Dna I Rna Izolacija_211206

DNA i RNA izolacija

• Centralna dogma molekularne biologije DNA RNA PROTEIN

Prisjetimo se! • DNA je dvolančana molekula izgrađena od dva komplementarna lanca, koja se na visokoj temperaturi denaturira (razdvajaju se lanci), a na nižoj se ponovo može renaturirati (spajaju se komplementarni lanci) • RNA je jednolančana molekula, vrlo je slična DNA • RNA i DNA mogu međusobno stvarati hibride – spajaju se komplementarni lanci

A

G

T

C

U

…izbor osnovnih metoda… • • • • • •

Izolacija DNA i RNA Lančana reakcija polimerazom (PCR) Reverzna transkripcija-PCR (RT-PCR) Kloniranje gena Southern blot/Northern blot Određivanje primarne strukture DNA (sekvenciranje)

ZAŠTO IZOLIRAMO DNA i RNA • Uklanjamo proteine • Odvajamo DNA od RNA i obrnuto • Želimo izolirati specifični dio DNA ili RNA (izolacija ukupne DNA ili RNA je prvi korak prema tome)

KOJA DNA SE MOŽE IZOLIRATI? • IZ TKIVA/STANICA: – GENOMSKA (KROMOSOMI) – DNA IZ ORGANELA

• IZ VIRUSA • IZ BAKTERIJA – GENOMSKA – PLAZMIDNA DNA

KOJA RNA SE MOŽE IZOLIRATI? • UKUPNA • mRNA – Izbor ovisi o cilju eksperimenta (mRNA je 2-5% ukupne RNA) – Za izolaciju mRNA potrebno je dodatno pročišćavanje koristeći karakteristiku mRNA da imaju polyA tail

TIPOVI METODA • 1) Temeljeni na razlikama u topivosti – A) Namatanjem na štapić (samo DNA) – B) Pročišćavanjem fenol-kloroform-izoamilnim alkoholom (DNA i RNA)

• 2) Metode temeljene na adsorpciji na kolone (DNA i RNA) • 3) Metode centrifugiranja u gradijentu gustoće CsCl (gotovo su je u potpunosti zamijenile kolone) (DNA i RNA)

1)A)IZOLACIJA DNA NAMATANJEM NA ŠTAPIĆ

1)B)IZOLACIJA DNA FENOLOM • DEPROTEINIZACIJA se postiže razgradnjom PROTEINAZOM K i ekstrakcijom organskim otapalima – Proteinaza K razgrađuje proteine – Ekstrakcija fenol-kloroform-izoamilni alkohol, • Za DNA uravnoteženo i nadsvođeno 0,1M Tris puferom pH 8 • Za RNA uravnoteženo H2O kiseli PH

Fenol denaturira proteine, kloroform čuva fenol od oksidacije i uklanja lipide, izoamilni alkohol sprječava pjenjenje uzorka

• TALOŽENJE DNA i RNA (PRECIPITACIJA)

• TALOŽENJE DNA i RNA (PRECIPITACIJA) – DNA i RNA se taloži u mješavini vode i alkohola u prisutnosti soli – Konačne koncentracije soli: 0.8M LiCl, 0.3-0.5M NaCl, NaOAc, ili 2.5M NH4Ac – Alkohol (30%-50% konačna koncentracija izopropanola; 60%-80% konačna koncentracija etanola) – Taloženje se pospješuje kratkim držanjem pri –20°C ili –70°C, iza čega slijedi centrifugiranje – Uklanjanje istaloženih soli postiže se“pranjem” taloga s 70% alkoholom, ponovno se centrifugira, a talog se suši i otapa u pogodnom puferu

2) ..gomila komercijalno dostupnih kolona; temelje se na adsorpciji DNA/RNA na kolone

3)

3) METODE IZOLIRANJA u gradijentu CsCl • Gradijent CsCl ukupne DNA izolirane iz stanica kvasca. Mitohondrijska DNA je A/T bogata (80%) pa se smješta u područje manje gustoće nego kromosomalna DNA. Na fotografiji je DNA bojana s Hoechst 33258 (bisbenzimide), upravo nakon ultracentrifugiranja (Sorval Discovery 90SE; 20 hours at 55,000 rpms).

SPECIFIČNOSTI IZOLACIJE RNA • RNA izolacija je vrlo slična DNA izolaciji; ali za razliku od DNA fenol je uravnotežen vodom koja ima kiseli pH • RNA se, za razliku od DNA, osjetljiva na razgradnju • DNaze za svoju aktivnost trebaju metalne ione pa se mogu inaktivirati s EDTA • RNase ne trebaju metalne ione zbog reaktivne 2´ hydroxyl group RNA molekule 

RNaza A iz pankreasa = neprijatelj no. 1 • RNase A je endoribonukleaza sastavljena od jednog proteinskog lanca • Rezistentna je na prisutnost EDTA • Može preživjeti dugotrajno kuhanje i autoklaviranje • Aktivnost joj ovisi o histidinu u aktivnom mjestu i može se inaktivirati histidin-specifičnom alkilirajućem agensu: diethyl pyrocarbonate (DEPC) • Druge ribonukleaze (E. coli RNase I and RNase M) vrlo su slične RNase A

Zaštita od RNaza Egzogenih koje se mogu unijeti tijekom rada Good working practices Endogenih koje se oslobađaju iz stanica i tkiva tijekom ekstrakcije Uklanjaju se inhibitorima RNazne aktivnosti Držanjem na ledu tijekom izolacije se smanjuje njihova aktivnost

Zaštita od RNaza • • • • •

Uvijek koristiti rukavice, na koži se nalazi obilje ribonukleaza Otopine za RNA izolaciju se pripremaju u autoklaviranom staklenom suđu (gdje je moguće koristiti novo plastično posuđe) Spaliti spatule kod vaganja, kemikalije autoklavirati nakon pripreme. Koristiti za pripremu otopina steriliziranu vodu Otopine se mogu tretirati s 0.1% DEPC (dodati DEPC, ostaviti preko noći na sobnoj temperaturi, autoklavirati) PAZI!!! DEPC JE JAKO KARCINOGEN!!!

