Cuantificacion_de_la_actividad_de_amila.docx

“CUANTIFICACION DE LA ACTIVIDAD DE AMILASAS, EVALUACION DEL EFECTO DE LA CONCENTRACION DE ENZIMAS” Hernández Soza Rocío del Carmen; Tapia Poveda María José. Universidad Técnica de Ambato. Facultad de Ciencia e Ingeniería en Alimentos, Modulo de Ingeniería de las Enzimas Resumen Las enzimas llevan a cabo un papel primordial dentro del metabolismo celular, la velocidad con la que se dan las reacciones catalizadas por las ellas puede variar con respecto a diferentes factores entre ellos la concentración de enzima. Para poder comprobar el planteamiento anterior en este ensayo se ha trabajado con soluciones de enzima -amilasa diluida a concentraciones de 1/50, 1/100 y 1/200. Para cada dilución de enzima se numero 6 tubos microbiológicos colocando 0,25 ml de solución de enzima y a intervalos de 30 segundo 0,25 ml de solución de sustrato de almidón al 1%, dejando que se lleve a cabo la reacción por unos minutos y deteniéndola con 0,5 ml de solución DNS. Las velocidades de reacción de la enzima obtenidas para la dilución 1/50 fue de 0,733 (mgMal/ml*min), para dilución 1/100 fue de 0,489 (mgMal/ml*min) y para la dilución 1/200 de 0,193 (mgMal/ml*min), y con Actividad Enzimática promedio de 2225,883 U/g. Palabras clave: Actividad enzimática, maltosa, velocidad de reacción, -amilasa. Abstract Enzymes perform a key role in cellular metabolism, the rate at which reactions catalyzed by the enzymes may vary on several factors including the concentration thereof are given. To check the above approach in this paper we have worked with dilute solutions of -amylase enzyme at concentrations of 1/50, 1/100 and 1/200. For each enzyme dilution tubes 6 microbiological number placing 0,25 ml of enzyme solution at

intervals of 30 seconds 0.25ml starch substrate solution 1%, allowing it to carry out the reaction for a few minutes and stopping with 0,5 ml of DNS solution. The reaction rates of the enzyme obtained for 1/50 dilution was 0.733 (mgMal/ml* min) to 1/100 dilution was 0,489 (mgMal/ml*min) and for dilution 1/200 of 0,193 (mgMal/ml* min), and average enzyme activity 2500.987 U/g. Keywords: Enzyme activity, maltose, reaction rate, - amylase.

I.

Sabiendo que las enzimas son aceleradoras de reacciones y son dependientes de factores como pH, temperatura, fuerza iónica, concentración de sustrato, presencia de inhibidores, etc., se puede estimar la capacidad catalítica de la enzima, basada en la velocidad de reacción de la enzima sometida a cualquiera de estos factores (González, 2004). Dado esta aclaración se ha planteado como

INTRODUCCIÓN

Todas las reacciones químicas que configuran el metabolismo celular son catalizadas por enzimas. Estos biocatalizadores son específicos y activos en condiciones moderadas para cada enzima, lo que les confiere un gran potencial de uso como catalizadores de procesos. Son de naturaleza proteica y su capacidad catalítica reside en el sitio activo (González, 2004). Las amilasas constituyen una clase de enzimas industriales correspondiente al 25% de las enzimas del mercado. Estas enzimas hidrolizan moléculas de almidón, para obtener diversos productos como la dextrina, y progresivamente polímeros más pequeños compuestos por unidades de glucosa (Rubiano, 2006). Entre las amilasas conocidas se encuentra la beta-amilasa (E. C. 3. 2.1.2), presente en plantas y bacterias. Su función es actuar en la reacción de hidrólisis de los enlaces alfa-1,4-glucosidicos del almidón con inversión en la configuración del carbono 1 pasándolo de la configuración alfa a la beta; así como de remover las unidades de maltosa continuas presentes en los terminales noreductores de la cadena polisacárida (Durango, et.al, 2008).

