Dna Replication

พันธุศาสตรโมเลกุลเบื้องตน (258444) ปการศึกษา 2/2547 กวี สุจิปุลิ

1

บทที่ 3 การจําลองดีเอ็นเอ (DNA replication) คํานํา การจําลองดีเอ็นเอในแตละโครโมโซม (chromosome) เกิดขึ้นในระยะเอสเฟต (S phase หรือ synthesis phase) ของระยะอินเทอรเฟต (interphase) ในกระบวนการแบงเซลลแบบไมโตซีส (mitosis) และไมโอซีส (meiosis) ทําให 1 โครโมโซมมี 2 ซีสเตอรโครมาติด (sisterchromatid) ซึ่งแตละโคร มาติดประกอบดวยดีเอ็นเอ 1 โมเลกุล ในป ค.ศ. 1953 Watson และ Crick ไดตั้งสมมติฐานเกีย่ วกับการ จําลองดีเอ็นเอสายคู (double helix) วามีการจําลองเปนแบบกึ่งอนุรักษ (semiconservative DNA replication) คือดีเอ็นเอสายคูมีการแยกออกจากกันเปนดีเอ็นเอสายเดีย่ ว (single strand DNA) 2 สาย ซึ่งแตละสายทําหนาที่เปนสายแมแบบ (template strand) ของดีเอ็นเอสายใหม (daughter strand) ที่มี ลําดับคูสมกัน (base complementary) กับดีเอ็นเอสายแมแบบทุกประการ เมื่อสิ้นสุดการจําลองดีเอ็นเอ จะได ดีเอ็นเอ 2 สาย ที่แตละโมเลกุลของดีเอ็นเอประกอบดวยดีเอ็นเอสายแมแบบ 1 สาย พันเกลียวกับ ดีเอ็นเอสายใหมอีก 1 สาย ดังมีรายงานการทดลองของ Mesclson และ Stahl (1958) คือทําการทดลอง โดยเลี้ยง E. coli ในอาหารที่มีธาตุไนโตรเจนกัมตรังสี (15N) โดยใช 15(NH4)2SO4 ซึ่งเปนองคประกอบ หลักของไนโตจีนัสเบส (nitrogenous base) เพื่อใหดีเอ็นเอของ E. coli ถูกติดฉลาก (label) ดวย 15N ทําใหได ดีเอ็นเอที่มีน้ําหนักมากคือ 15N/15N (heavy DNA) จากนั้นนําแบคทีเรียที่มีดีเอ็นเอชนิด 15 15 N/ N ดังกลาวไปเลี้ยงในอาหารที่มี 14N แลวปลอยใหเกิดการจําลองดีเอ็นเอผานไป 1 รุน (generation) จึงทําการสกัดดีเอ็นเอจากแบคทีเรีย จากนั้นนํามาปนเหวีย่ งใน CsCl gradient ไดแถบดี เอ็นเอ 1 แถบ คือแถบที่มีน้ําหนักที่ 15N /14N (hybrid DNA) แลวเมื่อมีการจําลองดีเอ็นเอในรุนที่ 2 ได แถบดีเอ็นเอ 2 แถบ ที่มีน้ําหนักอยูระหวาง 15N /14N กับแถบที่มีน้ําหนักเบา 14N /14N (light DNA) อยู ดานบน จากนัน้ เมื่อมีการจําลองดีเอ็นเอในรุนที่ 3 พบวาจะไดดีเอ็นเอที่น้ําหนักเบา 14N /14N เพิ่มมาก ขึ้น ซึ่งเห็นเปนแถบหนา จึงยืนยันไดวาการจําลองดีเอ็นเอของสิ่งมีชีวิตเปนแบบกึ่งอนุรักษ (รูปที่ 3.1)

รูปแบบของการจําลองดีเอ็นเอ (DNA replication mode) แบงไดเปน 3 รูปแบบ คือ 1. การจําลองดีเอ็นเอแบบทีตา (Theta mode of DNA replication) 2. การจําลองดีเอ็นเอแบบซิกมา (Rolling circle or sigma mode of DNA replication)

พันธุศาสตรโมเลกุลเบื้องตน (258444) ปการศึกษา 2/2547 กวี สุจิปุลิ

2

3. การจําลองดีเอ็นเอแบบตัววาย (Y-shaped mode of DNA replication)

รูปที่ 3.1 การจําลองดีเอ็นเอเปนแบบกึ่งอนุรักษ (semiconservative DNA replication) ในการทดลองของ Mesclson และ Stahl (ที่มา : Hartl และ Jones, 1998) I. การจําลองดีเอ็นแบบทีตา (Theta mode of DNA replication) Cairna (1963) รายงานวา การจําลองดีเอ็นรูปวงแหวนปลายปดของ E. coli เปนแบบ theta mode กลาวคือ ที่ตําแหนง oriC ของดีเอ็นเอวงแหวนเกลียวคูจะแยกเปนดีเอ็นเอสายเดี่ยวโดยไมมีการ ตัดสายดีเอ็นเอวงแหวนใหเปดออก เรียกจุดแยกบนดีเอ็นเอนี้วา bubble โดยบริเวณ oriC จะมีเพียง 1 จุดบนดีเอ็นเอวงแหวน (ring DNA) ของ E. coli จากนั้นมีการการจําลองดีเอ็นแบบสองทิศทาง

พันธุศาสตรโมเลกุลเบื้องตน (258444) ปการศึกษา 2/2547 กวี สุจิปุลิ

3

(bidirectional replication) (รูปที่ 3.2) ไปตามเสนดีเอ็นเอของ E. coli ซึ่งทําหนาที่เปนดีเอ็นเอแมแบบ เมื่อการจําลองดีเอ็นดําเนินไปครึ่งกระบวนการ จะเห็นดีเอ็นเอวงแหวนมีรูปรางคลาย theta (θ) และเมื่อ สิ้นสุดกระบวนการการจําลองดีเอ็น จะไดดีเอ็นเอวงแหวน 2 โมเลกุล ซึ่งแตละโมเลกุลประกอบดวย ดีเอ็นเอ 2 สาย สายหนึ่งเปนสายแมแบบ และอีกสายหนึ่งเปนสายใหม (รูปที่ 3.3) หมายเหตุ จุด oriC ประกอบดวยเบสจํานวน 245 คูเบส (base pairs) โดยมีลําดับเบสจํานวน 9-13 เบส เรียงซ้ําๆ กัน ที่เรียกวา repeating sequences of 9 and 13 bases (9 mers และ 13 mers)

รูปที่ 3.2 การจําลองดีเอ็นแบบสองทิศทาง ของโปรคารีโอตและยูคารีโอต (ที่มา : Russell, 1991)

พันธุศาสตรโมเลกุลเบื้องตน (258444) ปการศึกษา 2/2547 กวี สุจิปุลิ

4

รูปที่ 3.3 การจําลองดีเอ็นแบบ theta mode ของ E. coli (ที่มา : http://bioweb.wku.edu/courses/biol22000/14Topoisomerase/images/F12-18.JPG, 2547)

