0 * 0 0 * * 0 0 0 0 0 +3 0 0 0 0 0 * 0 0 +3 0 0 0 +1 * 0 +2 +2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 +2 0 0 0

0 0 +2 0 0 0 * 0 0 0 0 +1 0 * 0 0 * * 0 0 0 0 0 +4 0 0 0 0 0 * 0 +1 +4 0 0 0 +1 * 0 +2 +3 0 0 0 0 0 0 +1 0 0 0 +1 +2 0 0 0

* Τα ζώα αυτά δεν προσκομίστηκαν στο 2ο χρόνο από τους ιδιοκτήτες και ως εκ τούτου οι μετρήσεις δεν έγιναν

164

Πίνακας VIII: Αποτελέσματα της ορολογικής εξέτασης (IFAT) στον ορό του αίματος στα 56 ζώα της μελέτης στους χρόνους 0, 1 και 2 Ζώα Α1 Α2 Α3 Α4 Α5 Α6 Α7 Α8 Α9 Α10 Α11 Α12 Α13 Α14 Α15 Α16 Α17 Α18 Α19 Α20 Α21 Α22 Α23 Β1 Β2 Β3 Β4 Β5 Β6 Β7 Β8 Β9 Β10 Β11 Β12 Β13 Β14 Β15 Β16 Β17 Γ1 Γ2 Γ3 Γ4 Γ5 Γ6 Γ7 Γ8 Γ9 Γ10 Γ11 Γ12 Γ13 Γ14 Γ15 Γ16

Χρόνος 0

IFAT Χρόνος 1

Χρόνος 2

1/6400 1/6400 1/6400 1/6400 1/3200 1/3200 1/3200 1/1600 1/3200 1/3200 1/1600 1/3200 1/400 1/3200 1/6400 1/3200 1/3200 1/6400 1/1600 1/3200 1/3200 1/6400 1/3200 1/6400 1/6400 1/1600 1/3200 1/400 1/3200 1/6400 1/800 1/6400 1/3200 1/6400 1/3200 1/3200 1/3200 1/3200 1/1600 1/3200 1/3200 1/6400 1/3200 1/3200 1/3200 1/3200 1/3200 1/1600 1/3200 1/1600 1/3200 1/6400 1/800 1/6400 1/6400 1/12800

1/1600 1/1600 1/1600 1/3200 1/1600 1/3200 1/1600 1/800 1/1600 1/1600 1/800 1/1600 1/200 1/3200 1/3200 1/1600 1/800 1/6400 1/200 1/1600 1/1600 1/6400 1/400 1/6400 1/800 1/800 1/400 1/400 1/3200 1/1600 1/400 1/3200 1/1600 1/3200 1/800 1/1600 1/3200 1/800 1/800 1/3200 1/1600 1/3200 3200 1/1600 1/3200 1/1600 1/1600 1/200 1/1600 1/800 1/400 1/1600 1/800 1/6400 1/3200 1/6400

1/1600 1/400 1/1600 1/400 1/200 1/1600 * 1/800 1/800 1/800 1/800 1/800 1/200 * 1/800 1/800 * * 1/200 1/200 1/800 1/1600 1/100 1/3200 1/1600 1/800 1/400 1/400 1/1600 * 1/200 1/1600 1/1600 1/800 1/800 1/800 1/1600 * 1/400 1/800 1/800 1/800 1/6400 1/1600 1/800 1/1600 1/800 1/200 1/800 1/200 0 1/800 1/400 1/3200 1/800 1/3200

* Τα ζώα αυτά δεν προσκομίστηκαν στο 2ο χρόνο από τους ιδιοκτήτες και ως εκ τούτου οι μετρήσεις δεν έγιναν

165

Πίνακας IX: Αποτελέσματα της PCR στο μυελό των οστών στα 56 ζώα της μελέτης στους χρόνους 0, 1 και 2 PCR Ζώα Α1 Α2 Α3 Α4 Α5 Α6 Α7 Α8 Α9 Α10 Α11 Α12 Α13 Α14 Α15 Α16 Α17 Α18 Α19 Α20 Α21 Α22 Α23 Β1 Β2 Β3 Β4 Β5 Β6 Β7 Β8 Β9 Β10 Β11 Β12 Β13 Β14 Β15 Β16 Β17 Γ1 Γ2 Γ3 Γ4 Γ5 Γ6 Γ7 Γ8 Γ9 Γ10 Γ11 Γ12 Γ13 Γ14 Γ15 Γ16

Χρόνος 0

Χρόνος 1

Χρόνος 2

(+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+)

(+) (+) (+) (+) (-) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (-) (+) (+) (+) (-) (+) (+) (-) (+) (-) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+)

(+) (+) (+) (+) (-) (+) * (+) (+) (+) (+) (+) (+) * (+) (-) * * (-) (+) (+) (+) (-) (+) (+) (+) (-) (+) (+) * (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) * (+) (+) (+) (+) (+) (+) (-) (+) (+) (+) (+) (-) (-) (+) (+) (+) (+) (+)

* Τα ζώα αυτά δεν προσκομίστηκαν στο 2ο χρόνο από τους ιδιοκτήτες και ως εκ τούτου οι μετρήσεις δεν έγιναν

166

Πίνακας X: Οι τιμές του ρυθμού σπειραματικής διήθησης (ΡΣΔ) στα ζώα της ομάδας Α στους χρόνους 0, 1 και 2 Ζώα Α1 Α2 Α3 Α4 Α5 Α6 Α7 Α8 Α9 Α10 Α11 Α12 Α13 Α14 Α15 Α16 Α17 Α18 Α19 Α20 Α21 Α22 Α23

Ρυθμός σπειραματικής διήθησης (ml/min/kg) Χρόνος 0 Χρόνος 1 4,43 2,179 3,778 3,31 4,301 4,024 4,579 2,894 1,198 1,606 4,011 2,124 2,695 1,472 6,979 2,15 3,15 1,508 2,44 1,4 4,354 3,434 4,023 3,142 3,415 1,94 3,018 0,462 3,923 3,919 4,089 3,046 4,481 3,361 4,231 2,999 4,211 1,781 2,892 1,872 4,123 5,226 4,183 1,692 3,556 2,009

Χρόνος 2 3,722 3,889 3,644 3,854 4,16 4,058 * 4,289 3,345 4,75 4,23 5,65 4,182 * 3,996 3,893 * * 4,351 4,107 4,137 2,75 3,903

* Τα ζώα αυτά δεν προσκομίστηκαν στο 2ο χρόνο από τους ιδιοκτήτες και ως εκ τούτου οι μετρήσεις δεν έγιναν

167

Πίνακας ΧΙ: Οι τιμές του ρυθμού σπειραματικής διήθησης (ΡΣΔ) στα ζώα της ομάδας Β στους χρόνους 0, 1 και 2 Ζώα Β1 Β2 Β3 Β4 Β5 Β6 Β7 Β8 Β9 Β10 Β11 Β12 Β13 Β14 Β15 Β16 Β17

Ρυθμός σπειραματικής διήθησης (ml/min/kg) Χρόνος 0 Χρόνος 1 5,389 1,252 5,138 3,29 4,562 2,932 3,57 2,075 3,51 2,92 4,231 3,229 1,52 3,58 4,317 2,424 4,34 1,93 3,96 2,875 4,113 2,746 2,82 1,248 6,74 3,759 4,097 3,587 7,103 0,18 4,141 1,501 1,301 0,831

Χρόνος 2 3,875 3,901 4,195 2,424 1,836 3,931 * 4,228 3,004 4,332 3,966 1,941 4,728 4,003 * 4,18 0,632

* Τα ζώα αυτά δεν προσκομίστηκαν στο 2ο χρόνο από τους ιδιοκτήτες και ως εκ τούτου οι μετρήσεις δεν έγιναν

168

Πίνακας ΧΙΙ: Οι τιμές του ρυθμού σπειραματικής διήθησης (ΡΣΔ) στα ζώα της ομάδας Γ στους χρόνους 0, 1 και 2 Ζώα Γ1 Γ2 Γ3 Γ4 Γ5 Γ6 Γ7 Γ8 Γ9 Γ10 Γ11 Γ12 Γ13 Γ14 Γ15 Γ16

Ρυθμός σπειραματικής διήθησης (ml/min/kg) Χρόνος 0 Χρόνος 1 6,276 2,719 4,27 3,546 4,023 1,76 4,144 2,05 3,281 3,452 3,02 1,95 4,468 3,66 4,42 2,236 5,363 3,205 3,313 1,864 4,011 1,81 4,194 1,97 1,79 3,57 3,138 2,078 2,978 1,575 3,944 2,231

Χρόνος 2 4,222 4,117 3,972 3,296 1,68 1,68 4,024 3,862 4,136 3,628 3,518 4,172 4,002 4,014 3,783 3,721

169

Πίνακας ΧΙΙΙ: Συγκέντρωση του αζώτου ουρίας (SUN) και της κρεατινίνης στον ορό του αίματος στα ζώα της ομάδας Α στους χρόνους 0, 1 και 2 Ζώα Α1 Α2 Α3 Α4 Α5 Α6 Α7 Α8 Α9 Α10 Α11 Α12 Α13 Α14 Α15 Α16 Α17 Α18 Α19 Α20 Α21 Α22 Α23

SUN (mg/100 ml) Χρόνος 0 Χρόνος 1 Χρόνος 2 18 50 18 15 39 20 10 19 35 20 34 15 11 36 27 20 45 26 13 81 * 22 62 15 10 92 29 16 43 16 22 31 24 15 43 20 29 35 15 28 40 * 13 20 22 13 45 35 24 28 * 21 26 * 20 38 70 12 35 22 18 30 15 10 56 27 16 27 16

Κρεατινίνη (mg/100 ml) Χρόνος 0 Χρόνος 1 Χρόνος 2 1 1,9 1,1 1,2 1,5 1,2 1,1 1,1 1,2 1,1 1,5 1,1 1 2 1,2 1,1 2,1 1,2 1 1,6 * 1,2 1,9 1,1 1 2,7 1,3 1,2 2,1 1,2 1,1 1,6 1 1,1 1,6 1 1,2 1,4 1 1,3 1,8 * 1,1 1,1 1,2 1,1 2,1 1,5 1,3 1,2 * 0,9 1,3 * 1,1 1,9 1,7 1,1 1,4 1,3 1 1,4 1 1 2,3 1,1 1,2 1,3 1,1

* Τα ζώα αυτά δεν προσκομίστηκαν στο 2ο χρόνο από τους ιδιοκτήτες και ως εκ τούτου οι μετρήσεις δεν έγιναν

170

Πίνακας ΧΙV: Συγκέντρωση του αζώτου ουρίας (SUN) και της κρεατινίνης στον ορό του αίματος στα ζώα της ομάδας Β στους χρόνους 0, 1 και 2 Ζώα Β1 Β2 Β3 Β4 Β5 Β6 Β7 Β8 Β9 Β10 Β11 Β12 Β13 Β14 Β15 Β16 Β17

SUN (mg/100 ml) Χρόνος 0 Χρόνος 1 Χρόνος 2 10 13 28 20 25 17 10 57 22 20 41 20 30 33 55 30 30 22 30 74 * 28 41 29 11 66 25 25 22 31 10 42 29 10 58 24 15 21 24 17 20 18 15 32 * 30 30 12 30 84 121

Κρεατινίνη (mg/100 ml) Χρόνος 0 Χρόνος 1 Χρόνος 2 1,1 1,3 1,2 1,2 1,1 1,1 1 2,1 1,4 1,1 2,6 1,1 1,2 1,6 1,7 1 1,2 1,1 1,3 2,3 * 1,3 1,5 1,2 1,2 1,9 1,2 1,2 1 1,2 1 1,1 1,1 1 2,8 1,4 1 1,2 1,2 1,1 1,1 1,2 1,2 1,6 * 1,2 1,2 1,1 1,2 2,4 5,3

* Τα ζώα αυτά δεν προσκομίστηκαν στο 2ο χρόνο από τους ιδιοκτήτες και ως εκ τούτου οι μετρήσεις δεν έγιναν

171

Πίνακας XV: Συγκέντρωση του αζώτου ουρίας (SUN) και της κρεατινίνης στον ορό του αίματος στα ζώα της ομάδας Γ στους χρόνους 0, 1 και 2 Ζώα Γ1 Γ2 Γ3 Γ4 Γ5 Γ6 Γ7 Γ8 Γ9 Γ10 Γ11 Γ12 Γ13 Γ14 Γ15 Γ16

SUN (mg/100 ml) Χρόνος 0 Χρόνος 1 Χρόνος 2 17 43 28 23 30 20 14 21 17 30 26 25 15,7 24 27 29 40 60 23 25 20 26 27 22 30 55 22 28 78 12 27 68 62 20 37 16 15 27 13 28 54 22 22 23 21 22 32 14

