Fagocitosis In Vitro (prueba De Opsonocitofagocitosis)

ESCUELA PROFESIONAL DE BIOLOGÍA

Fagocitosis In Vitro (Prueba Opsonocitofágica) ASIGNATURA

: Inmunología

DOCENTE

: Blgo. Carlos Espinoza Valera

ALUMNO

: Rómulo Aycachi Inga

CICLO

: 2007 - I

Lambayeque, Abril de 2007.

FAGOCITOSIS IN VITRO (PRUEBA OPSONOCITOFÁGICA) I. INTRODUCCIÓN: Fagocitosis (del griego, -phagos, 'él que come'; kytos, 'célula'), proceso de ingestión de materia por ciertas células que se denominan, en este contexto, fagocitos. Las formas de vida unicelulares que engullen en masa e ingieren materia del exterior (como otras células, bacterias, o materia inorgánica) presentan fagocitosis. En organismos multicelulares, este proceso lo llevan a cabo células especializadas, casi siempre con el fin de defender al conjunto del organismo frente a potenciales invasores perjudiciales.

En la especie humana y en otros animales superiores, son células errantes que se distribuyen por todo el cuerpo. Grandes fagocitos, llamados macrófagos, tienen especial importancia en el sistema linfático, el hígado y el bazo. Estos macrófagos ameboides viajan también por todos los tejidos corporales e ingieren bacterias y otros materiales del exterior. Fagocitos más pequeños, que se conocen como leucocitos (un tipo de glóbulos blancos de la sangre), recorren todo el cuerpo a través del torrente sanguíneo. Son atraídos a los lugares donde se produce una infección mediante compuestos químicos que emiten las bacterias agresoras, y traspasan las paredes de los vasos sanguíneos hasta alcanzar a los invasores. El éxito del proceso depende de la naturaleza del material que penetre. Las proteínas unidas a las partículas extrañas que entran en la sangre, atraen a los fagocitos y les permiten adherirse a las proteínas e ingerirlas. Sin embargo, si invaden el organismo formas bacterianas más activas no pueden ser ingeridas hasta que los fagocitos las atrapen físicamente o hasta que sean recubiertas por determinadas proteínas llamadas anticuerpos. Si aún así no es posible ingerirlas, los fagocitos pueden incluso llegar a rodearlas por completo. El inmunólogo ruso Elie Metchnikof fue el primero en descubrir que muchos microorganismos podían ser englobados y digeridos por células fagocíticas a las cuales llamó macrófagos. La piel y las secreciones mucosas actúan como barreras y las enzimas proteolíticas (enzimas digestivas que escinden las proteínas) presentes en los líquidos orgánicos destruyen algunos organismos invasores. Además de esto, hay células con funciones inmunes innatas que responden rápidamente a los organismos invasores y los destruyen. Estas células son básicamente de dos tipos: monocitos (especialmente macrófagos) y leucocitos polimorfonucleados. Ambas son capaces de ingerir microorganismos por fagocitosis y destruirlos. También sintetizan y segregan muchas sustancias, entre ellas citoquinas y enzimas, que protegen frente a las infecciones y estimulan el desarrollo de la respuesta inmunitaria. La fagocitosis por polimorfonucleares neutrófilos se inicia a raiz del contacto de esta célula con factores quimiotácticos endógenos o elaborados por microorganismos (Nformilpéptidos)(1). Esta unión permite la migración direccional del fagocito hacia el agente injuriante y activa el metabolismo oxidativo celular. El reconocimiento y contacto con material a ser fagocitado está mediado por opsoninas que pueden ser anticuerpos o el fragmento C3b del complemento (2). La unión de la opsonina con la membrana celular gatilla la formación de vacuolas fagocíticas y activa la enzima NADPH oxidasa la cual comienza a generar radicales libres tales como anión superóxido, ion hidroxilo y peróxido de hidrógeno. Esto sucede cuando se está formando el fagosoma (3). Posteriormente, se produce la fusión

