Dna Extraction

DNA Extraction Γαβρίλης Ηλίας – Χημικός M.Sc. Διδακτική βιολογικών μαθημάτων. M.Sc. Καθηγητών Φυσικών Επιστημών. Συνεργάτης του ΕΚΦΕ Νικαίας

Απαιτούμενα όργανα και αντιδραστήρια. 



 

ΟΡΓΑΝΑ 1 Μικρό ποτήρι ζέσεως των 50 ml. Ηλεκτρική οδοντόβουρτσα. Υδατόλουτρο 50 0C. 1 μεγάλος δοκιμαστικός σωλήνας

ΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΙΑ  Εμφιαλωμένο νερό PH=7,6).  Απορρυπαντικό για το πλύσιμο των πιάτων (συμπυκνωμένο).  Πρωτεάση από τα χαπάκια για τον εβδομαδιαίο καθαρισμό των φακών επαφής (Περιέχουν σαμντιλυσίνη).  Ταινίες PHμερικές.  Μαγειρικό αλάτι (NaCl).  Κρύα Αιθανόλη (Έχει τοποθετηθεί στην κατάψυξη για 20 min).

Μεταφέρουμε στο ποτηράκι 10-20 ml εμφιαλωμένο νερό. 

Χρησιμοποιούμε την ηλεκτρική οδοντόβουρτσα για να αποσπάσουμε επιθηλιακά κύτταρα από το εσωτερικό του μάγουλου, τη γλώσσα και τον ουρανίσκο.

Τρόπος παραλαβής των κυττάρων. 



Τρίβουμε με την οδοντόβουρτσα το εσωτερικό του μάγουλου και τα άλλα σημεία. Σταματάμε τον κινητήρα και τον βάζουμε να «στροφάρει» μέσα στο νερό.

Τρόπος παραλαβής των κυττάρων. 

Η διαδικασία αυτή επαναλαμβάνεται επανειλημένα (1520 φορές), μέχρι το νερό να θολώσει αρκετά.

Τρόπος παραλαβής των κυττάρων. 

Αυτό γίνεται για να συλλεγούν όσο το δυνατόν περισσότερα κύτταρα.

Προσθήκη απορρυπαντικού. 



Στο θολό αιώρημα των κυττάρων προσθέτουμε 5-6 σταγόνες συμπυκνωμένου απορρυπαντικού. Αναδεύουμε κατόπιν για να ομογενοποιηθεί το αιώρημα.

Ο ρόλος του απορρυπαντικού 

Το απορρυπαντικό αποδιατάσσει τις κυτταρικές και τις πυρηνικές μεμβράνες, επιτρέποντας στο DNA να ελευθερωθεί στο διάλυμα.

Έλεγχος PH μετά την προσθήκη του απορρυπαντικού. 







Το εμφιαλωμένο νερό έχει PH=7,6. Μετά την προσθήκη του απορρυπαντικού το ΡΗ θα ανέβει. Εμείς θέλουμε να πετύχουμε ένα ΡΗ γύρω στο 8. Αυτό είναι και το ρυθμιστικό διάλυμα λύσης των κυττάρων που χρησιμοποιούμε.

Έλεγχος για τη ρύθμιση του ΡΗ 

Ελέγχουμε αν το ΡΗ του αιωρήματος λύσης των κυττάρων έχει την επιθυμητή τιμή ΡΗ.

Προσθήκη πρωτεάσης 





Χρησιμοποιούμε τις ταμπλέτες για τον πρωτεϊνικό καθαρισμό των φακών επαφής. Οι ταμπλέτες περιέχουν το πρωτεολυτικό ένζυμο σαμντιλυσίνη. Η σαμντιλυσίνη δεν κάνει διάκριση πλευρικών ομάδων στα σημεία κοπής.

Αναδεύουμε αργά το διάλυμα για 15 min Στο διάστημα αυτό επιδιώκουμε:  Τη λύση των κυτταρικών μεμβρανών για απελευθέρωση του DNA.  Την υδρόλυση των πρωτεϊνών (ιστόνες κλπ) που πακετάρουν το DNA.  Την αδρανοποίηση νουκλεασών που ελευθερώνονται με τη λύση των κυττάρων.

