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Para visualizar la importancia de los potenciales eléctricos en las ciencias, se toma como ejemplo la separación de moléculas de DNA por la electroforesis en gel, técnica que depende de un campo eléctrico el cual es producido por electrodos sometidos a un potencial eléctrico. La electroforesis es una de las principales herramientas de la bioquímica molecular, y los avances que se han logrado en esta se deben a la mejor comprensión que han tenido los diversos investigadores tanto de los campos eléctricos, potenciales y el efecto de estos en la materia, asi pues ocupando las características de los ácidos nucleicos, tales como tamaño, forma y carga, se han desarrollado metodologías específicas para la separación de DNA en diversas situaciones utilizando diversos campos y potenciales que se adapten a los requerimientos del problema a resolver. Electroforesis Potencial Campo Eléctrico Entre las sustancias biológicas más importantes se encuentran los ácidos nucleicos, los cuales son compuestos fundamentales de la célula viva. Desde el descubrimiento de la estructura de doble hélice por James Watson y Francis Crick en 1953 *, el estudio de los ácidos desoxirribonucleico (DNA) y ribonucleico (RNA), ha sido abordados por las diversas ciencias del conocimiento principalmente la química y la biología, sin embargo este campo no es ajeno a las ciencias físicas. Gracias a la dinámica molecular han surgido técnicas de laboratorio que sirven para estudiar el tamaño, la conformación y la carga de los fragmentos de DNA*, entre los que destacan la electroforesis; la cual consiste en utilizar una matriz coloidal, que es un gel poroso que permite la separación de los fragmentos de DNA, a la cual se aplica una corriente eléctrica por dos electrodos y debido a que los fragmentos tienen la misma densidad de carga, sufren de una fuerza de atracción proporcional a su masa y gracias a esto los fragmentos más pequeños atraviesan la matriz porosa con mayor velocidad, el resultado de este estudio es una secuencia de bandas que al ser comparadas con un marcador estándar se puede establecer el tamaño y forma de los fragmentos estudiados, esta técnica se ha seguido desarrollando y mejorando a través del tiempo. A continuación haremos una revisión de la evolución de la electroforesis a través del análisis de algunos artículos de divulgación científica. Configuración de electrodos utilizados en CHEF, los electrodos (alambre de platino, 0.030 pulgadas de diámetro) se suspendieron en una disolución al 0.5 de disolución tampón formada por Tris, borato y EDTA (45 mM tris, 45 mM borato, 1.25 mM EDTA, pH 8.3) y conectados a una serie de resistencias de 820 ohm y 2 Watts para el arreglo cuadrado y de 470 ohm y 2 Watts para el arreglo hexagonal, la alternación de la orientación del campo se generó por un timer (GrabLab modelo 451)

Las técnicas convencionales de electroforesis son ampliamente utilizadas en el laboratorio para separar biomoleculas utilizando un único par de electrodos para generar un campo eléctrico uniforme, estas técnicas tienen muchas limitaciones sobre todo en lo referente a la separación de grandes moléculas por arriba de los cincuenta mil pares de bases***, debido a que los fragmentos de DNA de este tamaño adoptan formas globulares, que sumado a su gran tamaño dificultan el paso a través de los poros del gel por lo que no se separan según su tamaño, por lo que la técnica

resulta inservible en estos casos; para evitar estos inconvenientes se han desarrollado nuevas configuraciones de electrodos durante la electroforesis, las cuales consisten en agregar otro par de electrodos a un cierto ángulo del primero y alternando el encendido y apagado de estos durante un tiempo establecido, este tipo de arreglos ha permitido trabajar con fragmentos de DNA de levaduras con una longitud de hasta 2 millones de bases ***, lo cual es un gran avance en la técnica. Aunque la electroforesis en gel por campos eléctricos alternados permite trabajar con fragmentos de mayor tamaño, aún tiene ciertos inconvenientes, entre los que destacan la irregularidad del campo eléctrico lo que provoca que las moléculas de DNA migren con trayectorias que dependen de la posición del gel de electroforesis con respecto al campo aplicado, lo que da como resultado que la comparación de las muestras sea muy difícil. Las limitaciones mencionadas pueden superarse al utilizar campos eléctricos homogéneos de contorno fijado (CHEF por sus siglas en inglés), el cual alterna entre dos orientaciones. Chu, Vollrath y Davis (1986) **utilizan este método para generar un campo eléctrico a partir de múltiples electrodos ordenados sobre el contorno de un polígono regular y fijados a potenciales eléctricos predeterminados.

Material y métodos. Campos eléctricos y potencial.