Κρεατινίνη (mg/100 ml) Χρόνος 0 Χρόνος 1 Χρόνος 2 1 1,7 1,2 1,2 1,2 1,2 1,1 1 1,2 1,2 1,2 1,2 1,2 1,5 1,2 1,3 1,9 1,8 1,2 1,2 0,9 1,1 1,2 1,2 1,3 1,8 1,1 1,2 2 1,1 1,3 1,7 1,7 1,2 1,9 1,2 1 1,2 1,1 1,3 1,2 1,1 1,2 1,2 1 1,2 1,8 1

172

Πίνακας XVI: Συγκέντρωση του φωσφόρου (P) στον ορό του αίματος των ζώων της ομάδας Α στους χρόνους 0, 1 και 2 Ζώα Α1 Α2 Α3 Α4 Α5 Α6 Α7 Α8 Α9 Α10 Α11 Α12 Α13 Α14 Α15 Α16 Α17 Α18 Α19 Α20 Α21 Α22 Α23

Χρόνος 0 4,8 3,8 4,3 4,3 4,8 4,9 4,4 4,8 4,1 4,7 4,7 4,3 4,3 4,9 3,9 3,8 3,9 4,9 5 4,8 4,8 4,6 4,1

Φωσφόρος (mg/100 ml) Χρόνος 1 6,7 3,8 5,5 4,6 5 7 3,9 6,7 5,1 5 3,9 5 5,7 5,1 5,3 6 4,7 5,3 6,1 9,2 6,2 6 4,8

Χρόνος 2 5,4 4,1 4 5 5 5,5 * 5 5 4,9 4,6 5 4,8 * 4,6 4,6 * * 5,2 5,1 6 4,4 3,9

* Τα ζώα αυτά δεν προσκομίστηκαν στο 2ο χρόνο από τους ιδιοκτήτες και ως εκ τούτου οι μετρήσεις δεν έγιναν

173

Πίνακας XVII: Συγκέντρωση του φωσφόρου (P) στον ορό του αίματος των ζώων της ομάδας Β στους χρόνους 0, 1 και 2 Ζώα Β1 Β2 Β3 Β4 Β5 Β6 Β7 Β8 Β9 Β10 Β11 Β12 Β13 Β14 Β15 Β16 Β17

Χρόνος 0 5 4,6 4,6 3,8 4,3 4,3 5 4,6 4,8 4,5 3,9 4,4 4,4 5,5 3,7 6,5 5,5

Φωσφόρος (mg/100 ml) Χρόνος 1 4,9 5,1 7,2 5 4,5 4,9 4,4 4,8 5,3 4,3 5,3 4,3 4,8 5,9 5,2 3,6 8,1

Χρόνος 2 5 5 4,7 4,3 3,8 5 * 3,7 4,1 5 5,5 5,2 6,2 4,4 * 3 14,6

* Τα ζώα αυτά δεν προσκομίστηκαν στο 2ο χρόνο από τους ιδιοκτήτες και ως εκ τούτου οι μετρήσεις δεν έγιναν

174

Πίνακας XVIII: Συγκέντρωση του φωσφόρου (P) στον ορό του αίματος των ζώων της ομάδας Β στους χρόνους 0, 1 και 2 Ζώα Γ1 Γ2 Γ3 Γ4 Γ5 Γ6 Γ7 Γ8 Γ9 Γ10 Γ11 Γ12 Γ13 Γ14 Γ15 Γ16

Χρόνος 0 4,5 4 5 4,2 4,7 6,4 4,5 4,5 3,7 4,5 6,5 5 4,6 4,6 4,7 4,9

Φωσφόρος (mg/100 ml) Χρόνος 1 3,8 6,9 3,6 5,2 5,1 6 5,1 3,3 6,3 5,1 7,3 6,9 5 6,9 5,6 5,2

Χρόνος 2 4,4 4,7 4,4 5,2 5 3,9 4,3 4,5 5 3,7 3 5,6 6 6,4 4,9 5,9

175

Πίνακας XIX: Οι τιμές του ειδικού βάρους των ούρων στα ζώα της ομάδας Α στους χρόνους 0, 1 και 2 Ζώα Α1 Α2 Α3 Α4 Α5 Α6 Α7 Α8 Α9 Α10 Α11 Α12 Α13 Α14 Α15 Α16 Α17 Α18 Α19 Α20 Α21 Α22 Α23

Χρόνος 0 1030 1039 1030 1035 1047 1035 1040 1034 1035 1055 1030 1040 1051 1030 1036 1050 1035 1030 1040 1032 1035 1040 1046

Ειδικό Βάρος Χρόνος 1 1023 1011 1025 1016 1026 1011 1024 1009 1030 1004 1015 1017 1016 1018 1026 1020 1050 1014 1010 1022 1025 1012 1010

Χρόνος 2 1032 1027 1030 1050 1040 1038 * 1047 1041 1045 1042 1026 1048 * 1037 1020 * * 1040 1030 1046 1038 1054

* Τα ζώα αυτά δεν προσκομίστηκαν στο 2ο χρόνο από τους ιδιοκτήτες και ως εκ τούτου οι μετρήσεις δεν έγιναν

176

Πίνακας XX: Οι τιμές του ειδικού βάρους των ούρων στα ζώα της ομάδας Β στους χρόνους 0, 1 και 2 Ζώα Β1 Β2 Β3 Β4 Β5 Β6 Β7 Β8 Β9 Β10 Β11 Β12 Β13 Β14 Β15 Β16 Β17

Χρόνος 0 1031 1047 1030 1051 1040 1032 1036 1034 1035 1040 1035 1034 1030 1038 1040 1052 1034

Ειδικό βάρος Χρόνος 1 1016 1028 1023 1019 1007 1020 1023 1021 1013 1016 1039 1007 1015 1026 1028 1024 1016

Χρόνος 2 1035 1039 1050 1032 1055 1045 * 1033 1030 1022 1037 1020 1052 1034 * 1042 1016

* Τα ζώα αυτά δεν προσκομίστηκαν στο 2ο χρόνο από τους ιδιοκτήτες και ως εκ τούτου οι μετρήσεις δεν έγιναν

177

Πίνακας XXI: Οι τιμές του ειδικού βάρους των ούρων στα ζώα της ομάδας Γ στους χρόνους 0, 1 και 2 Ζώα Γ1 Γ2 Γ3 Γ4 Γ5 Γ6 Γ7 Γ8 Γ9 Γ10 Γ11 Γ12 Γ13 Γ14 Γ15 Γ16

Χρόνος 0 1047 1051 1030 1031 1032 1034 1035 1050 1036 1050 1030 1039 1044 1045 1037 1030

Ειδικό βάρος Χρόνος 1 1025 1026 1016 1022 1017 1035 1030 1016 1015 1032 1009 1017 1021 1017 1018 1012

Χρόνος 2 1041 1037 1042 1044 1010 1026 1042 1025 1042 1055 1026 1017 1041 1026 1042 1029

178

Πίνακας XXII: Ευρήματα από τη μικροσκόπηση του ιζήματος των ούρων στα ζώα της ομάδας Α στους χρόνους 0, 1 και 2 Ζώα Α1 Α2 Α3 Α4 Α5 Α6 Α7 Α8 Α9 Α10 Α11 Α12 Α13 Α14 Α15 Α16 Α17 Α18 Α19 Α20 Α21 Α22 Α23

Χρόνος 0 1 2 0 0 0 0 2 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0

Ίζημα ούρων Χρόνος 1 0 2 0 0 1 0 4 0 0 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

Χρόνος 2 0 0 0 0 0 5 * 0 0 0 0 0 0 * 0 5 * * 0 0 0 5 0

* Τα ζώα αυτά δεν προσκομίστηκαν στο 2ο χρόνο από τους ιδιοκτήτες και ως εκ τούτου οι μετρήσεις δεν έγιναν

0: κανένα εύρημα 1: μικροσκοπική αιματουρία 2. σπερματοζωάρια 3. σπερματοζωάρια + μικροσκοπική αιματουρία 4. υελοκοκκιώδεις - κοκκιώδεις κύλινδροι 5. κρύσταλλοι ξανθίνης

179

Πίνακας XXIII: Ευρήματα από τη μικροσκόπηση του ιζήματος των ούρων στα ζώα της ομάδας Β στους χρόνους 0, 1 και 2 Ζώα Β1 Β2 Β3 Β4 Β5 Β6 Β7 Β8 Β9 Β10 Β11 Β12 Β13 Β14 Β15 Β16 Β17

Χρόνος 0 2 0 0 4 0 0 4 0 0 3 0 1 4 0 4 0 0

Ίζημα Χρόνος 1 3 0 0 2 4 0 1 0 4 4 4 0 0 0 0 2 0

Χρόνος 2 0 0 0 0 4 0 * 0 4 1 1 0 0 5 * 2 0

* Τα ζώα αυτά δεν προσκομίστηκαν στο 2ο χρόνο από τους ιδιοκτήτες και ως εκ τούτου οι μετρήσεις δεν έγιναν

0: κανένα εύρημα 1: μικροσκοπική αιματουρία 2. σπερματοζωάρια 3. σπερματοζωάρια + μικροσκοπική αιματουρία 4. υελοκοκκιώδεις - κοκκιώδεις κύλινδροι 5. κρύσταλλοι ξανθίνης

180

Πίνακας XXIV: Ευρήματα από τη μικροσκόπηση του ιζήματος των ούρων στα ζώα της ομάδας Γ στους χρόνους 0, 1 και 2 Ζώα Γ1 Γ2 Γ3 Γ4 Γ5 Γ6 Γ7 Γ8 Γ9 Γ10 Γ11 Γ12 Γ13 Γ14 Γ15 Γ16

Χρόνος 0 0 4 0 0 4 0 2 4 0 0 1 1 0 0 0 0

Ίζημα Χρόνος 1 3 0 0 0 4 0 0 0 0 4 0 0 0 0 0 0

Χρόνος 2 4 0 0 0 1 0 0 1 0 0 4 1 0 0 0 0

0: κανένα εύρημα 1: μικροσκοπική αιματουρία 2. σπερματοζωάρια 3. σπερματοζωάρια + μικροσκοπική αιματουρία 4. υελοκοκκιώδεις - κοκκιώδεις κύλινδροι 5. κρύσταλλοι ξανθίνης

181

Πίνακας XXV: Οι τιμές του λόγου Up/c στα ζώα της ομάδας Β στους χρόνους 0, 1 και 2 Up/c Ζώα Χρόνος 0 Χρόνος 1 Χρόνος 2 2,05 1,98 2,58 Β1 2,75 2,25 2,35 Β2 3,22 1,43 2,86 Β3 2,02 1,83 1,06 Β4 2,7 3,85 1,13 Β5 2 1,5 1,18 Β6 13,4 2,54 Β7 * 5,01 1,36 1,17 Β8 1,03 2,13 2,02 Β9 5,4 3,63 2,07 Β10 5,78 2,28 2,11 Β11 7,69 3,6 1,9 Β12 3,67 2,5 1,94 Β13 3,27 2,82 11,5 Β14 4,02 2,28 Β15 * 4,11 1,67 2,24 Β16 33,33 5,21 9,14 Β17 Πίνακας XXVI: Οι τιμές του λόγου Up/c στα ζώα της ομάδας Γ στους χρόνους 0, 1 και 2 Up/c Ζώα Χρόνος 0 Χρόνος 1 Χρόνος 2 1,6 0,2 0,53 Γ1 10,2 4,13 2,06 Γ2 1,72 0,92 0,43 Γ3 3,5 2,89 1,09 Γ4 2,9 1,78 1,07 Γ5 7,6 2,5 1,67 Γ6 3,84 1,65 1,52 Γ7 9,18 9,63 3,21 Γ8 10,62 6,24 1,65 Γ9 2,98 1,67 1,32 Γ10 10,57 4,48 3,42 Γ11 1,15 0,41 0,63 Γ12 4,23 5,51 1,22 Γ13 1,36 1,02 0,98 Γ14 3,27 2,43 1,23 Γ15 4,89 2,55 3,78 Γ16 * Τα ζώα αυτά δεν προσκομίστηκαν στο 2ο χρόνο από τους ιδιοκτήτες και ως εκ τούτου οι μετρήσεις δεν έγιναν

