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HHS Acceso Público autor manuscrito autor Manuscrito

J Clin Immunol. Autor manuscrito; PMC disponible en abril de 2016 01. Publicado en forma editada final como:

J Clin Immunol. Abril de 2015; 35 (3): 289-301. doi: 10.1007 / s10875-015-0139-3.

frecuencias reducidas de respuestas de células T específicos de CMV polifuncionales en los recién nacidos con infección congénita por CMV Laura Gibson 1, †, *, Constance M. Barysauskas +, #, Margaret McManus *, Sheryl Dooley *, ^, Daniele Lilleri §, Donna Fisher ¶, Tumul Srivastava ǁ, Don J. Diamond ǁ, y Katherine Luzuriaga *, ‡

†

autor Manuscrito

*

Departamento de Medicina, Framingham, MA 01702

Departamento de Pediatría, Framingham, MA 01702

^

Departamento de Boston del corazón Diagnóstico, Framingham, MA 01702

+

Cuantitativa Ciencias de la Salud, Dana-Farber Cancer Institute, Boston MA 02215

#

Departamento de Bioestadística y Biología Computacional, Dana-Farber Cancer Institute, Boston MA 02215

‡

Programa de Medicina Molecular de la Universidad de Massachusetts Medical School, Worcester, MA 01605

§

Laboratori Sperimentali di Ricerca-Área Trapiantologica, Fondazione IRCCS Policlinico San Matteo, 27100 Pavia,

Italia

autor Manuscrito

¶

Departamento de Pediatría, Hospital de Niños de Baystate, Escuela de Medicina de la Universidad de Tufts, Springfield, MA 01199

ǁ

División of Translational Investigación de Vacunas, Instituto de Investigación Beckman de la Ciudad de la Esperanza, Duarte, CA 91010

Introducción La infección congénita por citomegalovirus (CMV) es una causa importante de morbilidad infantil, y sigue siendo una alta prioridad para el desarrollo de vacunas [1]. Se estima que un 0,7% de los nacidos vivos o 30.000 bebés por año en los EE.UU. son diagnosticadas con la infección congénita por CMV, y casi el 20% de exposición permanente discapacidades neurológicas [2]. Por otra parte, los niños con infección congénita por CMV o posnatal pueden diseminar el virus en la

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orina durante períodos prolongados, lo que aumenta el riesgo de infección primaria por CMV seronegativos en sus cuidadores embarazadas [3-5]. Una estrategia posible vacuna contra el CMV es inmunizar a los bebés para prevenir la infección por CMV, reducir la excreción del virus tras la infección primaria, o para reducir el riesgo de infección congénita severa durante el embarazo más adelante en la vida, que ha sido una razón para la inmunización contra la rubéola universales [6-8] . Otra estrategia es vacunar a los recién nacidos con infección congénita CMV como inmunoterapia con o sin agentes antivirales, que ha sido la base de los ensayos clínicos de la vacuna de CMV en las mujeres seropositivas o receptores de trasplantes de células [6, 9, 10]. Tales enfoques requieren

1

Autor correspondiente, Enfermedades Infecciosas e Inmunología, UMassMemorial Medical Center, 55 avenida del lago del norte, Cuarto S7-715 Worcester, MA

01655, tel 508-856-3158, Fax 508-856-5981, [email protected].

Gibson et al.

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que la vacuna candidato inducir anticuerpos neutralizantes específicos de CMV potentes y / o las respuestas inmunes mediada por células

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en los lactantes que se correlacionan con el control de la replicación o la protección de la enfermedad viral, persisten en la memoria a largo plazo, y son evaluables en ensayos clínicos [11-13]. Por otra parte, estas respuestas deben adaptarse continuamente a la gran diversidad y la rápida evolución de las poblaciones de CMV dentro de los compartimentos de tejido anfitrión distintas [14].

La generación y el mantenimiento de las respuestas de células T anti-virales en el curso de la infección por CMV, y su papel en la protección contra la enfermedad clínica grave o control de la replicación viral no se han definido completamente [15]. las células T específicas del virus con especificidad distinta antígeno, la capacidad funcional, o fenotipo de superficie han sido demostrado que afectan a la patogénesis de enfermedades viral en una variedad de modelos, incluyendo animales [16, 17] o adulto seres humanos [18-21]. Sin embargo, las características únicas de la inmunidad celular en los niños pequeños pueden afectar a su capacidad para generar respuestas de células T anti-virales de protección durante la infección

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primaria o después de la vacunación, y por lo tanto garantizar una mayor investigación en estudios longitudinales [7, 11]. La infección congénita CMV es un sistema modelo para caracterizar estas células T.

Los esfuerzos para definir correlaciones inmunitarias de respuestas de células T anti-virales de protección en adultos se han centrado ampliamente en el fenotipo de memoria y la función efectora. Entre otros marcadores, las células T con experiencia antigénica se pueden distinguir por patrones de expresión de la isoforma CD45 transmembrana fosfatasa y la molécula de ganglio linfático homing CCR7 [29]. Por otra parte, el aumento de la evidencia sugiere que las células T capaces de múltiples funciones efectoras anti-virales simultáneas se asocian con marcadores de protección [30-32], y que el análisis de estas células T de memoria polifuncionales se pueden utilizar para evaluar el resultado después de la vacunación [13, 33 -36].

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Nuestro objetivo fue caracterizar el fenotipo y efectoras funciones de la memoria de células T específicos de CMV en los niños pequeños con infección congénita CMV en comparación con los adultos con infección primaria o crónica, y correlacionar estas respuestas con mediciones de carga viral longitudinales. Esta población infantil de identificación se utilizó como modelo de las respuestas inmunes celulares específicos de CMV longitudinales para proporcionar una base para los estudios en niños sanos con infección por CMV posnatal primaria, una población más difíciles de identificar. El uso de múltiples parámetros citometría de flujo, se demuestra diferencias cuantitativas y cualitativas en las respuestas de células T CD4 y CD8 específicos de CMV en los recién nacidos en comparación con los adultos.

métodos

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población de estudio

Diez niños con infección congénita por CMV se estudiaron longitudinalmente. Ellos fueron matriculados en la Universidad de Massachusetts Medical Center (Worcester, MA), el Hospital de Niños Baystate (Springfield, MA), y Policlinico San Matteo (Pavia, Italia). Diagnóstico de la infección congénita por CMV se realizó dentro de 3 semanas del nacimiento mediante la detección de ADN de CMV en la sangre neonatal [37, 38] y o aislamiento / virus de la orina. Tres de cada 10 bebés fueron sintomáticos con afectación del sistema nervioso central (SNC).