PROCJENA ČISTOĆE DNA I RNA spektrofotometrijski MJERENJE KONCENTRACIJE DNA I RNA A260 DNA A260/A280 A260 RNA A260/A280

1.0 ≈ 50 µg/ml 1.6 - 1.8 1.0 ≈ 40 µg/ml ~2.0

ELEKTROFOREZA • Electro = protok struje, phoresis, od Grčkog = nositi kroz • Gel je koloidna otopina, suspenzija sitnih čestica u mediju, ima konzistenciju želatine • Gel elektroforeza je postupak nabijenih molekula u gelu uz pomoć električne struje • Nabijene molekule mogu biti DNA, RNA, proteini...

ELEKTROFOREZA U AGAROZNOM GELU •

• •

•

•

Agaroza – polisaharid dobiven od morskih algi. Otapa se u puferu, zagrijava do vrenja, hladi pri čemu se stvara čvrsta mreža molekula Gel elektroforeza u agaroznom gelu je pogodna za razdvajanje molekula između 100 bp i 30000 bp Gel se treba djelomično ohladiti prije razlijevanja u kalup; tada se dodaje etidij bromid (za vizualizaciju pod UV svjetlom) i stavlja se “češalj” koji će napraviti u gelu rupe za nanošenje uzorka Pufer (TBE, TAE) osigurava ione koji omogućavaju vođenje struje – TAE, pH 8.0, ~50 mM - Tris, Acetate, EDTA – TBE, pH 8.0, ~50 mM - Tris, Borate, EDTA Kad se gel stisne uranja se u kadicu sa istim puferom (submarine gel)

ZAŠTO SE DNA i RNA razdvajaju u gelu? • DNA i RNA su negativno nabijene (DNA, RNA za negativno) • Kad se DNA ili RNA izlože utjecaju električnog polja one putuju prema pozitivnoj elektrodi • Manji fragmenti putuju brže od velikih (linearna DNA se razdvaja po molekularnoj težini) • Razdvajanje i po obliku (ne putuje samo po molekularnoj težini)

Elektroforeza u agaroznom gelu Pozitivna elektroda

češalj

pufer

Uzorci DNA u gelu

NANAŠANJE I PRAĆENJE ELEKTROFOREZE U GELU AGAROZE • Nanošenje uzoraka na gel olakšava miješanje s puferom za nanošenje uzorka u kojem se nalazi 30% glicerola (dodaje se u omjeru uzorak : pufer = 1:5) • Praćenje tijeka elektroforeze omogućuje vidljiva boja koja se dodaje u pufer za nanošenje uzorka • xylene cyanol (kreće se kao fragment od oko 5.0 kb fragments) • bromphenol blue (kreće se kao fragment od nekoliko stotina pb) • orange G (kreće se kao fragment od oko 50 pb)

Gel bojan Etidij bromidom pod UV svjetlom • EtBr se interkalira između baza • MUTAGEN, SVAKAKO RUKAVICE!!!! • Vidljiv jedino pod UV svjetlom • Nositi MASKU zbog UV svjetla!!

DNA na agaroznom gelu

REZOLUCIJA • % Agarose (w/v)

Size Range (kb prs) for Optimal Separation

• • • • • • • • •

2-30 0.7-20 0.5-10 0.2-3 0.1-2 0.07-1.5 0.04-0.9 0.03-0.6 0.01-0.4

0.5 0.75 1.0 1.5 2.0 3.0 (Nu-Sieve) 4.0 (N-S) 5.0 (N-S) 6.0 (N-S)

0.7%

2.5%

Isti uzorak na gelu različite gustoće

IZOLACIJA RNA • UKUPNA RNA – Najveći dio izolirane RNA otpada na ribosomalnu RNA: 28S i 18S. – mRNA čini najmanji dio ukupne RNA.

RNA na agaroznom gelu Nativna elektroforeza je dovoljna za procjenu kvalitete RNA Ocjena kvalitete RNA preparacije je najbolja na denaturirajućem agaroznom gelu u koji je dodan formaldehid jer većina RNA stvara unutarmolekularne sekundarne strukture što ih sprječava da u gelu putuju samo po veličini Kod dobre izolacije vrpce RNA moraju biti oštre. 28S ribosomalna RNA treba biti dvostrukog intenziteta od vrpce 18S.

LANČANA REAKCIJA POLIMERAZOM (PCR) • Lančana reakcija polimerazom (PCR) (od engl. polymerase chain reaction) je metoda umnažanja određenog odsječka DNA u uvjetima in vitro • Koristi se u molekularnoj biologiji/medicini, dijagnostici nasljednih i stečenih bolesti, dijagnostici patogena, u forenzici… • Izumitelju ove metode Dr. Kary Mullisu (rad objavljen 1985. godine) dodjeljena je Nobelova nagrada 1993. godine

DNA replikacija

PCR-riječima (1) • PCR je replikacija DNA u “ependorfici”, što omogućava umnažanje ciljnog slijeda više od milijardu puta u samo 2 sata • U stanici se replikacija odvija uz pomoć puno različitih proteina i enzima dok se kod PCR reakcije sve izvodi jednim jedinim enzimom DNA polimerazom • U DNA replikaciji se DNA enzimatski odmota, denaturira, RNA polimeraza sintetizira male komplementarne početnice, tu se veže DNA polimeraza koja onda replicira DNA • Tijekom PCR visoka temperatura se koristi za denaturaciju DNA, sintetske početnice koriste se umjesto malih RNA koje uokviruju regiju koja se želi umnožiti; početnice se vežu za komplementarne lance, jedna početnica na jedan, druga početnica na drugi lanac.

