Bio Mol 27-09

Préambule lundi 8 septembre 2008 09:23

Mécanismes de transcription et de traduction Procaryotes Chez les procaryotes, les gènes sont souvent regroupés sous forme d'opérons. Des séquences RBS (Ribosome Binding Site) (ou Shine Dalgarno) permettent aux ribosomes de se fixer sur l'ARN a traduire en protéine. Schéma de transcription de l'ADN :

Orientation 5' et 3'

Eucaryotes Les gènes eucaryotes sont composés de séquences introniques et exoniques. L'initiation de la traduction se fait sur une séquence ATG. A la suite de la transcription d'un gène, un ARN pré-messager est créé, il comporte encore des séquences introniques, une coiffe 5' ainsi qu'une queue poly-Adénylée en 3'. L'épissage permet d'exciser les introns, on obtient un ARN messager mature qui ne comporte que les séquences exoniques mises bout à bout, la coiffe 5' ainsi que la queue poly-Adénylée sont conservées.

La traduction aboutit à la création d'une protéine découlant indirectement du codage des séquences exoniques.

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Une bactérie doit être très économe, la multiplication, la nutrition, l'adaptation doivent être efficientes.

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Les Procaryotes lundi 8 septembre 2008 20:54

Parties de cours abordées : • Initiation • Elongation • Terminaison

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Chapitre 1 : Initiation de la transcription lundi 8 septembre 2008 10:00

Box

Séquence

-35

TGACA

-10

TATAAT

Le début de la transcription commence au niveau du nucléotide +1. Il est nécessaire de contrôler la fixation de l'ARN polymérase sur le promoteur.

1- Création du complexe fermé par la fixation de l'ARN polymérase sur toute la zone promotrice, englobant le nucléotide +1 et les séquences -35 et -10.

2- Création du complexe ouvert par la dénaturation des deux brins d'ADN pour permettre d'atteindre les bases. Cette ouverture se fait au niveau du nucléotide +1 jusqu'à environ la moitié de la séquence -10.

3- La synthèse de l'ARN peut débuter.

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4- Phase d'élongation : la polymérase quitte le promoteur et progresse vers l'extrémité 5'. La polymérase a une forte affinité au promoteur et une affinité plus faible aux séquences suivantes.

5- Terminaison de la traduction : arrivé en région terminatrice, le site de reconnaissance de Rho qui a été transcrit permet la liaison du facteur Rho impliqué dans le relargage de l'ARN polymérase :

Il y a formation d'une boucle terminative :

Rho progresse le long du brin d'ARN formé et éjecte in fine l'ARN polymérase :

4 points de contrôles :

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4 points de contrôles : • Contrôle de la fixation de l'ARN polymérase sur le promoteur. • Contrôle de l'ouverture de l'ADN. • Contrôle du début de la synthèse d'ARN. • Contrôle du départ de la polymérase du promoteur pour contrôler en réalité l'élongation.

Nous traiterons en général du cas d'E. coli. La structure de la polymérase d'E. coli est de type : α2ββ'ωσ Une protéine peut acquérir plusieurs conformations spatiales. Par exemple, elle peut se replier de telle sorte que des domaines NTD (N-Terminal Domain) et CTD s'agrègent de leur côtés respectifs et restent reliés par une séquence d'AA sans conformation particulière. La polymérase qui nous intéresse ici a juste ses deux sous-unités α qui comportent des domaines NTD et CTD reliés par un bras flexible.

La polymérase a une affinité forte pour une séquence particulière qui est promotrice. Elle peut toutefois se fixer autre part sur l'ADN, cependant cette fixation est à faible affinité et généralement l'initiation ne s'y fera pas : l'ARN polymérase va avoir tendance à se détacher successivement pour atteindre enfin la séquence promotrice. La sous-unité σ70 contient 2 parties impliquées dans la reconnaissance des séquences promotrices : • σ2 qui reconnait la séquence -10 : TATAAT • σ4 qui reconnait la séquence -35 : TGACA La région σ2 a un second rôle car c'est à son niveau (séquence -10) que l'ADN doit être ouvert. 1- Reconnaissance du site -10. 2- Ouverture de l'ADN autour de ce site -10.

