Article 4 Presentation

GENERAL NATURE OF THE GENETIC CODE FOR PROTEINS By Dr. F. H. C. CRICK, F.R.S. LESLIE BARNETT, Dr. S. BRENNER and Dr. R. J. WATTS-TOBIN

•

Цель: Доказательство гипотезы о том, что элементарной единицей в составе нуклеиновой кислоты, принимающей участие в кодировании одной аминокислоты в последовательности белка, является триплет нуклеотидов.

•

Объект исследования: rII-мутанты бактериофага Т4.

•

Мутаген для получения rII-мутантов: профлавин.

•

Способ доказательства: исследование фенотипов двойных и тройных rII-мутантов бактериофага Т4.

Система rII-мутантов фага Т4  Генетические эксперименты с фагами выполняются без непосредственного наблюдения над родителями и потомством.  Присутствие фагов устанавливают по их способности убивать заражаемые ими бактерии – возникают стерильные пятна (негативные колонии или бляшками) в сплошном слое бактериальных клеток на поверхности чашки Петри.

Система rII-мутантов фага Т4 

Негативные колонии rII-мутантов при посеве на Е.coli В имеют характерную морфологию - мутанты вызывают быстрый лизис клеток хозяина - в результате колонии rII намного крупнее, чем при заражении фагом дикого типа (rII+).

Колония rII-мутанта

Колония дикого типа rII+

Система rII-мутантов фага Т4 •

rII-мутанты не дают потомства, когда они инфицируют клетки Е.coli К (содержащие профаг лямбда), тогда как фаг Т4 дикого типа (rII+) нормально размножается в Е.coli К.

Система rII-мутантов фага Т4 •

rII-мутанты не дают потомства, когда они инфицируют клетки Е.coli К (содержащие профаг лямбда), тогда как фаг Т4 дикого типа (rII+) нормально размножается в Е.coli К.

Фенотипы при посеве на: Фаг

Е.coli В

Е.coli К

T4 rII+ (дикий тип)

Мелкие бляшки

Мелкие бляшки

T4 rII (мутантный тип)

Крупные бляшки

Бляшки отсутствуют

Система rII-мутантов фага Т4 Эксперимент по скрещиванию двух rII-мутантов фага Т4: 

Е.coli В

Е.coli К

Клетки пермиссивного хозяина (Е.coli В) заражают двумя различными rIIмутантами.

Система rII-мутантов фага Т4 Эксперимент по скрещиванию двух rII-мутантов фага Т4:  

Е.coli В

Е.coli К

Клетки пермиссивного хозяина (Е.coli В) заражают двумя различными rIIмутантами. Затем высевают полученных потомков на клетки Е.coli В и параллельно на клетки Е.coli К.

Система rII-мутантов фага Т4 Эксперимент по скрещиванию двух rII-мутантов фага Т4:   

Е.coli В

Е.coli К

Клетки пермиссивного хозяина (Е.coli В) заражают двумя различными rIIмутантами. Затем высевают полученных потомков на клетки Е.coli В и параллельно на клетки Е.coli К. Подсчитывают количество колоний на среде с Е.coli В – получают общее количество потомков от скрещивания.

Система rII-мутантов фага Т4 Эксперимент по скрещиванию двух rII-мутантов фага Т4:    

Е.coli В

Е.coli К

Клетки пермиссивного хозяина (Е.coli В) заражают двумя различными rIIмутантами. Затем высевают полученных потомков на клетки Е.coli В и параллельно на клетки Е.coli К. Подсчитывают количество колоний на среде с Е.coli В – получают общее количество потомков от скрещивания. Подсчитывают количество колоний на среде с Е.coli К – получают число rII+рекомбинантов.