Reactivos -

Ácido acético glacial Acetato de sodio Almidón soluble Ácido 3, 5 dinitrosalicílico Tartrato de sodio y potasio Hidróxido de sodio Maltosa β-amilasa de soya (sólida) Agua destilada

Materiales -

Medidor de pH o papel para medir pH Pipetas serológicas de 1, 5 y 10 ml Pipeta automática de 1 ml Gradillas Tubos de ensayo resistentes al calor Estufa a 60°C Desecador Balanza analítica Espectrofotómetro de visible

objetivo de la práctica, la cuantificación de la actividad enzimática de la -amilasa y el efecto de la concentración de enzima. II.

MATERIALES METODOS a.) Materiales b.) Método Método (Bernfeld, 1959)

Y

Este método se basa en la cuantificación de los oligosacáridos reductores liberados a partir de almidón los cuales se miden mediante la reducción del ácido 3,5dinitrosalicílico. Unidad de actividad Una unidad libera una micromol de grupos reductores calculados como maltosa por minuto a partir del almidón, a 25°C y pH 4,5 bajo las condiciones especificadas. Tampón acetato de sodio 0,02M de pH 4,5 (100 ml). Se preparó 50 ml de las soluciones de acetato de sodio y de ácido acético. Se mezcló las soluciones anteriores hasta obtener el pH deseado. Solución de ácido dinitrosalicílico (50 ml)

3,5-

Se pesó 0,5 g del ácido 3,5dinitrosalicílico y se disolvió en 20 ml de agua destilada (con agitación magnética). Se añadió 10 ml de hidróxido de sodio 2 M, se mezcló bien. Se agregó lentamente 15 g de tartrato de sodio y potasio y se aforo a 50 ml con agua destilada. Se mantuvo el reactivo protegido del dióxido de carbono en un frasco opaco bien cerrado. Solución de almidón al 1% (25 ml)

Se preparó este sustrato suspendiendo 0,25 g de almidón soluble en 25 ml de la solución tampón. Se calentó hasta ebullición para disolver el almidón. Se enfrío y llevo a volumen con agua destilada. Para el ensayo se incubo el almidón a 25°C al menos por 5 minutos (el tiempo dependerá del volumen de sustrato que se termostatice). Solución madre de maltosa Se calentó la maltosa por 4 h a 60°C en una caja petri. A continuación se tapó la caja y se enfrío en un desecador. Se pesó la cantidad necesaria para obtener una solución que contenga 2 mg/ml. Enzima Se preparó 10 ml de una suspensión al 10% de β-amilasa de soya en tampón de actividad. Se mantuvo la suspensión en agitación suave durante 1 h para extraer la enzima. A continuación se centrifugo la suspensión a la máxima velocidad disponible en la centrífuga (5950 rpm) por 10 min y se retiró cuidadosamente el sobrenadante. Se mantuvo en refrigeración la solución de enzima que se utilizó en la práctica y el resto se congelo. Se realizó varias diluciones de la βamilasa: 1/50, 1/100 y 1/200 con el tampón de actividad. Curva estándar de maltosa

Se ajustó el espectrofotómetro a 540 nm. Con la solución madre de maltosa se preparó la curva estándar de la siguiente manera: Se numero 6 tubos lavados y secos. Se colocó en cada uno la solución madre de maltosa con cantidades de (0.0, 0.10, 0.20, 0.30, 0.40. 0.50) respectivamente, se registró los pesos de cada alícuota. Se añadió agua destilada para completar 0,5 ml. Se registró el peso de la mezcla estándaragua. Se calculó con estos datos la concentración de maltosa de cada estándar. Se añadió a cada tubo 0,5 ml de solución de DNS y se incubo en un baño de agua hirviente por 5 min exactos, se enfrió a temperatura ambiente (20C). Se añadió 5 ml de agua destilada y se mezcló bien. Se leyó la absorbancia frente a un blanco preparado con 0,5 ml de agua destilada. Se elaboró una curva graficando Absorbancia vs concentración (mg/ml) de maltosa. Determinación de la actividad

0.5 ml de solución de DNS para detener la reacción. Se incubo los tubos en un baño de agua hirviente por 5 min EXACTOS, enfriarlos, se añadió 5 ml de agua destilada, se mezcló bien y se leyó la absorbancia a 540 nm vs el blanco preparado de idéntica manera pero invirtiendo el orden de mezcla de los reactivos, esto es 1° Enzima, luego DNS y finalmente sustrato. Se determinó la cantidad de maltosa liberada a partir de la curva estándar.