Elément UP Certains promoteurs comportent un élément UP responsable d'une meilleure reconnaissance pour la transcription. L'élément UP est reconnu par les domaines CTD des sous unités α. La stabilité conférée par la séquence UP permet une meilleure transcription. > Promoteurs dits "efficaces".

Intervention de la région σ3 Certains promoteurs ont une séquence -35 qui n'a rien a voir avec la séquence normalement reconnue par σ4. > Donc σ4 ne reconnait pas -35 Si on essaye d'installer la polymérase sur ce promoteur, seul l'interaction σ2 - -10 assure la stabilité.

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Si on essaye d'installer la polymérase sur ce promoteur, seul l'interaction σ2 - -10 assure la stabilité. > Condition instable, la polymérase aurait tendance à se détacher. Mais une région σ3 est présente juste à côté de σ2 impliquée dans la reconnaissance de la séquence -10. > La somme des interactions entre σ3 et l'ADN avant -10 ainsi que σ2 - -10 confèrent une stabilité suffisante.

La présence de la séquence -10 est indispensable étant donnée que c'est cette dernière qui est impliquée dans l'ouverture de l'ADN.

Contrôles de la transcription Pour commencer l'élongation., il faut dissocier σ70 de l'holoenzyme. Le reste de l'enzyme (ββ') n'a pas une affinité spécifique pour le promoteur, elle peut quitter le promoteur. Des Activateurs/Répresseurs peuvent assurer une régulation à divers niveaux : > Contrôle de la fixation de l'ARN polymérase sur le promoteur. > Contrôle de l'ouverture de l'ADN. > Contrôle du début de la synthèse d'ARN. > Contrôle du départ de la polymérase du promoteur pour contrôler en réalité l'élongation.

Cas de la régulation de l'expression du gène merT en fonction de la présence ou absence de mercure (Hg2+) Dans le cas du mercure, la bactérie doit mettre en place un système de défense qui nécessite de l'énergie et doit être finement régulé (en fonction de la présence ou absence d'un taux dangereux de mercure dans le milieu). > Production de la protéine merT capable de capter et "détoxifier" le mercure. Normalement, la bactérie ne produit pas merT mais lorsqu'un taux trop important de mercure est présent, la transcription se déclenche.

Les séquences -35 et -10 sont présentes et pourront être reconnues (par σ4 pour -35 et σ2 pour -10). L'écart entre la séquence -35 et -10 est de 15 à 17 pb en règle générale. La particularité du promoteur du gène merT est que l'écart entre -35 et -10 est de 19 pb. > σ4 et -35 peuvent se lier. > σ2 et -10 ne peuvent pas se lier. > Instabilité de la fixation de la polymérase

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En absence de mercure, la polymérase ne peut pas se fixer sur le promoteur du gène. La présence d'une concentration élevée en mercure induit une fixation d'un ion mercure sur une protéine activatrice "merR". Cette fixation s'accompagne d'un changement de conformation.

Répression de la transcription de merT

En absence de mercure, la protéine merR peut se fixer sur un site spécifique du promoteur du gène merT. La fixation de merR stabilise la structure tridimensionnelle de l'ADN et interdit toute fixation simultanée des régions -35 et -10 du promoteur par la sous unité σ de la polymérase.

Activation de la transcription de merT

En présence de mercure, la protéine merR acquiert une nouvelle conformation. Cette nouvelle conformation permet de tordre l'ADN au niveau du site de fixation. Les sites -35 et -10 se rapprochent. Bio Mol 2 Page 8

> Les sites -35 et -10 se rapprochent. > La polymérase peut se fixer sur le promoteur du gène. > Transcription. Une même protéine peut donc être un répresseur ou un activateur en fonction de la concentration du composé qui la contrôle.

Les promoteurs qui comportent des séquences -35 et -10 de type TTgACA et TATAAT proches ne peuvent être contrôlés que par répression. > Un promoteur fort est principalement contrôlé par des répresseurs car augmenter son activité est difficile. Un promoteur plus faible, par exemple avec des séquences -35 et -10 respectivement AgCACA et TAgCAT, rendra plus difficile la fixation de la polymérase ainsi que l'ouverture de l'ADN. > L'efficacité de l'initiation de la transcription est plus faible "au départ". > On peut donc utiliser des activateurs pour augmenter l'efficacité du promoteur. > On peut aussi utiliser des répresseurs pour diminuer encore plus l'efficacité du promoteur. > La combinaison Répresseur/Activateur est aussi envisageable.