Система rII-мутантов фага Т4 Эксперимент по скрещиванию двух rII-мутантов фага Т4:      Е.coli В

Е.coli К

Клетки пермиссивного хозяина (Е.coli В) заражают двумя различными rIIмутантами. Затем высевают полученных потомков на клетки Е.coli В и параллельно на клетки Е.coli К. Подсчитывают количество колоний на среде с Е.coli В – получают общее количество потомков от скрещивания. Подсчитывают количество колоний на среде с Е.coli К – получают число rII+рекомбинантов. Вычисляют расстояние между двумя исходными мутациями.

Почему использована именно система rII-мутантов фага Т4?  Использование бактериофагов позволяет проводить генетический анализ с высоким разрешением (внутригенный уровень).  Система rII-мутантов позволяет обнаружить фаги дикого типа, возникающие в результате рекомбинации между двумя различными rII-мутантами.

Профлавин-индуцируемые мутации Мутагены

Профлавин-индуцируемые мутации Мутагены Аналоги нуклеиновых оснований

Профлавин-индуцируемые мутации Мутагены Аналоги нуклеиновых оснований замещение отдельных оснований

эффект

2-аминопурин и 5бромурацил

примеры

есть реверсия

способность к реверсии в дикий тип под действием 2-аминопурина

Профлавин-индуцируемые мутации Мутагены Аналоги нуклеиновых оснований замещение отдельных оснований

эффект

2-аминопурин и 5бромурацил

примеры

профлавин и акридин

есть реверсия

способность к реверсии в дикий тип под действием 2-аминопурина

нет реверсии

Профлавин-индуцируемые мутации Мутагены Аналоги нуклеиновых оснований

Интеркалирующие красители

замещение отдельных оснований

эффект

?сдвиг рамки считывания?

2-аминопурин и 5бромурацил

примеры

профлавин и акридин

есть реверсия

способность к реверсии в дикий тип под действием 2-аминопурина

нет реверсии

Профлавин-индуцируемые мутации Мутагены Аналоги нуклеиновых оснований

Интеркалирующие красители

замещение отдельных оснований

эффект

сдвиг рамки считывания

2-аминопурин и 5бромурацил

примеры

профлавин и акридин

есть реверсия

способность к реверсии в дикий тип под действием 2-аминопурина

нет реверсии

Крик и Бреннер предположили, что профлавин вызывает включение (инсерцию) или удаление (делецию) одной нуклеотидной пары из последовательности ДНК. Последующие эксперименты подтвердили эту гипотезу и позволили сделать очень важные выводы о природе генетического кода.

•

В группе Крика и Бреннера была изучена индуцированная профлавином rIIмутация, обозначенная ими как FC0.

•

Эта мутация картируется в В-цистроне недалеко от границы с А-цистроном.

•

• •

При росте FC0-мутанта на Е. coli В с низкой частотой возникают спонтанные ревертанты, которые обнаруживаются по образованию колоний на рестриктивном хозяине Е. coli К. Скрещивание 1: Родители: rII<<+>> Х rII+ Потомство: rII+, rIIа и rIIb Т.О. большинство таких «ревертантов» не являются истинными – псевдоревертанты.

•

Дочерние rII-мутанты, возникающие при скрещивании 1 расщепляются на два класса - rIIа и rIIb. • Скрещивание 2: Родители: rIIa Х rIIFC0 Потомство: отсутствие rII+ -ревертантов. • Скрещивание 3: Родители: rIIb Х rIIFC0 Потомство: образование rII+ -ревертантов. Т.О. мутанты rIIа – являются собственно мутантами FC0, а мутанты rIIbпредставляет собой новый класс мутаций, которые мы будем называть FC1. Следовательно, псевдоревертанты rII<<+>> являются не истинными ревертантами, а двойными мутантами типа FC0 FC1, имеющими дикий фенотип.