182

Πίνακας XXVII: Συγκέντρωση των λευκωματινών και της χοληστερόλης στον ορό του αίματος στα ζώα της ομάδας Β στους χρόνους 0, 1 και 2 Ζώα Λευκωματίνες (g/100 ml) Χοληστερόλη (mg/100 ml) Χρόνος 0 Χρόνος 1 Χρόνος 2 Χρόνος 0 Χρόνος 1 Χρόνος 2 2,1 2,9 1,7 150 310 115 Β1 2,5 3,5 3,2 135 220 230 Β2 2,6 3,1 3,1 142 280 131 Β3 2,2 2,9 3 120 130 250 Β4 3,4 3,5 3,1 185 165 240 Β5 3 3,1 3,3 223 165 195 Β6 2,1 2,8 230 139 Β7 * * 3,1 3,2 3,5 240 250 230 Β8 2,4 3,3 3 200 232 158 Β9 2,5 2,9 3,3 320 167 176 Β10 2,8 2,2 2,7 240 240 340 Β11 2 2,9 2,8 135 242 154 Β12 2,8 3,3 3 100 256 235 Β13 2,6 3,5 3 230 190 175 Β14 3,3 3,2 184 256 Β15 * * 2,8 3,1 3,2 315 200 152 Β16 1,6 1,9 2,7 115 110 288 Β17 Πίνακας XXVIII: Συγκέντρωση των λευκωματινών και της χοληστερόλης στον ορό του αίματος στα ζώα της ομάδας Γ στους χρόνους 0, 1 και 2 Ζώα Λευκωματίνες (g/100 ml) Χοληστερόλη (mg/100 ml) Χρόνος 0 Χρόνος 1 Χρόνος 2 Χρόνος 0 Χρόνος 1 Χρόνος 2 2,8 3 3,1 342 184 270 Γ1 2,8 3,1 3 300 300 135 Γ2 2 2,6 2,9 185 170 160 Γ3 2,3 2,8 3,5 315 230 230 Γ4 2,5 3 3,1 95 150 200 Γ5 2,1 2,8 3,1 305 130 220 Γ6 2,6 2,2 3,1 305 286 300 Γ7 2,2 2,3 3,2 195 210 320 Γ8 3,1 2,7 3,1 103 260 150 Γ9 3 3,5 3,4 205 232 212 Γ10 2,3 2,8 3 305 223 206 Γ11 2,7 3,7 2,8 110 190 400 Γ12 3 3,4 3,3 210 182 160 Γ13 2,6 2,4 2,7 160 264 170 Γ14 3,1 3,2 3,1 200 205 103 Γ15 2,8 2,9 3,1 215 135 126 Γ16 * Τα ζώα αυτά δεν προσκομίστηκαν στο 2ο χρόνο από τους ιδιοκτήτες και ως εκ τούτου οι μετρήσεις δεν έγιναν

183

Πίνακας XXIX: Ανεπιθύμητες ενέργειες της θεραπευτικής αγωγής με αμφοτερικίνη Β στους 56 σκύλους της μελέτης Ζώα Α1 Α2 Α3 Α4 Α5 Α6 Α7 Α8 Α9 Α10 Α11 Α12 Α13 Α14 Α15 Α16 Α17 Α18 Α19 Α20 Α21 Α22 Α23 Β1 Β2 Β3 Β4 Β5 Β6 Β7 Β8 Β9 Β10 Β11 Β12 Β13 Β14 Β15 Β16 Β17 Γ1 Γ2 Γ3 Γ4 Γ5 Γ6 Γ7 Γ8 Γ9 Γ10 Γ11 Γ12 Γ13 Γ14 Γ15 Γ16

Ανεπιθύμητες ενέργειες Πολυουρία – πολυδιψία Έμετος (-) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (-) (+) (+) (+) (-) (+) (+) (+) (-) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (-) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+)

(-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (+) (-) (-) (-) (-) (+) (-) (-) (-) (-) (-) (+) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (+) (-) (-) (+) (-) (-) (-) (-) (+) (-) (-) (-) (-) (-) (-)

Μυϊκός τρόμος (-) (+) (-) (+) (-) (-) (+) (-) (-) (+) (+) (-) (-) (+) (+) (-) (+) (-) (-) (+) (-) (-) (+) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (+) (-) (-) (+) (+) (-) (-) (+) (-) (-) (-) (-) (+) (-) (+) (+) (-) (-) (+) (+) (-) (+) (+) (+) (+) (-) (+)

184

ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ

1.

Abranches P, Silva – Pereira MC, Conceicao – Silva FM, Santos – Gomes GM, Janz JG. Canine leishmaniasis: pathological and ecological factors influencing transmission of infection. J Parasitol 1991, 77: 557 – 561.

2.

Abrass CK. Clinical spectrum and complications of the nephrotic syndrome. J Invest Med 1997, 45: 143 – 153.

3.

Adams LG, Polzin DJ, Osborne CA, O’Brien TD. Correlation of urine Protein/Creatinine ratio and twenty-four-hour urinary protein excretion in normal cats and cats with surgically induced chronic renal failure. J Vet Intern Med 1992, 6: 36 – 40.

4.

Alexander J and Russell DG. The interaction of leishmania species with macrophages. Adv Parasitol 1992, 31: 175 – 254.

5.

Allen TA, Wilke WL, Fettman MJ. Captopril and enalapril: angiotensin converting enzyme inhibitors. J Am Vet Med Assoc 1987, 190: 94 – 96.

6.

Altet L, Francino O, Solano – Gallego L, Renier C, Sanchez A. Mapping and sequencing of the canine NRAMP1 gene and identification of mutations in leishmaniasis – susceptible dogs. Infect Immun 2002, 70: 2763 – 2771.

7.

Alvar J, Molina R, San Andres M, Tesouro M., Nieto J, Vitutia M, Gonzalez F, San Andres MD, Boggio J, Rodriguez F. Canine leishmaniasis : clinical, parasitological and entomological follow-up after chemotherapy. Ann Trop Med Parasitol 1994, 88: 371 – 378.

8.

Ashford DA, Bozza M, Freire M, Miranda JC, Sherlock I, Eulalio C, Lopes U, Fernandes O, Degrave W, Barker RH, Jr. Comparison of the polymerase chain reaction and serology for the detection of canine visceral leishmaniasis. Am J Trop Med Hyg 1995, 53: 251 – 255.

9.

Atkins CE, Brown WA, Coats JR, Crawford MA, DeFrancesco TC, Edwards J, Fox PR, Keene BW, Lehmkuhl L, Luethy M, Meurs K, Petrie JP, Pipers F, Rosenthal S, Sidley JA, Straus J. Effects of long-term administration of enalapril on clinical indicators of renal function in dogs with compensated mitral regurgitation. J Am Vet Med Assoc 2002, 221: 654 – 658.

185

10.

Bais R and Philcox M. Approved methods for measurement of catalytic concentration of enzymes. Part 8. IFCC method for lactate dehydrogenase. Eur J Clin Chem Clin Biochem 1994, 32: 639 – 644.

11.

Baneth G and Shaw SE. Chemotherapy of canine leishmaniosis. Vet Parasitol 2002, 106: 315 – 324.

12.

Baneth G, Day MJ, Roura X, Shaw S. Leishmaniosis. In: Arthropod – borne Infectious Diseases of the Dog and Cat. Shaw S and Day MJ (eds), Manson Publishing, London, UK, 2005, pp. 89 – 99.

13.

Baneth G. Leishmaniasis. In: Infectious Diseases of the Dog and Cat, 3rd ed. GE Greene (eds), Saunders company, Philadelphia, 2005, pp. 685 – 695.

14.

Barham D and Trinder P. Improved colour reagent for determination of blood glucose by oxidase system. Analyst 1972, 97: 142 – 145.

15.

Barnes JC, Stanley O, Craig TM. Diffuse cutaneous leishmaniasis in a cat. J Am Vet Med Assoc 1993, 202: 416 – 418.

16.

Bartles H, Bohmer M, Heirli C. Serum kreatininbestimung oline Enteiweissen. Clin Chim Acta 1972, 37: 193 – 197.

17.

Bau P, Bolard J, Dupouy-Camet J. Heated amphotericin to treat leishmaniasis. Lancet Infect Dis 2003, 3: 188.

18.

Belazzoug S. Leishmaniasis in Mediterranean countries. Vet Parasitol 1992, 44: 15 – 19.

19.

Belkaid Y, Mendez S, Lira R, Kadambi N, Milon G, Sacks D. A natural model of Leishmania major infection reveals a prolonged “silent” phase of parasite amplification in the skin before the onset of lesion formation and immunity. J Immunol 2000, 165: 969 – 997.

20.

Bell NH, Andriole VT, Sabesin SM, Utz JP. On the nephrotoxicity of amphotericin B in man. Am J Med 1962, 33: 64 – 69.

21.

Benderitter TH, Casanova P, Nashkidachvili L, Quilici M. Glomerulonephritis in dogs with canine leishmaniasis. Ann Trop Med Parasitol 1988, 82: 335 – 341.

22.

Bergeaud P. L’ apport de la corticotherapie dans le traitment de certaines formes de leishmaniose canine: Resultats sur une serie de quarante – troise cas. Prat Med Chir Anim Comp 1988, 5: S121 – 6.

186

23.

Berrahal F, Mary C, Roze M, Berenger A, Escoffier K, Lamouroux D, Dunan S. Canine leishmaniasis: identification of asymptomatic carriers by polymerase chain reaction and immunoblotting. Am J Trop Med Hyg 1996, 55: 273 – 277.

24.

Biancardi P, Fasanella A, Foglia Manzillo V, Trotta T, Pagano A, Sorino S, Gradoni L, Oliva G. The efficacy of enrofloxacin, alone or combined with metronidazole, in the therapy of canine leishmaniasis. Parasitol Res 2004, 93: 486 – 492.

25.

Biewenga WI, Gruys E, Hendriks HI. Urinary protein loss in the dog: nephrological study of 29 dogs without signs of renal disease. Res Vet Sci 1983, 33: 366 – 374.

26.

Blavier A, Keroack S, Denerolle P. Αtypical forms of canine leishmaniasis. Vet J 2001, 162: 108 – 120.

27.

Boltz DF and Lueck CH. Phosphorus. In: Colorimetric determinations of nonmetals, Boltz DF (eds), Interscience Publ, New York, 1958, pp. 41 – 46.

28.

Boothe D. Treatment of Fungal Infections. In: Small Animal Clinical Pharmacology and Therapeutics. Boothe D (eds), Saunders company, Philadelphia, 2001, pp. 223 – 227.

29.

Bourdoiseau G, Bonnefont C, Hoareau E, Boehringer C, Stolle T, Chabanne L. Specific IgG1 and IgG2 antibody and lymphocyte subset levels in naturally Leishmania infantum – infected treated and untreated dogs. Vet Immunol Immunopathol 1997, 59: 21 – 30.

30.

Bourdoiseau G, Marchal T, Magnol JP. Immunohistochemical detection of Leishmania infantum in canine skin and lymph nodes. In: Advances in Veterinary Dermatology, Kwochka KW, Willemse T, von Tscharner C (eds), Butterworth – Heinemann, Oxford, 1998, pp. 514.

31.

Bovee KC and Joyce T. Clinical evaluation of glomerular function: 24 – hour creatinine clearance in dogs. J Am Vet Med Assoc 1979, 174: 488 – 491.

32.

Bravo L, Frank LA, Brenneman KA. Canine Leishmaniasis in the United States. Comp Cont Ed Pract Vet 1993, 15: 69 – 71.

33.

Bray RS and Alexander J. Leishmania and the macrophage. In: The Leishmaniasis in Biology and Medicine. Vol I Biology and Epidemiology, Peters W and Killick – Kendrick R (eds), Academic Press, London, 1987, pp. 211 – 233. 187

34.

Brown SA, Walton CL, Crawford P, Bakris GL. Long-term effects of antihypertensive regimens on renal hemodynamics and proteinuria. Kidney Int 1993, 43: 1210 – 1218.

35.

Brown SA. Primary diseases of glomeruli. In: Canine and Feline Nephrology and Urology, Osborne CA and Finco DR (eds), Williams &

Wilkins,

Baltimore, 1995, pp. 368 – 385. 36.

Buracco P, Abate O, Guglielmino R, Morello E. Osteomyelitis and arthrosynovitis associated with Leishmania donovani infection in a dog. J Small Anim Pract 1988, 38: 29 – 30.

37.

Burton CJ, Combe C, Walls J, Harris KP. Secretion of chemokines and cytokines by human tubular epithelial cells in response to proteins. Nephrol Dial Transplant 1999, 14: 2628 – 2633.

38.

Bush BM. Electrolytes and metals: Plasma inorganic phosphate. In: Interpretation of Laboratory Results for Small Animal Clinicians. Blackwell Scientific Publications, Oxford, 1991, pp. 376 - 381.

39.

Cabral M, O’ Grady JE, Gomes S, Sousa JC, Thompson H, Alexander J. The immunology of canine leishmaniosis: strong evidence for a developing disease spectrum from asymptomatic dogs. Vet Parasitol 1998, 76: 173 – 180.

40.

Caillot D, Casasnovas O, Solary E, Chavanet P, Bonnotte B, Reny G, Entezam F, Lopez J, Bonnin A, Guy H. Efficacy and tolerance of an amphotericin B lipid (Intralipid) emulsion in the treatment of candidaemia in neutropenic patients. J Antimicrob Chemother 1993, 31: 161 – 169.

41.