III.

RESULTADOS

Tabla 1: Datos de la solución estándar de Maltosa

Se pipeteo 0.25 ml de cada dilución Peso total de Maltosa seca a 0,9952 utilizar (g) de enzima en una serie de 6 tubos Peso Maltosa (g) 0,0505 numerados. Se incubo los tubos así Peso maltosa +agua (g) 24,2146 como el sustrato a 25C hasta llegar Vol. (ml) 0,242146 a la temperatura de ensayo. A FUENTE: Laboratorio de Ingeniería de las Enzimas de la FCIAL- 2014 intervalos de 30 s, se añadió 0.25 ml ELABORADO POR: Hernández, Tapia de sustrato y a los tiempos previstos (0.5, 1, 2, 3, 6 y 12 min para la dilución 1/50 y a los 1, 2, 4, 8 y 12 min para la Concentración del estándar de dilución 1/100; y a los 2, 4, 8, 12 y 16 maltosa min para la dilución 1/200) se agregó

[ MALTOSA ] =

Peso maltosa(g)∗1000 Vol(ml)

[ MALTOSA ] =

0,0505(g)∗1000 24,2146(ml)

[ MALTOSA ] =2,085

1 ( 0,4337 )∗[Mal]−( 0,0213 0,4337 )

|¿|

[Mal ]=2,305∗|+0,0491|

Determinación de la Concentración de

g ml

Maltosa para las diferentes diluciones [Mal ]=2,305∗|+0,0491|

Tabla 2: Datos para la obtención de la curva estándar de Maltosa Peso (g)

Vol Peso agua T. Abs. (ml) (g)

[ Maltosa ] =

[Mal ]=0,0491

( Peso ( g )∗[ MALTOSA ] ) Peso3:TValores ( g) Tabla para la el cálculo de actividad de la -amilasa, dilución 1/50

(mg/ml)

Blanco

0,00

0,00

0,50

0,58

0,000

0,0000

Std. 1

0,10

0,184

0,40

0,66

0,262

0,5810

Std. 2

0,20

0,2845

0,30

0,66

0,426

0,8941

Std. 3

0,30

0,3847

0,20

0,67

0,573

1,2014

Std. 4

0,40

0,4866

0,10

0,67

0,703

1,5146

Std. 5

0,50 0,583 0,00 0,58 0,886 2,0855 FUENTE: Laboratorio de Ingeniería de las Enzimas de la FCIAL- 2014 ELABORADO POR: Hernández, Tapia

N° tubo

Abs. (540nm)

GRAFICO 1: Curva estandar de Maltosa 1.000 0.800 f(x) = 0.43x + 0.02 0.600 R² = 0.99 0.400 CURVA ESTANDAR DE 0.200 MALTOSA 0.000 0.0000 0.5000 1.0000 1.5000 2.0000 2.5000 [Maltosa] (mg/ml) FUENTE: Laboratorio de Ingeniería de las Enzimas de la FCIAL- 2014 ELABORADO POR: Hernández, Tapia

Ecuación obtenida a partir de la curva estándar de Maltosa:

y=0,4337 x−0,0213 Ec. 1

1 2 3 4 5 6 7

Tiemp o Rx (min) 0,0 0,5 1,0 2,0 3,0 6,0 12,0

Absorbanci a

[Mal ]=2,305∗|+0,0491| (mg/ml)

0,000 0,249 0,318 0,496 0,651 0,687 0,865

0,0491 0,623 0,782 1,193 1,550 1,633 2,044

FUENTE: Laboratorio de Ingeniería de las Enzimas de la FCIAL- 2014 ELABORADO POR: Hernández, Tapia