•

Аналогичным образом исследовали поведение новых rII-мутаций FC1. . Рост мутантов FC1 на пермиссивном хозяине Е.coli В

•

Аналогичным образом исследовали поведение новых rII-мутаций FC1. . Рост мутантов FC1 на пермиссивном хозяине Е.coli В

Спонтанно или под действием профлавина

Получение псевдоревертантов к дикому типу

•

Аналогичным образом исследовали поведение новых rII-мутаций FC1. . Рост мутантов FC1 на пермиссивном хозяине Е.coli В

Спонтанно или под действием профлавина

Получение псевдоревертантов к дикому типу

Отбор псевдоревертантов на непермиссивном хозяине Е.coli К

•

Аналогичным образом исследовали поведение новых rII-мутаций FC1. . Рост мутантов FC1 на пермиссивном хозяине Е.coli В

Спонтанно или под действием профлавина

Получение псевдоревертантов к дикому типу

Отбор псевдоревертантов на непермиссивном хозяине Е.coli К

Получение расщепления в потомстве от скрещивания псевдоревертантов и фага дикого типа

•

Аналогичным образом исследовали поведение новых rII-мутаций FC1. . Рост мутантов FC1 на пермиссивном хозяине Е.coli В

Спонтанно или под действием профлавина

Получение псевдоревертантов к дикому типу

Отбор псевдоревертантов на непермиссивном хозяине Е.coli К

Анализ расщепления и отбор новых мутантов

Получение расщепления в потомстве от скрещивания псевдоревертантов и фага дикого типа

•

Аналогичным образом исследовали поведение новых rII-мутаций FC1. . Рост мутантов FC1 на пермиссивном хозяине Е.coli В

Спонтанно или под действием профлавина

Получение псевдоревертантов к дикому типу

Отбор псевдоревертантов на непермиссивном хозяине Е.coli К

Анализ расщепления и отбор новых мутантов

Получение расщепления в потомстве от скрещивания псевдоревертантов и фага дикого типа

•

Аналогичным образом исследовали поведение новых rII-мутаций FC1. . Рост мутантов FC1 на пермиссивном хозяине Е.coli В

Спонтанно или под действием профлавина

Получение псевдоревертантов к дикому типу

FC(N)

Отбор псевдоревертантов на непермиссивном хозяине Е.coli К

Анализ расщепления и отбор новых мутантов

Получение расщепления в потомстве от скрещивания псевдоревертантов и фага дикого типа

•

Аналогичным образом исследовали поведение новых rII-мутаций FC1. . Рост мутантов FC1 на пермиссивном хозяине Е.coli В

Спонтанно или под действием профлавина

Получение псевдоревертантов к дикому типу

FC(N)

Отбор псевдоревертантов на непермиссивном хозяине Е.coli К

FC(N)FC(N+1)

Анализ расщепления и отбор новых мутантов

Получение расщепления в потомстве от скрещивания псевдоревертантов и фага дикого типа

•

Аналогичным образом исследовали поведение новых rII-мутаций FC1. . Рост мутантов FC1 на пермиссивном хозяине Е.coli В

Спонтанно или под действием профлавина

Получение псевдоревертантов к дикому типу

FC(N)

Отбор псевдоревертантов на непермиссивном хозяине Е.coli К

FC(N)FC(N+1) FC(N) Анализ расщепления и отбор новых мутантов

FC(N+1) rII+

Получение расщепления в потомстве от скрещивания псевдоревертантов и фага дикого типа

•

Аналогичным образом исследовали поведение новых rII-мутаций FC1. . Рост мутантов FC1 на пермиссивном хозяине Е.coli В

Спонтанно или под действием профлавина

Получение псевдоревертантов к дикому типу

FC(N)

Отбор псевдоревертантов на непермиссивном хозяине Е.coli К

FC(N)FC(N+1) FC(N+1) Анализ расщепления и отбор новых мутантов

FC(N) FC(N+1) rII+

Получение расщепления в потомстве от скрещивания псевдоревертантов и фага дикого типа

• • •

Многократно повторив аналогичные серии опытов, Крик и Бреннер получили целый ряд rII-мутантов этого типа: FC3, FC4, FC5 и т.д. Каждая мутация FC(N) способна к взаимной внутригенной супрессии с мутациями FC(N-1) и FC(N+1). Рекомбинация между различными мутантами в серии FC позволяет получить различные варианты двойных мутантов.