PCR-riječima (2) •

•

•

1)

U reakciju PCR se dodaje – DNA – DNA polimeraza – Početnice – 4 deoksinukleotida – Kofaktor MgCl2 2) PROGRAM PCR mašine – 1 do 10 minuta inicijalne denaturacije 94-96oC – 1 do nekoliko minuta pri 50-65oC tijekom kojih se početnice hibridiziraju na denaturirane lance – 1 do nekoliko minuta pri 72oC tijekom koje DNA polimeraza nastavlja lanac DNA, svaki ciklus ima duplo više molekula, nakon 30 ciklusa teoretski milijarda ...... INOVACIJE KOJE SU OMOGUĆILE PCR: – Temperaturno stabilna DNA polimeraza izolirana iz bakterije Thermus aquaticus. Ovaj enzim, nazvan Taq polimeraza, je aktivan usprkos ciklusima zagrijavanja i hlađenja. – PCR mašine (DNA thermal cyclers) koriste kompjutersku tehnologiju za finu regulaciju temperature u ciklusima.

PCR-slikom

Program PCR 1. Denaturacija DNA u osnovne lance 2. Hibridizacija početnica na lance DNA 3. Produžavanje lanca DNA polimerazom 4. Ponavljanje 30-35 puta

Program PCR 5’

3’

3’

5’

Ciljna DNA

A

početnice

Slobodni nukleotidi

B

Taq DNA polimeraza

2+ Mg2+ Mg2+ Mg Mg2+ Mg2+ Mg2+

Pufer koji sadrži magnezij

denaturacija 5’

3’

3’

5’

Target DNA

95oC

5’

3’

3’

5’

hibridizacija 5’

3’

3’

5’

Ciljna DNA A

početnice

B

~55oC

5’

3’ B

5’ 3’

5’

A

5’

Produljivanje lanca 5’

3’

3’

5’

ciljna DNA

72oC 5’

3’

5’ 3’

Taq polymerase

5’

5’

Odabir početnica • Početnice trebaju biti dovoljno specifične (komplemetarne) za određeni gen • IPAK one se mogu i znatno razlikovati od ciljne sekvence, a da se uz neke uvjete mogu umnožiti te i jako slične sekvence (“degenerirane početnice”) • Ključan kriterij za uspješnost reakcije PCR • Početnice možemo odabrati ručno (prema slijedu) ili uz pomoć specijaliziranih programa (npr. DNAStaR, mnogi su i dostupni na mreži) • Slijed i duljina početnica predstavljaju ključne parametre pri uspješnom odabiru početnica, za uobičajene svrhe početnice su 18-24 pb duljine

• Poželjno je da temperatura hibridizacije ili sparivanja (Ta annealing temperature) bude između 50-65oC. Temperatura koja se odabire za prvu reakciju PCR treba biti 5oC manje od temperature taljenja (Tm, od engl. melting temperature), a koja se izračunava po formuli. Tm= 2(A+T) + 4(G+C) • Odabrani par početnica treba imati što sličniju Tm • Početnice trebaju sadržavati 45-55% G i C nukleotida • Preporuka je da početnice počinju i završavaju s G ili C nukleotidom • Treba izbjeći ponavljanja purinskih ili pirimidinskih slijedova nukleotida • Treba izbjeći komplementarne sekvence dulje od 3 pb unutar samih početnica i između para početnica (time se izbjegava stvaranje sekundarnih struktura)

…druga strana PCR-a • U teoriji postoje pravila o reakciji PCR, ali u praksi ne postoji univerzalni protokol, pa svaku reakciju PCR treba optimizirati mjenjajući sve parametre pojedinačno – – – – – –

DNA kalup (potrebna je vrlo mala količina; nekad mogu smetati nečistoće, ali vrlo često zbog razrjeđenja to nije toliko bitno) Taq polimeraza (ni previše ni premalo) Početnice (temperatura hibridizacije) dNTP MgCl2 (par početnica je više ili manje osjetljiv na promjenu koncentracije) Dodaci reakciji DMSO, glicerol, betain, formamid, neionski detergenti, BSA… mogu poboljšati specifičnost PCR reakcije

Nakon svakog ciklusa broj kopija je dvostruko veći nego u prethodnom ciklusu 230=1,073,741,824 Ipak eksponencijalni porast broja kopija je ograničen

PCR mašina je sofisticirani termostat koji može brzo mijenjati temperaturu u željenom ritmu

PRIMJENA PCR • ODREĐIVANJE MUTACIJA u genskim bolestima (insercije, delecije, točkaste mutacije) npr. Duchenne mišićna distrofija (sa 9 parova početnica dobiva se 9 različitih PCR fragmenata u jednoj reakciji tzv. “multiplex PCR”, kod osoba sa delecijama 1 ili više PCR produkata će nedostajati) • ODREĐIVANJE PRISUTNOSTI NEŽELJENOG GENSKOG MATERIJALA (bakterijske i virusne infekcije) • IDENTIFIKACIJA OSOBE (često se koristi “multiplex PCR”) • FORENZIKA Može se umnožiti DNA i iz prilično razgrađenog materijala, i iz vrlo malo materijala

Real-Time PCR • Lančana reakcija polimerazom u stvarnom vremenu • Razvijena zbog nedostataka PCR (plato reakcije je već postignut u trenutku kada imamo dovoljno produkta za vizualizaciju) • Omogućuje kontinuirano praćenje reakcije PCR, a temelji se na oslobađanju fluorescentne boje tijekom PCR reakcije • JAKO SKUPO

RT-PCR Reverzna transkripcija je metoda kojom se molekula RNA prevodi u komplementarnu molekulu DNA (cDNA) djelovanjem enzima reverzna transkriptaza cDNA ili “complementary DNA” je kopija RNA, obično mRNA

cDNA

mRNA

Dvolančana

Jednolančana

Stabilna

Nestabilna

Jednostavna za manipulaciju

Komplicirana za manipulaciju

REVERZNA TRANSKRIPCIJA (RT)-PCR Prevođenje RNA u cDNA uz pomoć reverzne transkriptaze Oligo dT