Caillot D, Reny G, Solary E, Casasnovas O, Chavanet P, Bonnotte B, Perello L, Dumas M, Entezam F, Guy H. A controlled trial of the tolerance of amphotericin B infused in dextrose or in Intralipid in patients with haematological malignancies. J Antimicrob Chemother 1994, 33: 603 – 613.

42.

Cardoso L, Neto F, Sousa JC, Rodrigues M, Cabral M. Use of a leishmanin skin test in the detection of canine Leishmania – specific cellular immunity. Vet Parasitol 1998, 79: 213 – 220.

43.

Carrasco L, de Lara FC, Martin E, Hervas J, Molleda JM, Gomez – Villamandos JC, Lopez R. Acute haemorrhagic pancreatitis associated with canine visceral leishmaniasis. Vet Rec 1997, 141: 519 – 521.

188

44.

Cascio A, di Martino L, Occorsio P, Giacchino R, Catania S, Gigliotti AR, Aiassa C, Iaria C, Giordano S, Colomba C, Polara VF, Titone L, Gradoni L, Gramiccia M, Antinori S. A 6 day course of liposomal amphotericin B in the treatment of infantile visceral leishmaniasis: the Italian experience. J Antimicrob Chemother 2004, 54: 217 – 220.

45.

Cavaliero T, Arnold P, Mathis A, Glaus T, Hofmann – Lehmann R, Deplazes P. Clinical, serologic and parasitologic follow-up after long term allopurinol therapy of dogs naturally infected with Leishmania infantum. J Vet Int Med 1999, 13: 330 – 334.

46.

Center SA, Smith CA, Wilkinson E, Erb HN, Lewis RM. Clinicopathologic, renal immunofluorescent, and light microscopic features of glomerulonephritis in the dog: 41 cases (1975 – 1985). J Am Vet Med Assoc 1987, 190: 81 – 90.

47.

Center

SA,

Wilkinson

E,

Smith

CA,

Lewis

RM.

24-Hour

urine

protein/creatinine ratio in dogs with protein-losing nephropathies. J Am Vet Med Assoc 1985, 187: 820 – 824. 48.

Chang KP, Fong D, Bray RS. Biology of Leishmania and leishmaniasis. In: Leishmaniasis, Chang KP and Bray RS (eds), Elsevier Science, Amsterdam, 1985, pp. 1 – 30.

49.

Chaniotis B, Gozalo Garcia G, Tselentis Y. Leishmaniasis in Greater Athens, Greece. Entomological studies. Ann Trop Med Parasitol 1994, 88: 659 – 663.

50.

Chavanet PY, Garry I, Charlier N, Caillot D, Kissterman J-P, D’Athis MI, Portier H. Trial of glucose versus fat emulsion in preparation of amphotericin for use in HIV infected patients with candidiasis. Brit Med J 1992, 305: 921 – 925.

51.

Chulay JD and Bryceson AD. Quantitation of amastigotes of Leishmania donovani in smears of splenic aspirates from patiens with visceral leishmaniasis. Am J Trop Med Hyg 1983, 32: 475 – 479.

52.

Ciaramella P and Corona M. Canine leishmaniasis: clinical and diagnostic aspects. Comp Cont Ed Pract Vet 2003, 25: 358 – 368.

53.

Ciaramella P, Oliva G, Luna RD, Gradoni L, Ambrosio R, Cortese L, Scalone A, Persechino A. A retrospective clinical study of canine leishmaniasis in 150 dogs naturally infected by Leishmania infantum. Vet Rec 1997, 141: 539 – 543.

189

54.

Cook AK and Cowgill LD. Clinical and pathological features of protein-losing glomerular disease in the dog: a review of 137 cases (1985 – 1992). J Am Anim Hosp Assoc 1996, 32: 313 – 322.

55.

Cortadellas O. Initial and long term efficacy of a lipid emulsion of amphotericin B desoxycholate in the management of canine leishmaniasis. J Vet Intern Med 2003, 17: 808 – 812.

56.

Cortese L, Oliva G, Ciaramella P, Persechino A, Restucci B. Primary hypothyroidism associated with leishmaniasis in a dog. J Am Anim Hosp Assoc 1999, 35: 487 – 492.

57.

Costa FAL, Goto H, Saldagna LC, Silva SM, Sinhorini IL, Silva TC, Guerra JL. Histopathologic patterns of nephropathy in naturally acquired canine visceral leishmaniasis. Vet Pathol 2003, 40: 677 – 684.

58.

Cotran RS, Kumar V, Collins T. Robbins’ pathologic basis of disease. Saunders company, Philadelphia, 1999.

59.

Cowgill LD. Clinical significance, diagnosis and management of systemic hypertension in dogs and cats. In: Managing Renal Disease and Hypertension. Hill’s Pet Products and Harmon Smith, pp. 35 – 44.

60.

Cruz I, Morales MA, Noguer I, Rodriguez A, Alvar J. Leishmania in discarded syringes from intravenous drug users. Lancet 2002, 359: 1124 – 1125.

61.

D’Ambrosio C, Gallo C, Agresti A. Il ketoconazolo nella terapia della leishmaniosi del cane. Atti SISVET 1986, 40: 492 – 496.

62.

D’Amico G and Bazzi C. Pathophysiology of proteinuria. Kidney Int 2003, 63: 809 – 825.

63.

Day MJ. Interaction of the host immune system with arthropods and arthropod – borne infectious agents. In: Arthropod – borne Infectious Diseases of the Dog and Cat. Shaw S and Day MJ (eds), Manson Publishing, London, UK, 2005, pp. 30 – 40.

64.

de Jong PE, Anderson S, de Zeeuw D. Glomerular preload and afterload reduction as a tool to lower urinary protein leakage: Will such treatments also help to improve renal function outcome? J Am Soc Nephrol 1993, 3: 1333 – 1341.

190

65.

Denerolle P and Bourdoiseau G. Combination allopurinol and antimony treatment versus antimony alone and allopurinol alone in the treatment of canine leishmaniasis (96 cases). J Vet Intern Med 1999, 13: 413 – 415.

66.

Denerolle P. Leishmaniose canine: difficultes du diagnostic et du traitement. Prat Med Chir Anim Comp 1996, 31 : 137 – 45.

67.

Deplazes P, Arnold P, Skaggs J, Gessler M. [Parasitological and immunological progress control during and after chemotherapy of canine leishmaniasis]. Schweiz Arch Tierheilkd 1992, 134: 85 – 93.

68.

Deplazes P, Galrimm F, Papaprodromou M, Cavaliero T, Gramiccia M, Christofi G, Christofi N, Economides P, Eckert J. Canine leishmaniosis in Cyprus due to Leishmania infantum MON 1. Acta Trop 1998, 71 : 169 – 178.

69.

Deray G. Amphotericin B nephrotoxicity. J Antim Chemother 2002, 49: 37 – 41.

70.

Dereure J, Pratlong F, Dedet JP. Geographical distribution and the identification of parasites causing canine leishmaniasis in the Mediterranean Basin. Proceedings of the International Canine Leishmaniasis Forum, Barcelona, Spain, 1999, pp. 18 – 25.

71.

DiBartola SP, Tarr MJ, Parker AT, Powers JD, Pultz JA. Clinicopathologic findings in dogs with renal amyloidosis: 59 cases (1976 – 1986). J Am Vet Med Assoc 1989, 195: 358 – 364.

72.

DiBartola SP. Clinical approach and laboratory evaluation of renal disease. In: Textbook of Veterinary Internal Medicine, Ettinger SJ and Feldman EC (eds), Saunders company, Philadelphia, 2000, pp. 1600 – 1614.

73.

Dietze R, Barros GB, Teixeira L, Harris J, Michelson K, Falqueto A, Corey R. Effect of eliminating seropositive canines on the transmission of visceral leishmaniasis in Brazil. Clin Infect Dis 1997, 25: 1240 – 1242.

74.

DiGiorgio C, Faraut-Gambarelli F, Imbert A, Minodier P, Gasquet M, Dumon H. Flow cytometric assessment of amphotericin B susceptibility in Leishmania infantum isolates from patients with visceral leishmaniasis. J Antimicrob Chemother 1999, 44: 71 – 76.

75.

Dillon JJ. Angiotensin – converting enzyme inhibitors an angiotensin receptor blockers for IgA nephropathy. Semin Nephrol 2004, 24: 218 – 224.

191

76.

Doumas BT, Watson WA, Biggs HG. Albumin standards and the measurement of serum albumin with bromocresol green. Clin Chem 1971, 31: 37 – 96.

77.

Ellis ME, al-Hokail AA, Clink HM, Padmos MA, Ernst P, Spence DG, Tharpe WN, Hillier VF. Double-blinded randomized study of the effect of infusion rates on toxicity of amphotericin B. Antimicrob Agents Chemother 1992, 36: 172 – 179.

78.

Engwerda CR and Kaye PM. Organ – specific immune responses associated with infectious disease. Immunology Today 2000, 21: 73 – 77.

79.

Epstein M. Aldosterone as a mediator of progressive renal disease; pathogenic and clinical implications. Am J Kid Dis 2001, 37: 677 – 688.

80.

Eriksson U, Seifert B, Schaffner A. Comparison of effects of amphotericin B deoxycholate infused over 4 or 24 hours: randomized controlled trial. Br Med J 2001, 322: 579 – 582.

81.

Faraut-Gambarelli F, Piarroux R, Deniau M, Giusiano B, Marty P, Michel G, Faugere B, Dumon H. In vitro and in vivo resistance of Leishmania infantum to meglumine antimoniate: a study of 37 strains collected from patients with visceral leishmaniasis. Antimicrob Agents Chemother 1997, 41: 827 – 830.

82.

Fawcett JK and Scott JE. A rapid and precise method for the determination of urea. J Clin Pathol 1960, 13: 156 – 159.

83.

Ferrari P, Marti HP, Pfister M, Frey FJ. Additive antiproteinuric effect of combined ACE inhibition and angiotensin II receptor blockade. J Hypertens 2002, 20: 125 – 130.

84.

Ferrer L, Rabanal RM, Domingo M, Ramos JA, Fondevila D. Identification of Leishmania donovani amastigotes in canine tissues by immunoperoxidase staining. Res Vet Sci 1988, 44: 194 – 196.

85.

Ferrer L, Juanola B, Ramos JA, Ramis A. Chronic colitis due to Leishmania infection in two dogs. Vet Pathol 1991, 28: 342 – 343.

86.

Ferrer L. Leishmaniasis. In: Kirk’s current veterinary therapy XI, Kirk RW and Bonagura JD (eds), Saunders company, Philadelphia, 1992, pp. 266 – 270.

87.

Ferrer L. Leishmaniasis: update in diagnosis and therapy. 14th Annual Congress ESVD – ECVD, 1997, pp. 33 – 36.

88.

Ferrer L. Clinical aspects of canine Leishmaniasis. Proceedings of the International Canine Leishmaniasis Forum, Barcelona, Spain 1999, pp. 6 – 10. 192

89.

Ferrer L. The pathology of canine leishmaniasis. Proceedings of the Second International Canine Leishmaniasis Forum, Sevilla, Spain, 2002, pp. 21 – 24.

90.

Finco DR. Simultaneous determination of phenosulfonophtalein excretion and endogenous creatinine clearance in the normal dog. J Am Vet Med Assoc 1971, 159: 336 – 340.

91.

Finco DR, Coulter DB, Barsanti JA. Simple, accurate method for clinical estimation of glomerular filtration rate in the dog. Am J Vet Res 1981, 42: 1874 – 1877.

92.

Finco DR, Brown SA, Crowell WA, Barsanti JA. Exogenous creatinine clearance as a measure of glomerular filtration rate in dogs with reduced renal mass. Am J Vet Res 1991, 52: 1029 – 1032.

93.

Finco DR, Tabaru H, Brown SA, Barsanti JA. Endogenous creatinine clearance measurement of glomerular filtration rate in dogs. Am J Vet Res 1993, 54: 1575 – 1578.

94.

Finco DR. Evaluation of renal functions. In: Canine and Feline Nephrology and Urology, Osborne CA and Finco DR (eds), Williams & Wilkins, Baltimore, 1995a, pp. 216 – 229.

95.

Finco DR. Applied physiology of the kidney. In: Canine and Feline Nephrology and Urology, Osborne CA and Finco DR (eds), Williams & Wilkins, Baltimore, 1995b, pp. 29 – 46.

96.

Finco DR. Urinary protein loss. In: Canine and Feline Nephrology and Urology, Osborne CA and Finco DR (eds), William & Wilkins, Baltimore, 1995c, pp. 211 – 215.

97.

Finco DR, Brown SA, Brown CA, Crowell WA, Cooper TA, Barsanti JA. Progression of chronic renal disease in the dog. J Vet Int Med 1999, 13: 516 – 528.

98.