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Diez mujeres embarazadas con infección primaria por CMV se estudiaron longitudinalmente como controles adultos para la infección

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primaria por CMV. Ellos se inscribieron en el Policlínico San Matteo (Pavia, Italia). Diagnóstico de la infección primaria por CMV se basa en uno o más de los siguientes criterios: reciente seroconversión IgG-CMV específica, la presencia de CMV IgM específica y de baja avidez de IgG, y / o presencia de ácidos nucleicos de CMV en la sangre [39]. Momento de la infección primaria por CMV se basa en la disminución de los niveles de anticuerpo IgM-CMV específica, aumentando los niveles de avidez de IgG, la presencia de síntomas clínicos, y / o resultados de laboratorio [40]. bebés sanos sin infección por VIH o CMV que han nacido de madres infectadas por VIH-1 [24], y los adultos sanos con infección crónica o ninguna CMV, sirvieron como controles adicionales. Las mujeres embarazadas y lactantes no infectados por el VIH de las mujeres infectadas por el VIH se ha demostrado para generar CMV robusta o la respuesta inmune celular a la vacuna específica, respectivamente [41-43]. Los bebés y los adultos no embarazadas con infección primaria por CMV no estaban disponibles como controles para este estudio. La infección suele ser asintomática o leve en estas poblaciones, por lo que están con poca frecuencia identificada por un proveedor de cuidado de la salud y por lo tanto rara vez se dispone de inclusión en el estudio.

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Estos estudios fueron aprobados por los comités de los sujetos humanos en las instituciones participantes. consentimiento informado por escrito se obtuvo de los participantes adultos o de un padre o tutor legal de los niños.

la estimulación de células mononucleares de sangre periférica y tinción

Se procesaron las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) como se describe [24] y fueron estimuladas (0,5 x 10 6 en 250 l de RPMI con 10% de suero bovino fetal) con grupos de péptidos traslapantes abarcan CMV UL83 (pp65) o UL122 (temprano inmediato (IE) -2). Anti-CD107a y

- CD107b (Alexa-647), brefeldina A, y monensina (BD Pharmingen) y los anticuerpos a coestimuladoras moléculas CD28 y

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49d se añadieron con el péptido. Tras una incubación de 6 horas, se fijaron las células, se tiñeron con anticuerpos específicos para CD8 (ECD), CD4 (azul Pacífico), CD14 / 16/19 (APC-Cy7), CD45RA (FITC), CCR7 (PE-Cy7), y colorante vital Live / Dead azul (Invitrogen), permeabiliza, después se tiñeron con la proteína inflamatoria de macrófagos (MIP) - 1 β ( PE), el interferón (IFN) - γ ( Alexa-700), y la interleucina (IL) -2 (PerCP-Cy5.5). Todos los anticuerpos se obtuvieron en la forma conjugada de BD Pharmingen con la excepción de CD107a / b, CD14 / 16/19, IFN γ, y IL2 obtiene a partir de BioLegend. Medio solo y Staphylococcus enterotoxina B (SEB, toxina Technology, Sarasota, FL) se utilizaron como controles negativos y positivos, respectivamente. muestras longitudinales de cada sujeto se estudiaron simultáneamente en el mismo ensayo.

péptidos CMV

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Se obtuvo el péptido piscina CMV pp65 (péptidos de ácido 15 amino superposición por 11 aminoácidos) a través del Programa de reactivos de referencia, División de SIDA, NIAID, NIH NIH AIDS Research and. El IE-2 piscina péptido CMV se sintetizó como se describe [44]. Citometría de flujo

Citometría de flujo se realizaron utilizando un instrumento LSRII (BD Bioscience, San Jose, CA) y se analizaron los datos utilizando FlowJo (TreeStar, Palo Alto, CA), maja (versión 1.6.2 Mario

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Roederer, VRC, NIAID, NIH, Bethesda, MD), o SPICE (versión 5, Mario Roederer, VRC, NIAID, NIH) de software.

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Las células de interés se identificaron mediante un algoritmo de gating serial incorporando linfocitos (hacia adelante frente a dispersión lateral), singletes de células, células vivas, CD14 / 16 / 19- células (para enriquecer en células CD3), CD4 + o CD8 + células, y las células de memoria (CD45RA o CCR7). Los umbrales para definir CD45RA negativo o poblaciones de células CCR7 se determinaron utilizando “fluorescencia menos uno” tubos que incluían todos los anticuerpos en el panel excepto CD45RA o CCR7, respectivamente.

células CD4 o CD8 T se distinguen por los patrones de CD45RA o expresión CCR7, y se incluyen (CD45RA + CCR7 +) y células T memoria total poblaciones ingenuo. células T de memoria totales se dividen adicionalmente en subconjuntos definidos como memoria central (CM, CD45RA-CCR7 +), la memoria efectora (EM, CD45RA-CCR7), o RA memoria efector (EMRA, CD45RA

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+ CCR7 -) [29]. Las frecuencias de células T de memoria totales se calcularon como un porcentaje de todas las células CD4 o CD8 T y subconjuntos de células T de memoria (CM, EM, o EMRA) se calcularon como un porcentaje de células T de memoria totales, donde Total = (CM + EM + EMRA) (Fig 1).

respuestas funcionales de células CD4 o CD8 T se calcularon restando las frecuencias de respuesta sin estimulación de la respuesta con CMV o estimulación SEB ( “fondo-resta”). El umbral para definir la respuesta “detectable” se fijó en ≥ 90 º percentil de la distribución de fondo-resta los valores negativos [34]. Para los sujetos con 2 o más detectables respuestas en 1 o más puntos de tiempo, los datos generados a partir de FlowJo para cada marcador funcional formateado en maja y se analizaron para los patrones de polifuncionalidad usando SPICE. Como anteriormente, el umbral en SPICE se fijó en ≥ 90 º

percentil de la distribución de los valores negativos de antecedentes-resta.