5’

Slučajne početnice (pdN6)

5’

Gen-specifične početnice

5’

3’ AAAAAAA TTTTTTT

3’ NNNNNN

NNNNNN

AAAAAAA

3’ AGCGA

AAAAAAA

REVERZNA TRANSKRIPCIJA (RT)-PCR Reverzna transkriptaza AMV (avian myeloblastosis Virus) ili MMLV (Moloney Murine Leukemia Virus) Tipična RT reakcija 1 µg ukupne RNA 500 ng početnica (pdN6) 0.1 mM DTT 1mM dNTPs 1U RNase inhibitor H2O bez nukleaza

1µl 1µl 1µl 2µl 1µl 13µl

19µl – zagrij 80°C 4’, prebaci u led + 1µl 200U MMLV – superscript 25°C - 10’ 42°C – 50’ 95°C, 2’ 1-20µl u 50 µl PCR smjese

RT-PCR • semikvantitativni: -uspoređuje se relativna količina ciljne mRNA u dva sustava uz korištenje ubikvitarnog ("housekeeping") gena kao referentnog oslonca • najčešće korišteni referentni geni: gliceraldehid-3-fosfat-dehidrogenaza (GAPDH), β-aktin, ciklofilini, hipoksantin-fosforibozil-transferaza (HPRT), mikroglobulini, rRNA

• kvantitativni: -interni standard koji se umnaža u istoj epruveti s ciljnom cDNA, uz iste početnice, dajući produkte različite veličine (to je zapravo kompetitivni PCR) - korištenjem poznatih razrjeđenja standarda može se odrediti koncentracija ciljne mRNA

Upotreba RT-PCR • Određivanje razine ekspresije gena

• Izolacija gena kloniranjem gena....

nastavlja se

KLONIRANJE U PLAZMIDNI VEKTOR • Što je klon? – Klon je skupina identičnih molekula, stanica ili organizama.

• Što je kloniranje? – Kloniranje je postupak razvoja i odabira klona

• Kloniranje u plazmidni vektor je postupak ubacivanja komadića DNA u plazmidni vektor kako bi se njime moglo manipulirati

Što su plazmidi? • Plazmidi su cirkularne, dvolančane molekule DNA u bakterijama • Mogu se replicirati neovisno o stanici domaćinu. • Veličina plazmida se kreće od nekoliko kb do oko 100 kb. • Plazmidni vektori potječu od prirodnih plazmida koji prenose rezistenciju na antibiotike, osiguravaju toxine u patogenim bakterijama, zaštićuju bakterije od toksičnih metala

KLONIRANJE U PLAZMIDNI VEKTOR = KLONIRANJE GENA

…kada je počelo • Prvi eksperiment kloniranja izveden je 1973. godine u kojem je korišten prirodni plazmid iz Staphylococcus aureus • 1977 godine Bolivar and Rodriguez su konstruirali prvi upotrebljivi vector pBR322.

Plazmidni vektori

• 1982 nastala je nova generacija vektora za kloniranje (J. Messing) nazvana pUC serija. Razvijeni su od pBR322 i to tako da je zamjenjena TcR-gene regija sa genom za alpha-peptid ßgalactosidaze (lacZ') koji uključuje višestruko mjesto za kloniranje (MCS) i koji počinje 15 nukleotida od lacZ' gena. • Ostatak gena za β-galaktozidazu se osigurava u bakteriji domaćinu E.coli

Što plazmid čini plazmidom? • Ori-origin of replication, izvorište replikacije • MCS /multicloning site) višestruko mjesto za kloniranje (ovdje se lako ubacuju DNA fragmenti uz pomoć različitih restrikcijskih endonukleaza) • Gen za rezistenciju na antibiotik (ampicilin, kanamicin, tetraciklin, higromicin)

Vrste plazmidnih vektora PROKARIOTSKI

EUKARIOTSKI

KLONIRANJE U PLAZMID • 1. IZOLACIJA GENA • 2. CIJEPANJE PLAZMIDA ( i FRAGMENTA) RESTRIKCIJSKIM ENDONUKLEAZAMA • 3. IZOLACIJA DIJELOVA VEKTORA I INSERTA • 4. LIGACIJA • 5. TRANSFORMACIJA • 6. ODABIR KOLONIJA • 7. PROČIŠĆAVANJE

1. IZOLACIJA GENA • Fragment dobiven PCR-om • Fragment dobiven RT-PCR-om • Fragment iz nekog plazmida

2. CIJEPANJE PLAZMIDA ( i FRAGMENTA) RESTRIKCIJSKIM ENDONUKLEAZAMA • 1962. Arber and Dussoix su otkrili da E. coli može zaustaviti rast bakteriofaga λ degradacijom DNA faga • 1965. Arber je otkrio da E. coli metilira svoju DNA kako bi razlikovala svoju od tuđe DNA (1978. Nobelova nagrada) • 1970. Prva DNA specifična restrikcijska endonukleaza izolirana iz Haemophilus influenzae - HindII

• Endonukleaze izolirane iz bakterija • Prepoznaju specifične palindromske sekvence • “Molekularne škare” cijepaju jedinstvene DNA sekvence • Cijepaju asimetrično ili simetrično i stvaraju “ljepljive” ili “ravne” krajeve

3. IZOLACIJA ŽELJENIH DIJELOVA VEKTORA I PLAZMIDA • Nanošenje pocijepanih plazmida na gel uz standard • Izrezivanje iz gela dijelova koje želimo spojiti • Elektroelucija i pročišćavanje ILI upotreba kita za izolaciju iz gela • Mjerenje količine VEKTORA i INSERTA (omjer ovisi o tipu kloniranja)