Font A, Durall N, Domingo N, Closa JM, Mascort J, Ferrer L. Cardiac Tamponade in a Dog with Visceral Leishmaniasis. J Am Anim Hosp Assoc 1993, 29: 95 – 100.

99.

Font A, Roura X, Fondevila D, Closa JM, Mascort J, Ferrer L. Canine mucosal leishmaniasis. J Am Anim Hosp Assoc 1996, 32 : 131 – 137.

100. Font A. Canine leishmaniasis. Proceedings of the 17th ACVIM Forum, Chicago, USA, 1999: 630 – 632. 193

101. Forrester SD and Lees GE. Renal manifestation of polysystemic diseases. In: Canine and Feline Nephrology and Urology, Osborne CA and Finco DR (eds), William & Wilkins, Baltimore, 1995, pp. 491 - 504. 102. Fossati P and Prencipe L. Serum triglycerides determined colorimetrically with an enzyme that produces hydrogen peroxide. Clin Chem 1982, 28: 2077 – 2080. 103. Gangneux JP, Dullin M, Sulahain A, Garin YJ, Derouin F. Experimental evaluation of second – line oral treatments of visceral leishmaniosis caused by Leishmania infantum. Antimicrob Agent Chemother 1999, 43: 172 – 174. 104. Gansevoort RT, de Zeeuw D, de Jong PE. Is the antiproteinuric effect of ACE inhibition mediated by interference in the renin – angiotensin system? Kidney Int 1994a, 45: 861 – 867. 105. Gansevoort RT, de Zeeuw D, Shahinfar S, Redfield A, de Jong PE. Effects of the angiotensin II antagonist losartan in hypertensive patients with renal disease. J Hypertens Suppl 1994b, 12: S37 – 42. 106. Garcia – Alonso M, Blanco A, Reina D, Serrano FJ, Alonso C, Nieto CG. Immunopathology of the uveitis in canine leishmaniasis. Parasite Immunol 1996, 18 : 617 – 623. 107. Ginel PJ, Lucena R, Lopez R, Molleda JM. Use of allopurinol for maintentance of remission in dogs with leishmaniasis. J Small Anim Pract 1998, 39: 271 – 274. 108. Ginel PJ, Mozos E, Fernandez A, Martinez A, Molleda JM. Canine pemphigus foliaceus associated with leishmaniasis. Vet Rec 1993, 133: 526 – 527. 109. Gleadhill A, Peters AM, Michel AR. A simple method for measuring glomerular filtration rate in dogs. Res Vet Sci 1995, 59: 118 – 123. 110. Gradoni L, Gramiccia M, Manciatti F, Pieri S. Studies on canine leishmaniasis control. 2. Effectiveness of control measures against canine leishmaniasis in the Isle of Elba, Italy. Trans R Soc Trop Med Hyg 1988, 82: 568 – 571. 111. Gradoni L. Epizotiology of canine leishmaniasis in southern Europe. Proceedings of the International Canine Leishmaniasis Forum, Barcelona, Spain, 1999, pp. 32 – 36. 112. Gradoni L. The diagnosis of canine leishmaniasis. Proceedings of the Second International Canine Leishmaniasis Forum, Sevilla, Spain 2002, pp. 7 – 14.

194

113. Gramiccia M, Gradoni L, Orsini S. Decreased sensitivity to meglumine antimoniate (Glucantime) of Leishmania infantum isolate from dogs after several courses of drug treatment. Ann Trop Med Parasitol 1992, 86: 613 – 620. 114. Grauer GF, Thomas CB, Eicker SW. Estimation of quantitative proteinuria in the dog, using the urine protein – to – creatinine ratio from a random, voided sample. Am J Vet Res 1985, 46: 2116 – 2119. 115. Grauer GF and DiBartola SP. Glomerular disease. In: Textbook of Veterinary Internal Medicine: Diseases of the Dog and Cat, Ettinger SJ, Feldman EC (eds), Saunders company, Philadelphia, 2000, pp. 1662 – 1678. 116. Grauer GF, Greco DS, Getzy DM, Cowgill LD, Vaden SL, Chew DJ, Polzin DJ, Barsanti JA. Effects of enalapril vs placebo as a treatment for canine idiopathic glomerulonephritis. J Vet Intern Med 2000, 14: 526 – 533. 117. Grauer GF. Canine glomerulonephritis: new thoughts on proteinuria and treatment. J Small Anim Pract 2005, 46: 469 – 478. 118. Green GF and Kabel AL. Hypercoagulable state in three dogs with nephrotic syndrome: role of acquired antithrombin III deficiency. J Am Vet Med Assoc 1982, 181: 914 – 917. 119. Green RA, Russo EA, Greene RT, Kabel AL. Hypoalbuminemia – related platelet hypersensitivity in two dogs with nephrotic syndrome. J Am Vet Med Assoc 1985, 186: 485 – 488. 120. Greenberg A. Primer on Kidney Diseases, 3rd ed. San Diego, Academic Press, 2001. 121. Greene CE, O’Neal KG, Barsanti JA. Antimicrobial chemotherapy. In: Clinical microbiology and infectious diseases of the dog and cat, Greene CE, ed, Saunders company, Philadelphia, 1984, p. 173. 122. Greene CE. Appendix: Amphotericin B. In: Infectious Diseases of the Dog and Cat. Greene CE (eds), Saunders company, Philadelphia, 1998, pp. 801 – 803. 123. Grodecki KM, Gains MJ, Baumal R, Osmond DH, Cotter B, Valli VE, Jacobs RM. Treatment of X-linked hereditary nephritis in Samoyed dogs with angiotensin converting enzyme (ACE) inhibitor. J Comp Pathol 1997, 117: 209 – 225. 124. Grooters AM and Taboada J. Update on antifungal therapy. Vet Clin Small Anim 2003, 33: 749 – 758. 195

125. Grosjean NL, Vrable RA, Murphy AJ, Mansfield LS. Seroprevalence of antibodies against Leishmania spp. among dogs in the United States. J Am Vet Med Assoc 2003, 222: 603 – 606. 126. Groulade P and Person JM. Incidence and significance of monoclonal gammopathies in dogs. Comparison with those in humans. Bull Acad Natl Med 1987, 171: 1013 – 1015. 127. Guarga JL, Moreno J, Lucientes J, Gracia MJ, Peribanez MA, Alvar J, Castillo JA. Canine leishmaniasis transmission: higher infectivity amongst naturally infected dogs to sand flies is associated with lower proportions of T helper cells. Res Vet Sci 2000, 69: 249 – 253. 128. Hamming I, Navis G, Kocks M, van Goor H. ACE inhibition has adverse renal effects during dietary sodium restriction in proteinuric and healthy rats. J Pathol 2006, 209: 29 – 39. 129. Hebert LA, Birmingham DJ, Mahan JD, Cosio FG, Dillon JJ, Sedmak DD, Shen XP, McAllister C. Effect of enalapril therapy on glomerular accumulation of immune complexes and mesangial matrix in experimental glomerulonephritis in the nonhuman primate. Am J Kid Dis 1997, 30: 243 – 252. 130. Heller J, Kramer HJ, Horacek V. Comparative effects of the angiotensin II receptor blocker EXP 3174 and of the angiotensin – converting enzyme inhibitor captopril on renal glomerular hemodynamics in the dog. Kidney Blood Press Res 1997, 20: 391 – 397. 131. Herbrecth R and Letscher V. Safety and efficacy of Intralipid emulsions of amphotericin B. J Antimicrob Chemother 1997, 40: 137 – 139. 132. Herbrecht R, Sosa C, Himy R, Villard O. Successful treatment of visceral leishmaniasis with high-dose amphotericin B diluted in fat emulsion: a case report. Trans R Soc Trop Med Hyg 1996, 90: 322 – 323. 133. Horder M, Elser RC, Gerhardt W, Mathieu M, Sampson EJ. Approved recommendation on IFCC methods for the measurement of catalytic concentration enzymes. Part 7, IFCC method for creatine kinase. Eur J Clin Chem Biochem 1991, 29: 435 – 456. 134. Hurley KJ and Vaden SL. Proteinuria in dogs and cats: A diagnostic approach. In: Kirk’s Current Veterinary Therapy – Small Animal Practice XII, Bonagura JD (eds), Saunders company, Philadelphia, 1995, pp. 937 – 940. 196

135. Hutchison FN, Cui X, Webster SK. The antiproteinuric action of angiotensin – converting enzyme is dependent on kinin. J Am Soc Nephrol 1995, 6: 1216 – 1222. 136. Iseki K, Ikemyia Y, Iseki C, Takishita S.. Proteinuria and the risk of developing end-stage renal disease. Kindey Int 2003, 63: 1468 – 1474. 137. Jacob F, Polzin DJ, Osborne CA, Neaton JD, Kirk CA, Allen TA, Swanson LL.. Association of initial proteinuria with morbidity and mortality in dogs with spontaneous chronic renal failure. J Am Vet Med Assoc 2005, 226: 393 – 400. 138. Jaenke RS and Allen TA. Membranous nephropathy in the dog. Vet Pathol 1986, 23: 718 – 733. 139. Jendrassik L and Grof P. Vereinfachte photometrische methoden zur bestimmung des bilirubins. Biochem Z 1938, 297: 81 – 89. 140. Joly V, Aubry P, Ndayiragide A, Carriére I, Kawa E, Mlika – Cabanne N, Aboulker JP, Coulaud JP, Larouze B, Yeni P. Randomized comparison of amphotericin B deoxycholate dissolved in dextrose or Intralipid for the treatment of AIDS-associated cryptococcal meningitis. Clin Infect Dis 1996, 23: 556 – 562. 141. Juttner C, Rodriguez Sanchez M, Rollan Landeras E, Slappendel RJ, Fragio Arnold C. Evaluation of the potential causes of epistaxis in dogs with natural visceral leishmaniasis. Vet Rec 2001, 149: 176 – 179. 142. Kassai T, Cordero del Campillo M, Euzeby J, Gaafar S, Hiepe Th, Himonas E. Standardized nomencature of animal parasitic diseases (SNOAPAD). Vet Parasitol 1998, 29: 299 – 326. 143. Kemp M, Kharazmi T, Kharazmi A. The contrasting roles of CD4+ T cells in intracellular infections in humans: leishmaniasis as an example. Immunol Today 1996, 17: 13 – 16. 144. Killick – Kendrick R. The life-cycle of Leishmania in the sandfly with special reference to the form infective to the vertebrate host. Ann Parasitol Hum Comp 1990, 65: 37 – 42. 145. Killick – Kendrick R and Killick – Kendrick M. Biology of sand fly vectors of Mediterranean canine leishmaniasis. Proceedings of the International Canine Leishmaniasis Forum, Barcelona, Spain 1999, pp. 26 – 31.

197

146. Kim MJ, Song JH, Suh JH, Lee SW, Kim GA. Additive antiproteinuric effect of combination therapy with ACE inhibitor and angiotensin II receptor antagonist: differential short-term response between IgA nephropathy and diabetic nephropathy. Yonsei Med J 2003, 44: 463 – 472. 147. Kirsh R, Goldstein R, Tarloff J, Parris D, Hook J, Hanna N, Bugelski P, Poste G. An emulsion formulation of amphotericin B improves the therapeutic index when treating systemic murine candidiasis. J Infect Dis 1988, 158: 1065 – 1070. 148. Kittleson MD, Kienle RD. Management of heart failure. In: Small Animal Cardiovascular Medicine, Kittleson MD and Kienle RD (eds), Mosby Inc., St. Louis, 1998, pp. 149 – 194. 149. Kontos VJ, Papadopoulos O, French TW. Natural and experimental infection with a Greek strain of Ehrlichia platys. Vet Clin Pathol 1991, 20: 101 – 105. 150. Kontos VJ and Koutinas AF. Old World Canine Leishmaniasis. Comp Cont Ed Pract Vet 1993, 15: 949 – 959. 151. Kontos VJ and Koutinas AF. Clinical observation in 15 spontaneous cases of canine babesiosis. Canine Practice 1997, 22: 30 – 34. 152. Koutinas AF, Scott DW, Kontos VI, Lekkas S, Skin Lesions in Canine Leishmaniasis (Kala – Azar): A Clinical and Histopathological Study on 22 Spontaneous Cases in Greece. Vet Dermatol 1993, 3: 121 – 130. 153. Koutinas AF, Polizopoulou ZS, Saridomichelakis MN, Argyriadis D, Fytianou A, Plevraki KG. Clinical Considerations on Canine Visceral Leishmaniasis (CVL) in Greece: A Retrospective Study of 158 Spontaneous Cases (1989 – 1996). J Am Anim Hosp Assoc 1999a, 35: 376 – 383. 154. Koutinas AF, Kontos VI, Kaldrimidou H, Lekkas S. Canine leishmaniasis – associated nephropathy: a clinical clinicopathologic and pathologic study in 14 spontaneous cases with proteinuria. Europ J Comp Anim Pract 1999b, 5: 31 – 38. 155. Koutinas AF, Saridomichelakis MN, Mylonakis ME, Leontides L, Polizopoulou Z, Billinis C, Argyriadis D, Diakous N, Papadopoulos O. A randomized, blinded, placebo – controlled clinical trial with allopurinol in canine leishmaniosis. Vet Parasitol 2001, 98: 247 – 261.