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la detección de CMV

ADN de CMV se cuantificó en la sangre periférica en Policlinico San Matteo (Pavia, Italia) para todos los sujetos. Hasta diciembre de 2007, las muestras se ensayaron inicialmente por PCR cuantitativa con equivalentes límite de detección 10 del genoma (GE) Total / 10? L de sangre. Las muestras negativas para el ADN se ensayaron luego por triplicado mediante PCR anidada [39, 45]. Las muestras de ADN negativas por PCR cuantitativa y positivas por PCR anidada (es decir, ADN presente pero <10 GE / 10? L) se informan como 3 GE / 10? L. Después de diciembre de 2007, las muestras se ensayaron mediante PCR en tiempo real con límite de detección 25 GE / ml de sangre entera) [46]. Los dos ensayos fueron calibrados internamente y validados por un programa de control de calidad externo (Control de calidad para diagnóstico molecular, www.qcmd.org). laboratorios clínicos en los sitios participantes llevaron a cabo el aislamiento del virus de la orina.

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Análisis de los datos puntuaciones de Savage no paramétricas se utilizaron para comparar los porcentajes de células T de memoria totales y de subconjuntos de células T de memoria (CM, EM, o EMRA) en estudio inicial, la presencia de respuestas de células T específicos de CMV detectables en cualquier momento, la frecuencia de CMV pp65- células T específicas en estudio inicial, y la presencia de respuestas polifuncionales en cualquier momento entre todos los grupos de estudio. pruebas de suma de rangos de Wilcoxon no paramétricas se utilizaron para comparar porcentajes de CMV memoria pp65specific subconjuntos de células T entre los niños y los adultos C P, la carga viral CMV en estudio inicial, y la duración de detectable CMV DNAemia. La prueba exacta de Fisher se utilizó para comparar

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ADN de CMV detectable en la sangre periférica en estudio inicial entre los lactantes C y adultos P. software de SAS v 9.3 fue

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utilizado para todos estos análisis (SAS Institute, Inc., Cary, Carolina del Norte).

Wilcoxon de suma de rangos de prueba se utilizó para comparar las frecuencias de respuestas polifuncionales. se muestra los datos normalizados, es decir, cada valor de medición se pondera por su contribución relativa al total de todas las mediciones para la muestra, y se expresó como “porcentaje de respuesta total” [47]. La significación estadística se definió como p < 0.05.

resultados población de estudio La Tabla 1 muestra las características de la población de estudio. Los sujetos del estudio fueron recién nacidos con infección congénita (C)

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por CMV. Los sujetos de control eran lactantes con no (N), la infección por CMV y adultos con primaria (P), crónica (CH), o ninguna infección (N) CMV. Todos menos 3 recién nacidos con infección CMV congénita ( “C lactantes”), y todos los adultos con infección primaria por CMV ( “P”) adultos, fueron estudiados en ≥ 2 puntos de tiempo. Los bebés con ninguna infección CMV ( “N lactantes”) se estudiaron a los 2 puntos de tiempo (2 - 6 meses y 12 - 18 meses de edad). Los adultos con crónicas ( “adultos CH”) o no ( “N”) adultos infección por CMV fueron cada estudiaron en 1 punto de tiempo.

Para los adultos P, mediana de edad gestacional al inicio de la infección primaria fue de 8 semanas (rango de 0 a 21 semanas). La mediana de duración de la infección por CMV en estudio inicial, definido como el tiempo entre el inicio y el estudio inicial, fue de 9 semanas (rango 3 a 13 semanas).

Para los bebés C, mediana de edad postnatal en estudio inicial fue de 4 semanas (rango de 2 días a 30 semanas). La mediana de duración de la infección por CMV en estudio inicial, que se define como el tiempo entre el inicio de la infección materna y estudio inicial infantil, fue de

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32 semanas (rango de 22 a 63 semanas) durante 6 lactantes con temporización conocida de la infección materna. Esta definición probablemente sobreestima la duración de la infección por CMV en estudio inicial en aproximadamente 6 semanas, durante las cuales la transmisión en tiempo de la madre al feto tiene lugar [48]. Las muestras obtenidas en el útero durante la infección temprana por CMV no estaban disponibles.

subconjuntos de células T de memoria en los niños y adultos primero Se compararon las frecuencias de la memoria y la memoria total de subconjuntos T CD4 y CD8 poblaciones de células entre todos los grupos de cohortes (figura 2). Las frecuencias medianas de las células T de memoria totales fueron significativamente inferiores en C recién nacidos en comparación con los adultos P (CD4 30% versus 66%,

p = 0.003; CD8 40% versus 71%, p = 0,022), y en N lactantes en comparación con N adultos (CD4 33% versus 74%, p = 0.002; CD8 29% versus 77%, p = 0,002). Las frecuencias medianas de memoria total de células T CD4 en los lactantes de C y N no fueron

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significativamente diferentes. Para ambos grupos infantiles de C y N, la mayoría de las células CD4 T de memoria eran CD45RA -CCR7 + (CM; frecuencias medianas de> 51%; p < 0,05 frente a todos los grupos de adultos), y la mayoría de las células CD8 T de memoria eran CD45RA + CCR7 (EMRA; frecuencias medianas de> 60%;

p < 0,02 frente a todos los grupos de adultos). Por el contrario, para todos los grupos de adultos P, CH y N, la mayoría de las células CD4 o CD8 T de memoria eran CD45RA-CCR7 (EM; frecuencias medianas de> 58%,

p < 0,01 frente a ambos grupos infantiles).

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Las frecuencias medianas de las células T EM fueron significativamente más bajos para C recién nacidos en comparación con los adultos

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P (CD4 23% versus 52%, p = 0.003; CD8 29% versus 65%, p = 0,003) y para N lactantes en comparación con N adultos (CD4 25% versus 50%, p = 0.002; CD8 12% versus 59%, p = 0,002). Por el contrario, las frecuencias medianas de las células T EMRA fueron significativamente mayores para C recién nacidos en comparación con los adultos P (CD4 8% frente a 6%, p = 0,046; CD8 63% versus 33%, p = 0,007) y para N lactantes en comparación con N adultos (CD4 17% versus 10%, p = 0,013; CD8 80% versus 40%,

p = 0,006). Las frecuencias medianas de las células T CD4 CM fueron significativamente mayores para los lactantes C en comparación con los adultos P (68% versus 42%, p = 0,036), y para N lactantes en comparación con N adultos (51% versus 43% en p = 0,05). células CM T CD8 fueron insignificantes para todos los grupos. Las frecuencias de las poblaciones de células T de memoria totales o subconjunto en P, CH y N adultos no difirieron significativamente.