Al realizarse la electroforesis, se utiliza una placa de gel por lo que el campo eléctrico dentro de esta puede delimitarse al plano (x, y), porque solo existirían las componentes E_x y E_y. Se conoce que el campo eléctrico puede representarse como el negativo del gradiente de una función escalar llamada potencial eléctrico __ Ec 1 Un campo eléctrico homogéneo es aquel generado por un par electrodos, paralelos e infinitamente largos, para facilitar el cálculo, este par de electrodos hipotéticos se coloca en el eje x, el primero en y=0 y el segundo a una distancia y=a, por lo que el potencial eléctrico por el par de electrodos seria Ec 2 Donde OMEGA O es el voltaje aplicado a través de los electrodos, al sustituir la Ec. 2 en la Ec. 1, los campos eléctricos generados por los electrodos son homogéneos y perpendiculares a los electrodos Ec3 Es ilógico pensar en un electrodo infinitamente largo, pero es factible producir un campo eléctrico homogéneo con un sistema finito **, utilizando múltiples electrodos sobre el contorno de un polígono cuyas caras coinciden con las posiciones del hipotético electrodo infinito. Los electrodos

en y=0 y y=a, se fijan a los potenciales 0 y OMEGA0, respectivamente y los electrones intermedios se fijan puntos entre 0 y omega o del potencial dados por la Ec. 2. Al aplicar el teorema de la unicidad, en todos los puntos del espacio fuera del arreglo de los electrodos debe cumplirse la ecuación de Laplace Ec4, que puede escribirse como Ec 5. Al suponer que existe un potencial que satisface la Ec. 5, y que cumpla con las condiciones especificadas en la superficie del polígono de electrodos, asumimos que existe la función Ec 6 Que también es solución de la Ec. 5, debido a que la ecuación de Laplace es lineal, si OMEGA y PSI satisfacen la Ec. 5, entonces cualquier combinación lineal de estas funciones también lo hará Ec7 Nos interesa la diferencia de estas funciones que denominaremos la función W. Ec 8 Por supuesto la función W no satisface la condiciones de frontera sobre los electrodos, de hecho, en la superficie, W=0, debido a que omega y psi, tienen el mismo valor sobre la superficie. W será solución de un arreglo de electrodos que están sujetos a un potencial cero, por lo que se concluye que W=0 para todos los puntos del espacio. Ahora si W tiene un extremo en un punto P, consideremos una esfera centrada en ese punto, se sabe que la media sobre la esfera de una función que satisface la ecuación de Laplace es igual al valor de su centro, y como W no tiene ningún máximo o mínimo al ser W=0 en todo el espacio se concluye que pfi=omega en todo el espacio por lo que solo existe una única solución que satisface la ecuación 5 y las condiciones de frontera sobre la superficie del arreglo de electrodos, con lo que se comprueba que en cualquier lugar dentro del polígono existirá un potencial igual al generado por dos electrodos infinitos.

A partir de lo demostrado con anterioridad Chu, Vollrath y Davis utilizan dos arreglos de electrodos diferentes, uno cuadrangular y otro hexagonal, los cuales se muestran en la figura 1, en estos contornos dos de los electrodos opuestos definen la orientación del campo eléctrico, la alternación en la orientación del campo se produce por un prendido y apagado de los electrodos, el ángulo entre estos campos eléctricos alternados viene dado por la geometría del arreglo, 90° para el cuadrangular y 120° o 60° para el hexagonal, dependiendo de la posición de la placa de gel de electroforesis con respecto al hexágono y la asignación de la polaridad de los electrodos. Los electrodos intermedios se pueden fijar a los potenciales deseados por cualquier método, por ejemplo al utilizar una serie de resistencias de 820 ohm y 2 Watts para el arreglo cuadrado y de 470 ohm y 2 Watts para el arreglo hexagonal, aunque estas resistencias son muy parecidas a las del gel, lo cual dista mucho de un circuito ideal no obstante se han encontraron buenos resultados al utilizar esta configuración de resistencias.