II. การจําลองดีเอ็นแบบซิกมา (Rolling circle or sigma mode of replication) (รูปที่ 3.4) เปนการจําลองดีเอ็นเอแบบทิศทางเดียว (unidirectional replication) พบในเอฟแฟกเตอร (F-factor) ของแบคทีเรีย และไวรัสบางชนิด เชน bacteriophage, λ phage และ φ X 174 phage ซึ่งมี ขั้นตอนการจําลองตัวเองดังนี้ 1. สายใดสายหนึ่งของดีเอ็นเอเกลียวคูของวงแหวนดีเอ็นเอถูกตัดที่พันธะฟอสเฟอรไดเอส เทอร (phosphodiester bond) เกิดรอยขาด (nick) ทําใหเกิดปลาย 3/OH และปลาย 5/PO4 อิสระขึ้น 2. บริเวณจุดขาดที่ปลาย 3/OH ของดีเอ็นเอจะทําหนาที่เปนไพรเมอร (primer) สําหรับเอนไซม ดีเอ็นเอโพลีเมอรเรส (DNA polymerase) เพื่อสังเคราะหดีเอ็นเอสายใหมใหยาวออกไปโดยใชดีเอ็นเอ อีกสายหนึ่งทีไ่ มไดถูกตัดซึง่ อยูในรูปวงแหวนสายเดีย่ วเปนแมแบบ 3. ขณะปลาย 3/OH ที่มีการสังเคราะหดีเอ็นเอสายใหมไปรอบๆ สายดีเอ็นเอวงแหวนสาย เดี่ยวที่ทําหนาที่เปนแมแบบ ก็จะดันใหปลาย 5/PO4 ที่อยูบริเวณรอยขาดคลายตัวออกจากวงแหวนไป เรื่อยๆ หลุดมาเปนดีเอ็นเอสายเดี่ยว (linear single strand DNA) ซึ่งจะถูกใชเปนแมแบบในการ สังเคราะหดีเอ็นเอสายใหมขึ้นมาอีก 1 สาย โดยดีเอ็นเอสายใหมที่สงั เคราะหขึ้นจะเปนดีเอ็นเอทอน สั้นๆ ที่เรียกวา Okasaki fragment เนื่องจากทิศทางการสังเคราะหดีเอ็นเอสายใหมเปนแบบ 5/ → 3/ ดังนั้นทุกครั้งที่ดีเอ็นเอสายแมแบบที่มีปลาย 5/PO4 ถูกดันออกมาก็จะมีไพเมอรตวั ใหมเขาเกาะแลวเริ่ม กระบวนการสังเคราะหดีเอ็นสายใหมขึ้น จึงทําใหไดดีเอ็นเอสายใหมเปนทอนสั้นๆ 4. เมื่อการจําลองดีเอ็นดําเนินไปไดประมาณครึ่งกระบวนการ จะเห็นดีเอ็นเอวงแหวนมีรูปราง คลายกับ sigma (σ)

พันธุศาสตรโมเลกุลเบื้องตน (258444) ปการศึกษา 2/2547 กวี สุจิปุลิ

5

5. เมื่อสิ้นสุดกระบวนการ การจําลองดีเอ็น จะเกิดเหตุการณ 2 แบบ คือ 5.1 บริเวณปลาย 5/PO4 ของดีเอ็นเอสายเดี่ยวที่ใชเปนแมแบบ อาจถูกตัดออกหรือไมถูกตัด ออกก็ได นั้น กลาวคือถาถูกตัดออกก็จะไดเปนดีเอ็นโมเลกุลใหม แตถาไมถูกตัดออกก็มีการสังเคราะห ดีเอ็นสายใหมตอไปเรื่อยๆ โดยใช ดีเอ็นเอสายเดี่ยวที่มีปลาย 5/PO4 กลาวเปนแมแบบ 5.2 สายดีเอ็นเอที่มีปลาย 3/OH วางอยูนนั้ ยังคงสังเคราะหดีเอ็นเอสายใหมตอไป เพื่อเขาสูการ จําลองดีเอ็นในรอบที่ 2 และเปนเชนนี้ไปเรื่อย เมื่อสิ้นสุดการจําลองสาย DNA ดังกลาวก็ถูกตัดออกจาก ดีเอ็นเอวงแหวน

รูปที่ 3.4 การจําลองดีเอ็นแบบซิกมา (ที่มา : http://bricker.tcnj.edu/tech/le17/rollcir.gif , 2547 และ http://www.sci.sdsu.edu/~smaloy/MicrobialGenetics/topics/phage/roll-circle.GIF, 2547)

พันธุศาสตรโมเลกุลเบื้องตน (258444) ปการศึกษา 2/2547 กวี สุจิปุลิ

6

III. การจําลองดีเอ็นแบบตัววาย (Y-shaped mode of replication) (รูปที่ 3.5) พบในยูคารีโอต และไวรัสบางชนิดที่มีดีเอ็นเอมีรูปรางเปนเสน (linear DNA) ซึ่งกระบวนการ จําลองดีเอ็นเอนั้นจะมีจุดเริ่มตน (ori) ของการเกิด replication bubble บนสายดีเอ็นเอ โดยในไวรัสนั้น มีจุด ori เพียงจุดเดียว แตยูคารีโอตมีจุด ori หลายจุดบนดีเอ็นเอสายเดียวกัน ซึ่งในแตละ bubble จะมี การจําลองดีเอ็นเอแบบสองทิศทาง และยังคงดําเนินตอไปเรื่อยๆ จนกระทั่งแตละ bubble มาบรรจบกัน กลายเปน bubble ใหญ ซึ่งการเคลื่อนที่ของ bubble ไปสูปลายดีเอ็นเอนั้นทําใหโครงสรางของดีเอ็นเอมี รูปรางเปน อักษร Y shape เมื่อสิ้นสุดกระบวนการจําลองดีเอ็นเอได ดีเอ็นเอ 2 โมเลกุล แตละโมเลกุล ประกอบดวยสายเดิมหนึ่งสายและสายใหมที่สังเคราะหขึ้นมาอีกหนึ่งสาย

รูปที่ 3.5 กระบวนการจําลองดีเอ็นเอแบบอักษรวาย (ที่มา Klug : และ Cummingd, 2000)

ปจจัยที่จําเปนตอกระบวนการจําลองดีเอ็นเอ 1. สารตั้งตน (substrate หรือ precursor) สารตั้งตนที่จําเปนในการจําลองโมเลกุลของดีเอ็นเอ คือ ดีออกซีไรโบนิวคลีโอไซดไทร ฟอสเฟต (deoxyribonucleoside triphosphate; dNTP) มี 4 ชนิด คือ ดีออกซีอะดีโนซีนไทรฟอสเฟต (deoxyadenosine triphosphate ;dATP) ดีออกซีกัวโนซีนไทรฟอสเฟต (deoxyguanosine triphosphate; dGTP) ดีออกไซทิดีนซีไทรฟอสเฟต (deoxycytidine triphosphate; dCTP), ดีออกซีไทมิดีนไทร

7

พันธุศาสตรโมเลกุลเบื้องตน (258444) ปการศึกษา 2/2547 กวี สุจิปุลิ

ฟอสเฟต (deoxythymidine triphosphate; dTTP) ซึ่งกระบวนการสังเคราะหนิวคลีโอไทดในเซลลนั้น 2 วิธี คือ 1) กระบวนการสังเคราะหขึ้นใหมจากสารโมเลกุลเล็ก (de novo synthesis) เปนกระบวนการ สั ง เคราะห nucleotide จากสารตั้ ง ต น ที่ มี โ มเลกุ ล เล็ ก เช น กรดอะมิ โ น (amino acid) คารบอนไดออกไซด (CO2) แอมโมเนีย (ammonia) และฟอเมต (formate) เปนตน 2) กระบวนการสังเคราะหโดยวิถีกูคืน (salvage pathway) คือ กระบวนการสังเคราะหนวิ คลี โอไทดจากสารอาหาร หรือการสลายกรดนิวคลีอิก หรือนิวคลีโอไทดในรางกาย กระบวนการสังเคราะหนิวคลีโอไทดดังกลาวเกิดขึ้นภายในเซลล โดยเริ่มสังเคราะหโมเลกุลพิ วรีน (purine nucleus) และโมเลกุลไพริมิดีน (pyrimidine nucleus) กอน จากนั้นทําการเชื่อมตออะตอม ของ C และ N ที่ไดจากสารตั้งตนเปนวงแหวนพิวรีน (purine ring) บนโมเลกุลของ 5/phosphoribosyl1-pyrophosphate (PRPP) ซึ่ง C และ N ที่ใชไดมาจากคารบอนไดออกไซด (CO2) ไกลซีน (glycine) กลูตามีน (glutamine) ฟอเมต (formate) และ แอสพาเตต (aspatate) สําหรับวงแหวนไพริมิดีน (pyrimidine ring) สวนประกอบของนิวเคลียสไดมาจากคารบอนไดออกไซด กลูตามีน และ แอสพา เตต (รูปที่ 3.6)