alteración de la función y el fenotipo de CMV respuestas de células T específicas pp65 en los bebés

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Para cuantificar las frecuencias y caracterizar las propiedades funcionales de las células T específicos de CMV en los recién nacidos y adultos en distintas etapas de la infección, se compararon CD4 o CD8 T respuestas de las células a CMV piscinas pp65 o péptidos IE-2 medidos por los marcadores de la citotoxicidad (CD107) , quimiotaxis (MIP1 β), o la secreción de citoquinas anti-viral (IFN γ o IL2). Ambos productos génicos de CMV son objetivos comunes para las respuestas de células T específicos de CMV en adultos con infección crónica [49]. En particular, las células T CD4 dirigidos IE-2 con más frecuencia que IE-1 en adultos, así que elegimos para examinar IE-2 en los lactantes en lugar de IE-1 como en nuestros estudios anteriores [23, 24]. Representante flujo citometría de parcelas para una madre y lactante par demostración de células T CD4 respuestas a CMV pp65 o SEB medido por CD107, MIP1 β, IFN γ, o la expresión de IL-2 (Fig 3). Las respuestas a IE-2 no se detectaron en ninguna lactantes C, pero se detectaron en 1 de 10 (CD4 solamente) adultos P y 2 de 5 (CD8 solamente) CH adultos (datos no mostrados). Por lo tanto, nos hemos centrado en la caracterización de las respuestas a CMV pp65. En general, no se observó ninguna tendencia longitudinal distinta de pp65specific CD4 o respuestas de células T CD8 para cualquier grupo, excepto P adultos no mostraron expresión IL2 por las células T CD4 pp65specific más de 3 meses después de la aparición de la infección (datos no presentados).

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Para las células pp65-específicos CD4 T, una proporción más baja (2 de 10; p = 0,019) de los lactantes C tuvieron respuestas detectables por cualquier marcador funcional en cualquier punto de tiempo en comparación con los adultos P (Fig

4). En estos 2 bebés C, sola IFN γ- y se detectaron células T CD4 individuales IL2 que expresan a sólo 1 (6 meses o 19 meses, respectivamente) de 5 puntos de tiempo durante los primeros 15 o 19 meses de edad, respectivamente (figura 5). Se encontraron células T CD4-pp65 de CMV específica principalmente dentro del subconjunto de células T EM para adultos P, pero se distribuyeron equitativamente a través de subconjuntos para los 2 bebés C con respuestas (figura 6). La proporción media de células EM fue menor (p = 0,03) y de las células EMRA fue mayor (p = 0,04) para los lactantes C en comparación con los adultos P.

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Para las células T CD8 pp65-específicos, la proporción de lactantes C y P adultos con respuestas detectables por cualquier marcador funcional en cualquier punto de tiempo no difirió (8 de 10 para ambos grupos) (Fig 4). Sin embargo, las frecuencias de todas las células T CD8 responder-pp65 específico ( p = 0,006 frente a P adultos; p = 0,040 frente a adultos CH; datos no mostrados), y de MIP1 β( p = 0,043 frente a P adultos; p = no significativo (NS) versus CH adultos) o expresar CD107-( p = NS frente a P adultos; p = NS frente CH adultos) las células T CD8-pp65 específica, fueron más bajos en los lactantes C (Fig 5). Las frecuencias de las respuestas medidas por el IFN γ no fueron significativamente diferentes entre C, P,

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y grupos CH, y las respuestas por parte de cualquier medida no fueron significativamente diferentes entre el P y grupos de adultos CH.

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Se detectaron respuestas medidas por IL2 en 1 de cada 5 adultos CH pero no otros sujetos. Se encontraron células T CD8-pp65 de CMV específica casi exclusivamente dentro de los subconjuntos de células EM o EMRA T para ambos bebés C y adultos P (Fig 6).

las respuestas de células T específicos de CMV se compararon entre los lactantes con (CNS; n = 3) o sin (no CNS; n = 7) infección sintomática que implica el sistema nervioso central, aunque no se identificaron diferencias significativas. Dos de 3 bebés del SNC tenían detectable CD4 (frente a 0 de 7 no CNS; p = NS) y CD8 (frente a 6 de 7 no CNS; p = respuestas de las células NS) T. De los bebés del SNC con las células T CD8 detectables, 0 de 2 (frente a 2 de 6 no CNS;

p = NS) tuvo respuestas detectables polifuncionales.

frecuencias reducidas de respuestas de células T específicos de CMV polifuncionales en los bebés

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células T capaces de múltiples funciones efectoras simultánea ( “polifuncional”) se han asociado con la protección de la infección viral [30-32]. Para caracterizar estas respuestas en las cohortes de estudio, se compararon las frecuencias y los patrones de células T polifuncional CMV pp65specific utilizando análisis SPICE para los sujetos con ≥ 2 funciones detectado en cualquier punto de tiempo. Significativamente menos lactantes C con células T detectables pp65-específicos tuvieron respuestas polifuncionales (0 de 2 con respuestas CD4; 2 de 8 con respuestas de CD8) en comparación con P (CD4

p = 0,033; CD8 p = 0.003) o CH (CD8 p = 0.011) adultos (figura 7). Los patrones de las funciones celulares T CD4 variaron para P y CH adultos, pero la secreción de IL2 fue el menos común (Fig 8). Menos lactantes C tenía células T CD8 polifuncionales que los adultos ( p < 0,05), pero cuando está presente siguió los patrones más comunes de los adultos con la co-expresión de CD107 / IFN γ / MIP1 β o de CD107 / MIP1 β ( Fig 8). Menos bebés C tenían una sola expresión de CD107 que los adultos ( p < 0,05).

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Persistencia de ADN de CMV detectable en la sangre periférica de los recién nacidos con infección congénita CMV

ADN de CMV fue detectable en la sangre periférica de los 9 lactantes C ensayados, con una carga mediana CMV en estudio inicial de 10 GE / 10? L de sangre (rango de 3 a 1.000 GE) (Tabla 1). La mediana de tiempo entre el inicio de materno infección y infantil estudio inicial (una medida de la duración de la infección por CMV infantil en estudio inicial) fue de 26 semanas (rango de 22 a 63 semanas) para 5 de los 9 lactantes C (momento de la infección materna no se conocía para 4 lactantes).