4. LIGACIJA • Upotreba DNA ligaze • PREMA VRSTI KRAJEVA KOJE SPAJAMO RAZLIKUJEMO: – Kloniranje ljepljivih krajeva – Kloniranje tupih krajeva – AT kloniranje – Kloniranje hibridiziranih sintetskih oligonukleotida

– Kloniranje tupih krajeva

• Krajevi koji se spajaju nastali su djelovanjem restrikcijskih enzima koji daju ravne (tupe) krajeve ili se radi o insertu nastalom PCR-om i to DNA polimerazom koja ostavlja ravne krajeve (Vent, Pwo)

– Kloniranje ljepljivih krajeva

• Krajevi koji se spajaju nastali su djelovanjem istog restrikcijskog enzima ili djelovanjem dvaju različitih enzima ali koji daju ISTE jednolančane krajeve

– AT kloniranje

• Koristi karakteristiku obične TaqDNA polimeraze da na 5’ krajevima ostavlja A u insertu. Vektor se može obraditi istim enzimom ali uz dodatak dTTPa , time se dobiva vektor koji ima T na svojim krajevima

5. TRANSFORMACIJA •

TRANSFORMACIJA NAKON KEMIJSKE OBRADE STANICA – Postupak ubacivanje gole plazmidne DNA u stanicu. Ako ubačena DNA posjeduje izvorište replikacije koje prepoznaje domaćinova DNA polimeraza, bakterija će replicirati stranu DNA zajedno sa svojom. – Postupak kombinacije transformacije sa SELEKCIJOM ANTIBIOTIKOM omogućuje da nakon transformacije izrastu kolonije koje nose stranu DNA (plazmidna DNA sadrži gen za rezistenciju na antibiotik) – Bakterija koja je u stanju primiti u sebe stranu DNA naziva se KOMPETENTNA BAKTERIJA – Najčešći način obrade bakterija kako bi postale kompetentnima je obrada bakterija u logaritamskoj fazi s CaCl2. Bakterijska membrana je propusna za ione Cl, ali nije propusna za ione Ca. Kako ioni Cl prodiru u bakterije, molekule H2O ih slijede. Taj unos H20 dovodi do bubrenja bakterije što je neophodno potrebno za unos DNA. Točan molekularan mehanizam nije poznat. – U postupku transformacije nakon dodatka strane DNA slijedi temperaturni šok. Pri čemu se aktiviraju geni potrebni za preživljenje (heat shock genes) koji su uključeni u ulazak strane DNA u stanicu.

• • •

ELEKTROPORACIJA je metoda kojom se unosi DNA u stanicu Primjenjuje se visoka voltaža kako bi se napravile privremene rupe u bakterijskoj membrani kroz koje može ući DNA U periodu oporavka rupe se zatvaraju i unesena plazmidna DNA se može replicirati unutar bakterije

6. ODABIR KOLONIJA koje sadrže plazmid • • • •

Plavo bijela selekcija Izolacija plazmida i restrikcijska analiza PCR Southern blot hibridizacija na kolonijama

PLAVO BIJELA SELEKCIJA • Je metoda jednostavnog odabira bakterijskih kolonija koje u sebi sadrže rekombinantni plazmid sa željenim insertom • pBluescript u sebi ima gen dojavljivač β-galaktozidazu • Višestruko mjesto za kloniranje se nalazi usred gena za β-galaktozidazu • U “praznom” plazmidu dolazi do ekspresije βgalaktozidaze koja dodani bezbojni supstrat (x-gal), u prisustvu induktora IPTG, pretvara u PLAVO obojeni • Ako je strana DNA ubačena u plazmid poremeti se ORF (open reading frame) ili otvoreni okvir čitanja za β-galaktozidazu nema enzimske aktivnosti i bakterije nisu plave već BIJELE

SVE IZRASLE BAKTERIJSKE KOLONIJE SADRŽE PLAZMID SVE PLAVE KOLONIJE SADRŽE PLAZMID BEZ INSERTA SVE BIJELE KOLONIJE SADRŽE PLAZMID S INSERTOM

7. IZOLACIJA PLAZMIDA • = izolacija plazmidne DNA… • Bakterije se talože centrifugiranjem i resuspendiraju u puferu kojin sadrži glukozu i EDTA • LIZA BAKTERIJA SDS-NaOH (SDS je ionski detergent koji otapa fosfolipide, denaturira proteine, oslobađa se bakterijski sadržaj u otopinu; NaOH denaturira DNA) • Dodaje se K-acetat i octena kiselina (stvara se precipitat SDS/lipid/protein; neutralizira se NaOH dodana u prethodnom koraku-PLAZMIDNA DNA SE RENATURIRA) • Precipitat se uklanja centrifugiranjem, a plazmidna DNA ostaje u supernatantu • Izopropanol precipitira DNA; odvaja se centrifugiranjem • Pere se precipitat 70% alkoholom • Suši se talog plazmidne DNA • Resuspendira se u vodi ili u TE-puferu pH8

Kloniranje je metoda kojom se svašta može...

SOUTHERN BLOT -metodu je osmislio EDWIN SOUTHERN temelji se na formiranju DNA hibrida između dva komplementarna lanca DNA, koji dolaze iz različitih izvora -zbog toga DNA lanci trebaju biti JEDNOLANČANI (DNA treba biti denaturirana) ciljna (tražena) DNA u smjesi različitih fragmenata DNA

obilježena sonda DNA kojom tražimo ciljnu sekvencu

JEDNOLANČANA!

komplementarni lanci

  A G T C T T G C A A | T | C | A | G | A | A | C | G | T T |

JEDNOLANČANA!

obilježena sonda DNA ciljna (tražena) DNA

Na gel nanosimo materijal u kojem se traži neki slijed; npr tražimo određeni gen, staničnu DNA ćemo pocijepati raznim restrikcijskim enzimima

PROBU (cDNA fragment) obilježimo (radioaktivno ili kemiluminiscentno) INKUBIRAMO MEMBRANA s probom u pogodnom puferu