พิวรีน

ไพริมิดีน

รูปที่ 3.6 แหลง C และ N ของวงแหวนพิวรีน และไพริมิดีน (ที่มา : http://medlib.med.utah.edu/NetBiochem/pupyr/pupy12.gif, 2547)

2. ดีเอ็นเอแมแบบ (DNA template) คือดีเอ็นเอสายเดี่ยว (single strand DNA) ที่เกิดจากการแยกของดีเอ็นเอสายคู (double strand DNA) ซึ่งทําหนาที่เปนสายแมแบบในกระบวนการจําลองดีเอ็นเอเพื่อสังเคราะหดีเอ็นเอสายใหมซึ่งมี เบสคูสมเขามาจับคู (complementary base pair) กับดีเอ็นเอสายแมแบบ โดยการจําลองดีเอ็นเอเปน

พันธุศาสตรโมเลกุลเบื้องตน (258444) ปการศึกษา 2/2547 กวี สุจิปุลิ

8

แบบกึ่งอนุรักษ คือ เมื่อสิ้นสุดกระบวนการจําลองดีเอ็นเอ จะไดดีเอ็นเอ 2 โมเลกุล แตละโมเลกุล ประกอบดวยดีเอ็นเอสายเดิมหรือแมแบบ (template strand) 1 สาย กับสายใหมอีกหนึ่งสาย (daughter strand) 3. อารเอ็นเอไพเมอร (RNA primer) คือ อารเอ็นเอ (RNA) สายสั้นๆ (RNA oligonucleotide) ที่ประกอบดวยไรโบนิวคลีโอไทด (ribonucleotide) ประมาณ 5-15 เบส ซึ่งถูกสังเคราะหมาจากอารเอ็นเอโพลีเมอรเรส (RNA polymerase หรือ primase) โดยอารเอ็นเอไพเมอรนี้มีเบสที่เปนคูสม (complementary base) ที่สามารถเขาจับกับดี เอ็นเอแมแบบที่บริเวณจุด bubble โดยใชพันธะไฮโดรเจน นอกจากนี้ที่บริเวณปลาย 3/OH ของ อารเอ็นเอไพเมอรมีปลาย 3/OH อิสระ เพื่อใหดีเอ็นเอโพลีเมอรเรส (DNA polymerase) นําดีออกซี ไรโบสนิวคลีโอไซดไทรฟอสเฟต (dNTP) ที่มีเบสคูสมกับดีเอ็นเอแมแบบเขามาเชื่อมตอดวยพันธะ ฟอสฟอไดเอสเทอร (phosphodiester bond) ดีเอ็นเอสายใหมที่สรางขึ้นมีทิศทางการสังเคราะหแบบ 5/ → 3/ 4. เอนไซม (enzyme) เอนไซมที่เกีย่ วของกับกระบวนการจําลองดีเอ็นมีหลายชนิด ดังนี้ 4.1 Helix uncoiling protein (หรือ helicase) ทําหนาที่สลายพันธะไฮโดรเจนระหวางเบสของ 2 สายโพลีนิวคลีโอไทด เพื่อแยกใหเปน โพลีนิวคลีโอไทดสายเดีย่ ว ซึ่งการทํางานของ helicase เกี่ยวของกับโปรตีน 3 ชนิด คือ dnaA, dnaB และ dnaC ซึ่งโปรตีนเขาเกาะกับดีเอ็นเอสายคู โดยอาศัยพลังงานจากการ hydrolysis ATP 4.2 DNA topoisomerase หรือ DNA gyrase หรือ helix relaxing protein ทําหนาที่คลายปมเหนือจุดแยก (replication fork หรือ replication bubble) โดยการตัดสายใด สายหนึ่งหรือทั้งสองสายของดีเอ็นเอ ณ ตําแหนงเหนือบริเวณจุดแยกเพื่อคลายปมของดีเอ็นเอไมให เกิดปมเวียนขาว (positive suppercoils) หลังจากคลายปมแลวจะเชื่อมตอรอยตัดเขาอยางเดิม ซึ่ง ปฏิกิริยาดังกลาวตองอาศัยพลังงานจากการ hydrolysis ATP 4.3 DNA polymerase ในโปรคารีโอต (Prokaryote) พบวามี DNA polymerase 3 ชนิด ไดแก 1) DNA polymerase I (pol I)

พันธุศาสตรโมเลกุลเบื้องตน (258444) ปการศึกษา 2/2547 กวี สุจิปุลิ

9

เปนเอนไซมตวั แรกที่ถูกคนพบวามีหนาที่เกี่ยวของกับการจําลองดีเอ็นเอ และซอมแซมดีเอ็น เอ มีโครงสรางเปนโพลีเปบไทด (polypeptide) สายเดี่ยว มีน้ําหนาโมเลกุลประมาณ 109,000 ดาลตัน ซึ่งการทํางานของ DNA polymerase I ตองการดีเอ็นเอแมแบบ หนาที่สําคัญของ DNA polymerase I คือ 1) Proofreading หรือ editing function ในกระบวนการจําลองดีเอ็นเอ ถาสายใหมของดีเอ็นเอ ที่สังเคราะหขึ้นมา (daughter strand) มีการนําเบสที่ไมใชเบสคูสมกับดีเอ็นเอสายแมแบบ DNA polymerase I เขาทําหนาที่ตรวจสอบและดําเนินการแกไข โดยใชคุณสมบัติ 5/ → 3/ exonuclease ตัดนิ วคลีโอไทดที่ผิดนั้นออกไป แลวนํานิวคลีโอไทดที่ถูกตองเขาเชื่อมตอแทน ซึ่งอาจเรียกกระบวนการนี้ วาการซอมแซมดีเอ็นเอ (excision repair) 2) Nick translation เมื่อเกิดการแตกหักของพันธะฟอสฟอไดเอสเทอรบนดีเอ็นเอสายใดสาย หนึ่งของดีเอ็นเอเกลียวคู เรียกวาเกิด nick (คือ รอยขาดบนสายโพลีนิวคลีโอไทดที่ขาดออกจากกัน เนื่องจากพันธะฟอสโฟไดเอสเทอรถูกทําลาย โดยรอยขาดนี้มีนวิ คลีโอไทดหางกันอยูเพียง 1 นิวคลีโอ ไทดเทานัน้ แตถาเกิดชองวางที่มีนวิ คลีโอไทดหายไปหลายตัว เรียกวาเกิด gap) พบวา DNA polymerase I จะเขาทําหนาที่ซอมแซม nick โดยใชคุณสมบัติทั้ง 5/ → 3/ exonuclease และ polymerase โดยตัด นิวคลีโอไทดที่จากปลาย 5/PO4 ของบริเวณที่เกิด nick ออกจากสายดีเอ็นเอ จากนั้นนํานิวคลีโอไทด ที่ถูกตองเขาเชื่อมตอที่ตําแหนงปลาย 3/OH ของบริเวณที่เกิด nick โดยใชการ ทํางานของ polymerase แต DNA polymerase I ไมสามารถเชื่อมตอระหวางนิวคลีโอไทดที่บริเวณ nick ได ดังนัน้ nick เคลื่อนตัวไปตามความยาวของสายดีเอ็นเอ ในทิศทางเดียวกับการสังเคราะหดีเอ็น เอ (5/ → 3/) 2) DNA polymerase II (pol II) เปนเอนไซมมนี ้ําหนักโมเลกุลประมาณ 90,000 MW มีจาํ นวนนอยใน E. coli อาจมีหนาที่ เกี่ยวกับการซอมแซมดีเอ็นเอ มีคุณสมบัติดังนี้ 2.1) มีคุณสมบัติ 3/→5/ exonuclease 2.2) ตองการดีเอ็นเอแมแบบ และไพรเมอร 2.3) ไมสามารถเกิดกระบวนการจําลองดีเอ็นเอที่มีขนาดยาวๆ ได (นอยกวา 100 nucleotides) 2.4)ไมสามารถทํางานไดถามี sulfidyl group (-SH) 3) DNA polymerase III (pol III)