ADN de CMV fue detectable en 6 de 10 adultos P ( p = NS frente a lactantes C), con una carga mediana CMV en estudio inicial para estos 6 sujetos de 10 GE / 10? L de sangre (rango de 3 a 100 GE; p = NS frente a lactantes C). La mediana de tiempo entre el inicio de la infección y el estudio inicial (una medida de la duración de la infección por CMV en estudio inicial) para estos sujetos fue de 5

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semanas (rango 3 - 13 semanas; p = 0,013 frente a lactantes C). ADN de CMV fue indetectable en los otros 4 de 10 adultos P en estudio inicial y en el transcurso del período de estudio. La mediana de tiempo entre el inicio de la infección y el estudio inicial para estos 4 sujetos fue de 11 semanas (rango de 7 - 12 semanas; p = 0,037 frente a los lactantes de C, y p = NS frente a 6 P adultos con ADN de CMV detectable en estudio inicial como arriba). La carga CMV mediana al estudio inicial para todos los 10 adultos P era 3 GE / 10? L de sangre (rango de 0 a 100 GE; p = NS frente a lactantes C) (Tabla 1).

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Discusión La infección congénita CMV es un problema clínico significativo con las estrategias de prevención o de tratamiento eficaces limitadas, y sirve como un modelo relevante en el que para examinar la interacción de toda la vida dinámica entre virus y huésped. Mientras que muchos estudios han demostrado el papel crítico de las respuestas inmunes celulares específicos de CMV en el control de la gravedad de la replicación y la enfermedad viral, las características específicas de estas respuestas que confieren protección permanecen incompletamente determinada [15]. Como resultado, el desarrollo de una vacuna contra el CMV ha sido relativamente empírico con eficacia medible pero limitado. La estrategia óptima de inmunización se ha demostrado que incluir lactantes de menos de 1 año de edad [6, 50, 51]. Para enfocar estos esfuerzos hacia la identificación de los mecanismos de inmunidad celular protectora en esta población, probamos la hipótesis de que el fenotipo de memoria o la capacidad funcional de las células T CMV-específicos es diferente y asociada con el control reducido de la replicación viral en los recién nacidos con infección congénita por CMV en comparación con inmunocompetentes adultos con infección primaria o crónica. Nuestros datos demuestran reducidos o alterados CMV-pp65 específico CD4, CD8, o células T poyfunctional en estos recién nacidos, que fueron asociados con la detección prolongada

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de ADN de CMV en la sangre periférica.

Primero examinamos la distribución total de memoria T CD4 y CD8 poblaciones celulares. CD45RA y CCR7 han sido utilizados para identificar poblaciones de células T con homing distinta de tejido, la capacidad para la proliferación rápida, o la función efectora anti-viral [29]. En comparación con los adultos, los niños tenían compartimentos de células de memoria T totales significativamente menores en estudio inicial, principalmente debido a las frecuencias más bajas de la subconjunto de células CD45RA-CCR7-EM T. Este patrón se observó independientemente del estado de la infección por CMV, lo que sugiere un fenómeno en lugar de virusspecific edad asociada con una menor exposición al antígeno acumulada en los lactantes en comparación con los adultos. La distribución de subconjuntos de células T de memoria observada en nuestro estudio es similar a la reportada en otras cohortes de niños jóvenes sanos [7, 52].

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Consistente con el efecto de la exposición a antígeno sobre la evolución de las poblaciones de células T de memoria, la única diferencia significativa observada en el estudio inicial para recién nacidos con infección congénita por CMV en comparación con infantes CMV-no infectada fue mayor frecuencia de células T CD8 EM. Este hallazgo concuerda con estudios previos que muestran que la infección viral congénita desplaza la población total de células T CD8 a un fenotipo más diferenciado de memoria [25, 52]. La importancia clínica de las células T CD8 relativamente tardías disociados en lactantes con CMV congénita u otra infección viral no se conoce, pero puede estar asociada con efectos tan dispares como memoria de células T inadecuada de larga duración de protección y control ineficaz de la infección viral en el tiempo [ 53], la senescencia de las células T como se observa en CMVinfected adultos mayores [54],

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Entre los adultos inmunocompetentes, las células T CD4 específicos de CMV heterogéneos y robustos son fácilmente detectable, y se han asociado con el control de la replicación viral, enfermedad menos grave, y un menor riesgo de transmisión viral de la madre al niño [19, 55-57]. Estas células muestran una mayor citotóxico (CD107) y la quimiotaxis (MIP1 β) funciones y ayudante inferior (IL2), y etapas más avanzadas de la maduración [29, 58]. En consonancia con este patrón, la mayoría de los adultos en nuestro estudio con primaria (7 de 10) o crónica (3 de 5) tenía la infección por CMV CMV

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las respuestas de células T CD4-pp65 específica con varias combinaciones de las 4 funciones expresan casi exclusivamente

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por las células T EM. Por el contrario, estas respuestas rara vez se detectan en los recién nacidos con infección congénita por CMV, incluso cuando un panel ampliado de funciones incluyendo IFN γ, IL2, MIP1 β, y CD107 fue examinado por citometría de flujo. Sólo 2 niños tuvieron respuestas detectables, que consistía en IFN γ- o células que expresan IL2 distribuyen por igual dentro de los compartimentos de células T de memoria EM, CM, y EMRA. De interés, estos niños eran 2 de 3 en el estudio con infección sintomática que afectan el sistema nervioso central.

Nuestros resultados coinciden con otros estudios de las respuestas de células T CD4 específicos de CMV en los recién nacidos o niños pequeños. Los primeros estudios que utilizan ensayos linfoproliferativos granel mostraron que las respuestas fueron poco frecuentes en niños con congénita [59-61] postnatal infección o [62] CMV. Es de destacar que, Pasar et al [60, 62] demostró un menor número de respuestas a CMV en comparación con el virus del herpes simple en recién nacidos infectados con ambos virus, lo que sugiere que la reducción de la inmunidad celular puede ser específica para el CMV, pero no otros herpesvirus. Estudios más recientes usando ensayos

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para medir las respuestas de una sola célula en niños con infección CMV postnatal también han demostrado frecuencias más bajas de células T CD4-CMV específicos detectados por IFN γ o la secreción de IL-2 en comparación con los adultos [26-28]. De acuerdo con nuestros estudios, Lidehall et al informaron recientemente que menos CMVspecific IFN γ- que producen células T CD4 fueron detectables en los recién nacidos con infección congénita o post-natal CMV en comparación con los adultos con infección primaria por CMV [28].