Répresseur Opérateur dans le promoteur

Un répresseur reconnait une séquence spécifique de l'ADN appelée Opérateur. Cet opérateur est entre les séquences -35 et -10. > Il empêche la fixation de la polymérase.

Opérateur après le promoteur

D'autres répresseurs peuvent se fixer plus loin dans l'ADN, après le promoteur > Logiquement, ce type de répresseur ne peut pas bloquer la fixation de la polymérase, par contre il peut bloquer l'ouverture de l'ADN.

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Activateur Activateurs de classe I sur site -61

Un activateur peut se fixer sur le site -61 en amont de la séquence -35. Cette protéine activatrice se lie aussi avec les domaines CTD des sous unités α de la polymérase. L'activateur de classe I peut lier une ou les deux sous unités α. En partant d'un promoteur faible, la somme des interactions confère une bonne stabilité grâce à l'activateur.

Activateurs de classe II sur site -41

D'autres promoteurs faibles peuvent avoir un site -41 où se fixera une protéine activatrice. L'activateur qui se lie sur le site -41 peut réaliser 3 liaisons : > Une avec un domaine CTD d'une sous unité α. > Une avec un domaine NTD de la même sous unité α. > La dernière avec la protéine σ70. > La somme des interactions stabilise la fixation de la polymérase. > Activation de la transcription. L'activateur de Classe II, comme le classe I est susceptible d'avoir des interactions différentes (une seule ou deux sous unités α considérées par exemple) étant donné la variabilité des cas qui peuvent se présenter. Un activateur de classe 2 fait deux choses : > Faciliter la fixation de la polymérase sur le promoteur en multipliant les interactions et donc en renforçant la stabilité. > Favoriser l'ouverture de l'ADN à l'issue de cette fixation. (Ce qui n'est pas possible pour un activateur de classe I sur -61 étant donné qu'il est trop loin de la protéine σ70 ) Si on revient sur notre exemple de promoteur faible avec des bases changées, il est plus judicieux d'imaginer un activateur de classe II car : > On cherche à augmenter la fixation de la polymérase, fragilisée par des bases atypiques. > On cherche aussi à aider l'ouverture de l'ADN étant donné que la séquence changée confère une meilleure liaison entre les deux brins (CG).

Le dimère d'activateur peut se fixer sur l'ADN :

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Chaque monomère se fixe sur un demi site similaire. Activateur de classe I :

Exemple de la protéine CRP (ou CAP) :

L'adénylate cyclase nécessite d'être phosphorylée pour devenir réellement active. Si du glucose est en cours de transport, l'adénylate cyclase ne sera pas phosphorylée. Dans le cas d'une bactérie dans un milieu pauvre en glucose, le phosphate du transporteur passe sur l'adénylate cyclase étant donné que le transporteur n'a pas d'activité. > Activation de l'adénylate cyclase. > Utilisation de l'ATP, rejet d'AMPc. Normalement, la protéine CRP n'est active. Lorsqu'elle fixe une molécule d'AMPc, elle devient active.

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Le dimère de CRP formé, vient se fixer sur l'ADN et stabilise la liaison entre la polymérase et le promoteur faible.

Exemple du lactose : L'opéron lac ne sera exprimé que si il y a du lactose disponible et que du glucose n'est pas disponible. La protéine CRP est impliquée pour tester la concentration en glucose. En ce qui concerne la concentration en lactose, elle est contrôlée par l'opéron LacI.

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LacI peut se dimériser, chaque extrémité des deux monomères interagissent avec l'ADN. Chaque monomère se fixe sur à peu près la même séquence d'ADN. Si il y a du lactose de disponible, le lactose va se fixer sur le dimère de LacI et changer sa conformation : les bras forment un angle tel que les têtes s'éloignent de l'ADN et ne peuvent plus être fixées simultanément. > En présence de lactose, LacI ne se fixe pas sur l'ADN. En réalité, LacI existe sous forme de tétramère car un dimère génère un site d'interaction pour un autre dimère.