พันธุศาสตรโมเลกุลเบื้องตน (258444) ปการศึกษา 2/2547 กวี สุจิปุลิ

10

เป น เอนไซม ที่ เ กี่ ย วข อ งกั บ กระบวนการจํ า ลองดี เ อ็ น เอ โดยทํ า หน า ที่ ก ระตุ น ให เ กิ ด การ สังเคราะหดีเอ็นเอสาย leading และ lagging strand ซึ่งมีคุณสมบัติดังนี้ 3.1) ทําหนาทีข่ ยายยาวหรือสังเคราะหสายโพลีนิวคลีโอไทดสายใหม โดยมีทิศทาง 5/ → 3/ 3.2) ตองการดีเอ็นเอแมแบบ และไพรเมอร ตองมี Mg+2 เปนตัว catarizer ในการจําลองดีเอ็นเอ 3.3) มีโครงสรางซับซอนกวา Pol I และ Pol II โดย Pol III เปน holoenzyme ที่ประกอบดวย โพลีเปบไทดจาํ นวน 10 หนวย มีน้ําหนักโมเลกุล 422,000 MW โดยเอมไซมหลัก (core enzyme) ประกอบดวยโพลีเปปไทด หลายสาย เชน α, β, Ψ, γ, χ และ δ เปนตน โดยมีน้ําหนักโมเลกุล ประมาณ 170,000 MW (รูปที่ 3.12) 3.4) มีคุณสมบัติ 3/ → 5/ exonuclease และ 5/ → 3/ exonuclease 3.5) ไมสามารถเชื่อมตอ 3/OH และ 5/-monophosphate group 3.6) สกัดใหบริสุทธิ์ไดยาก มักจะอยูรวมกับ DNA polymerase II 3.7) มีคุณสมบัติ 3→5 exonuclease และ 5→3 exonuclease 3.8) มี ป ระสิ ท ธิ ภ าพในการทงานที่เ กี่ ย วของกั บ กระบวนการจํ า ลองดี เ อ็ น เอสู ง กว า DNA polymerase I ประมาณ 15 เทา และ สูงกวา DNA polymerase II ประมาณ 300 เทา

รูปที่ 3.12 องคประกอบของ DNA polymerase III ของ E. coli ในยูคารีโอต พบวามี DNA polymerase 3 ชนิด (รูปที่ 3.13) 1) DNA polymerase α หรือ maxi polymerase 1.1) มีน้ําหนักโมเลกุลประมาณ 220,000 ดาลตัน 1.2) มีปริมาณสูงในชวงระยะ S (Synthesis-DNA) ของการแบงเซลลในระยะอินเตอรเฟต 2) DNA polymerase β หรือ mini polymerase

พันธุศาสตรโมเลกุลเบื้องตน (258444) ปการศึกษา 2/2547 กวี สุจิปุลิ

11

2.1) มีน้ําหนักโมเลกุลประมาณ 45,000 ดาลตัน 2.2) ทําหนาที่เกี่ยวกับการซอมแซมดีเอ็นเอ 3) DNA polymerase γ หรือ mitochondrial polymerase 3.1) พบในนิวเคลียส และไมโตคอนเดรีย 3.2) มีน้ําหนักโมเลกุลประมาณ 60,000 ดาลตัน 3.3) ทําหนาที่เกี่ยวกับการจําลองดีเอ็นเอในไมโตคอนเดรีย

รูปที่ 3.13 DNA polymersae ชนิดตางๆ ของ Simian virus 40 (SV40) 5. RNA polymerase (RNA primase) 5.1 ทําหนาทีส่ ังเคราะห RNA primere ที่มีขนาดประมาณ 1-60 นิวคลีโอไทด ทั้งนี้ขึ้นอยูกับ ชนิดสิ่งมีชีวิต 5.2 ใช RNA polymerase เพื่อสังเคราะห RNA primer ในสาย leading strand โดย RNA polymerase ซึ่งไวตอการตอบสนองของ rifampicin 5.3 ใช RNA primase เพื่อสังเคราะห RNA primer ในสาย lagging strand โดย RNA primase ซึ่งไมตอบสนองตอ rifampicin 6. ทิศทาง 5/ → 3/ exonuclease ทําหนาที่ตัดนิวคลีโอไทดของโพลีนิวคลีโอไทดสายเดีย่ ว โดยตัดจากสวนปลาย 5/PO4 ไปยัง ดาน 3/OH (ทิศทาง 5/ → 3/) 7. ทิศทาง 3/ → 5/ exonuclease

พันธุศาสตรโมเลกุลเบื้องตน (258444) ปการศึกษา 2/2547 กวี สุจิปุลิ

12

ทําหนาที่ตัดนิวคลีโอไทดของโพลีนิวคลีโอไทดสายเดีย่ ว โดยตัดจากสวนปลาย 3/OH ไปยัง ดาน 5/PO4 (ทิศทาง 3/ → 5/) 8. Endonuclease ทําหนาที่ตัดบริเวณภายในของสายโพลีนิวคลีโอไทดของดีเอ็นเอ โดยทําลายพันธะฟอสฟอได เอสเทอร ทําใหเกิดปลาย 3/OH และ 5/PO4 ที่บริเวณจุดตัดเกิดเปนรอยขาดที่เรียกวา nick 9. DNA ligase ทําหนาที่เชื่อมรอยขาด nick ระหวางปลาย 3/OH ของนิวคลีโอไทดหนึ่งกับ 5/ monophosphate ของอีกนิวคลีโอไทดหนึ่ง ดวยพันธะฟอสฟอไดเอสเทอร (รูปที่ 3.14)

รูปที่ 3.14 การเชื่อมตอรอยขาดของดีเอ็นเอ โดยการทํางานของ DNA ligase (ที่มา : http://163.238.8.180/~davis/Bio_327/lectures/DNA_Repl_Chromosomes/ligase.gif, 2547)

ขั้นตอนกระบวนการจําลองดีเอ็นเอมี 3 ขั้นตอน คือ 1. การเริ่มตนการจําลองดีเอ็นเอ (initiation of DNA replication) 2. การขยายยาวของสายโพลีนิวคลีโอไทดสายใหม (polymerlization of DNA replication) 3. สิ้นสุดการจําลองดีเอ็นเอ (termination of DNA replication)

กระบวนการจําลองดีเอ็นเอในโปรคารีโอต (DNA replication in prokaryote) การจําลองดีเอ็นเอในโปรคารีโอตมีขั้นตอนที่สําคัญ ดังนี้ I. การเริ่มตนการจําลองดีเอ็นเอ

พันธุศาสตรโมเลกุลเบื้องตน (258444) ปการศึกษา 2/2547 กวี สุจิปุลิ

13

เปนขั้นตอนที่เกี่ยวของกับการทํางานของเอมไซม และตองการตําแหนงเริ่มตนที่มีลําดับเบส จําเพาะบนสายดีเอ็นเอ ขั้นตอนการเริ่มตนการจําลองดีเอ็นเอมีดังนี้ 1. เฮลิเคส (helicase) ทําหนาที่ทําลายเกลียวคูของดีเอ็นเอ (double helix) เกิด replication fork หรือ bubble ขึ้น ณ บริเวณจุดเริ่มตนการจําลองดีเอ็นเอ (origin of DNA replication หรือ ori) ซึ่งมีเพียงจุดเดียวใน E. coli โดยมีลําดับเบสที่จําเพาะประมาณ 240-250 คูเบส ที่ เปนตําแหนงจดจําของ helicase ซึ่งทําหนาที่คลายเกลียวคูของดีเอ็นเอ โดยทําลายพันธะไฮโดรเจน ระหวางเบสที่อยูบนแตละสายของโพลีนิวคลีโอไทด เพื่อใหไดเปนดีเอ็นเอสายเดีย่ ว ขั้นตอนการเกิด replication fork มีดังนี้ 1) dnaA protein complex ประกอบดวยโปรตีน 10-20 หนวย เขามาเกาะ (binding หรือ interaction) กับ oriC ที่ตําแหนง 9 mers (A-T rich) โดยใชพลังงานจากการ hydrolysis ATP ทําให DNA อยูในสภาพเกลียวเวียนซาย (left-hand หรือ negative supercoil) ซึ่งงายตอการทําลายพันธะ ไฮโดรเจน ทําใหดีเอ็นเอเกลียวคูเปดออก (open complex) กลายเปนดีเอ็นเอสายเดีย่ ว (รูปที่ 3.15) 2) เกิด prepriming complex โดย dnaB protein (ทําหนาที่เปน helicase) รวมตัวกับ dnaC กลายเปน prepriming complex โดยใชพลังงานจากการ hydrolysis ATP แลวเขาเกาะกับดีเอ็นเอสาย เดี่ยว (ssDNA) บริเวณ open complex ที่อยูระหวาง dnaA และ oriC เมื่อ helicase จะเขาทําหนาทีค่ ลายเกลียวคู โดยทําลายพันธะไฮโดรเจน ระหวางเบสที่อยูบนแต ละสายโพลีนิวคลีโอไทด ทําใหเกิด replication fork หรือ bubble ซึ่งเปนจุดเริ่มตนการการจําลอง ดีเอ็นเอ (initiation point) โดย 1 bubble จะมี replication fork 2 จุด ที่มีทิศทางตรงขามกัน