Entre los adultos, las células T CD8 CMV pp65-específicos son sesgada hacia robustas funciones citotóxicas y quimiotaxis, un perfil consistente con las respuestas efectoras y la capacidad de reclutar células a los sitios locales de la replicación viral [63, 64]. En particular, Kim et al [63] mostró que la memoria finales de las células T CD8-pp65 específico (CD27-CD45RA +) CMV en adultos sanos producen poca IL2 pero abundante MIP1 β. Mientras que se detectaron CMV pp65-específicos respuestas de células T CD8 en la mayoría de los lactantes C y P adultos en nuestro estudio, las frecuencias de estas respuestas, en

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particular solo MIP1 β- o CD107-expresión y las células polifuncionales, fueron más bajos en los bebés. En los adultos, las células T polifuncionales se asocian con la protección antiviral medida por progresión de la enfermedad más lento, un control más frecuente de la replicación viral, o la reducción de tratamiento con medicamentos antivirales [30-32], y la medición de estas respuestas se ha utilizado para evaluar antiviral estrategias de vacunación [13, 33-36]. Pocos estudios han examinado las respuestas de células polifuncionales CD4 o CD8 T en los lactantes, que se detectaron con poca frecuencia en la infección congénita VIH [65, 66], pero comúnmente y con fenotipo heterogéneo y perfiles funcionales siguiente Bacillus Calmette-Guérin vacunación [35, 67]. Al igual que en estos estudios, nuestro trabajo muestra que los recién nacidos con infección congénita por CMV son relativamente incapaces de generar respuestas de células T polifuncional, pero cuando está presente, β con o sin IFN γ [ 64].

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Con estos perfiles de CMV respuestas de células T-pp65 específico, a continuación, examinamos el nivel y duración de ADN de CMV detectable en la sangre periférica de los lactantes con congénita y adultos con infección primaria por CMV. ADN de CMV en estudio inicial era detectable en todos los lactantes C en comparación con sólo el 60% de P adultos, a pesar de duración significativamente más larga estimado de la infección por CMV en los recién nacidos en el momento del muestreo. Aunque las tasas de descomposición no pudieron ser estimados a partir de nuestros datos, la duración de ADN de CMV detectable en la sangre periférica de los recién nacidos con infección congénita CMV fue al menos dos veces más que los adultos con infección primaria por CMV. Este hallazgo sugiere que los bebés tienen una exposición más prolongada a la replicación viral, y que

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sus respuestas de células T específicos de CMV no dan lugar a la liquidación de la viremia. La relación entre el nivel de

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exposición al virus y el resultado clínico de la infección congénita por CMV no se ha definido por completo, sino una asociación entre la carga viral y secuelas graves se ha observado en muchos estudios, y se ha utilizado como fundamento para el tratamiento antiviral de la infección congénita por CMV [68, 69].

Los mecanismos que regulan la inducción, la expansión, la diferenciación, la calidad, y el mantenimiento de las respuestas inmunes celulares específicas de virus no se comprenden bien, especialmente para lactantes con infección viral congénita, aunque el conocimiento en esta área está aumentando [7, 11]. Además de compromiso del receptor de células T (TCR) y los ligandos co-estimuladoras, se ha demostrado que las células T neonatales para requerir una señal de citocina suficiente para permitir una transición efectiva de ingenuo células T efectoras [70]. IL-12 se ha identificado como un mediador crítico en esta vía, y es necesario para sostener la fosforilación y la expresión de las proteínas de transducción de señales de TCR proximal CD3 ξ y Lck. Sin embargo, IL-12 por las células antigenpresenting (APC) se altera a través de al menos el primer año de vida, lo que probablemente limita la

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capacidad de los niños para generar respuestas de células T específicas de virus adecuados que controlan la replicación viral y la enfermedad clínica límite. Nuestros datos muestran que los lactantes son relativamente incapaz de generar respuestas de las células T CD8 polifuncionales pero cuando presentes patrones de expresión son similares a los adultos, apoyando así el modelo de un umbral de inducción crítico para la inducción de respuestas de las células efectoras T.

Además, los bebés característicamente exhiben perfiles de citoquinas que favorecen la polarización de las células T a relativamente más anti- (especialmente T helper 2 y las células T reguladoras) que las respuestas pro-inflamatorias [71]. A su vez, ayuda limitada de células T CD4 y / o supresión de células T amplificado pueden conducir a la generación o mantenimiento de las células T CD8 específicas de virus subóptima. En los seres humanos y modelos animales, las células T CD8 generados con inadecuada ayuda de

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células T CD4 durante la infección o la vacunación no logran sostener anti-viral función efectora o protección [13, 36, 72]. Además, el deterioro funcional de células T o “agotamiento” es un estado molecular distinto asociado con la infección viral crónica, que implica la expresión de los co-receptores inhibidores tales como el antígeno del receptor-1 (PD1) y linfocitos T citotóxicos muerte programada 4 (CTLA4) , reducido funciones efectoras y la capacidad proliferativa, y la diferenciación relativamente terminal, y se correlaciona con los marcadores de la progresión de la enfermedad [53]. Estas células T se han identificado en la infección primaria por CMV [73]. Del mismo modo, nuestros datos muestran células T CD8 relativamente diferenciadas en los lactantes con comparación con aquellos sin infección congénita por CMV se plantea la posibilidad de que estas células están en un estado de deterioro funcional. Al mismo tiempo, este estado puede limitar T inflamación patológica mediada por células y daño tisular [53], especialmente en el sistema nervioso central que puede conducir a un retraso grave del desarrollo neurológico en algunos niños con infección congénita CMV. Si bien nuestro estudio no identificó una diferencia en las células CD4 detectable o respuestas de células T CD8 en el SNC en comparación con los niños no afectados SNC debido a la pequeña cohorte, otros han mostrado evidencia de la inmunopatología en ratón [74] y el feto humano [75] modelos. Estos y otros mecanismos intrínsecos a o que afecta al sistema inmunitario en desarrollo, junto con la evasión viral inmune [76] o de la evolución genómica [14], perturban la interacción virus-huésped dinámico para favorecer la replicación viral

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persistente o enfermedad grave en la vida temprana.