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del fagosoma con lisosomas celulares constituyéndose el fagolisosoma (4). Al vertir su contenido al fagosoma, estos organelos aportan mieloperoxidasa que genera hipoclorito o hipoyodito a partir del peróxido de hidrógeno. El anión superóxido, el ion hidroxilo, el peróxido de hidrógeno y el hipoclorito son parte de los mecanismos bactericidas oxígenodependientes. Actúan sobre la membrana bacteriana produciendo peroxidación de lípidos, rompimiento de proteínas de membrana y de uniones disulfuro entre ellas y formación de uniones cruzadas entre lípidos. Los gránulos específicos y azurófilos de los polimorfonucleares aportan también diversas proteínas con capacidad bacteriostática y bactericida. Entre las primeras se encuentran la lisozima que ataca la mureína de la pared bacteriana y la lactoferrina que priva a las bacterias de un elemento esencial para su vida cual es el fierro. Los gránulos azurófilos aportan las proteínas catiónicas microbicidas CAP 57 y CAP 37 que rompen la membrana externa de bacterias gram-negativas. Además, vierten al fagosoma las enzimas proteolíticas catepsina G y elastasa así como la lisozima. Este grupo de elementos microbicidas conforman los mecanismos bactericidas oxígeno-independientes. Finalmente, las enzimas hidrolíticas de los lisosomas digieren a los microrganismos muertos (5). Durante la fagocitosis se produce frecuentemente liberación de enzimas lisosómicas (6) tales como las proteasas neutras las que contribuyen a la fluidificación de la matriz extracelular. Asimismo aporta mediadores químicos de la inflamación tales como las proteínas catiónicas. Estos mediadores aumentan la permeabilidad vascular en forma directa o induciendo la liberación de histamina en la célula cebada. También son quimiotácticos para monocitos e inhiben el movimiento de otros neutrófilos y eosinófilos. La fagocitosis por macrófagos es similar a la descrita para polimorfonucleares neutrófilos difiriendo de esta en que carecen de mieloperoxidasa. A diferencia de los polimorfonucleares, los macrófagos cumplen una labor fundamental en la respuesta inmune adaptativa al ser células presentadoras de antígeno.

Este sería el mecanismo fagocítico básico (muy similar al ya existente en protozoos amebianos), pero dicho mecanismo primitivo se ve mejorado (unas 4.000 veces) por medio de otros componentes del sistema inmune: se trata de un conjunto de moléculas, denominadas opsoninas, que recubren al microorganismo, y que sirven de vínculo de unión entre la partícula invasora y el fagocito. Como ejemplo de opsoninas se cuentan la IgG (para la que el fagocito

3

posee el receptor Fcγ R) y el componente C3b del complemento (para el que el fagocito dispone del receptor CR1). Las actividades antimicrobianas en la fagocitosis se pueden clasificar en:

I.

Mecanismos dependientes de oxígeno: A. intermediarios reactivos de oxígeno (ROI) B. intermediarios reactivos de nitrógeno (RNI) II. Mecanismos independientes de oxígeno: proteínas antimicrobianas preformadas: A. péptidos catiónicos como las defensinas B. catepsina G (proteinasa neutra) C. lisozima D. lactoferrina (secuestra Fe y altera las proteínas de FeS II. OBJETIVOS:  Demostrar la capacidad de los leucocitos de fagocitar microorganismos.  Observar el mecanismo fagocitario dependiente del tiempo.  Adiestrar al alumno en la práctica para la observación y determinación de la fagocitosis in Vitro

III. MATERIALES: a) Material biológico:  Muestra de sangre citratada  Cepa bacteriana b) Material no biológico:

 Tubos de ensayo estériles

 Solución salina fisiológica estéril (SSFE).

 Láminas portaobjetos.  Estufa.  Aguja hipodérmica Nº 21  Centrífuga  Jeringas de 10 ml.  Colorante Wright

 Torniquete o liga.  Alcohol.

 Microscopios  Baño María

 Algodón.

IV. PROCEDIMIENTO: A.Preparación de la suspensión bacteriana:

 En un cultivo líquido de una cepa bacteriana, llevar a centrifugación a 3500 r.p.m. por 5 min. Eliminar el sobrenadante, agregar SSFE y llevar a centrifugación

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nuevamente. Repetir esta operación hasta obtener un sobrenadadote claro (esto es el lavado de la cepa bacteriana).

 Luego volver a agregar SSFE hasta obtener una suspensión cuya turbidez sea equivalente al tubo Nº 3 del nefelómetro de Mac Farland (9 x 109 bact./ml).  Dejar reposar.

B.Inactivación de la cepa bacteriana  Luego de obtener la suspensión bacteriana, llevamos a baño María para la inactivación por accion del calor.  Para el caso de E. coli, se puede someter a calor por 30 min., para el caso de Bacillus subtilis (cepa usada por el autor) se debe someter a 80º C por 60 min.  Luego dejar reposar C.Preparación de la muestra de sangre:

 Colocar en un tubo de ensayo citrato de sodio (anticoagulante) 0.2 ml para 1 ml de sangre total.