GRAFICO 2: Curva de Dilución 1/50 1.000

[Maltosa] (mg/ml)

Tubo

Vol Malt. (ml)

[Mal ]=2,305∗(0)+0,0491

0.800 0.600

f(x) = 0.73x + 0.12 R² = 0.9

0.400 0.200 0.000

0.0

Linear () 0.2

0.4

0.6

0.8

Tiempo de reación (min) FUENTE: Laboratorio de Ingeniería de las Enzimas de la FCIAL- 2014 ELABORADO POR: Hernández, Tapia

1.0

1.2

Tabla 4: Valores para la el cálculo de actividad de la -amilasa, dilución 1/100 Tiemp o Rx (min)

Absorbanci a

0,0 1,0 2,0 4,0 8,0 12,0

0,000 0,209 0,424 0,548 0,717 0,702

(mg/ml)

GRAFICO 4: Curva de Dilución 1/200 2.000 [Maltosa] (mg/ml)

0,0491 0,531 1,027 1,313 1,702 1,668

[Maltosa] (mg/ml)

1.0

Linear () 1.5 2.0

FUENTE: Laboratorio de Ingeniería de las Enzimas de la FCIAL- 2014 ELABORADO POR: Hernández, Tapia

Tabla 5: Valores para la el cálculo de actividad de la -amilasa, dilución 1/200 Tiempo Rx (min)

Absorbanci a

1 2 3 4

0,0 2,0 4,0 8,0

0,000 0,216 0,409 0,671

Li nea r ()

0.500

0.000 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0

GRAFICA 5: Curvas de las Diluciones 1/50, 1/100 y 1/200

Tiempo de reación (min)

N° tubo

1.000

f(x) = 0.19x + 0.13 R² = 0.98

FUENTE: Laboratorio de Ingeniería de las Enzimas de la FCIAL- 2014 ELABORADO POR: Hernández, Tapia

f(x) = 0.49x + 0.05 R² = 1

0.5

1.500

Tiempo de reación (min)

GRAFICO 3: Curva de Dilución 1/100

0.0

1,799 1,760

[Mal ]=2,305∗|+0,0491|

FUENTE: Laboratorio de Ingeniería de las Enzimas de la FCIAL- 2014 ELABORADO POR: Hernández, Tapia

1.200 1.000 0.800 0.600 0.400 0.200 0.000

0,759 0,742

FUENTE: Laboratorio de Ingeniería de las Enzimas de la FCIAL- 2014 ELABORADO POR: Hernández, Tapia

2.5

[Maltosa] (mg/ml)

N° tub o 1 2 3 4 5 6

12,0 16,0

5 6

2.500 2.000 1.500 1.000 0.500 0.000 0.0

FUENTE: Laboratorio de Ingeniería de las Enzimas de la FCIAL-2014 ELABORADO POR: Hernández, Tapia

Estimación de la velocidad formación de maltosa Dilución 1/50

[Mal ]=2,305∗|+0,0491| v enz =0,7332 (mg/ml) 0,0491 0,547 0,992 1,596

2.0

Dilución 1/100 Polynomial (Dilución 1/100) Dilución 1/200 Polynomial (Dilución 1/200) 4.0 6.0 8.0 10.0 12.0 14.0 Dilución 1/50 Tiempo (min)

mgMal ml∗min

Dilución 1/100 v enz =0,4888

mgMal ml∗min

de

Dilución 1/200 v enz =0,1911

Dilución 1/100

mgMal ml∗min

( )

V(mgMal/ml*min)

Actividad f(x) = 0.24x - 0.26 R² = 0.98

1

mgMal ( ml∗min )∗10 ∗0,5 ml ∗100 3

U Actividad = g 342mg∗0,09952 g∗0,2421 ml

GRAFICO 6: Velocidades de la enzima para las diluciones 1/50, 1/100 y 1/200 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 0.5

0,488

1.5

2

Dilución 1/200

Velocidad (mg Mal/ml*mi n) 2.5 3 3.5

0,191

FUENTE: Laboratorio de Ingeniería de las Enzimas de la FCIAL- 2014 ELABORADO POR: Hernández, Tapia

3

( Ug )= 342mg∗0,09952 g∗0,2421 ml

Actividad

( Ug )=2317,939 Ug

Tabla 6: Resumen de los valores de concentración de glucosa, velocidades de reacción y actividad enzimática obtenidos.