Le tétramère est susceptible de reconnaître 2 séquences, pour cela il faut former une boucle avec l'ADN. Quand on introduit une boucle près d'un promoteur chez la bactérie, on a tendance à diminuer l'activité de transcription.

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En absence de lactose, on n'exprime pas l'opéron : > LacI est mis en place sur O1 et O2. > Répression du promoteur. Le promoteur ici étudié est faible. La fixation de LacI sur les deux opérateurs augmente l'affinité de la polymérase pour le promoteur. > Il y a des interactions entre LacI et la polymérase. > L'affinité totale est importante. Cependant, LacI réprime la transcription : > En empêchant l'ouverture des brins (dimère du bas). > Met en place une boucle (dimère du haut). En présence de lactose, on exprime l'opéron > LacI capte du lactose, les bras s'éloignent. > LacI ne peut plus se fixer sur l'ADN. LacI quitte l'ADN, il n'y a plus de boucle ni de stabilité renforcée de l'ADN. > Transcription possible. Le promoteur est faible et pose un problème pour une transcription efficace. Un activateur de classe I va entrer en jeu : activateur CRP. Si la concentration en glucose est forte, CRP ne fixe pas d'AMPc et ne change donc pas de conformation lui permettant de se fixer sur l'operateur. Si il n'y a pas assez de glucose disponible, CRP devient active par liaison à de l'AMPc et peut se lier à l'ADN pour stabiliser la fixation de la polymérase. Le dimère de CRP se fixe sur le site -61 et stabilise l'association de la polymérase avec le promoteur faible. Si lactose et concentration faible en glucose : > CRP activé > Production de LacZ, LacY et LacA En réalité, LacI ne fixe pas le lactose mais un isomère du lactose : l'allo-lactose. L'allo-lactose est un isomère de lactose formé à partir de l'enzyme LacZ.

Cependant, le système ne peut pas être initié puisqu'il n'y a pas de LacZ pour former de l'allo-lactose en absence de lactose. Bien sûr il y a une activité basale du gène. Quant à l'opéron Gal, il sera exprimé lorsque la concentration en galactose est élevée et que la concentration en glucose est faible. La protéine CRP n'est pas limitée à l'opéron Lac, elle va être utilisée pour contrôler une expression en fonction de la concentration en glucose.

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La protéine CRP peut aussi agir en tant qu'activateur de classe II.

Acides gras :

La bactérie peut faire la biosynthèse et dégradation des acides gras. > Si beaucoup d'AG disponibles : dégradation possible pour fabriquer de l'ATP > Si peu d'AG disponibles : biosynthèse possible.

La régulation des protéines Fab se fait avec FabR : > Si beaucoup d'AG : FabR fixe une molécule d'AG et s'inactive en changeant de formation. > Si peu d'AG : FabR reste active et peut se fixer sur une séquence de l'ADN.

Si beaucoup d'AG : Promoteur faible

Promoteur fort

Peu de production de FabA

Beaucoup de production de FabL

Si peu d'AG : Promoteur faible

Promoteur fort

FabR se fixe sur le site -41. Joue un rôle d'activateur de classe II

FabR se fixe sur l'opérateur mais ne peut pas activer. Il joue un rôle de répresseur en empêchant la fixation de la polymérase.

On obtient beaucoup de FabA

On obtient peu de FabL FabR peut donc avoir un rôle activateur ou répresseur en fonction de l'endroit où il se fixe.

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Cas de la bactérie V. Fischeri : "Homard m'a tuer" Cette bactérie est capable de dégager de la lumière car un de ses opérons code pour plusieurs protéines qui s'agrègent pour former l'enzyme Luciférase. Cette enzyme est capable de catalyser une réaction chimique tout en dégageant de la lumière. L'intérêt pour la bactérie repose dans la relation de symbiose qu'elle entretient avec son hôte : le homard. > En effet, le Homard a un organe qui sera colonisé par la bactérie Vibrio Fischeri. > En retour, le Homard entretient la bactérie en lui fournissant tous les nutriments dont elle a besoin. Prenons le cas d'une bactérie V. Fischeri seule sans son hôte, dans la mer. Dans ce cas, elle n'a aucun intérêt à fournir de la lumière. Lorsque la densité de bactéries est importante (dans le homard), V. Fischeri fournit de la lumière. Quorum Sensing : Capacité de détecter la densité bactérienne environnante. La région promotrice ne comporte pas de séquence -35 reconnaissable par σ4. Cependant, une région en amont de -10 permet de stabiliser la polymérase via σ3. Bactérie libre :