• • •

Многократно повторив аналогичные серии опытов, Крик и Бреннер получили целый ряд rII-мутантов этого типа: FC3, FC4, FC5 и т.д. Каждая мутация FC(N) способна к взаимной внутригенной супрессии с мутациями FC(N-1) и FC(N+1). Рекомбинация между различными мутантами в серии FC позволяет получить различные варианты двойных мутантов.

Выводы: • •

Комбинация двух мутаций - одной четной и одной нечетной приводит к проявлению дикого фенотипа (взаимная супрессия). Комбинация пары четных или пары нечетных мутаций дает мутантный фенотип (отсутствие супрессии).

Тройные rII-мутанты

Выводы: • •

Комбинация трех четных или трех нечетных мутаций приводит к проявлению дикого фенотипа. Комбинации из одной четной и двух нечетных или одной нечетной и двух четных мутаций приводит к проявлению мутантного фенотипа.

Тройные rII-мутанты

Выводы: • •

Комбинация трех четных или трех нечетных мутаций приводит к проявлению дикого фенотипа. Комбинации из одной четной и двух нечетных или одной нечетной и двух четных мутаций приводит к проявлению мутантного фенотипа. Т.О. обнаружен факт, что три мутации, каждая из которых в паре с любой из двух других мутаций не приводит к взаимной супрессии, присутствуя одновременно в виде тройной комбинации, проявляют способность к внутригенной супрессии.

Для объяснения полученных результатов были выдвинуты следующие предположения: •

Исходная мутация FC0 представляет собой делецию или вставку одной нуклеотидной пары. Внутригенная супрессия FC0 достигается при включении одной дополнительной нуклеотидной пары (если FC0-делеция) или при делеции одной нуклеотидной пары (если FC0-вставка).

Для объяснения полученных результатов были выдвинуты следующие предположения: •

Исходная мутация FC0 представляет собой делецию или вставку одной нуклеотидной пары. Внутригенная супрессия FC0 достигается при включении одной дополнительной нуклеотидной пары (если FC0-делеция) или при делеции одной нуклеотидной пары (если FC0-вставка).

•

Считывание нуклеотидной последовательности при трансляции кода начинается в фиксированной точке гена и идет последовательно кодон за кодоном. Поэтому удаление или включение одной нуклеотидной пары автоматически приводит к сдвигу рамки считывания. При этом последующие нуклеотиды включаются в состав кодонов с измененным за счет сдвига смысловым значением. Это означает, что между кодонами нет «знаков препинания».

Для объяснения полученных результатов были выдвинуты следующие предположения: •

Исходная мутация FC0 представляет собой делецию или вставку одной нуклеотидной пары. Внутригенная супрессия FC0 достигается при включении одной дополнительной нуклеотидной пары (если FC0-делеция) или при делеции одной нуклеотидной пары (если FC0-вставка).

•

Считывание нуклеотидной последовательности при трансляции кода начинается в фиксированной точке гена и идет последовательно кодон за кодоном. Поэтому удаление или включение одной нуклеотидной пары автоматически приводит к сдвигу рамки считывания. При этом последующие нуклеотиды включаются в состав кодонов с измененным за счет сдвига смысловым значением. Это означает, что между кодонами нет «знаков препинания».

•

При синтезе полипептидов основания считываются тройками, т. е. кодоны имеют триплетную природу.

Для объяснения полученных результатов были выдвинуты следующие предположения: •

Исходная мутация FC0 представляет собой делецию или вставку одной нуклеотидной пары. Внутригенная супрессия FC0 достигается при включении одной дополнительной нуклеотидной пары (если FC0-делеция) или при делеции одной нуклеотидной пары (если FC0-вставка).