รูปที่ 3.15 ขั้นตอนการเกิด open complex ที่บริเวณ oriC และหนาทีข่ องโปรตีน dna B ชวย ให primase เขาเกาะกับดีเอ็นเอ เพื่อเริ่มตนสังเคราะห RNA primer (ที่มา : Klug และ Cumming, 1994)

พันธุศาสตรโมเลกุลเบื้องตน (258444) ปการศึกษา 2/2547 กวี สุจิปุลิ

14

2. อารเอ็นเอไพเมสทําหนาที่สังเคราะหอารเอ็นเอไพเมอร (primase catalyses formation of RNA primer) dnaB นอกจากทําหนาที่เปน helicase เพื่อเขาเกาะกับ ssDNA ที่ตําแหนงเฉพาะบนตําแหนง open complex แลวยังทําหนาที่กระตุนให primase หรือ RNA polymerase เขามาเกาะที่ตําแหนง ssDNA open complex (oriC) ทั้ง 2 strands เพื่อทําหนาที่สังเคราะห RNA primer ที่มียาวประมาณ ประมาณ 1-60 คูเบส ที่เรียกวา RNA primer หรือ RNA oligonucleotide ที่มีปลาย 3' OH เปนอิสระ และเปนเบสคูสมกับสายดีเอ็นเอแมแบบ (single DNA template) การสังเคราะห RNA primer เริ่มตนดวยการเกิด complex ที่เรียกวา primosome (6 proteins + ss DNA + primase + helicase) ซึ่งประกอบดวย โปรตีน 6 ชนิด คือ n, n/, n//, τ, dna B และ dna C เขา จับกับดีเอ็นเอสายเดี่ยว โดยใช ATP จากนั้น primase จะเขารวมกับ preprimosome เกิดเปนหนวยที่ เรียกวา primosome ซึ่งโปรตีน n/ จะใชพลังงานจาการยอยสลาย ATP เพื่อใชสําหรับการเคลื่อนที่ primosome ไปตามความยาวของดีเอ็นเอ จนกระทั่งไปพบ priming site ซึ่งเลือกโดยสุม หลังจากนั้น โปรตีน dna B. จะเปลี่ยนแปลงโครงสรางของดีเอ็นเอ ตรวจหาตําแหนงที่คัดเลือก ทําให primase เริ่มตนสังเคราะห RNA primer ขึ้น (รูปที่ 3.16)

รูปที่ 3.16 โครงสรางของ primase (ที่มา : http://www.mun.ca/biochem/courses/3107/images/primase_model.gif, 2547)

เมื่อมีการสังเคราะห RNA primer แลว RNA primer จะเขาเกาะกับดีเอ็นเอแมแบบ เพื่อเริ่มตน การจําลองดีเอ็นเอ โดยอาศัยการทํางานของ polymerase III ที่นํานิวคลีโอไทดตัวใหมเขามาเติมที่ 3/OH ของ RNA primer (รูปที่ 3.17)

พันธุศาสตรโมเลกุลเบื้องตน (258444) ปการศึกษา 2/2547 กวี สุจิปุลิ

15

รูปที่ 3.17 ไพรเมอรที่มีปลาย 3/– OH อิสระ เปนตัวเริ่มตนในการจําลองตัวเองของ ดีเอนเอ (ที่มา : http://www.cat.cc.md.us/courses/bio141/lecguide/unit1/prostruct/dnareppr/images/u4fg8b.jpg, 2547)

3. Single-stranded binding protein (SSBPs) SSBPs ประกอบดวยกรดอะมิโนประมาณ 100 ตัว ที่เกาะอยูกับดีเอ็นเอสายเดียว ( โดย SSBPs มีหนาที่สําคัญคือ ชวยให helicase ทํางานไดดีขึ้น และปองกันไมใหดีเอ็นเอสายเดี่ยว (ssDNA) ที่แยก จากกันแลวกลับเขามาสรางพันธะไฮโดรเจนเพื่อเกิดเปนดีเอ็นเอสายคูใหมอีกครั้ง นอกจากนี้ SSBPs ยังปองกันไมให ssDNA แตละสายมาสรางพันธะไฮโดรเจนภายในสายเดียวกันที่เกิดโครงสรางที่ เรียกวา hairpin loop ขึ้น รวมทั้งยังปองกันไมใหดีเอ็นเอสายเดี่ยวถูกยอยดวยเอนไซม นิวคลีเอส (nuclease) อยางไรก็ตามเมื่อ DNA polymerase ผานจุดนี้ไปแลว พบวา SSBP ก็ถูกปลอยออกจาก โมเลกุลของ ssDNA (รูปที่ 3.18)

พันธุศาสตรโมเลกุลเบื้องตน (258444) ปการศึกษา 2/2547 กวี สุจิปุลิ

16

รูปที่ 3.18 ขั้นตอนการจําลองดีเอ็นเอที่เกี่ยวของกับเอนไซมตางๆ (ที่มา : Klung และ Cumming, 1194)

II. การขยายยาวของสายโพลีนิวคลีโอไทด (รูปที่ 3.19) เหตุการณที่สําคัญในขั้นตอนการขยายยาวของสายโพลีนิวคลีโอไทด มีดังนี้ 1. การสังเคราะหโพลีนิวคลีโอไทดสายใหม 2 สาย โดยการทํางานของ DNA polymerase III กระบวนการจําลองดีเอ็นเอเปนแบบกึ่งอนุรักษ ดีเอ็นเอเกลียวคูประกอบดวย 2 สายโพลีนิวคลี โอไทด ซึ่งมีทิศทางแบบ antiparallel คือ สายหนึ่งมีทิศทาง 5/ → 3/ สวนอีกสายหนึ่งมีทิศทางตรงกัน ขามคือ 3/ → 5/ ดังนั้นเมื่อเกิด replication fork แลว RNA primer จะเขาเกาะกับดีเอ็นเอแมแบบทั้ง สองสาย จากนั้น DNA polymerase III ทําหนาที่ในการสังเคราะหโพลีนิวคลีโอไทดสายใหมโดยนํา deoxynucleotide 5-triphosphate ที่มีเบสเปนเบสคูสมกับสายดีเอ็นแมแบบมาเชื่อมตอกับ RNA primer ที่มีปลาย 3/OH อิสระ โดยใชพันธะฟอสฟอไดเอสเทอร ดังสมการ poly (nucleotide) n –3/OH + dNTP → poly (nucleotide) n+1 3/OH + PP รูปแบบการสังเคราะหโพลีนิวคลีโอไทดสายใหมโดยใชดเี อ็นเอแมแบบทั้งสองสาย มีดังนี้ 1) สาย leading strand