Način detekcije obilježene probe ovisi o obilježavanju (fotografski filmkemiluminiscencija)

Razdvojenu DNA prenosimo na najlonsku ili nitroceluloznu membranu PRIJENOS NA MEMBRANU SE RADI KAKO BI RAZDVOJENA DNA BILA NA MEDIJU S KOJIM SE MOŽE DALJE LAKŠE MANIPULIRATI

Ispiremo nevezanu probu

REZULTAT: Otkrili smo u Kojim se fragmentima nalazi Neki slijed

HIBRIDIZACIJSKA SONDA • Sonda je mali dio onoga što tražimo • Može se obilježiti – Haptenom, npr. digoxigenein-dUTP, biotindUTP; detekcija se vrši dalje obilježenim protutijelima – Fluorokromom, npr. fluorescein-dUTP; moguća je direktna detekcija

• Načini obilježavanja – Metodom nasumične klice (random primer labeling) – PCR

Fotografski film

kemiluminiscencija

mišje anti DIG protutijelo obilježeno enzimom

Otopljeni supstrat DIG obilježena hibridizirana sonda Membrana

Slika 0.7% agaroznog gela sa 14 uzoraka i markerom MW. Svaki uzorak je razgrađen istom restrikcijskom endonukleazom.

Fotografski film nakon Southern Blot hibridizacije pokazuje u kojem se soju nalazi slijed koji odgovara slijedu korištene obilježene probe.

NORTHERN BLOT • Isto što i Southern ali se na agarozni gel nanosi RNA (ime Northern je reakcija na “Southern” blot) • Proba je obilježena DNA ili RNA • Sve što vrijedi za Southern, ali je po analogiji rada s DNA potreban iznimni oprez rada zbog rada s RNA (RNase…) • Neizostavna metoda za dokazivanje jačine ekspresije (mRNA), ili određivanje veličine transkripta

SEKVENCIRANJE ili ODREĐIVANJE PRIMARNOG SLIJEDA NUKLEOTIDA • Nobelova nagrada za kemiju 1980. godine: Paul Berg (1/2), Walter Gilbert (1/4), Frederic Sanger (1/4)

Sangerova (dideoksi-) metoda • Temelji se na zaustavljanju enzimatske sinteze komplementarnog lanca DNA ugradnjom OBILJEŽENIH analoga nukleotida (dideosiribonukleozidtrifosfata; nedostaje 3’-OH skupina deoksiriboze) • Sinteza komplementarnog lanca DNA započinje oligonukleotidnom klicom koja je komplementarna slijedu DNA • Korištenjem smjese sva četiri dNTP i jednog ddNTP, sinteza novog lanca prekida se na svakom mjestu ugradnje ddNTP, dajući tako skup lanaca različitih dužina • Četiri odvojene reakcije, svaka s različitim dideoksinukleotidom, daju potpunu informaciju o slijedu nukleotida u analiziranoj molekuli DNA.

Sekvenciranje Sangerovom dideoksi metodom, upotrebom lančane reakcije polimerazom i kapilarne elektroforeze

PROTEINI

PROTEINI • Natrij dodecil sulfat-poliakrilamid gel elektroforeza (SDS-PAGE) i Western blot • Kultura stanica • Transfekcija u eukariotsku stanicu • Monoklonska protutijela

ELEKTROFOREZA • ELEKTROFOREZA je proces pokretanja nabijenih molekula u električnom polju. • Molekule se u električnom polju kreću u ovisnosti o naboju, obliku i veličini. • Najčešće korištene mediji za elektroforezu: poliakrilamid i agaroza

PAGE i SDS-PAGE • Poliakrilamidni gel (PAGE) se formira kada se mješavina akrilamida i umrežujućih (cross-linker) bisakrilamida polimerizira u duge lance kovalentnim vezama. • Veličina pora u poliakrilamidnim gelovima je određena % gela (što je veći postotak to su pore manje) • PAGE i SDS-PAGE se izvode na vertikalnom gelu (agarozni gel je bio horizontalni gel)

SDS-PAGE • PAGE je metoda u kojoj se proteini razdvajaju po molekularnoj težini i po naboju • SDS-PAGE = sodium dodecyl (lauryl) sulfate – polyacrilamide gel electrophoresis je metoda u kojoj se proteini razdvajaju po molekularnoj težini • SDS je detergent (nalazi se na listi sastojaka šampona, sapuna i pasta za zube). SDS razara vodikove veze, blokira hidrofobne interakcije i razmata protein, uništava tercijarnu i sekundarnu strukturu proteina. Time se izjednačavaju naboji na molekulama proteina (svi su negativno nabijeni). • Proteini se mogu u potpunosti razmotati kada se u pripremi uzorka koristi ditiothreitol ili 2-merkaptoetanol, koji cijepaju disulfidne veze između cisteina. • Za skoro sve proteine vrijedi pravilo da se SDS veže u količini 1.4 g SDS-a na gram proteina, osiguravajući tako ukupni negativni naboj svakog proteina

SDS-PAGE se koristi za – – – – –

Određivanje veličine proteina Identifikaciju proteina Provjeru čistoće proteinskog uzorka Identifikaciju disulfidnih veza Kvantifikaciju proteina

PUFERSKI SUSTAVI • KONTINUIRANI – Samo jedan gel za razdvajanje, uzorci se odmah nakon stavljanja na gel počinju razdvajati

• DISKONTINUIRANI – Uzorci prvo prolaze kroz gel velikih pora (stacking gel = gel za sabijanje) koji omogućava ukoncentriravanje uzorka, a zatim se razdvajaju u gelu manjih pora (separating = running = gel za razdvajanje)

PRIPREMA GELA Gel za sabijanje

Gel za razdvajanje

PRIPREMA GELA = POLIMERIZACIJA • Amonij persulfat je inicijator • N,N,N’,N’-tetramethylethylenediamine (TEMED) je katalizator • Polimerizacija može biti i fotokemijska (riboflavin i UV svjetlo dugih valnih duljina kao inicijatori, TEMED kao katalizator) recept za PRIPREMU GELA H2O akrilamid/bisakrilamid donji pufer TrisHCl pH 8.8 APS 10% SDS 10% TEMED

