Bradford

DETERMINACIÓN DE PROTEÍNAS POR EL MÉTODO DE BRADFORD (no sacar esta hoja) Blanco: Este tubo no contiene proteína, se reemplaza la muestra por agua y se le agrega el correspondiente volumen de reactivo. Se realiza para determinar la absorbancia del reactivo, este valor se descuenta de la absorbancia del resto de los tubos. Curva de calibración: Para su realización se utilizará la solución testigo de concentración conocida. Con la medida de absorbancia de cada tubo y conociendo la cantidad de proteínas que contiene cada uno de los tubos, es posible realizar una curva de calibración (gráfico A595 vs µ g de proteína). Es necesario realizarla cada vez que se procesen las muestras. La concentración del TESTIGO es 100 µ g/ml. Muestra incógnita: se procesa en simultáneo y en las mismas condiciones que la curva de calibración. El tubo contiene la muestra y la misma cantidad de reactivos que los anteriores. Para conocer la cantidad de proteínas de la muestra (µ g), se determina la absorbancia de la misma y se interpola en la curva de calibración. Cada grupo procesa una sola Muestra incógnita (A o B). Protocolo: Tubo Blanco

H2O Testigo Muestra Reactivo de Proteína Absorbancia AoB Bradford a 595 nm (µ l) (µ l) (µ g) (ml) (µ l) 600 -------- ---------2

1

450

150

----------

2

2

300

300

----------

2

600

----------

2

-------

600

2

3

------Muestra ------AoB -

Procedimiento: Pipetear en el orden de la tabla: - Primero el AGUA con la pipeta de 1 ml (rotulada H2O). - El TESTIGO con otra pipeta de 1 ml (rotulada T) respetando el orden de los tubos: 1,2 y 3. - Luego con otra pipeta de 1 ml (rotulada A o B según corresponda) la MUESTRA INCÓGNITA en su tubo correspondiente. -Por último, el reactivo de Bradford con la pipeta de 5 ml (rotulada R). - Mezclar el contenido de los tubos. - Incubar 5 minutos a temperatura ambiente. Observar el color de la curva de calibración y comparar con el color de la muestra incógnita con la curva. De esta manera estimar los valores de proteínas de la muestra incógnita. Luego leer en el fotocolorímetro tanto la curva y como la muestra incógnita. Completar la tabla con los valores de absorbancia y realizar el gráfico A595 vs µ g de proteína.

Interpolar en el gráfico el valor de absorbancia de las muestras incógnita en dicha curva y determinar µ g de proteína de las muestras y en luego determinar su concentración µ g/ml. Analizar si existe concordancia con el valor estimado visualmente. Al finalizar el trabajo práctico es IMPORTANTE que todo el material quede limpio y en su lugar. Se enjuagarán las pipetas con agua. Para limpiar los tubos de Bradford los alumnos contarán con una pizeta con etanol. Primero se descartará el contenido de los tubos en las piletas. Luego se enjuagarán los tubos con un poco de etanol y por último con abundante agua.