พันธุศาสตรโมเลกุลเบื้องตน (258444) ปการศึกษา 2/2547 กวี สุจิปุลิ

17

เมื่อ RNA primer เขาเกาะกับสายโพลีนิวคลีโอไทดสายแมแบบที่มีทิศทาง 3/ → 5/ พบวา DNA polymerase สามารถสังเคราะหดีเอ็นเอสายใหมโดยเพิ่มจํานวนนิวคลีโอไทดไดอยางตอเนื่อง ตลอดสาย เรียกวา continuous หรือ leading strand ทั้งนี้เนื่องจากทิศทางการสังเคราะหสายโพลีนิวคลี โอไทดหรือการทํางานของ DNA polymerase III ทําในทิศทาง 5/ → 3/ ซึ่งมีทิศทางการสังเคราะหดี เอ็นเอสายใหมเปนทิศทางเดียวกับการคลายเกลียวของดีเอ็นเอเกลียวคู 2) สาย lagging strand ถาใชสายโพลีนิวคลีโอไทดอีกสายหนึ่งที่มีทิศทาง 5/ → 3/ เปนสายแมแบบ พบวาการ สังเคราะหดีเอ็นเอสายใหมไมสามารถสังเคราะหหรือเพิ่มจํานวนนิวคลีโอไทดไดอยางตอเนื่องที่ เรียกวา discontinuous หรือ lagging strand เพราะทิศทางการสังเคราะหดีเอ็นเอสวนทางกับการคลาย เกลียวของดีเอ็นเอเกลียวคู ฉะนั้นจึงมีการสังเคราะห DNA เปนทอนสั้นๆ ที่เรียกวา okazaki fragment ซึ่งมีจํานวนนิวคลีโอไทดประมาณ 1000- 2000 นิวคลีโอไทด และทุกครั้งที่เกิดจุด replication fork จุด ใหม RNA primer ก็จะเขาเกาะกับดีเอ็นเอสายแมแบบที่มีทิศทาง 5/ →3/ ใหม แลว DNA polymerse III ก็จะเขาทําหนาที่สังเคราะหโพลีนิวคลีโอไทดสายใหมขึ้นมา DNA polymerase III มีคุณสมบัติที่สําคัญคือ 1) ทําหนาที่ polymersize ทั้งสาย leading strand และสาย lagging strand 2) ตองการดีเอ็นเอแมแบบ และ RNA primer ที่มีปลาย 3/OH อิสระ 3) เปน holoenzyme ขนาดใหญมากคือ มากกวา 600 กิโลดาลตัน ซึ่งประกอบดวยโพลีเบป ไทดที่แตกตางกัน 5-10 ชนิด โดยเอมไซมที่มีรูปรางแบบ asymmetric dimeric structure ประกอบดวย 2γ, β, α, δ, ε, และ τ subunit ซึ่งเปนสวนสําคัญในปฏิกิริยา polymerize 4) β subunit มีรูปรางเปน donut-shaped dimer ซึ่งมีลักษณะคลาย clamp ซึ่งสามารถเคลื่อนที่ ไปตามความยาวของเสนดีเอ็นเอ (รูปที่ 3.20) เพื่อทําหนาที่สังเคราะหเพียงดีเอ็นเอสายสั้นๆ เทานั้น คือ ประมาณ 20 นิวคลีโอไทด 5) α subunit เปนตัวทําใหเกิดปฏิกิริยา polymeriztion สวน ε subunit ทําใหเกิดปฏิกิริยา 3/ → 5/ exnuclease 6) สวนอีก 5 subunits คือ 2γ, δ, ε, และ τ subunit รวมกันเปน γ complex ทําหนาที่เปนตัวนํา β subunit เขาเกาะกับ duplex DNA-primer substrate 7) τ subunit ทําหนาที่เกีย่ วกับการเกิด dimerize ของ core enzyme

พันธุศาสตรโมเลกุลเบื้องตน (258444) ปการศึกษา 2/2547 กวี สุจิปุลิ

18

รูปที่ 3.19 ขั้นตอนการขยายยาวของสายโพลีนิวคลีโอไทด

รูปที่ 3.20

β subunit มีรูปรางเปน donut-shaped dimer ซึ่งมีลักษณะคลาย clamp

2. เมื่อ helicase ทําหนาทีข่ ยายจุด replication fork ตอไปอีกสาย leading strand ก็จะ polymerize ตอไปเรื่อยๆ ในทิศทาง 5/→3/ สวนสาย lagging strand ก็จะสังเคราะห okazaki fragment

พันธุศาสตรโมเลกุลเบื้องตน (258444) ปการศึกษา 2/2547 กวี สุจิปุลิ

19

สายใหมขึ้นมาในทิศทาง 5/→3/ โดยมี RNA primer ตัวใหมเขากับดีเอ็นเอแมแบบที่บริเวณ replication fork ที่เกิดขึ้นใหม แลวเริ่มกระบวนการสังเคราะห okazaki fragment สายใหมขึ้นมา (รูปที่ 3.21 และ 3.22)

รูปที่ 3.21 การขยายยาวของสายโพลีนิวคลีโอไทดในกระบวนการสังเคราะหดีเอ็นเอ (ที่มา : http://opbs.okstate.edu/~petracek/Chapter%2025%20figures/Fig%2025-13.JPG, 2547)

พันธุศาสตรโมเลกุลเบื้องตน (258444) ปการศึกษา 2/2547 กวี สุจิปุลิ

20

รูปที่ 3.22 การจําลองตัวเองของดีเอนเอ (ที่มา : http://www.groton.k12.ct.us/WWW/fsr/student/fall02/DNA/dnarep.jpg , 2547)

3. DNA topoisomerase หรือ DNA gyrase ขณะที่ helicase ทําลายพันธะไฮโดรเจนระหวางเบสที่อยูตางสายโพลีนิวคลีโอไทดนั้น พบวา บริเวณเหนือจุดแยกจะเกิดปมของสายดีเอ็นเอที่พันกันแนน (คลายกับการดึงปลายเชือกเสนคูใหแยก ออกจากกันเปนเสนเดี่ยว โดยกดใหปลายเชือกดานหนึ่งใหอยูกับที่ ก็จะทําใหเกิดปมเหนือจุดแยกขึ้น) ดังนั้น DNA topoisomerase จะมีทําหนาที่คลายปมเหนือจุดแยก (replication fork) ในขณะเกิด กระบวนการจําลองดีเอ็นเอ โดยการทําลายพันธะฟอสฟอไดเอสเทอรระหวางนิวคลีโอไทดภายในสาย โพลีนิวคลีโอไทดเดียวกัน เพื่อเปนการลดจํานวน supercoil ที่เกิดขึ้นเหนือบริเวณจุด replication fork

พันธุศาสตรโมเลกุลเบื้องตน (258444) ปการศึกษา 2/2547 กวี สุจิปุลิ

21

โดยใชพลังงานจาก ATP จากนั้นก็ทําหนาที่เชื่อมรอยขาดระหวางนิวคลีโอไทดดวยพันธะฟอสฟอได เอสเทอร DNA topoisomerase แบงออกเปน 2 ชนิด คือ 1) DNA topoisomerase I ทําหนาที่ตัดดีเอ็นเอสายเดีย่ วที่อยูเหนือจุด replication fork (บางครั้งอาจตัดทั้งสองสายของโพลีนิวคลีโอไทด) (รูปที่ 3.23) 2) DNA topoisomerase II (DNA gyrase) ทําหนาที่ตัดและเชื่อมตอดีเอ็นเอสายเดี่ยวที่อยู เหนือจุด replication fork (บางครั้งอาจตัดทั้งสองสายของโพลีนิวคลีโอไทด)