Le schéma 2 montre une bactérie qui ne transcrit pas la luciférase. Dans cet état, l'enzyme LuxI produit la molécule Y à partir de X. Cette molécule Y est larguée dans le milieu et joue le rôle de molécule de communication. Bio Mol 2 Page 16

Cette molécule Y est larguée dans le milieu et joue le rôle de molécule de communication. Groupe de bactéries : Lorsque la densité en bactéries est importante, la concentration en Y augmente énormément. Cette concentration joue un rôle dans la transcription de la luciférase. En effet, des molécules d'Y peuvent rentrer dans la bactérie puis se fixer sur l'activateur LuxR qui changera de conformation. L'activateur devient actif et est susceptible de se lier à une zone activatrice -42.

Il y a interaction entre les domaines CTD des sous unités α et l'activateur qui a pu se fixer : LuxR. LuxR augmente la stabilité de la polymérase qui peut débuter la transcription : activateur de classe II.

Cas des opérons Mal : Les opérons Mal codent pour les enzymes qui permettent de transformer le maltose en glucose. Bien sûr, les opérons Mal seront exprimés si : > Il y a du maltose disponible. > Il n'y a pas de glucose. La concentration en glucose sera encore une fois testée à l'aide de l'activateur CRP. Pour prendre en compte la disponibilité du maltose, ce n'est pas un répresseur qui est utilisé, mais un activateur : malT Quelquefois il faut plusieurs activateurs qui travaillent ensemble, c'est le cas ici.

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Si malT se fixe sur le promoteur en zone -41, on peut activer la transcription. > Rôle d'activateur de classe II Mais ce site en -41 est de faible affinité et est en compétition avec le site de fixation de forte affinité, zones oranges. Le site -41 ainsi que le site fort un peu en amont ne peuvent pas être utilisés conjointement car ils se chevauchent.
Dans le cas d'une bactérie avec : • Beaucoup de maltose : > Activation de malT • Beaucoup de glucose : > CRP inactif ⇒ Seul malT est activé.

Si on cherche à fixer 2 molécules de malT : • On remplit les deux sites à forte affinité. • Le site à faible affinité n'est pas rempli puisque le site à forte affinité adjacent est occupé. > Le site -41 n'est pas occupé, pas de stabilisation de la polymérase, pas de transcription. Dans le cas d'une bactérie avec : • Beaucoup de maltose : > Activation de malT • Peu de glucose : > CRP actif

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Quand CRP se fixe sur l'ADN, il réalise un pli (sorte de boucle). Ce pli d'ADN provoque un encombrement stérique entre les deux molécules malT. > Ejection d'un malT du site d'affinité proche du site faible. ⇒ Fixation possible d'un malT sur le site de faible affinité -41. ⇒ Transcription L'éjection du malT peut aussi se faire sur le site à forte affinité de gauche, dans ce cas la transcription n'est pas possible puisque le malT du site fort de droite est toujours présent. (le site -41 doit rester accessible). Certains activateurs fonctionnent donc en changeant la conformation de l'ADN, le contact avec la polymérase n'est pas indispensable comme dans le cas des activateurs plus conventionnels.

C'est ici un gène qui nécessite un activateur de Classe I et un activateur de Classe II pour être activé. > L'activateur de classe II augmente la stabilité de la polymérase. Ces interactions peuvent ne pas être suffisantes pour permettre une initiation efficace. > l'activateur de classe I augmente la stabilité de la polymérase en faisant des interactions avec les domaines CTD des sous-unités α. ⇒ La somme des interactions est suffisante. Bio Mol 2 Page 19

⇒ La somme des interactions est suffisante.

Dans ce cas, il y a un site de fixation faible pour une protéine X en -41. Seule, la protéine X se fixe difficilement sur son site et ne permet pas la stabilisation de la polymérase. Par contre, si Y se fixe sur son site alors la fixation de X est stabilisée. > La somme permet la stabilisation in fine de la polymérase.