•

Считывание нуклеотидной последовательности при трансляции кода начинается в фиксированной точке гена и идет последовательно кодон за кодоном. Поэтому удаление или включение одной нуклеотидной пары автоматически приводит к сдвигу рамки считывания. При этом последующие нуклеотиды включаются в состав кодонов с измененным за счет сдвига смысловым значением. Это означает, что между кодонами нет «знаков препинания».

•

При синтезе полипептидов основания считываются тройками, т. е. кодоны имеют триплетную природу.

•

Все или большая часть из 64 возможных триплетов кодируют какуюнибудь аминокислоту, то есть код является вырожденным (более одного триплета кодируют одну и ту же аминокислоту).

•

В группе Крика и Бреннера была изучена индуцированная профлавином rIIмутация, обозначенная ими как FC0.

•

Эта мутация картируется в В-цистроне недалеко от границы с А-цистроном.

•

Пусть участку В-цистрона, где картируется мутация FC0 и супрессирующие ее мутации, соответствует следующий фрагмент некоторой гипотетической последовательности мРНК:

Дикий тип

CAU CAU CAU CAU CAU CAU CAU CAU CAU CAU CAU CAU CAU His – His – His – His – His – His – His – His – His – His – His – His – His

•

В группе Крика и Бреннера была изучена индуцированная профлавином rIIмутация, обозначенная ими как FC0.

•

Эта мутация картируется в В-цистроне недалеко от границы с А-цистроном.

•

Пусть участку В-цистрона, где картируется мутация FC0 и супрессирующие ее мутации, соответствует следующий фрагмент некоторой гипотетической последовательности мРНК:

Дикий тип

CAU CAU CAU CAU CAU CAU CAU CAU CAU CAU CAU CAU CAU His – His – His – His – His – His – His – His – His – His – His – His – His Допустим, что мутация FC0, индуцированная действием профлавина, приводит к делеции А во втором кодоне:

Дикий тип

CAU CAU CAU CAU CAU CAU CAU CAU CAU CAU CAU CAU CAU

Мутация FC0

CAU CUC AUC AUC AUC AUC AUC AUC AUC AUC AUC AUC AUC His – Leu – Ile – Ile – Ile – Ile – Ile – Ile – Ile – Ile – Ile – Ile – Ile

•

• •

При росте FC0-мутанта на Е. coli В с низкой частотой возникают спонтанные ревертанты, которые обнаруживаются по образованию колоний на рестриктивном хозяине Е. coli К. Скрещивание 1: Родители: rII<<+>> Х rII+ Потомство: rII+, rIIа и rIIb Т.О. большинство таких «ревертантов» не являются истинными – псевдоревертанты. Реверсия мутации FC0 к дикому фенотипу возможна если недалеко от делеции спонтанно или под действием профлавина произойдет вставка дополнительного нуклеотида, например U:

Дикий тип

CAU CAU CAU CAU CAU CAU CAU CAU CAU CAU CAU CAU CAU

Мутация FC0

CAU CUC AUC AUC AUC AUC AUC AUC AUC AUC AUC AUC AUC

Ревертант

CAU CUC AUC AUU CAU CAU CAU CAU CAU CAU CAU CAU CAU His – Leu – Ile – Ile – His – His – His – His – His – His – His – His – His

•

Дочерние rII-мутанты, возникающие при скрещивании 1 расщепляются на два класса - rIIа и rIIb. • Скрещивание 2: Родители: rIIa Х rIIFC0 Потомство: отсутствие rII+ -ревертантов. • Скрещивание 3: Родители: rIIb Х rIIFC0 Потомство: образование rII+ -ревертантов. Т.О. мутанты rIIа – являются собственно мутантами FC0, а мутанты rIIbпредставляет собой новый класс мутаций, которые мы будем называть FC1. Следовательно, псевдоревертанты rII<<+>> являются не истинными ревертантами, а двойными мутантами типа FC0 FC1, имеющими дикий фенотип. Ревертант