รูปที่ 3.23 คุณสมบัติของ gyrase หรือ topoisomerase ที่ทําหนาทีค่ ลายเกลียวเหนือจุดแยก III. การสิ้นสุดการจําลองดีเอ็นเอ เมื่อสิ้นสุดขั้นตอนการจําลองดีเอ็นเอจะไดดีเอ็นเอ 2 โมเลกุล โดยแตละโมเลกุลประกอบดวย โพลีนิวคลีโอไทดแมแบบหรือโพลีนิวคลีโอไทดสายเดิม 1 สาย และอีกสายหนึ่งเปนโพลีนิวคลีโอไทด สายใหม ซึ่งโพลีนิวคลีโอไทดสายใหมที่พบใน leading strand และ lagging strand นั้นมี RNA primer ติดอยูที่ปลาย 5/PO4 ซึ่ง RNA primer นี้จําเปนตองถูกขจัดออกไปโดยใช (1) ribonuclease (RNase) ที่ มีความจําเพาะกับ RNA primer หรือ (2) DNA polymerase I (5/→3/ exonuclease) ตัดที่ปลาย 5/PO4 ของ RNA primer โดยตัดที่ละโมเลกุล ขณะเดียวกันก็มีการเติมนิวคลีโอไทดตัวใหมเขาไปที่ปลาย 3/OH ของสายดีเอ็นเอสายใหมที่ถูกสังเคราะหขึ้น คลายกับการเกิด nick translation จนเหลือชองวางที่ เรียกวา nick จากนั้น DNA lygase จึงเขาทําหนาที่เปนเชื่อมรอยตอระหวางนิวคลีโอไทด (nick) โดย สรางพันธะฟอสฟอไดเอสเทอรที่ปลาย 3/OH ของนิวคลีโอไทดหนึ่ง กับ 5/PO4 ของอีกนิวคลีโอไทด หนึ่งที่อยูติดกันโดยใชพลังงานจากการ hydrolysis ATP (รูปที่ 3.24) เหตุการณที่เกิดขึ้นในขั้นตอนการ สิ้นสุดการจําลองดีเอ็นเอ พอสรุปไดดังนี้

พันธุศาสตรโมเลกุลเบื้องตน (258444) ปการศึกษา 2/2547 กวี สุจิปุลิ

22

1. การขจัด RNA primer บนสาย leading strand สายโพลีนิวคลีโอไทดสายใหมที่พบใน leading strand ที่มี DNA polymerase III ทําหนาที่ สังเคราะหสายโพลีนิวคลีโอไทดในทิศทาง 5/→3/ ไปเรื่อยจนสิ้นสุดสายดีเอ็นเอแมแบบ (3/→5/) จากนั้น DNA polymerase III จะหยุดทํางาน แตจะมี DNA polymerase I ชนิด 5/→3/ exonuclease เขามาทําหนาที่ตัด ณ ตําแหนงปลาย 5/PO4 ของ RNA primer โดยตัดทีละ 1 นิวคลีโอไทด ขณะเดียวกัน DNA polymerase I ก็นํานิวคลีโอไทดที่ถูกตองหรือมีเบสคูสมกับดีเอ็นเอแมแบบมาเชื่อมตอที่ปลาย 3/OH ของสาย leading strand (theta mode of DNA replication) คลายกับการเกิด nick translation จากนั้น DNA ligase เขาทําหนาที่เชื่อมชองหวางระหวางนิวคลีโอไทดโดยตอระหวางนิวคลีโอไทด ดวยพันธะฟอสฟอไดเอสเทอร กรณีของโปรคารีโอตดีเอ็นเอมีรูปรางเปน circular DNA พบวาไมมีปญหาเรื่องการเติม nucleotide ในสวนของชองวาง (gap) หลังจากที่มีการตัด RNA primer ออกไปแลว เนื่องจากมีการ จําลองดีเอ็นเอแบบ theta mode of DNA replication (รูปที่ 3.24) 2. การขจัด RNA primer บนสาย lagging strand สวนสายโพลีนิวคลีโอไทดสายใหมของ lagging strand นั้นจะประกอบไดดว ย okazaki fragment จํานวนมาก ซึ่งแตละสาย okazaki fragment จะถูกนํามาเชือ่ มตอเปนสายโพลีนิวคลีโอไทด ยาวตอเนื่อง (continuous strand) ได โดยการทํางานของ DNA polymerase III ซึ่งทําหนาที่นํานิวคลีโอ ไทดมาตอที่ปลาย 3/OH ของ okazaki fragment หนึ่งไปเรื่อยๆ จนถึงปลาย 5/PO4 ของ RNA primer ของอีก okazaki fragment หนึ่งที่อยูติดกันซึ่งถูกสังเคราะหขึ้นมากอนแลว จากนัน้ DNA polymerase III จะแยกออกจาก okazaki fragment (ทั้งนี้เพราะวา DNA polymerase III ไมสามารถ polymerization ตอไปได หรือ DNA polymerase III ไมสามารถทํางานไดบริเวณ nick ทีมีปลาย 5/ triphosphate อยูด วย (RNA primer) ยกเวนแตมเี อมไซมบางชนิดมาตัด triphosphate ใหเปน monophosphate) ดังนัน้ การ เชื่อมตอระหวางนิวคลีโอไทดที่อยูบริเวณ nick ตองอาศัยการทํางานของ DNA ligase จึงเขาทํางาน เชื่อมตอระหวางนิวคลีโอไทด (โดยทัว่ ไป DNA ligase จะอยูในสภาพ inactive เมื่อนิวคลีโอไทดอยูใ น รูปของ ribo-form แต DNA polymerase I สามารถทํางานไดอยางมีประสิทธิภาพบริเวณรอยขาดนี้ คือ ทําใหเกิด nick translation ขึ้น)

พันธุศาสตรโมเลกุลเบื้องตน (258444) ปการศึกษา 2/2547 กวี สุจิปุลิ

23

รูปที่ 3.24 การขจัด RNA primer ที่ปลาย 5/ ของดีเอ็นเอสายใหม

กระบวนการจําลองดีเอ็นเอในยูคารีโอต (DNA replication in eukaryote) ขั้นตอนการจําลองดีเอ็นเอในยูคารีโอตมีลักษณะคลายกับโปรคารีโอตแตมีความซ้ําซอน มากกวา และมีชนิดของเอมไซม รวมทั้งวิธีการในแตละขั้นตอนแตกตางกันไปบาง ซึ่งสามารถสรุป ขั้นตอนการจําลองดีเอ็นในยูคารีโอตได ดังนี้ I. การเริ่มตนการจําลองดีเอ็นเอ ในสัตวเลี้ยงลูกดวยน้ํานม พบวามี DNA polymerase และเอมไซมหลายชนิดที่เกี่ยวของกับ กระบวนการเริ่มตนการจําลองดีเอ็นโดยขั้นตอนการคลายกับโปรคารีโอตแตตางกันเล็กนอย เชน ขั้นตอนการเริ่มตนการจําลองดีเอ็นเอของไวรัสชนิดsimian virus 40 หรือ SV40 (in vitro) สามารถสรุป ไดดังนี้ (รูปที่ 3.25) 1. T antigen เปนโปรตีนทีม่ ีหนาที่หลายอยาง (multifunctional proteins) โดย T antigen จะ เขาจับกับตําแหนงเริ่มตนบนสายดีเอ็นเอของไวรัส (SV40 origin) เพื่อคลายเกลียวคูของ duplex DNA ของไวรัสใหเปนดีเอ็นเอสายเดียว โดย T antigen ทําหนาที่คลายกับ helicase ในโปรคารีโอต 2. จากนั้น Replication protein A (RPA) เขามามาจับกับดีเอ็นเอสายเดี่ยว (ssDNA) โดย RPA ทําหนาที่คลาย single-strand binding protein (SSB) ในโปรคารีโอต 3. เกิด Complex โดย Primase เขาเกาะกับ DNA polymerase α จากนั้นจึงเขารวมกับ RFA (Replication protein A) เปน complex แลวจึงเขาเกาะกับ ssDNA template เพื่อเริ่มกระบวกการจําลอง