Accepteurs d'électrons :

La bactérie a plusieurs accepteurs possibles : • O2 • Nitrate • Fumarate En présence des trois accepteurs, les électrons iront exclusivement sur l'oxygène, c'est l'accepteur le plus fort. Si seulement les deux autres accepteurs sont disponibles, les électrons iront sur le nitrate. Le fumarate est donc l'accepteur le plus faible. Le rendement en terme d'ATP créé est dans le même sens que l'acceptation. Passage des électrons : • Vers le Nitrate NO3- : Nitrate réductase. • Vers le Fumarate : Fumarate réductase. Chez la bactérie il y a un opéron pour les sous unités Nitrate réductase et un autre pour les sous unités de la Fumarate reductase. La transcription se fera donc sélectivement en fonction de la présence ou absence de la nitrate réductase. Pour contrôler cette transcription, on peut utiliser des répresseurs ou activateurs. Premier test : Pour savoir si il y a oui ou non de l'oxygène disponible, la bactérie utilise la protéine FNR.

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La protéine FNR contient un centre fer-souffre avec 4 atomes de fer et souffre : forme active. Ce centre peut être oxydé très facilement en présence d'oxygène et on aboutira à une protéine FNR avec seulement 2 atomes de fer et de souffre : forme inactive. Donc si il y a du de l'O2, FNR est inactive. Second test : quantité de nitrate disponible.

NARX est capable de fixer le nitrate et ainsi de phosphoryler NARL qui passe sous forme active. Troisième test : IHF se fixe sur une séquence spécifique d'ADN en avant de la région promotrice de l'opéron Nitrate reductase et pli l'ADN. Les deux promoteurs sont faibles et nécessitent donc des activateurs. 1) Si O2 disponible > FNR inactif Or FNR est un activateur indispensable pour les deux opérons. > Donc si il y a de l'oxygène, FNR est inactif, pas de transcription des deux opérons. ⇒ Utilisation de l'oxygène. ⇒ Optimisation de la production d'ATP. 2) Pas d'oxygène Nitrate présent Fumarate présent NARX phosphoryle NARL > NARL-P est active.

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FNR se fixe à -41 et jouera une rôle d'activateur de classe II. Cependant NARL-P peut aussi se fixer sur son site. > Cette fixation empêche l'approche de l'ARN polymérase. ⇒ Pas de transcription de l'opéron Fumarase réductase.

Pour le nitrate, FNR se fixe sur son site -41. Le promoteur ne peut pas être activé par FNR seul. Vers -200, NARL-P peut se fixer sur son site. > Trop loin de la polymérase pour favoriser sa stabilité. IHF va provoquer le pliage de l'ADN.

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Ce pli va permettre de générer un grand nombre d'interactions au profit de la polymérase : • Avec NARL • Avec FNR ⇒ Transcription de l'opéron nitrate 3) Pas d'oxygène Pas de nitrate Fumarate présent On doit donc transcrire l'opéron Fumarate. NARL est inactive étant donné qu'il n'y a pas de nitrate. • NARL se détache de son site ⇒ Fixation possible de la polymérase ⇒ Transcription de l'opéron Fumarate. En ce qui concerne l'opéron Nitrate, le détachement de NARL limite les interactions avec l'ARN polymérase qui ne pourra pas se fixer et y rester.

Système à deux composants :

Le Sensor comporte un résidu Histidine accessible nécessaire à l'auto-phosphorylation. Le Response Regulator comporte un résidu Aspartate qui portera un phosphate. > Cette structure sera impliquée dans la réponse au signal. Dans l'exemple du test de la concentration en nitrate, NARX est le Sensor, NARL est le Response Regulator. Par exemple l'osmolarité est testée par un Sensor EMVZ et le Response Regulator est OMPR. Bio Mol 2 Page 23

Par exemple l'osmolarité est testée par un Sensor EMVZ et le Response Regulator est OMPR. La concentration en glutamine est testée par un Sensor NTR B et l'information est transmise à un Response Regulator NTR C. Un Sensor qui n'a pas capté de signal peut interagir avec son Response Regulator et lui prendre son phosphate.