Τοποθετούμε το ποτηράκι στο υδατόλουτρο 50 0C για 15 min. 

Η τοποθέτηση στο υδατόλουτρο γίνεται για να υποβοηθηθεί και να επιταχυνθεί η διαδικασία λύσης και απελευθέρωσης του DNA.

Αναδεύουμε αργά με τη γυάλινη ράβδο όσο το ποτηράκι βρίσκεται στο υδατόλουτρο

Προς το τέλος της διαδικασίας προσθέτουμε το NaCl. 

Το διάλυμα του NaCl πρέπει να είναι αρκετά πυκνό

Γιατί προστίθεται 5M NaCl; (Πρακτικά εμείς προσθέτουμε 5-6 μικρές «σπαθίδες»με το κουταλάκι των αντιδραστηρίων 

Τα ιόντα Na+ του NaCl συνδέονται με τις φωσφορικές ομάδες των μορίων του DNA, εξουδετερώνοντας το ηλεκτρικό φορτίο των μορίων του DNA.



Η προσθήκη του NaCl επιτρέπει στα μόρια του DNA να πλησιάσουν αντί να απομακρύνονται, διευκολύνοντας με αυτό τον τρόπο την καταβύθιση του DNA στο διάλυμα μετά την προσθήκη της αλκοόλης.

Ψύχουμε το διάλυμα βυθίζοντας σε νερό ώστε να επανέλθει σε θερμοκρασία περιβάλλοντος 

Στη διάρκεια αυτή και μέχρι να ψυχθεί το διάλυμα αναδεύουμε διαρκώς για 10 min.

Μεταφέρουμε το διάλυμα στον μεγάλο δοκιμαστικό σωλήνα.

Προσθέτουμε διπλάσια ποσότητα κρύας αιθανόλης 

Η προσθήκη της αιθανόλης γίνεται από τα τοιχώματα του δοκιμαστικού σωλήνα, υπό κλιση ώστε να μη διαταραχτεί η πυκνότερη κάτω στοιβάδα.

Ο ρόλος της αιθανόλης. 





Το DNA δεν μπορεί να διαλυθεί σε αλκοόλη. Όταν η αλκοόλη είναι κρύα έχουμε ακόμη μικρότερη διαλυτότητα. Η προσθήκη κρύας αλκοόλης δημιουργεί συσσωματώματα DNA με αποτέλεσμα να καταβυθίζονται στο διάλυμα

Βυθίζουμε τη ράβδο και αναδεύουμε ελαφρά στη μεσεπιφάνεια των 2 στοιβάδων χωρίς να τις διαταράξουμε

Μετά από 15-20 min εμφανίζεται ένα πρώτο «θόλωμα» στο κάτω μεσαίο τμήμα της αλκοολικής στοιβάδας. 

Η διαδικασία εμφάνισης του θολώματος επιταχύνεται αν γέρνουμε προς τα πλάγια και επαναφέρουμε τον σωλήνα, ώστε οι στοιβάδες να κάνουν επαφή αλλά να μην διαταράσσονται.

Μετά από μισή ώρα εμφανίζονται στη θολή στοιβάδα οι πρώτες λευκές ίνες.

Όσο περνά η ώρα οι ίνες γίνονται πιο ευδιάκριτες.

Φωτογραφίες των ινών με διάφορους φωτισμούς.

Κοντινή φωτογραφία 

Η αλκοολική στοιβάδα τραβηγμένη από κοντά.

Στο φως του εργαστηρίου.

…και στο σκοτάδι με φακό.

Οι ίνες αιωρούνται όταν τις τινάζουμε με ένα καλαμάκι. 

Μεγέθυνση των αιωρούμενων ινών.

ΓΑΒΡΙΛΗΣ ΗΛΙΑΣ ΤΕΛΟΣ