198

156. Kramer AB, Laverman GD, van Goor H, Navis G. Inter-individual differences in anti-proteinuric response to ACEi in established adriamycin nephrotic rats are predicted by pretreatment renal damage. J Pathol 2003, 201: 160 – 167. 157. Lachaud L, Chabbert E, Dubessay P, Reynes J, Lamothe J, Bastien P. Comparison of various sample preparation methods for PCR diagnosis of visceral leishmaniasis using peripheral blood. J Clin Microbiol 2001, 39: 613 – 617. 158. Lachaud LS, Marchergui – Hammami S, Chabbert E, Dereure J, Dedet JP, Bastien P. Comparison of six PCR methods using peripheral blood for detection of canine visceral leishmaniasis. J Clin Microbiol 2002, 40: 210 – 215. 159. Laguna F, Lopez-Velez R, Pulido F, Salas A, Torre-Cisneros J, Torres E, Medrano FJ, Sanz J, Pico G, Gomez-Rodrigo J, Pasquau J, Alvar J. Treatment of visceral leishmaniasis in HIV-infected patients: a randomized trial comparing meglumine antimoniate with amphotericin B. Spanish HIV – Leishmania Study Group. AIDS 1999, 13: 1063 – 1069. 160. Laguna F, Videla S, Jimenez – Mejias ME, Sirera G, Torre – Cisneros J, Ribera E, Prados D, Clotet B, Sust M, Lopez – Velez R, Alvar J [Spanish HIVLeishmania Study Group]. Amphotericin B lipid complex versus meglumine antimoniate in the treatment of visceral leishmaniasis in patients infected with HIV: a randomized pilot study. J Antimicrob Chemother 2003, 52: 464 – 468. 161. Lainson R and Shaw JJ. Evolution, classification and geographical distribution. In: The Leishmaniasis in Biology and Medicine. Vol I Biology and Epidemiology, Peters W and Killick – Kendrick R (eds), Academic Press, London, 1987, pp. 1 – 120. 162. Lamothe J. Essai de traitement de la leishmaniose canine par l’ amphotericine B (39 cas). Prat Med Chir Anim Comp 1997, 32: 133 – 141. 163. Lamothe J. Treatment of canine leishmaniasis from A (Amphotericin B) to Z (Zyloric®). Proceedings of the International Canine Leishmaniasis Forum, Barcelona, Spain 1999, pp. 12 – 17. 164. Lamothe J. Activity of amphotericin B in lipid emulsion in the initial treatment of canine leishmaniasis. J Small Anim Pract 2001, 42: 170 – 175.

199

165. Lamothe J, Roura X, Sanchez A, Cheron M, Bolard J. An open clinical trial with amphotericin B treated by heat in canine leishmaniasis. Proceedings of the 18th ESVD – ECVD Congress, Nice, France 2002, p. 212. 166. Lamothe J. La leishmaniose canine: limites diagnostiques de la serologie a partir de deux cas cliniques. Prat Med Chir Anim Comp 2002, 37: 55 – 59. 167. Lasri S, Sahibi H, Natami A, Rhalem A. Western blot analysis of Leishmania infantum antigens using sera from pentamidine-treated dogs. Vet Immunol Immunopathol 2003, 91: 13 – 18. 168. Lees GE. Early diagnosis of renal disease and renal failure. Vet Clin North Am Small Anim Pract 2004, 34: 867 – 885. 169. Leger N, Gramiccia M, Gradoni L, Madulo – Leblond G, Pesson B, Ferte H, Boulanger N, Killick – Kendrick R, II. Isolation and typing of Leishmania infantum from Phlebotomus neglectus on the island of Corfu, Greece. Trans R Soc Trop Med Hyg 1988, 82: 419 – 420. 170. Leontides LS, Saridomichelakis MN, Billinis C, Kontos V, Koutinas AF, Galatos AD, Mylonakis ME. A cross-sectional study of Leishmania spp. infection in clinically healthy dogs with polymerase chain reaction and serology in Greece. Vet Parasitol 2002, 109: 19 – 27. 171. Lobetti R. Infectious causes of anaemia. Proceedings of the 27th WSAVA Congress, volume I, Gordoba, Spain, 2002, pp. 277 – 278. 172. Lott JA, Stephan VA, Pritchard KA. Evaluation of the Coomassie Brilliant Blue G – 250 method for urinary protein. Clin Chem 1983, 29: 1946 – 1950. 173. Lulich JP and Osborne CA. Interpretation of urine protein-creatinine ratios in dogs with glomerular and nonglomerular disorders. Comp Cont Educ Pract Vet 1990, 12: 59 – 72. 174. Lulich JP, Osborne CA, Polzin DJ. Diagnosis and long-term management of protein-losing glomerulonephropathy. A 5-year case-based approach. Vet Clin North Am Small Anim Pract 1996, 26: 1401 – 1416. 175. Maddux MS and Barriere SL. A review of complications of amphotericin B therapy: Recommendations for prevention and management. Drug Intell Clin Pharm 1980, 14: 177 – 181.

200

176. Mancianti F, Nardoni S, Melosi M. Evaluation of the effectiveness of commercial immunomigration tests in the diagnosis of canine leishmaniasis. Parassitologia 2002, 44: 99. 177. Manna L, Vitale F, Reale S, Caracappa S, Pavone LM, Della Morte R, Cringoli G, Staiano N, Gravino AE. Comparison of different tissue sampling for PCRbased diagnosis and follow-up of canine visceral leishmaniosis. Vet Parasitol 2004, 125: 251 – 262. 178. Martin-Sanchez J, Lopez-Lopez MC, Acedo-Sanchez C, Castro-Fajardo JJ, Pineda JA, Morillas-Marquez F. Diagnosis of infections with Leishmania infantum using PCR – ELISA. Parasitology 2001, 122: 607 – 615. 179. Mauricio IL, Howard MK, Stothard JR, Miles MA. Genomic diversity in the Leishmania donovani complex. Parasitology 1999, 119: 237 – 246. 180. Mehlhorn A and Piekarski G. Grundriss der Parasitenkunde. Gustav Fiscer Verlag, Stuttgart, 1985. 181. Mehta RT, McQueen TJ, Keyhani A, Lopez – Berestein G. Phagocyte transport as mechanism for enhanced therapeutic activity of liposomal amphotericin B. Chemoterapy 1994, 40: 256 – 264. 182. Mendez CL. Results of a triple treatment in dogs with leishmaniasis. Proceedings of the 16th Annual Congress of the ESVD – ECVD, Helsinki, Finland 1999, p. 124. 183. Miles MA, Vexanat JA, Furtado Campos JH, Fonseca de Castro JA. Canine leishmaniasis in Latin America: control strategies for visceral leishmaniasis. Proceedings of the International Canine Leishmaniasis Forum, Barcelona Spain, 1999, pp. 46 – 53. 184. Minodier P, Piarroux R, Gambarelli F, Joblet C, Dumon H. Rapid identification of causative species in patients with Old World leishmaniasis. J Clin Microbiol 1997, 35: 2551 – 2555. 185. Minodier P, Retornaz K, Horelt A, Garnier JM. Liposomal amphotericin B in the treatment of visceral leishmaniasis in immunocompetent patients. Fundam Clin Pharmacol 2003, 17: 183 – 188. 186. Mishra M, Biswas UK, Jha AM, Khan AB. Amphotericin versus sodium stibogluconate in first-line treatment of Indian kala-azar. Lancet 1994, 344: 1599 – 1600. 201

187. Molyneux DH and Killick – Kendrick R. Morphology, ultrastructure and life cycles. In: The Leishmaniasis in Biology and Medicine. Vol I Biology and Epidemiology, Peters W and Killick – Kendrick R (eds), Academic Press, London, 1987, pp. 121 – 176. 188. Moreau P, Milpied N, Fayette N, Ramme JF, Harousseau JL. Reduced renal toxicity and improved clinical tolerance of amphotericin B mixed with intralipid compared with conventional amphtoericin B in neutropenic patients. J Antimicrob Chem 1992, 30: 535 – 541. 189. Morelli E, Loon N, Meyer T, Peters W, Myers BD. Effects of converting – enzyme inhibition on barrier function in diabetic glomerulopathy. Diabetes 1990, 39: 76 – 82. 190. Moreno J, Nieto J, Chamizo C, Gonzalez F, Blanco F, Barker DC, Alva J. The immune response and PBMC subsets in canine visceral leishmaniasis before, and after, chemotherapy. Vet Immunol Immunopathol 1999, 71: 181 – 195. 191. Moreno J and Alvar J. Canine leishmaniasis: epidemiological risk and the experimental model. Trends Parasitol 2002, 18: 399 – 405. 192. Moritz A, Steuber S, Greiner M. Clinical follow-up examination after treatment of canine leishmaniosis. Tokai J Exp Clin Med 1999, 23: 279 – 283. 193. Muller N, Zimmermann V, Forster U, Bienz M, Gottstein B, Welle M. PCRbased detection of canine Leishmania infections in formalin-fixed and paraffin – embedded skin biopsies: elaboration of a protocol for quality assessment of the diagnostic amplification reaction. Vet Parasitol 2003, 114: 223 – 229. 194. Murray HW and Delph-Etienne S. Visceral leishmanicidal activity of hexadecylphosphocholine (miltefosine) in mice deficient in T cells and activated macrophage microbicidal mechanisms. J Infect Dis 2000, 181: 795 – 799. 195. Mylonakis ME, Koutinas AF, Billinis C, Leontides LS, Kontos V, Papadopoulos O, Rallis T, Fytianou A. Evaluation of cytology in the diagnosis of acute canine monocytic ehrlichiosis (Ehrlichia canis): a comparison between five methods. Vet Microbiol 2003, 91: 197 – 204. 196. Nath KA. The tubulointerstitium in progressive renal disease. Kidney Int 1998, 54: 992 – 994.

202

197. Nieto CG, Navarrete I, Habela MA, Serrano F, Redondo E. Pathological changes in kidneys of dogs with natural Leishmania infection. Vet Parasitol 1992, 45: 33 – 47. 198. Nieto CG, Vinuelas J, Blanco A, Garcia – Alonso M, Verdugo SG, Navarrete I. Detection of Leishmania infantum amastigotes in canine choroids plexus. Vet Rec 1996, 139: 346 – 347. 199. Noli C and Auxilia ST. Treatment of canine Old World visceral leishmaniasis: a systematic review. Vet Dermatology 2005, 16: 213 – 232. 200. Noronha IL, Fujihara CK, Zatz R. The inflammatory component in progressive renal disease – are interventions possible? Nephrol Dial Transplant 2002, 17: 363 – 368. 201. Oliva G, Gradoni L, Ciaramella P, De Luna R, Cortese L, Orsini S, Davidson RN, Persechino A. Activity of liposomal amphotericin B (Ambisome) in dogs naturally infected with Leishmania infantum. J Antimicrob Chemother 1995, 36: 1013 – 1019. 202. Oliva G, Gradoni L, Cortese L, Orsini S, Ciaramella P, Scalone A, de Luna R, Persechino A. Comparative efficacy of meglumine antimoniate and aminosidine sulphate, alone or in combination, in canine leishmaniasis. Ann Trop Med Parasitol 1998, 92: 165 – 171. 203. Olliaro PL, Guerin PJ, Gerstl S, Haaskjold AA, Rottingen JA, Sundar S. Treatment options for visceral leishmaniasis: a systematic review of clinical studies done in India, 1980 – 2004. Lancet Infect Dis 2005, 5: 763 – 774. 204. Olsen SJ, Swerdel MR, Blue B, Clark JM, Bonner DP. Tissue distribution of amphotericin B lipid complex in laboratory animals. J Pharm Pharmacol 1991, 43: 831 – 835. 205. Omata K, Saito T, Sato H, Sato T, Abe F, Yamada M, Yaoita H, Endo Y, Ito S, Kanazawa M, Abe K. Therapeutic advantage of angiotensin converting enzyme inhibitors in chronic glomerulonephritis. Immunopharmacology 1999, 44: 43 – 48. 206. Osman OF, Kager PA, Zijlstra EE, el-Hassan AM, Oskam L. Use of PCR on lymph-node sample as test of cure of visceral leishmaniasis. Ann Trop Med Parasitol 1997, 91: 845 – 850.