7.5% 16.1 ml 7.6 ml 6.0 ml 100 ml 300 ml 15 ml

10% 13.6 ml 10.1 ml 6.0 ml 100 ml 300 ml 15 ml

15% 8.6 ml 15.0 ml 6.0 ml 100 ml 300 ml 15 ml

SDS-PAGE

BOJANJE SDS-PAGE GELOVA • Coomassie blue bojanje – temelji se na nespecifičnom vezanju boje Coomasie blue na proteine – Razdvojeni proteini se istovremeno fiksiraju i bojaju, a zatim se odbojava backgroundproteini se pojavljuju kao plave vrpce (bands) na bezbojnoj podlozi

BOJANJE SDS-PAGE GELOVA • Bojanje srebrom – Temelji se na vezanju iona srebra na SH i COOH grupe razdvojenih proteina – Proteini se nakon elektroforeze fiksiraju, izlažu srebrnom nitratu i “razvijanjem” se stvara crni precipitat srebra

ODREĐIVANJE MOLEKULARNE TEŽINE PROTEINA IZ SDS-PAGE

WESTERN BLOT • Western blot je metoda detekcije jednog proteina, u mješavini puno različitih proteina, razdvojenih SDSPAGE-om • Nakon SDS-PAGE proteini se prenose na membranu na kojoj se izvodi imunodetekcija • Za imunodetekciju se koriste specifična protutijela na željeni protein (primarna protutijela), nakon čega se vezanje tih protutijela određuje protutijelima na primarna protutijela (sekundarna protutijela) koja su obilježena enzimom • Signal se dobiva kemijskom reakcijom (kolorimetrija ili kemiluminiscencija)

WESTERN BLOT • SDS-PAGE • Prijenos na membranu • Blokiranje veznih mjesta na membrani (nemasno mlijeko, BSA) • Inkubacija s primarnim protutijelom • Ispiranje • Inkubacija sekundarnim protutijelom obilježenim enzimom • Ispiranje • Kemijska reakcija (kemiluminiscencija, kromogena vizualizacija=kolorimetrija)

PRIJENOS PROTEINA NA MEMBRANU

TIPOVI PRIJENOSA 1)TANK TRANSFER 2)SEMI-DRY

BLOKIRANJE MEMBRANE • Blokiranje nespecifičnog vezivanja proteina na membrani • BSA, nemasno mlijeko u prahu, ovalbumin, želatina… • Puferi: PBS (phospahate-buffered saline) ili TBS (Tris-buffered saline) uz dodatak Tween-20 (neionski detergent za smanjenje intenziteta nespecifičnih interakcija)

1) KROMOGENA VIZUALIZACIJA • Primarno protutijelo • Sekundarno protutijelo je obilježeno alkalnom fosfatazom ili peroskidazom • Supstrat se bira prema enzimu BCIP/NBT (AP) ili DAB (PO)

Enzim AP ili PO

Otopljeni supstrat

Obojeni precipitat

Sekundarno protutijelo

Primarno protutijelo Protein Membrana

2) KEMILUMINISCENCIJA • Primarno protutijelo • Sekundarno protutijelo je obilježeno alkalnom fosfatazom ili peroskidazom • Supstrat se bira prema enzimu, produkt reakcije ima sposobnost kemiluminiscencije • Signal se bilježi na fotografskom filmu

Fotografski film kemiluminiscencija

Otopljeni supstrat

Enzim AP ili PO

Sekundarno protutijelo

Primarno protutijelo Protein Membrana

PREDNOSTI KEMILUMINISCENCIJE NAD KROMOGENOM VIZUALIZACIJOM • Kromogenom vizualizacijom – može se detektirati samo jedan protein, a membrana se ne može više koristiti za novu reakciju

• Kemiluminiscencija – Membrana se može koristiti više puta za određivanje različitih proteina (između stripping) – Mijenjanjem vremena ekspozicije filma membrani može se kontrolirati jačina signala i “uhvatiti” signal upravo u trenutku kada je još uvijek linearan odnos između količine proteina i signala na fotografskom filmu

KULTURA STANICA • Stanice se mogu uzgajati u petrijevki • S obzirom na podrijetlo: – Primarne kulture (direktno iz tkiva), imaju ograničen broj dioba – Trajne kulture, neograničeno se dijele

• S obzirom na način rasta – Adherentne – Stanice u suspenziji

• Npr fibroblasti rastu oko 50 generacija i zatim umiru, pokazuju kontaktnu inhibiciju, odnosno prestaju rasti kada postignu monosloj • NAČINI DOBIVANJA 1)EKSPLANTACIJA: dio tkiva se stavlja u petrijevu zdjelicu, stanice migriraju iz tkiva (Upotrebljava se za stanice koje su osjetljive na proteaze; nije pogodno za stanice koje se slabo adheriraju ili slabo migriraju) 2) ENZIMATSKO OSLOBAĐANJE se odabire za stanice koje su otporne na enzimsku razgradnju Enzimska razgradnja služi da se stanice razdvoje jedna od druge i da se odvoje od ekstracelularnog matriksa (Tripsin, Kolagenaza II, Elastaza, Hijaluronidaza, DNase, Pronaza, odnosno kombinacije enzima)

Primarne kulture

Trajne kulture • Neograničeno rastu, neke imaju smanjenu kontaktnu inhibiciju – A) tumorske stanice – B) stanice iz primarne kulture koje su prošle krizu (gensku promjenu u kulturi), relativno je jednostavno dobiti trajnu liniju iz stanica glodavaca – C) primarne kulture koje su transformirane u kulturi tumorskim virusom ili onkogenom

stanična kultura = uzgoj stanica in vitro • ZA Jednostavni sustav za proučavanje molekularnih mehanizama