พันธุศาสตรโมเลกุลเบื้องตน (258444) ปการศึกษา 2/2547 กวี สุจิปุลิ

24

ดีเอ็นเอ โดย primase ทําหนาที่สราง RNA primer และ DNA polymerase α ทําหนาที่สังเคราะหสาย โพลีนิวคลีโอไทดสายใหม โดยไดรับการกระตุนจาก RFA II. การขยายยาวของสายโพลีนิวคลีโอไทดของยูคารีโอต กระบวนการจําลองดีเอ็นเอโดยทั่วไปเปนแบบ bidirectional DNA replication (แบบ Y mode) เมื่อสิ้นสุดกระบวนการจะไดดีเอ็นเอสาย 2 สาย คือ leading strand และ lagging strand คลายกับการ จําลองดีเอ็นเอในโปรคารีโอต โดยเหตุการณที่สําคัญในขั้นตอนการขยายยาวของสายโพลีนิวคลีโอ ไทดของยูคารีโอต (รูปที่ 3.25) มีดังนี้ 1. เหตุการณบนสาย leading strand สายโพลีนิวคลีโอไทดสายใหมของสาย leading strand พบวา มีโปรตีนที่เรียกวา proliferating cell nuclear antigen (PCNA) ซึ่งทําหนาที่คลาย β subunit ของ DNA polymerase III คือ เขาเกาะที่ ปลาย 3/OH RNA primer–template terminus เพื่อปลดปลอย DNA polymerase α และ primase ออก จากสายดีเอ็นเอแมแบบ จากนั้น DNA polymerase δ เขารวมกับ RFC-PCNA complex ที่ปลาย 3/OH ของ leading strand เพื่อทําหนาที่สังเคราะหหรือขยายยาวสายโพลีนิวคลีโอไทดสายใหมของสาย leading strand 2. เหตุการณบนสาย lagging strand สวนสายโพลีนิวคลีโอไทดสายใหมของสาย lagging strand พบวา RFC-primase-polymerase α complex เขาเกาะที่ปลาย 3/OH ของ lagging strand เพื่อทําหนาที่ polymerization ในทิศทาง 5/→3/ โดยจะมีการสังเคราะหโพลีนิวคลีโอไทดสายใหมของ lagging strand แบบไมตอเนื่อง ทําใหเกิด okazaki fragment ขึ้น ในขณะที่มีการสังเคราะหโพลีนิวคลีโอไทดสายใหมของทั้งสาย leading strand และ lagging strand ก็จะมีเอมไซม topoisomerase ทําหนาที่คลายปมเหนือจุด replication fork (หรือ replicon) คลายกับในโปรคารีโอต

พันธุศาสตรโมเลกุลเบื้องตน (258444) ปการศึกษา 2/2547 กวี สุจิปุลิ

รูปที่ 3.25 ขั้นตอนการเริ่มการจําลองดีเอ็นเอของไวรัสชนิด SV40 (in vitro) (ที่มา : http://www.rci.rutgers.edu/~molbio/Courses/MBB_408_512/DNAreplec3.pdf, 2547)

25

พันธุศาสตรโมเลกุลเบื้องตน (258444) ปการศึกษา 2/2547 กวี สุจิปุลิ

26

III. การสิ้นสุดการจําลองดีเอ็นเอ (รูปที่ 3.26) กระบวนการสิ้นสุดการจําลองดีเอ็นเอในยูคารีโอตจะมีความซับซอนมากกวาในโปรคารีโอต เนื่องจากดีเอ็นเอในยูคารีโอตมีลักษณะเปนเสน (linear DNA) โดยพบวามีลําดับเบสที่จําเพาะบริเวณ สวนปลายของโครโมโซมยูคารีโอต (eukaryotic chromosome หรือ telomere) ซึ่งเปนลําดับเบสที่ไมมี สวนของยีนอยู แตมีบทบาทสําคัญในการกําหนดกระบวนการสิ้นสุดการจําลองดีเอ็นเอ กลาวคือ บริเวณสวนปลายของโครโมโซมยูคารีโอตประกอบดวยจํานวนซ้ําหลายๆ ซ้ําของลําดับเบสทอนสั้น ของ G-C rich sequence ที่ตําแหนงปลาย 3/OH เชน ในสัตวมีกระดูกสันหลัง (vertibrate) พบวามี ลําดับเบส 5/ TTGGGG 3/ / 3/ AACCCC 5/ สวนในมนุษย พบวามีลําดับเบส 5/ TTAGGG 3’ / 3/ AATCCC 5/ sequence ที่เปนสวนสําคัญในกระบวนการสิ้นสุดการจําลองตัวเองของดีเอ็นเอ โดย สามารถสรุปขั้นตอนได (รูปที่ 3.24) ดังนี้ 1. การเพิ่มของ G-C rich sequences ที่บริเวณปลาย 3/OH ของดีเอ็นเอแมแบบ ซึ่งจะทําการ เพิ่มลําดับเบส G-C rich sequence หลายๆ ชุด (copy) ที่ปลาย 3/OH ของดีเอ็นเอแมแบบ โดยการทํางาน ของ telomerase ซึ่งภายใน telomerase ประกอบดวยสายอารเอ็นเอแมแบบ (RNA template) ที่มีลําดับ เบส 5/ AACCCC 3/ ซึ่งจะเขาเกาะกับสายดีเอ็นเอแมแบบที่ปลาย 3/OH โดย RNA template มีลําดับเบส 5/ AAC 3/ ลอยอยูอิสระหรือที่ไมไดเขาเกาะกับดีเอ็นเอดีเนเอแมแบบ ซึ่งจะใช 5/ AAC 3/ นี้เปน อารเอ็นเอแมแบบ เพื่อสังเคราะหลําดับเบส 5/ TTG 3/ ที่ปลาย 3/OH ของดีเอ็นเอสายแมแบบ โดยการ ทํางานของ telomerase 2. การเคลื่อนที่ (translocation) ของ telomerase โดย telomerase มีการเคลื่อนที่ตอไปอีก 3 เบส ทําใหตําแหนง 5/ AAC 3/ ของอารเอ็นเอไพเมอรที่อยูใน telomerase ลอยเปนอิสระอีกครั้ง ดังนั้น จึงมีการสังเคราะห TTG ที่ปลาย 3/OH ของดีเอ็นเอสายแมแบบขึ้นมาอีก 3. การขยายยาวของลําดับเบส TTG ที่ปลาย 3/OH ของดีเอ็นเอสายแมแบบ โดยมีการ สังเคราะหนิวคลีโอไทดที่มีลําดับ 5/ TTG 3/ ที่ปลาย 3/OH ของดีเอ็นเอสายแมแบบเพิ่มขึ้นโดยใช อารเอ็นเอไพเมอรรวมกับทํางานของ telomerase ซึ่งอาจทําซ้ําหลายๆ ซ้ํา จนไดลําดับเบสดังกลาว เพิ่มขึ้นมากมาย (ทําใหมี G rich จํานวนมาก) 4. การสังเคราะห primer โดย primase เขามาเกาะที่ปลาย 3/OH ของดีเอ็นเอแมแบบ แลวเริ่ม กระบวนการสังเคราะห RNA primer (ใน tetrahymena มี RNA จํานวน 159 นิวคลีโอไทด ซึ่ง ประกอบดวย 5/ CAACCCCAA 3/) ซึ่งเขาเกาะกับดีเอ็นเอสายแมแบบ 5. DNA replication โดย DNA polymerase จึงเขาทําหนาที่นํานิวคลีโอไทดเขามาเชื่อมตอที่ ปลาย 3/OH ของไพรเมอรโดยมีลําดับเบสเปนเบสคูสมกับดีเอ็นเอสายแมแบบ

พันธุศาสตรโมเลกุลเบื้องตน (258444) ปการศึกษา 2/2547 กวี สุจิปุลิ

27

6. Primer remove เมื่อสิ้นสุดกระบวนการจําลองดีเอ็นเอพบวา RNA primer ที่ปลาย 5/PO4 ของสายโพลีนิวคลีโอไทดทสี่ ังเคราะหขึ้นมาใหมจะถูกตัดทิ้งไปประมาณ 12-16 เบส โดยไมมกี าร ทดแทนขึ้นมาอีก เพราะสวนที่ขาดหายไปคือ telomere sequence ซึ่งจะมีการสรางขึ้นมาทดแทนอยู เสมอโดย telomerase

รูปที่ 3.26 ขั้นตอนการขยายยาวของดีเอ็นเอสายใหม โดยการทํางานของ telomerase ในกระบวนการสิ้นสุดจําลองดีเอ็นเอ (ที่มา : http://www.rci.rutgers.edu/~molbio/Courses/MBB_408_512/DNAreplec3.pdf, 2547)