La bactérie E. coli comporte d'autres facteurs σ : > σ32 par exemple, n'a pas la même séquence que σ70 et reconnait donc d'autres types de promoteurs. > σ54 reconnait encore d'autres promoteurs. > σE en reconnait encore d'autres, etc…

σ32 σ32 est nécessaire pour contrôler la réponse à un choc thermique. Le passage d'une température de 30°c à 42°c est un choc thermique qui induira la synthèse de nouvelles protéines de protection vis-à-vis de la température. Avant le choc : La protéine n'est pas présente dans la bactérie avant le choc thermique car : 1. L'ARNm peut se replier et acquérir une bonne stabilité en cachant le codon initiateur dans une structure double brin. 2. Il y a une dégradation des σ32 produites via chaperonnes à destination des protéases.

Un petit nombre d'ARNm σ32 ne se replient pas et peuvent être traduits. > Mais il n'y a qu'une partie infime de σ32 du fait du second contrôle. Après le choc : L'augmentation de la température déstabilise la formation secondaire en épingle de l'ARNm de σ32. > La proportion d'ARNm susceptibles d'être traduits est plus importante. > Beaucoup de protéines σ32 produites. > Logiquement, les protéines chaperonnes captent les σ32 et les envoient vers la dégradation. > Cependant, les protéines chaperonnes doivent réparer toutes les autres protéines mal repliées ⇒ Les σ32 échappent à l'attention des chaperonnes et ne seront pas détruites. ⇒ Beaucoup de molécules σ32. ⇒ Transcription des gènes de protection thermique L'augmentation de la température induit un plus grande proportion de protéines incorrectement repliées, c'est ce qui permet à σ32 de ne pas être captées puisque les chaperonnes ont d'autres protéines à contrôler.

σE : Bio Mol 2 Page 24

σE :

σE n'est normalement pas accessible à α2ββ' car elle est complexée à une protéine dans la membrane interne. Les porines dans la membrane externe sont impliquées dans la détection du stress. Un stress externe provoque la dénaturation des pores, cela aboutit à des protéines dénaturées dans l'espace intermembranaire. Ensuite, ces protéines dénaturées peuvent interagir avec la protéine ancrée dans la membrane interne : changement de conformation et libération de σE. > Complexation avec α2ββ' > Transcription possible des gènes.

σ54 : C'est un facteur particulier :

1) σE , σ70 et σ32 reconnaissent la même structure globale (-35 puis 18 pb puis -10). Par contre, σ54 est atypique car reconnait deux blocs de séquences : • -24 • -12 > Ces deux sites sont plus proches 2) Un promoteur qui utilise σ54 a toujours besoin d'un activateur, mais celui-ci se fixe loin dans l'ADN. Un site IHF est présent entre le site activateur et le bloc -24. Deux activateurs nécessaires Bio Mol 2 Page 25

> Deux activateurs nécessaires En absence de l'activateur : L'ADN polymérase se fixe efficacement sur le promoteur, mais il n'y a pas d'initiation parce qu'il n'est pas possible d'ouvrir les brins de l'ADN. En présence de l'activateur : Un multimère de protéine activatrice se fixe sur le site -200. IHF se fixe et plie l'ADN.

3) Le multimère d'activateur va interagir avec σ54 et favoriser la séparation des brins. Ce phénomène nécessite de l'ATP. > Initiation de la transcription σ54 est spécialisé dans le métabolisme et gestion de stock d'azote chez la bactérie.

La bactérie utilise la glutamine comme source de groupement NH2. > Pour fabriquer des AA, Vitamines, Nucléotides, … La bactérie va uniquement produire la Glutamine Synthase si le taux en glutamine est faible. > Contrôle de l'expression du gène de la Glutamine Synthase qui utilise σ54. Pour activer le gène de la Glutamine Synthase, il faudra l'activateur NTRC. La protéine NTRC est active uniquement sous forme phosphorylée. > Si le taux de glutamine est faible, NTRC sera phosphorylée. > NTRC-P jouera le rôle de protéine activatrice. > Activation de la transcription du gène Glutamine Synthase. C'est un système à deux composants pour déclencher la phosphorylation de NTRC.