CAU CUC AUC AUU CAU CAU CAU CAU CAU CAU CAU CAU CAU

Дикий тип

CAU CAU CAU CAU CAU CAU CAU CAU CAU CAU CAU CAU CAU

•

Дочерние rII-мутанты, возникающие при скрещивании 1 расщепляются на два класса - rIIа и rIIb. • Скрещивание 2: Родители: rIIa Х rIIFC0 Потомство: отсутствие rII+ -ревертантов. • Скрещивание 3: Родители: rIIb Х rIIFC0 Потомство: образование rII+ -ревертантов. Т.О. мутанты rIIа – являются собственно мутантами FC0, а мутанты rIIbпредставляет собой новый класс мутаций, которые мы будем называть FC1. Следовательно, псевдоревертанты rII<<+>> являются не истинными ревертантами, а двойными мутантами типа FC0 FC1, имеющими дикий фенотип. Ревертант

CAU CUC AUC AUU CAU CAU CAU CAU CAU CAU CAU CAU CAU РЕКОМБИНАЦИЯ

Дикий тип

CAU CAU CAU CAU CAU CAU CAU CAU CAU CAU CAU CAU CAU

Мутация FC0

CAU CUC AUC AUC AUC AUC AUC AUC AUC AUC AUC AUC AUC

Мутация FC1

CAU CAU CAU CAU UCA UCA UCA UCA UCA UCA UCA UCA UCA His – His – His – His – Ser – Ser – Ser – Ser – Ser – Ser – Ser – Ser – Ser

Тройные rII-мутанты

Выводы: • Комбинация трех четных или трех нечетных мутаций приводит к проявлению дикого фенотипа. • Комбинации из одной четной и двух нечетных или одной нечетной и двух четных мутаций приводит к проявлению мутантного фенотипа.

При сочетании трех нуклеотидных делеций или трех вставок на достаточно близком расстоянии друг от друга рамка считывания остается неизменной практически для всей матрицы. Например, делеция второго, третьего и четвертого А приводит к следующей структуре мРНК: Дикий тип

CAU CAU CAU CAU CAU CAU CAU CAU CAU CAU CAU CAU CAU

Тройной мутант

CAU CUC UCU CAU CAU CAU CAU CAU CAU CAU CAU CAU CAU His –Leu – Ser – His – His – His – His – His – His – His – His – His – His

•

Цель: Доказательство гипотезы, о том что элементарной единицей в составе нуклеиновой кислоты, принимающей участие в кодировании одной аминокислоты в последовательности белка, является триплет нуклеотидов.

•

Объект исследования: rII-мутанты бактериофага Т4.

•

Мутаген для получения rII-мутантов: профлавин.

•

Способ доказательства: исследование фенотипов двойных и тройных rII-мутантов бактериофага Т4.

Для объяснения полученных результатов были выдвинуты следующие предположения: •

Исходная мутация FC0 представляет собой делецию или вставку одной нуклеотидной пары. Внутригенная супрессия FC0 достигается при включении одной дополнительной нуклеотидной пары (если FC0-делеция) или при делеции одной нуклеотидной пары (если FC0-вставка).

•

Считывание нуклеотидной последовательности при трансляции кода начинается в фиксированной точке гена и идет последовательно кодон за кодоном. Поэтому удаление или включение одной нуклеотидной пары автоматически приводит к сдвигу рамки считывания. При этом последующие нуклеотиды включаются в состав кодонов с измененным за счет сдвига смысловым значением. Это означает, что между кодонами нет «знаков препинания».

•

При синтезе полипептидов основания считываются тройками, т. е. кодоны имеют триплетную природу.

•

Все или большая часть из 64 возможных триплетов кодируют какуюнибудь аминокислоту, то есть код является вырожденным (более одного триплета кодируют одну и ту же аминокислоту).