 Luego en este mismo tubo colectamos aproximadamente 1 ml de sangre mediante punción venosa. Mezclar suavemente para evitar la coagulación (la obtención de sangre se realiza de manera aséptica).  Dejar reposar. D.Prueba Opsonocitofágica:

 Luego, en un tubo estéril aparte agragamos 0.5 ml de la sangre nitratada y 0.5 ml de la suspensión celular (relación 1:1). Agitar suavemente para mezclar.

 Luego, llevar a estufa a 37°C por 30 a 60 min.  Cumplidos el tiempo agitar los tubos y extraer una gota de sangre y realizar la extensión en el extremo de la lámina portaobjeto (previamente limpio y desengrasado).  Dejar secar el frotis al medio ambiente.  Verter sobre el frotis de 15 a 16 gotas de colorante Wright y dejar actuar durante un minuto. Agregar luego la misma cantidad de agua destilada. Homogenizar y dejar actuar durante tres minutos.

 Lavar con agua corriente y dejar secar la lámina al medio ambiente y observar.  Anotar resultados (contar el numero de bacterias fagocitadas tanto por los macrófagos como por los polimorfonuclares) E.Valores de referencia: VALORES

INTERPRETACIÓN

5

0-1 bact./cel

……………………

Fagocitosis negativa

1-20 bact./cel

……………………

Fagocitosis incipiente

20-40 bact./cel.

……………………

Fagocitosis moderada

40 a más bact./cel

……………………

Fagocitosis excelente

V. RESULTADOS:

6

Nº de célula

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50

PMNs

Macrófagos

7 6 20 10 19 1 5 25 3 5 7 7 6 3 6 4 2 6 3 3 7 9 3 16 22 5 7 8 12 2 5 6 2 6 5 4 10 2 2 6 7 6 4 3 2 5 3 2 10 5

18 8 4 25 5 3 12 9 3 18 3 11 5 10 12 5 5 3 10 9 8 11 14 10 5 16 17 23 2 30 15 15 20 11 16 1 0 0 11 9 10 17 2 19 23 27 23 33 1 26

Nº de célula

51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100

PMNs

Macrófagos

7 5 4 5 4 4 3 1 8 4 7 8 5 3 12 4 1 0 12 4 6 7 19 3 0 13 7 6 5 10 14 14 2 11 15 11 3 7 6 8 0 1 20 14 11 23 21 15 3 5

7 23 22 4 31 23 2 8 5 2 10 18 30 1 42 0 18 14 21 14 9 15 22 1 9 19 20 4 29 20 16 17 4 0 4 1 25 19 10 3 7 11 14 25 16 13 9 10 15 9

7

• • •

Total de bacterias fagocitadas en todos los PMNs es de 715, observado en 2 láminas. • Entonces el promedio es de 715/100 = 7.15 bact./PMN Total de bacterias fagocitadas por macrófagos es de 226, observado en 2 láminas. • Entonces el promedio es de 1264/ 100 = 12.64 bact./macrof. Para encontrar el promedio total de fagocitosis se procede de la manera siguiente: Promedio de macrófagos totales + promedio de neutrofilos totales 2 7.15 + 12.64 2

=

9.89

Entonces, el promedio de fagocitosis es de 9.89 bact./cel. , o sea, este valor representa una fagocitosis incipiente. VI. Conclusiones  Entonces la fagocitosis que presenta el Alumno Rómulo Aycachi Inga es de tipo incipiente.  Este valor relativamente bajo puede deberse a muchos factores, entre ellos la mala manipulación de la muestra, mala tincion, que impedia la diferenciación de las estructuras tipicas de las células sanguíneas, mala toma de muestra, que el donador de sangre no haya estado en ayunas y otros factores tanto endógenos como exogénos. VII. REFERENCIAS:

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Microsoft ® Encarta ® 2007. © 1993--2006 Microsoft Corporation. Reservados todos los derechos. ROJAS ESPINOSA, Oscar y Patricia, Arce Paredes (2003) Fagocitosis: Mecanismos y consecuencias. Asoc. Mexicana de Bioquímica Clínica. Mexico D.F. ABBAS A. K. y cols. (2002) Inmunología Celular y Molecular. 3º Edic. Mc Graw Hill. Madrid.

VIII. OBSERVACIONES EN PRÁCTICA -

Observación de células sanguíneas típicas con coloración de Wriht

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Morfología características de las células sanguíneas encargadas de la fagocitosis

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