• PROTIV Stanice u kulturi ne reagiraju potpuno jednako kako bi reagirale u tijelu Promjene u organizmu se ne mogu objasniti promjenama u stanicama Svako otkriće dobiveno na nivou stanice mora se potvrditi na organizmu

UZGAJANJE STANICA • Stanice se uzgajaju in vitro – u plastičnim posudama (označene tissue culture) različitog oblika (petrijeve zdjelice, T-bočice, roler boce…..) – U vlažnom inkubatoru pri pogodnoj temperaturi uz kontrolirani dotok ugljičnog dioksida – U potpuno sterilnim uvjetima (upotreba sterilnog kabineta s protokom sterilnog zraka, upotreba svog sterilnog suđa) – U posebnom mediju za uzgoj stanica

Najčešće korišteni mediji • Eagle’s Basal Medium • Eagle’s Minimal Essential Medium (MEM) • Dulbecco’s modification of MEM (DMEM) • ULOGA medija Osiguravanje hranjivih tvari aminokiselina, masnih kiselina, elemenata u tragovima, soli, vitamina, kofaktora Osiguravanje odgovarajućeg kemijskog okoliša pH i osmolalnost (ioni i bikarbonati) Izvor energije

TRANSFEKCIJA U KULTURU STANICA • Transfekcija je postupak kojim se može unjeti strana DNA (obično plazmidna DNA) u eukariotsku stanicu • Gen koji se u plazmidnoj DNA nalazi se transkribira, translatira i eksprimira

METODE TRANSFEKCIJE Često se ove metode nazivaju TROJANSKI KONJ Jer se molekule nosači vezani za DNA vežu na staničnu membranu I unose u stanicu.

• • • • • •

Kalcij fosfat DEAE-dextran Transfekcija posredovana liposomoma Elektroporacija Genski pištolj (Gene gun) Mikroinjekcija

Često ih nazivaju metodama GRUBE SILE

TIPOVI TRANSFEKCIJE • PROLAZNA TRANSFEKCIJA – –

Transfekcija pri kojoj se plazmid ne integrira u domaćinov kromosom. Prema tome je i ekspresija gena koji se u plazmidu nalaze prolazna i istražuje se obično 24-72 sata nakon transfekcije. Ova metoda se obično koristi uz neki gen dojavljivač (luciferaza, beta galaktozidaza, zeleni fluorescentni protein gfp) čija se ekspresija određuje. Prema tome ova metoda je česta za istraživanje promotora, ali se može koristiti i za inaktivaciju nekog gena unošenjem neaktivne forme istog (kompeticija neaktivne forme proteina za supstrat može se privremeno inaktivirati funkcija nekog staničnog proteina)

• STABILNA TRANSFEKCIJA –

–

Stabilna transfekcija je metoda u kojoj se nakon transfekcije izoliraju stanice koje su integrirale plazmid u kromosom stanice. Odabir ovih stanica omogućen je genom za rezistenciju stanica na neku kemikaliju koji se nalazi u plazmidu zajedno sa genom koji želimo u tim stanicama eksprimirati. Ovako izolirane stanične linije (potrebna je selekcija individualnih stanicaklon stanica) mogu poslužiti za istraživanje funkcije nekog proteina, a mogu služiti i za izoliranje veće količine proteina iz stanica.

Vektor za transfekciju: Za ekspresiju u eukariotskoj stanici

Ovdje ubaci gen!

V CM oter om Pr

GFP

Poliadenilacijsko mjesto

40 SV oter om

Pr

Neom y resist cin ance

cillin Ampi nce ta resis

Za amplifikaciju plazmida u bakterijama

pCMV/GFP

pUC

Gen za rezistenciju kako bi se mogla izolirati stabilna stanična linija

Poliadenilacijsko mjesto

Bakterijsko izvorište replikacije

TRANSFEKCIJA LIPOSOMIMA

Genski pištolj

Bojanje na β-galaktozidazu nakon transfekcije plazmidom koji sadrži β-galaktozidazu

Detekcija fluorescencije nakon transfekcije plazmidom koji sadrži zeleni fluorescentni protein (gfp) ili crveni fluorescentni protein (rfp)

MDCK Cells Madin-Darby Canine Kidney Polarized Epithelial Cells

TRANSFEKCIJA JE IZVRSNA METODA ZA PRAĆENJE LOKALIZACIJE PROTEINA U STANICI

DNA (Hoechst) Golgi (ceramide) Lysosomes (LysoTracker)

Molecular Probes, Inc.

MONOKLONSKA PROTUTIJELA • Humoralni imunitet nas štiti od patogena uz pomoć protutijela • Nakon što se organizam susretne sa stranim proteinom razvija se čitav niz različitih protutijela na taj protein; oni se vežu na različite epitope (antigenske determinante na stranom proteinu)

TEHNOLOGIJA PROIZVODNJE MONOKLONSKIH PROTUTIJELA

George Kohler i Cesar Milstein 1984. dobili Nobelovu nagradu za medicinu, za otkriće MoAb Treći nagrađeni Niels Jerne.

Protutijela POLIKLONSKA

MONOKLONSKA

Dobivena od više različitih B linija limfocita

Dobivena od jednog klona B limfocita

Razlika od šarže do šarže Ne baš tako dobor sredstvo u dijagnostici

Reproducibilni, gotovo neiscrpni izvorprotutijela s točno određenom specifičnosti Izvrsno za dijagnostiku

UPOTREBA MONOKLONSKIH PROTUTIJELA • Nezamjenjivo u bazičnim istraživanjima (Western, imunocitokemija, pročišćavanje proteina...) • Nezamjenjivo u dijagnostici • Upotreba u terapiji – Odbacivanje transplantataMuronomab-CD3 – Kardiovaskularne bolesti Abciximab – Tumori Rituximab – Infektivne bolesti Palivizumab – Inflamatorne bolesti Infliximab