203

207. Owens SD, Oakley DA, Marryott K, Hatchett W, Walton R, Nolan TJ, Newton A, Steurer F, Schantz P, Giger U. Transmission of visceral leishmaniasis through blood transfusions from infected English foxhounds to anemic dogs. J Am Vet Med Assoc 2001, 219: 1076 – 1083. 208. Ozon C, Marty P, Pratlong F, Breton C, Blein M, Lelievre A, Haas P. Disseminated feline leishmaniasis due to Leishmania infantum in Southern France. Vet Parasitol 1998, 75: 273 – 277. 209. Palacio J, Liste F, Gascón M. Urinary protein/creatinine ratio in the evaluation of renal failure in canine leishmaniasis. Vet Rec 1995, 137: 567 – 568. 210. Papadogiannakis EI, Koutinas AF, Saridomichelakis MN, Vlemmas J, Lekkas S, Karameris A, Fytianou A. Cellular immunophenotyping of exfoliative dermatitis in canine leishmaniosis (Leishmania infantum). Vet Immunol Immunopathol 2005, 104: 227 – 237. 211. Papadopoulos B and Tselentis Y. Sandflies in the greater Athens region, Greece. Parasite 1994, 131 – 140. 212. Pena MT, Roura X, Davidson MG. Ocular and periocular manifestations of leishmaniasis in dogs : 105 cases (1993 – 1998). Vet Opthalmol 2000, 3: 35 – 41. 213. Pennisi MG, De Majo M, Masucci M, Britti D, Vitale F, Del Maso R. Efficacy of the treatment of dogs with leishmaniosis with a combination of metronidazole and spiramycin. Vet Rec 2005, 156, 346 – 349. 214. Persechino A, Oliva G, Ciaramella P. Impiego dell’aminosidina nella terapia della leishmaniosi del cane. Nota I. Rivista Di Zootecnia Veterinaria 1994, 22: 11 – 16. 215. Petit C, Yardley V, Gaboriau F, Bolard J, Croft SL. Activity of heat-induced reformulation of amphotericin B deoxycholate (fungizone) against Leishmania donovani. Antimicrob Agents Chemother 1999, 43: 390 – 392. 216. Pinelli E, Killick – Kendrick R, Wagenaar J, Bernadina W, del Real G, Ruitenberg J. Cellular and humoral immune responses in dogs experimentally and naturally infected with Leishmania infantum. Infect Immun 1994, 62: 229 – 235. 217. Pinelli E, Gonzalo RM, Boog CJP, Rutten VP, Gebhard D, del Real G, Ruitenberg EJ. Leishmania infantum – specific T cell lines derived from 204

asymptomatic dogs that lyse infected macrophages in a major histocompatibility complex – restricted manner. Eur J Immunol 1995, 25: 1594 – 1600. 218. Pinelli E, Rutten VPMG, Ruitenberg EJ. Cellular immune responses in canine leishmaniasis. Proceedings of the International Canine Leishmaniasis Forum, Barcelona, Spain, 1999, pp. 60 – 64. 219. Pizoni R and Remuzzi G. Pathophysiology and management of progressive chronic renal failure. In: Primer on Kidney Diseases, 3rd ed, Greenberg A (eds), San Diego, National Kidney Foundation, 2001, pp. 385 – 396. 220. Plevraki K, Koutinas AF, Kaldrymidou H, Roumpies N, Papazoglou LG, Saridomichelakis MN, Savvas I, Leontides L. Effects of allopurinol treatment on the progression of chronic nephritis in Canine leishmaniosis (Leishmania infantum). J Vet Intern Med 2006, 20: 228 – 233. 221. Plotnick A. Lipid – based formulations of amphotericin B. J Am Vet Med Assoc 2000, 216: 838 – 841. 222. Plumb DC. Veterinary Drug Handbook, 5th ed. Blackwell Publishing, 2005. 223. Poli A, Abramo F, Mancianti F, Nigro M, Pieri S, Bionda A. Renal involvement in canine leishmaniasis. A light-microscopic, immunohistochemical and electron-microscopic study. Nephron 1991, 57: 444 – 452. 224. Poli A, Sozzi S, Guidi G, Bandinelli P, Mancianti F. Comparison of aminosidine (paromomycin) and sodium stibogluconate for treatment of canine leishmaniasis. Vet Parasitol 1997, 71: 263 – 271. 225. Polizopoulou ZS, Koutinas AF, Saridomichelakis MN, Patsikas MN, Leontides LS, Roubies NA, Desiris AK. Clinical and laboratory observations in 91 dogs infected with Dirofilaria immitis in northern Greece. Vet Rec 2000, 146: 466 – 469. 226. Polzin DJ, Osborne CA, Ross S. Chronic kidney disease. In: Textbook of Veterinary Internal Medicine, Ettinger SJ and Feldman EC (eds), Saunders company, Philadelphia, 2005, pp. 1756 - 1785. 227. Quinnell RJ, Kennedy LJ, Barnes A, Courtenay O, Dye C, Garcez LM, Shaw MA, Carter SD, Thomson W, Ollier WE. Susceptibility to visceral leishmaniasis in the domestic dog is associated with MHC class II polymorphism. Immunogenetics 2003, 55: 23 – 28.

205

228. Rallis T, Day MJ, Saridomichelakis MN, Adamama-Moraitou KK, Papazoglou L, Fytianou A, Koutinas AF. Chronic hepatitis associated with canine leishmaniosis (Leishmania infantum): a clinicopathological study of 26 cases. J Comp Pathol 2005, 132: 145 – 152. 229. Reddi AS, Ramamurthi R, Miller M, Dhuper S, Lasker N. Enalapril improves albuminuria preventing glomerular loss of heparin sulfate diabetic rats. Bioch Med Metabol Biol 1991, 45: 119 – 131. 230. Reiner SL. Parasites and T Helper Cell Development: Some Insights. Parasitology Today 1994, 10: 485 – 488. 231. Reithinger R, Lambson BE, Barker DC, Davies CR. Use of PCR to detect Leishmania (Viannia) spp. in dog blood and bone marrow. J Clin Microbiol 2000, 38: 748 – 751. 232. Reithinger R, Teodoro U, Davies CR. Topical insecticide treatments to protect dogs from sand fly vectors of leishmaniasis. Emerg Infect Dis 2001, 7: 872 – 876. 233. Reithinger R, Espinoza JC, Courtenay O, Davies CR. Evaluation of PCR as a diagnostic mass-screening tool to detect Leishmania (Viannia) spp. In domestic dogs (Canis familiaris). J Clin Microbiol 2003, 41: 1486 – 1493. 234. Rhalem A, Sahibi H, Lasri S, Jaffe CL. Analysis of immune responses in dogs with canine visceral leishmaniosis before, and after, drug treatment. Vet Immunol Immunopathol 1999, 71: 69 – 76. 235. Ribeiro JM. Role of saliva in tick/host interactions. Exp Appl Acarol 1989, 7: 15 – 20. 236. Riera C, Valladares JE, Gallego M, Alisa MJ, Catillejo S, Fisa R, Ribas N, Carrio J, Alberola J, Arboix M. Serological and parasitological follow – up in dogs experimentally infected with Leishmania infantum and treated with meglumine antimoniate. Vet Parasitol 1999, 84: 33 – 47. 237. Roeschlam PBEGW. Enzymatic determination of total cholesterol in serum. J Clin Chem Biochem 1974, 12: 403 – 407. 238. Roura X, Sanchez A, Ferrer L. Follow up of leishmania infected dogs after treatment using a PCR technique. Proceedings of the 14th Annual Congress of the ESVD – ECVD, Piza, Italy 1997, p. 171.

206

239. Roura X, Fondevila D, Sanchez A, Ferrer L. Detection of Leishmania infection in paraffin – embedded skin biopsies of dogs using polymerase chain reaction. J Vet Diagn Invest 1999a, 11: 385 – 387. 240. Roura X, Sanchez A, Ferrer L. Diagnosis of canine leishmaniasis by a polymerase chain reaction technique. Vet Rec 1999b, 144 : 262 – 264. 241. Roze M. Ocular manifestation of canine leishmaniasis, diagnosis and treatment. Proceedings of the 27th WSAVA Congress, volume I, Granada, Spain, 2002, pp. 475 – 476. 242. Rubin S. Nephrotoxicity of amphotericin B. In: Kirk’s Current Veterinary Therapy IX: Small Animal Practice. Kirk RW (eds), Lea and Febiger, Philadelphia, 1986, pp. 1142 – 1146. 243. Rubin SI, Krawiec DR, Geiberg H, Shanks RD. Nephrotoxicity of amphotericin B in dogs: a comparison of two methods of administration. Can J Vet Res 1989, 53: 23 – 28. 244. Ruggenenti P, Perna A, Zoccali C, Gherardi G, Benini R, Testa A, Remuzzi G. Chronic proteinuric nephropathies. II. Outcomes and response to treatment in a prospective cohort of 352 patients: differences between women and men in relation to ACE gene polymorphism. Gruppo Italiano di Studi Epidemologici in Nefrologia (Gisen). J Am Soc Nephrol 2000, 11: 88 – 96. 245. Ruilope LM, Casal MC, Praga M, Alcazar JM, Decap G, Lahera V, Rodicio JL. Additive antiproteinuric effect of converting enzyme inhibition and a low protein intake. J Am Soc Nephrol 1992, 3: 1307 – 1311. 246. Saridomichelakis MN, Mylonakis ME, Leontides LS, Koutinas AF, Billinis C, Kontos VI. Evaluation of lymph node and bone marrow cytology in the diagnosis of canine leishmaniasis (Leishmania infantum) in symptomatic and asymptomatic dogs. Am J Trop Med Hyg 2005a, 73: 82 – 86. 247. Saridomichelakis MN, Mylonakis ME, Leontides LS, Billinis C, Koutinas AF, Galatos AD, Gouletsou P, Diakou A, Kontos VI. Periodic administration of allopurinol is not effective for the prevention of canine leishmaniosis (Leishmania infantum) in the endemic areas. Vet Parasitol 2005b, 130: 199 – 205. 248. Sarker CB, Chowdhury KS, Siddiqui NI, Lamal MF, Rahman S, Momen A, Dhar DK, Alam KS. Clinical profile of Kala-azar in adults: as seen in 207

Mymensing Medical College Hospital, Mymensingh, Bangladesh. Mymensignh Med J 2003, 12: 41 – 44. 249. Sawaya BP, Briggs JP, Schnermann J. Amphotericin B nephrotoxicity: the adverse consequences of altered membrane properties. J Am Soc Nephrol 1995, 6: 154 – 164. 250. Scalone A, de Luna R, Oliva G, Baldi L, Satta G, Vesco G, Mignone W, Turilli C, Mondesire RR, Simpson D, Donoghue AR, Frank GR, Gradoni L. Evaluation of the Leishmania recombinant K39 antigen as a diagnostic marker for canine leishmaniasis and validation of a standardized enzyme – linked immunosorbent assay. Vet Parasitol 2002, 104: 275 – 285. 251. Schlebusch H, Rick N, Lang H, Knedel M. Normalbereich der Akivitaten Klinish Wichtiger Enzyme. Dtsch Med Wschr 1974, 99: 765 – 766. 252. Sharp NG. Molecular biology of infectious disease. In: Kirk’s Current Veterinary Therapy XIII, Bonagura JD (eds), Saunders company, Philadelphia, 2000, pp. 246 – 249. 253. Sideris V, Papadopoulou G, Dotsika E, Karagouni E. Asymptomatic canine leishmaniasis in Greater Athens area, Greece. Eur J Epidemiol 1999, 15: 271 – 276. 254. Slappendel RJ. Canine leishmaniasis. A review based on 95 cases in The Netherlands. Vet Q 1988, 10: 1 – 16. 255. Slappendel RJ and Greene CE. Leishmaniasis. In: Infectious Diseases of Dog and Cat, 1st ed. Greece CE (eds), Saunders company, Philadelphia, 1990, pp. 769 – 777. 256. Slappendel RJ and Teske E. The effect of intravenous or subcutaneous administration of meglumine antimoniate (Glucantime) in dogs with leishmaniasis. A randomized clinical trial. Vet Q 1997, 19: 10 – 13. 257. Slappendel RJ and Ferrer L. Leishmaniasis. In: Infectious Diseases of Dog and Cat, 2nd ed. Greene CE (eds), Saunders company, Philadelphia, 1998, pp. 450 – 458. 258. Solano – Gallego L, Llull J, Ramos G, Riera C, Arboix M, Alberola J, Ferrer L. The Ibizian hound presents a predominantly cellular immune response against natural Leishmania infection. Vet Parasitol 2000, 90: 37 – 45.