El gel de electroforesis esta constituido por una disolución al 0.5 de disolución tampón formada por Tris, borato y EDTA (45 mM tris, 45 mM borato, 1.25 mM EDTA, pH 8.3) Los campos eléctricos homogéneos con orientaciones alternadas se han utilizado ampliamente en la electroforesis en gel para separar DNA de levaduras en la figura 2 se exhiben los resultados de un aparato de electroforesis en gel con campos eléctricos ortogonales alternados (OFAGE por sus siglas en ingles), en el cual el gel de electroforesis está sujeto a diversas orientaciones de campo eléctrico (entre 120° y 150°) debido al tamaño de la placa del gel y los electrodos. En cambio en los arreglos presentados en la figura 1, los geles están sujetos a campos uniformes, esta diferencia se observa fácilmente en el patrón de separación el cual es más recto en los arreglos CHEF que en el OFAGE, lo que permite hacer una mejor comparación entre las muestras. La resolución de la electroforesis (bandas compactas) es afectada por el ángulo de reorientación de los campos eléctricos, es posible obtener una excelente resolución con fragmentos de DNA de hasta 2 millones de bases con un ángulo de 120° Figura 2 B, con el ángulo de 90° aparece una movilidad mayor de los fragmentos lo cual se traduce en una pérdida de la resolución Figura 1 C, al utilizar el arreglo hexagonal con 60° la movilidad aumenta y la resolución es casi nula, lo cual apoya lo encontrado por Carle et al acerca de la baja resolución con ángulos de reorientación pequeños**7. El efecto de perdida de resolución se ha intentado resolver cambiando el tiempo de pulsación de los electrodos o la fuerza del campo eléctrico sin embargo la excesiva movilidad al utilizar ángulos más cerrados no pudo alterarse como se describe en la figura 2D. Los autores Schwartz y Cantor han concluido que un gradiente en un campo eléctrico fuerte es necesario para obtener una buena resolución, sin embargo, Chu, Vollrath y Davis observaron que aún mas importante que el gradiente del campo eléctrico, un ángulo correcto de reorientación es crucial, esta conclusión es apoyada por el hecho de que los ángulos menores a 90° probados experimentalmente obtuvieron una resolución menor, a pesar de que cuentan con un gradiente intenso. Otro método de electroforesis en gel, es el de la inversión de campo **7, donde el campo eléctrico se invierte periódicamente y así un solo par de electrodos pueden utilizarse para generar un campo eléctrico homogéneo, pero debido a que la migración del DNA no es una función monotónica de tamaño, ocurre una comigración de moléculas que difieren de tamaño al aplicarse en fragmentos de DNA muy grandes, problema que puede resolverse al escoger un rango apropiado de pulsaciones, por su lado el CHEF produce una excelente resolución en moléculas muy grandes de DNA. El entendimiento de como las variables discutidas, gradiente, ángulo de reorientación, función monotónica de tamaño, afectan la migración de moléculas de gran tamaño de DNA, puede ayudar a dilucidar como separar moléculas aún más grandes. En la electroforesis convencional se separan moléculas de tamaño menor a las cincuenta mil bases, y al aumentar el voltaje, el tiempo para obtener una resolución adecuado disminuye, sin embargo una de las desventajas es que el patrón de migración a través del gel se distorsiona, resultando principalmente afectadas las moléculas de bajo peso molecular, este problema se elimina usando un CHEF sin alternación.

El contorno fijado puede ser utilizado para la electroforesis de campos no uniformes, por ejemplo un gradiente de un campo negativo que disminuye desde 7.76 a 1.0 V/cm produce numerosos efectos en la migración del DNA, que se aprecian en la figura 4. I) la movilidad del DNA disminuye mientras este se mueve por el gel, y así la electroforesis puede prolongarse para incrementar la resolución al trabajar con moléculas de mayor tamaño al convencional. Ii) el gradiente negativo contrarresta la superposición de bandas, con un efecto más pronunciado en las moléculas de bajo peso molecular. Iii) la migración de DNA adopta una trayectoria curvilínea lo cual aumenta el tiempo de permanencia de las moléculas de bajo peso molecular en el gel, con lo que se obtiene un tiempo mayor para la separación de las moléculas más grandes.

Fig2

Utilizando los CHEF se puede identificar la estructura secundaria del DNA, tales como el DNA superenrollado o el ramificado, debido a que tales estructuras presentan anomalías de movilidad en respuesta a los cambios de voltaje**10. Para separar las estructuras lineales de las otras estructuras se utiliza un arreglo cuadrangular de electrodos para generar un CHEF con campos eléctricos de intensidad diferente en ambas orientaciones, el DNA con estructuras secundarias termina encontrándose en puntos deslocalizados al arco de las moléculas lineales. Los artículos revisados describen un método general utilizando diversas configuraciones de electrodos, para generar campos eléctricos homogéneos, ya sea con contornos fijados, con o sin alternación e incluso utilizando campos de diferentes intensidades. Las configuraciones descritas necesitan que el potencial adecuado sea utilizado para manipular los campos eléctricos, permitiendo así controlar la electroforesis para separar fragmentos de DNA de maneras que previamente no era posible.