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conclusiones Nuestro estudio proporciona nuevos conocimientos de las respuestas inmunitarias celulares anti-virales neonatales, y apoya los esfuerzos en curso para delinear los mecanismos pertinentes de protección y para desarrollar una vacuna contra el CMV preventivo o terapéutico eficaz dirigida a los niños pequeños. El uso de un flujo ampliado citometría panel de marcadores funcionales, se muestra que las respuestas CMV específicos de las células T pueden cebarse en la vida temprana, pero su frecuencia o “calidad” pueden no ser óptimos para el control de la infección por CMV. En comparación con los adultos, los niños con infección CMV congénita tienen las células T CD4 con menos frecuencia CMV detectable-pp65 específica y las frecuencias más bajas de células CD8 T capaces de citotóxico, quimiotaxis, y múltiples funciones simultáneas, todo en la fijación de ADN de CMV detectable persistente en el periférico sangre. Además, estudios recientes muestran que las poblaciones de genoma de CMV son muy variables entre los compartimentos de tejido [14], necesitando la plasticidad de la respuesta inmune en el huésped. La implicación de estos hallazgos es que una vacuna contra el CMV efectiva dirigida a los niños jóvenes tendría que adaptarse a las características específicas de la inmunidad adaptativa en este grupo de edad. Con este fin, un informe reciente mostró que una vacuna basada en el complejo CMV gH / gL-pentámero induce respuestas humorales robustos que neutralizan la infección

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por CMV de las células endoteliales y fibroblastos [12]. Esta vacuna candidato puede superar las limitaciones del sistema inmunitario neonatal, especialmente si se combina con pp65, IE1 / 2, u otros objetivos de respuestas celulares [44]. La implicación de estos hallazgos es que una vacuna contra el CMV efectiva dirigida a los niños jóvenes tendría que adaptarse a las características específicas de la inmunidad adaptativa en este grupo de edad. Con este fin, un informe reciente mostró que una vacuna basada en el complejo CMV gH / gL-pentámero induce respuestas humorales robustos que neutralizan la infección por CMV de las células endoteliales y fibroblastos [12]. Esta vacuna

candidato puede superar las limitaciones del sistema inmunitario neonatal, especialmente si se combina con pp65, IE1 / 2, u otros objetivos de respuestas celulares [44]. La im

Nuestro trabajo demuestra la viabilidad de nuevos enfoques experimentales aplicadas a los estudios de los niños que pueden ser utilizados para la evaluación de esta población en los ensayos clínicos. Por otra parte, nuestro trabajo proporciona una base desde la cual estudiar la inmunidad celular específicos de CMV en los recién nacidos sanos con infección primaria por CMV o crónica, una población más difíciles de identificar. Los perfiles fenotípicos y funcionales de las células T anti-virales de protección que persisten en la memoria no están completamente definidos para cualquier población [15, 29], por lo que la caracterización adicional de estas características será

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particularmente crítica para el diseño de estrategias de prevención y tratamiento de CMV.

Expresiones de gratitud Agradecemos a Wanda Depasquale para la asistencia en la preparación del manuscrito, Linda Lambrecht para la gestión del transporte y el almacenamiento de muestras clínicas de los sitios participantes, Robin Brody y Thomas Greenough útil para el debate de la citometría de flujo, Maripat Toye para la recogida de muestras y el apoyo administrativo, y Maria Grazia Revello de muestras clínicas.

Fondos Este trabajo es apoyado por el Fondo de Investigación Thrasher (LG); las siguientes subvenciones de los Institutos Nacionales de Salud: K08AI062752 (LG), Centro Nacional de Investigación de Recursos UL1RR031982 (apoyo parcial a CMB), AI063356, AI103960, y CA077544 (apoyo parcial a enfermedad articular degenerativa), CA033572 (a City of Hope Cancer Center), R01HD040450 (KL); K24HD001489 (KL), y el Centro de la Universidad de Massachusetts para la Investigación del SIDA (AI042845); y Ministero della Salute, Istituto de Ricovero e Cura un Carattere Scientifico Policlinico San Matteo Ricerca Finalizzata, convenzione 126 y Ricerca Corrente (Grant 80513) (DL).

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estrategia Fig 1. Gating para las poblaciones de células T de memoria

se muestran gráficos de puntos representativos con poblaciones de células T de memoria para una madre (A110) y su hijo (P110). células CD4 (columna izquierda) o CD8 (columna derecha) T se diferencian por CD45RA (eje y) o CCR7 (eje x) expresión. poblaciones de células T incluyen memoria total (puerta en forma de L que incorpora CM + EM + EMRA como se indica en el diagrama leyenda) con subconjuntos de memoria central (CM, CC45RA-CCR7 +, cuadrante inferior derecho), la memoria efectora (EM, CD45RA-CCR7, inferior izquierda cuadrante), o RA memoria efector (EMRA, CD45RA

+ CCR7, cuadrante superior izquierdo). células T vírgenes (CD45RA + CCR7 +, cuadrante superior derecho) no están incluidos en la puerta

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autor Manuscrito frecuencias Fig 2. La mediana de células T de memoria en estudio inicial

células totales T de memoria (barras llenas; panel izquierdo CD4; panel de la derecha CD8) se muestran como porcentaje de todos (memoria total más naïve) las células T, y la memoria T subconjuntos de células (regiones dentro de las barras como se indica en la

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leyenda) se muestran como porcentaje de células totales T de memoria. En comparación con los adultos P, los bebés C tenía memoria total inferior CD4 ( p = 0.003) o CD8 ( p = 0,022) frecuencias de células T. En comparación con N adultos, N lactantes tenían memoria total inferior CD4 ( p = 0.002) o CD8 ( p = 0,002) frecuencias de células T. No hubo diferencias significativas en las frecuencias de células totales T de memoria entre grupos de adultos P, CH y N. Véase el texto para la comparación de los subconjuntos de células T. C, infantil congénita; P, adulto primaria; CH, adulto crónica; N (I), no infante infección; N (A), sin infección de adultos; EM, la memoria efector (CD45RA-CCR7); CM, la memoria central (CC45RA-CCR7 +); EMRA, RA memoria efector (CD45RA + CCR7)