Calculo de la actividad enzimática de la -amilasa

0,9952 g P enzima= 10 ml

mgMal ( ml∗min )∗10 ∗0,5 ml ∗200

Actividad

Dilución de la enzima

Peso de enzima por ml de volumen de tampón de actividad

( Ug )=2961,137 Ug

Concentración del estándar de Maltosa

[ MALTOSA ] =2,085

g ml

P enzima=0,09952 g/ml Dilución 1/50

Actividad enzimática de la β-amilasa

U Actividad = g

( )

Velocidad Mal 3 ∗10 ∗V Treacción es de ml∗min reacción ∗FD PM Mal∗P Enz∗V Enz(sol. madre)Actividad

(

v enz mg

)

enzimática

Dilución 1/50

0,733

3

U = g 342mg∗0,09952 g∗0,2421 ml

Actividad

( )

Actividad

( Ug )=2223,887 Ug

Dilución 1/200

mgMal mgMal mgMal 0,488 0,191 ml∗min ml∗min ml∗min U U U 2223,887 2961,137 2317,939 g g g 0,733

Promedio de la actividad enzimática

mgMal ( ml∗min )∗10 ∗0,5 ml 50

Dilución 1/100

2500,98

U g

FUENTE: Laboratorio de Ingeniería de las Enzimas de la FCIAL- 2014 ELABORADO POR: Hernández, Tapia

IV.

DISCUSION

La velocidad de reacción de una enzima depende de varios factores, uno de ellos es la concentración de enzima, puesto que un mayor concentración de enzima permite la transformación de una mayor cantidad de sustrato, en menor tiempo (Durango, et.al, 2008). En la presente practica se llevó a cabo la reacción de sustrato de almidón al 1%, en diferentes diluciones de enzima, comprobando que velocidad catalítica depende la concentración de enzima, los valores de velocidad se presentan en la tabla 6 de resultados, en donde se muestra que para la dilución de menor concentración de enzima 1/50 tiene una velocidad de 0,733 (mgMal/ml*min), siendo superior a las otras dos velocidades reportadas. La concentración de maltosa obtenida para cada dilución se obtuvo a partir de la ecuación linealizada (Ec. 1) de la curva estándar de maltosa presentada en el Grafico 1 de resultados. Todos los datos de concentración de maltosa para las diluciones se presentan en las tablas 3, 4 y 5 y a cada tabla le corresponden los gráficos 2, 3 y 4 de resultados. A partir de estos gráficos se obtuvo la velocidad de reacción de la enzima para cada dilución, graficando solamente la parte lineal de los datos. Se presenta en la gráfica 6 la variación de velocidades con respecto a la concentración de

glucosa. Obteniendo como velocidad media 0,2444 (mgMl/ml*min). Se calculó también la actividad enzimática para cada dilución, los datos de actividad se presentan en la tabla 6 de resultados, aquí se puede observar que la mayor actividad 2961,137 U/g, es para la dilución 1/100, estimando así que la actividad enzimática no depende tanto de la concentración de enzima con la que se trabaje sino más bien al tiempo de reacción o a algún factor exógeno que no se ha podido establecer en la práctica. Además se reporta la actividad media para las tres diluciones siendo esta de 2500,987 U/g. V.

CONCLUSIONES

Se realizó cuantificación de la actividad enzimática de la -amilasa a diferentes concentraciones de enzima, reaccionando sobre sustrato de almidón al 1% en diferentes tiempos, obteniendo una actividad mayor de 2931,137 U/g para la dilución de 1/100, y como actividad media entre las tres diluciones (1/50, 1/100 y 1/200) de 2225,883 U/g. Además se determinó el efecto de la concentración de enzima sobre la velocidad de reacción en el sustrato de almidon obteniendo la mayor cantidad de miligramos de maltosa por ml y por tiempo (0,733), en comparación con las demás diluciones.