208

259. Solano – Gallego L, Llull J, Arboix M, Ferrer L, Alberola J. Evaluation of the efficacy of two leishmanins in asymptomatic dogs. Vet Parasitol 2001a, 102: 163 – 166. 260. Solano – Gallego L, Morel P, Arboix M, Alberola J, Ferrer L. Prevalence of Leishmania infantum infection in dogs living in an area of canine leishmaniasis endemicity using PCR on several tissues and serology. J Clin Microbiol 2001b, 39: 560 – 563. 261. Solbach W and Laskay T. The host response to Leishmania infection. Advances in Immunology 2000, 74: 275 – 317. 262. Song JH, Lee SW, Suh JH, Kim ES, Hong SB, Kim KA, Kim MJ. The effects of dual blockade of the rennin-angiotensin system on urinary protein and transforming growth factor – beta excretion in 2 groups of patients with IgA and diabetic nephropathy. Clin Nephrol 2003, 60: 318 – 326. 263. Sorkine P, Nagar H, Weinbroum A, Setton A, Israitel E, Scarlatt A, Silbiger A, Rudick V, Kluger Y, Halpern P. Administration of amphotericin B in lipid emulsion decreases nephrotoxicity: results of a prospective, randomized, controlled study in critically ill patients. Crit Care Med 1996, 24: 1311 – 1315. 264. Souza LC and Campa A. Pharmacological parameters of intravenously administered amphotericin B in rats: comparison of the conventional formulation with amphotericin B associated with a triglyceride-rich emulsion. J Antimicrob Chemother 1999, 44: 77 – 84. 265. Spreng D. Leishmania polyarthritis in two dogs. J Small Anim Pract 1993, 34: 559 – 563. 266. Sundbar S, Gupta LB, Makharia MK, Singh MK, Voss A, Rosenkaimer F, Engel J, Murray HW. Oral treatment with miltefosine for visceral leishmaniosis. Ann Trop Med Parasitol 1999, 93: 589 – 597. 267. Sundar S, Gupta LB, Rastogi V, Agrawal G, Murray HW. Short-course, cost effective treatment with amphotericin B – fat emulsion cures visceral leishmaniasis. Trans R. Soc Trop Med Hyg 2000, 94: 200 – 204. 268. Sundar S, Agrawal G, Rai M, Makharia MK, Murray HW. Treatment of Indian visceral leishmaniasis with single or daily infusions of low dose liposomal amphotericin B: randomized trial. Brit Med J 2001, 323: 419 – 422.

209

269. Sundar S, Jha TK, Thakur CP, Mishra M, Singh VR, Buffels R. Low-dose liposomal amphotericin B in refractory Indian visceral leishmaniasis: a multicenter study. Am J Trop Med Hyg 2002, 66: 143 – 146. 270. Sundar S, Jha TK, Thakur CP, Mishra M, Singh VP, Buffels R. Single – dose liposomal amphotericin B in the treatment of visceral leishmaniasis in India: a multicenter study. Clin Infect Dis 2003, 37: 800 – 804. 271. Sundar S, Mehta H, Suresh AV, Singh SP, Rai M, Murray HW. Amphotericin B treatment for Indian visceral leishmaniasis: conventional versus lipid formulations. Clin Infect Dis 2004, 38: 377 – 383. 272. Syriopoulou V, Daikos GL, Theodoridou M, Pavlopoulou I, Manolaki AG, Sereti E, Karamboula A, Papathanasiou D, Krikos X, Saroglou G. Two doses of a lipid formulation of amphotericin B for the treatment of Mediterranean visceral leishmaniasis. Clin Infect Dis 2003, 36: 560 – 566. 273. Szoka FC and Tang M. Amphotericin B formulated in liposomes and lipid based systems: a review. J Liposome Res 1993, 3: 363 – 375. 274. Tabaru H, Finco DR, Brown SA, Cooper T. Influence of hydration state on renal function of dogs. Am J Vet Res 1993, 54: 1758 – 1764. 275. Thakur CP. Comparison of glucose versus fat emulsion in the preparation of amphotericin B for use in kala – azar. Trans R Soc Trop Med Hyg 1994, 88: 698 – 699. 276. Thakur CP, Pandey AK, Sinha GP, Roy S, Behbehani K, Olliaro P. Comparison of three treatment regimens with liposomal amphotericin B (Ambisome) for visceral leishmaniasis in India: a randomized dose-finding study. Trans R Soc Trop Med Hyg 1996, 90: 319 – 322. 277. Thefeld W, Hoftmeister H, Bush EW, Koller PO, Vollmaz J. Reterenzwerte for die Bestimmung der Transaminasen GOT und GPT sowie der Alkalischen Phosphatase in serum mit Optimierten Standard methoden. Dtsch Med Wschr 1974, 99: 343 – 351. 278. Thompson JS, Johnstone AC, Jones BR, Hancock WS. The ultrastructural pathology of five lipoprotein lipase-deficient cats. J Comp Pathol 1989, 101: 251 – 262. 279. Trees A and Shaw S. Imported diseases in small animals. In Practice 1999, 482 – 490. 210

280. Vaden SL. Glomerular Diseases. In: Textbook of Veterinary Internal Medicine, Ettinger SJ and Feldman EC (eds), Saunders company, Philadelphia, 2005, pp. 1786 - 1800. 281. Valladares JE, Alberola J, Esteban M, Arboix M. Disposition of antimony after the administration of N-methylglucamine antimoniate to dogs. Vet Rec 1996, 138: 181 – 183. 282. Valladares JE, Riera C, Pastor J, Gallego M, Portus M, Arboix M. Hepatobiliar and renal failure in a dog experimentally infected with Leishmania infantum. Vet Rec 1997, 141: 574 – 575. 283. Valladares JE, Riera C, Alberola J, Gallego M, Portus M, Cristofol C, Franquelo C, Arboix M. Pharmacokinetics of meglumine antimoniate after administration of a multiple dose in dogs experimentally infected with Leishmania infantum. Vet Parasitol 1998, 75: 33 – 40. 284. Valladares JE, Riera C, Gonzalez – Enseyat P, Diez-Cascon A, Ramos G, Solano – Gallego L, Gallego M, Portus M, Arboix M, Alberola J. Long term improvement in the treatment of canine leishmaniosis using an antimony liposomal formulation. Vet Parasitol 2001, 97: 15 – 21. 285. Vamvakidis CD, Koutinas AF, Kanakoudis G, Georgiadis G, Saridomichelakis M. Masticatory and skeletal muscle myositis in canine leishmaniasis (Leishmania infantum). Vet Rec 2000, 146: 698 – 703. 286. Van der Lugt JJ, Carlyon JF, de Waal TD. Cutaneous leishmaniasis in a sheep. J S Afr Vet Assoc 1992, 63: 74 – 77. 287. Verlander JW. Glomerular filtration. In: Textbook of Veterinary Physiology, 2nd edn. Cunningham JG (eds), Saunders company, Philadelphia, 1997, pp. 511 – 521. 288. Vexenat JA, Olliaro PL, Fonseca de Castro JA, Cavalcante R, Furtado Campos JH, Tavares JP, Miles MA. Clinical recovery and limited cure in canine visceral leishmaniasis treated with aminosidine (paromomycin). Am J Trop Med Hyg 1998a, 58: 448 – 453. 289. Vexenat JA, Croft SL, Furtado Campos JH, Miles MA. Failure of buparvaquone (Butalex) in the treatment of canine visceral leishmaniosis. Vet Parasitol 1998b, 77: 71 – 73.

211

290. Vinuelas J, Garcia – Alonso M, Ferrando L, Navarrete I, Molano I, Miron C, Carcelen J, Alonso C, Nieto CG. Meningeal leishmaniosis induced by Leishmania infantum in naturally infected dogs. Vet Parasitol 2001, 101: 23 – 27. 291. Vouldoukis I, Drapier JC, Nussler AK, Tselentis Y, Da Silva OA, Gentilini M, Mossalayi DM, Monjour L, Dugas B. Canine visceral leishmaniasis: successful chemotherapy induces macrophage antileishmanial activity via the L-arginine nitric oxide pathway. Antimicrob Agent Chemother 1996, 40: 253 – 256. 292. Wapstra FH, Van Goor H, Navis G etal. Antiproteinuric effect predicts renal protection by angiotensin – converting enzyme inhibition in rats with established adriamycin nephrosis. Clin Sci 1996, 90: 393 – 401. 293. Weber MA, Smith DH, Neutel JM, Graettinger WF. Cardiovascular and metabolic characteristics of hypertension. Am J Med 1991, 91(suppl. 1A): 4S – 10S. 294. Weiscliselbaum TE. An accurate and rapid method for the determination of proteins in small amounts of blood serum and plasma. Am J Clin Path 1946, 16: 40 – 49. 295. Wheeler DC and Bernard DB. Lipid abnormalities in the nephrotic syndrome: causes, consequences, and treatment. Am J Kid Dis 1994, 23: 331 – 346. 296. White JV, Olivier NB, Reiman K, Johnson C. Use of protein – to –creatinine ration in a single urine specimen for quantitative estimation of canine proteinuria. J Am Vet Med Assoc 1984, 185: 882 – 885. 297. Wiegmann TB, Herron KG, Chonko AM, MacDougall ML, Moore WV. Effects of angiotensin – converting enzyme inhibition on renal function and albuminuria in normotensive type I diabetic patients. Diabetes 1992, 41: 62 – 67. 298. Wolf AM and Troy GC. Deep mycotic diseases. In: Textbook of veterinary internal medicine, Ettinger SJ and Feldman EC (eds), Saunders company, Philadelphia, 1995, pp. 439 – 463. 299. Wolschrijn CF, Meyer HP, Hazewinkel HAW, Wolvekamp WTC. Destructive polyarthritis in a dog with leishmaniasis. J Small Anim Pract 1996, 37: 601 – 603.

212

300. Woo KT, Lau YK. Proteinuria: clinical significance and basis for therapy. Singap Med J 2001, 42: 385 – 389. 301. World Health Organization. The Leishmaniases. Technical Report Series No 701 ed. WHO, Geneva, 1984. 302. World Health Organization. Control of Leishmaniases. Technical Report Series No 793 ed. WHO, Geneva, 1990. 303. Wunderlin E and Pospischil A. Peroxidase – antiperoxidase labeling of Leishmania amastigotes in formalin fixed and paraffin embedded tissue sections. Berl Munch Tierarztl Wochenschr 1992, 105: 302 – 304. 304. Zaffaroni E, Rubaudo L, Lanfranchi P, Mignone W. Epidemiological patterns of canine leishmaniasis (correction of leishmaniosis) in Western Liguria (Italy). Vet Parasitol 1999, 81: 11 – 19. 305. Zaragoza C, Barrera R, Centeno F, Tapia JA, Duran E, Gonzalez M, Mane MC. SDS – PAGE and western blot of urinary proteins in dogs with leishmaniasis. Vet Rec 2003, 34: 137 – 151. 306. Zatelli A, Borgarelli M, Santilli R, Bonfanti U, Nigrisoli E, Zanatta R, Tarducci A. Glomerular lesions in dogs infected with Leishmania organisms. Am J Vet Res 2003, 64: 558 – 561. 307. Zini E, Bonfanti U, Zatelli A. Diagnostic relevance of qualitative proteinuria evaluated by use of sodium dodecyl sulfate – agarose gel electrophoresis and comparison with renal histologic findings in dogs. Am J Vet Res 2004, 65: 964 – 971. 308. Κοντός ΒΙ και Κουτίνας ΑΦ. Η ηπατοζωονόσος στο σκύλο: Αναφορά 11 κλινικών περιστατικών. Δελτ Ελλ Κτην Εταιρ 1990, 41: 73 – 81. 309. Πλευράκη Κ. Η επίδραση της θεραπείας με αλλοπουρινόλη στην εξέλιξη της χρόνιας νεφρίτιδας στη λεϊσμανίωση του σκύλου (Leishmania infantum). 2003, Διδακτορική διατριβή, Κτηνιατρική Σχολή Α.Π.Θ. 310. Σαριδομιχελάκης ΜΝ και Κουτίνας ΑΦ. Η διάγνωση της λεϊσμανίωσης του σκύλου. Πράκτικά 6ου Πανελλήνιου Συνεδρίου Κτηνιατρικής Μικρών Ζώων, Αθήνα, Μάρτιος 2002, pp. 550 – 559. 311. Σαρόγλου Γ. Σπλαχνική λεϊσμανίωση στην Ελλάδα. Πρακτικά 6ου Πανελλήνιου Συνεδρίου Κτηνιατρικής Μικρών Ζώων, Αθήνα 16 – 18 Μαρτίου 2001. Δορυφορικό Συμπόσιο: Η Λεϊσμανίωση στην Ελλάδα σήμερα, 2001, p. 560. 213

312. Χαραλαμπίδης

ΣΘ

και

Διάκου

ΑΝ.

Τοξοπλάσμωση,

λεϊσμανίωση,

τοξοκαρίαση και φιλαρίαση του σκύλου στη Μακεδονία και στη Θράκη. Πρακτικά 5ου Πανελλήνιου Συνεδρίου Κτηνιατρικής Μικρών Ζώων, Αθήνα, 1999, pp. 168 – 170. 313. Χαραλαμπίδης ΣΘ. Πρωτοζωολογία. 2nd ed. University Studio Press, Θεσσαλονίκη, 1998.

214