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Fig 3. respuestas de células T específicos de CMV

respuestas de células T CD4 representante funcionales (x e y ejes) a SEB (fila superior) o pp65 de CMV (fila inferior) para un adulto de embarazo a las 18 semanas de gestación (4 meses después del inicio de la infección, las columnas de la izquierda) y su hijo en 3 meses de edad (columnas de la derecha)

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autor Manuscrito Fig 4. Detectable CMV respuestas de células T-pp65 específica

se muestran los porcentajes de lactantes o adultos con CMV detectable CD4-pp65 específica (izquierda) o CD8 (derecha) respuestas de las células T mediante cualquier medida de la función en cualquier punto de tiempo. Todas las comparaciones no son significativamente

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diferentes, excepto las células T CD4 para lactantes C frente a P adultos ( p = 0,019)

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Fig 5. Las frecuencias de respuestas de células T-pp65 de CMV específica detectables

Los diagramas de caja muestran las frecuencias de CMV pp65 específica CD4 (izquierda) o CD8 (derecha) las células T detectadas por las medidas individuales de la función (CD107, MIP1 β, IFN γ, o IL2) para los lactantes C, adultos P, y CH adultos. Todas las respuestas detectables y se incluyen los puntos de tiempo. Las líneas horizontales representan la 25 º, 50 º ( mediana), o 75 º percentiles. Los diamantes indican las frecuencias medias y las barras de error indican los valores mínimo y máximo. lactantes C mostraron frecuencias significativamente más bajos de células T CD8-pp65 específica detectable por cualquier función (es decir, cerrada en todas las células que responden, que no se muestra; p = 0,006 frente a P adultos; p = 0,040 frente a CH adultos) o por MIP1 β ( p = 0,043 frente a P adultos; p

= NS frente CH adultos). Las frecuencias de las respuestas medidas por CD107, IFN γ, o IL2 no fueron significativamente diferentes entre los grupos

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Fig 6. CMV memoria-pp65 específica subconjuntos de células T

Las frecuencias de subconjuntos de células T de memoria (CM, EM, o EMRA) para responder CMV pp65specific CD4 (izquierda) o CD8 (derecha) se muestran las células T. Todas las respuestas detectables y puntos temporales se incluyen. La mediana de frecuencias se indican mediante barras horizontales. Se encontraron células CMV pp65specific T CD4 principalmente dentro del subconjunto de células T EM para P adultos, pero se distribuyeron relativamente igual en subconjuntos para los 2 bebés C con respuestas. Estos bebés C presentaron menor EM ( p = 0,03) y mayor EMRA ( p = 0,04) frecuencias de células T CD4 en comparación con los adultos pág. las células T CD8 específicas CMV pp65-se encuentra casi exclusivamente dentro de los subconjuntos de células EM o EMRA T para todos los grupos

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autor Manuscrito respuestas de células Fig 7. Detectable polifuncional T

se muestran los porcentajes de sujetos con CMV polifuncional CD4 detectable-pp65 específica (izquierda) o (derecha) las células T CD8

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por cualquier combinación de ≥ 2 funciones en cualquier punto de tiempo. Significativamente menos lactantes C tenía células CD4 o CD8 T polifuncionales en comparación con P o adultos CH. Los 2 lactantes C con las respuestas de células T CD4 detectables no tenían células polifuncionales

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autor Manuscrito autor Manuscrito Fig 8. Los patrones de respuestas de células T polifuncionales

Polifuncional CMV CD4 (panel superior) pp65-específico o CD8 (panel inferior) las respuestas de células T se definen como expresión de ≥ 2 medidas de la función (CD107, MIP1 β, IFN γ, y / o IL-2) en la estimulación con CMV pp65. se muestra los datos

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normalizados, es decir, cada valor de medición (frecuencia de respuesta) se pondera por su contribución relativa al total de todas las mediciones en el grupo (C, P, o CH), y se expresó como “porcentaje de respuesta total” para cada grupo . Pies (leyenda superior) ilustran frecuencias relativas de las respuestas con 1 - 4 funciones para cada grupo. Bares (leyenda inferior) representan frecuencias relativas de las respuestas que consisten en los perfiles funcionales específicas indicadas a lo largo del eje x (cajas). A significativamente menor (* p <0,05) proporción de lactantes C tenía células T CD8-pp65 de CMV específica polifuncional en comparación con P o adultos CH, pero cuando están presentes estas células expresan los mismos perfiles comunes como adultos con co-expresión de CD107 y MIP1 β con o sin IFN γ. Además, una significativamente menor (+ p <0,05) proporción de lactantes C tenía células T CD8-pp65 específico de CMV que expresaban CD107 solo comparado con P o adultos CH

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tabla 1

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Características de la población estudiada a, b

Tema

La edad postnatal en el estudio

la carga viral (/ sangre 10? l de GE) Síntomas

inicial (meses do)

infantes C

SNC

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B101

4.5

M102

1.5

33

SNC

M103

0.5

3

SNC

P105

0.5

1000

ninguna

P110

2 días

10

ninguna

P111

2 días

10

ninguna

P113

1.3

10

ninguna

P114

3.8

10

ninguna

P115

2 días

3

ninguna

P107

7.0

10

ninguna

DAKOTA DEL NORTE

autor Manuscrito

P adultos vez desde el inicio de infección en estudio inicial (meses)

la carga viral (/ sangre 10? l de GE) Síntomas

autor Manuscrito

A110

2.5

0

A112

1.0

3

sí

A115

2.5

0

sí

A116

2.8

0

sí

A117

1.2

100

sí

A118

1.6

0

sí

A119

3.0

10

sí

A120

0.7

30

sí

A121

2.6

10

sí

A122

0.6

3

ninguna

ninguna

una Abreviaturas: GE, equivalentes de genoma; “C”, los bebés recién nacidos con infección congénita por CMV; “P” adultos, los adultos con infección primaria por CMV; ND, no realizado; SNC, los síntomas de la infección congénita por CMV que afectan el sistema nervioso central.

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segundo Los bebés con ninguna infección CMV (n = 10; edad 2 - 6 meses de edad en estudio inicial) y adultos con crónica (n = 5) o sin (n = 7), la infección por CMV no están incluidos en la tabla como las características no son aplicable. do Meses a menos que se indique lo contrario

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