VI. -

-

-

REFERENCIAS Corao, G. 2004. Métodos cualitativos para la identificación de carbohidratos (monosacáridos, disacáridos y polisacáridos). Disponible en http://webdelprofesor.ula.ve/ farmacia/gmendez/manuales %20PDF/EXPERIMENTO %204%20IDENT%20CARB %2006-05.pdf. 10/05/14. Durango, E., Batista, A., Cepeda, I. y Tobón, H. 2008. Producción de enzimas amilasa microbiana, mediante fermentación en estado líquido. Universidad Pontificia Bolivariana. Centro de Investigaciones. Monteria – Cordoba. 6-9 pp. González, C. 2004. Evaluación de la actividad amilásica como indicador del grado de

-

-

biotransformación de residuos organicos procedentes de la Industrialización de papa congelada. Proyecto de Grado para optar al Título de Ingeniero de Producción Agroindustrial. Universidad Politécnica de Valencia. 6-9 pp. Rubiano, C. 200oyaca). 6. Aislamiento y caracterización de microrganismos Termófilos anaerobios lipolíticos y amilolíticos de manantiales termominerales de Paipa Iza (Boyacá). Trabajo de Grado como requisito parcial para optar por el Titulo de Microbióloga Industrial. 22-24 pp. Wikipedia. 2013. Diastasa. Disponible en http://es.wikipedia.org/wiki/ Diastasa. 10/05/14.

VII.

ANEXO

ANEXO 1: CUESTIONARIO 1. Presente las características más relevantes de β-amilasa de soya y sus aplicaciones Enzima presente en la malta que se activa durante la fase de degradación de almidón y proteínas en la etapa de maceración. Origen de β -amilasa: cereales, soya y camote. La β-amilasa se la conoce con el nombre de enzima sacarogénica, pues actúa sobre la amilosa, rompiendo unidades 1,4, dando maltosa. Sobre la amilopectina actúa en las uniones alfa-1,4 de la cadena recta, y detiene su acción a distancia de 2 unidades de glucosa antes de atacar las uniones alfa-1,6. Se trata de una exo-amilasa, ya que actúa sobre el terminal de la molécula; mientras la amilosa es transformada totalmente en maltosa, la cadena ramificada de la amilopectina se conserva en un 40-45% sin hidrolizar. La β-amilasa no necesita de activador para actuar, pero es menos estable al calor, inactivándose a 70 °C por 15 min. El pH óptimo de la beta-amilasa es de 4,5 (Wikipedia, 2013). 2. ¿Cuál debería ser la concentración de enzima a utilizar si cambiamos la relación de la mezcla enzima: sustrato de 1:1 (utilizada en la práctica) a 1:5 para obtener valores de velocidad de reacción equivalentes?. La solución madre corresponde a la dilución 1/10, si se quiere obtener una relación 1:5 se debe aumentar la concentración de la solución madre 5 veces para obtener valores de reacción equivalentes. c) ¿En qué consiste el método para cuantificar específicamente maltosa?. Prueba

B A R F O E

Procedimiento Sustancia problema Reactivo de Barfoed. Acetato de cobre cristalizado 13,3 g en 200 ml de H2O destilada. Filtrar si es necesario. Añadir 1.8 ml de ácido acético glacial (CH3COOH). Mezclar y calentar en

Volumen (ml) 1

2,5

D

baño de agua hirviente, contando los minutos y sacar del baño cada tubo inmediatamente después que haya aparecido el precipitado rojo ladrillo de Cu2O. Anotar el tiempo que corresponda a cada carbohidrato. La aparición de un precipitado rojo, antes de los 6 min indica la presencia de un monosacárido. La aparición de un escaso precipitado rojo, entre 9 y 12 min indica la presencia de Lactosa o Maltosa.

(Carao, 2004).