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Si la concentration en glutamine est faible, le Sensor NTRB capte le signal. > NTRB s'autophosphoryle sur résidu histidine. > Le Sensor transmet son phosphate au Response Regulator : NTRC. > NTRC est phosphorylée : NTRC-P. Si la concentration en glutamine est forte, le Sensor reste non phosphorylée, in fine NTRC n'est pas phosphorylée. > NTRC reste inactive. > Pas de rôle d'activateur. > Pas de transcription. Certaines bactéries peuvent fixer l'azote (exemple : Klebsiella Pneumoniae) car elles expriment l'enzyme Nitrogénase. > Fixation de N2 et production de NH4+. > Cet azote peut ensuite servir à la production de glutamine. L'enzyme Nitrogénase est complexe et composée d'un grand nombre de sous unités. Chez K. Pneumoniae, il y a 7 opérons distincts qui codent pour l'ensemble des sous unités Nitrogénase. la transcription de ces opérons dépendra de ces facteurs : > Si la concentration en glutamine est forte, il n'y aura pas transcription. > Si la concentration en glutamine est faible, il y aura transcription. Si la concentration en glutamine est faible : > NTRC est activée. > Rôle d'activateur. > Transcription des opérons. Cependant, l'enzyme Nitrogénase est très rapidement inactivée en présence d'O2. Fabriquer la Nitrogénase si il y a de l'O2 est du gaspillage. Les deux conditions pour la transcription sont donc : • Peu de Glutamine. • Pas d'O2. Si la concentration en glutamine est faible : Activation du système à 2 composants : > NTRC activé. > Rôle activateur. > Activation de la transcription sur certains gènes. • NIFL • NIFA

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NIFA et NIFL sont regroupés dans un opéron comportant un site activateur -200 sensible aux multimères de NTRC. Cela aboutit à la production de NIFL et NIFA. Dès sa synthèse, NIFL capte une molécule de FADH2 : NIFL-FADH2 Ce FADH2 est capable de tester la présence d'oxygène : > En présence d'oxygène, NIFL devient NIFL-FAD En présence d'oxygène : La protéine NIFL-FAD n'a pas la même structure tridimensionnelle qu'avec du FADH2 et acquiert la capacité de se fixer sur la protéine NIFA. NIFA seule est activatrice. NIFA complexée à NIFL n'est plus activatrice.

En absence d'oxygène : Pour les opérons Nitrogénase, l'activateur est la protéine NIFA multimérisée sur le site -200. Si NIFA est sous forme active (seule), elle forme un multimère qui se fixe sur le site -200. IHF permet de plier l'ADN > NIFA interagit avec σ54 de la polymérase. > Ouverture des brins possible Transcription

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> Transcription ⇒ Enzyme active. ⇒ Formation de Glutamine

Si [Gln] faible : > NIFA activé. Et si [O2] important : > NIFA inactivé par NIFL. La transcription implique l'absence de Gln et d'O2.

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Chapitre 2 : Terminaison de la transcription mardi 23 septembre 2008 12:01

Intérêts du contrôle de la terminaison : > Dans le cadre d'un terminateur dans la partie codante : pour générer ou non un ARNm qui code pour une protéine fonctionnelle (ou différente).

Il y a 2 classes de terminateurs chez la bactérie : • Rho dépendant. • Rho indépendant. On s'intéresse surtout aux terminateurs Rho-indépendants.

La séquence A est complémentaire à la séquence B, c'est un palindrome car A' est complémentaire à B'. > Palindrome interrompu suivit d'une zone riche en T-A. > Terminateur Rho-indépendant.

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Lorsque les segments A et B ont été transcrits en ARN, ils peuvent s'apparier puisqu'ils sont palindromiques. > Cela tire sur l'ARN. > l'ARN est tenu faiblement par des paires A-U à ce moment là. > Arrachement de la fin de l'ARN. > Terminaison provoquée.

Pour contrôler ce type de terminaison, il faut limiter l'appariement entre A et B. > Bloquer l'appariement grâce à une protéine qui se fixe autour de la séquence A. Le répresseur peut ne reconnaître qu'un motif d'ARNm. > Le répresseur peut être spécifique d'un seul gène du génome. Le répresseur peut être sous forme active ou inactive : > On peut contrôler la terminaison de la transcription pour un seul gène du génome.

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