Для сигнал-специфичного связывания и транспорта необходим белковый комплекс Вайдман Бриджит, Сакаи Хидеаки, Дэвис Терри и Вайдман Мартин
Nature, 1994, Vol. 370, 11th August, p. 434-440
Ключевые слова NAC
(nascent-polypeptide-associated complex) SRP (signal recognition particles) Signal peptide Nascent chain Cytosol-depleted Ribosome-associated nascent polypeptide
Методы Система
трансляции in vitro у эукариот Получение стабильных комплексов рибосома - растущий полипептид Обнаружение связывания растущего полипептида с NAC и SRP Различение сигнал-специфичного и неспецифичного связывания Локализация NAC относительно рибосомы Обнаружение транспорта в ЭР
Система трансляции in vitro у эукариот Использует
очищенные от мембранных органелл клеточные экстракты, обогащённые тРНК, рибосомами, аминокислотами и факторами трансляции
В
данной работе использована система wheat-germ – экстракт из зародышей пшеницы
Получение стабильных комплексов рибосома - растущий полипептид сДНК,
кодирующая необходимый белок (урезанный с С-конца до нужного размера и без стоп-кодона) встраивалась в плазмиду и транскрибировалась РНКполимеразой E. coli Данный транскрипт транслировался в бесклеточной системе экстракта зародышей пшеницы
Различение сигнал-специфичного и неспецифичного связывания fffLuc – пероксисомальная люцифераза pF1β – пре β субъединица митохондриальной АТФазы САТ – хлорамфеникол ацетилтрансфераза pCOXIV – пре 4 субъединица митохондриальной цитохромоксидазы pPL – бычий пре-пролактин pPl-M – не переносящийся SRP мутант препролактина Opsin *Цифра вначале показывает длину полипептида
Обнаружение связывания растущего полипептида с NAC и SRP Вместо
лизина использовалось фотоактивируемое производное лизина с TDBA (3-фторметилдиазирин-4 –бензоат) – при освещении ковалентно пришивается к субстрату за счёт образования карбенов (время полужизни 1 нс). Молекулярную массу связанного комплекса (и его наличие) определяли на денатурирующем форезе в полиакриламидном геле.
Механизм
Локализация NAC относительно рибосомы Экстракция
NAC ацетатом калия из комплекса с растущим полипептидом – – –
L - 150mM M – 250mM H – 500mM
Обработка
пуромицином для отделения растущего полипептида от рибосомы
Обнаружение транспорта в ЭР
При –
–
добавлении фракции ЭР
Появление полосы, соответствующей гликозилированному производному используемых пептидов Появление устойчивости к протеиназе К
Что связывается с комплексом растущий пептид-рибосома? Несколько белков экстракта, но больше всего – белок с массой около 33К
* - флуоресцирующий продукт массой от массы полипептида до 33К hxv – была ли фотоактивация
Является ли этот белок коровым белком рибосомы?
Является ли этот белок коровым белком рибосомы? Нет,
так как экстрагируется 500mM ацетатом калия
Образование
комплекса с растущим полипептидом полностью обратимо, так как восстанавливается при добавлении 3х разных бесклеточных экстрактов (зародышей пшеницы, мозга коровы и сабачьей поджелудочной железы)
Выделе ние и очистка NAC
Выделение и очистка NAC Обнаружено –
–
2 белка
α субъединица – 33К. В человеческом геноме обнаружен в виде 3-х перекрывающихся фрагментов. β субъединица – 21К. В человеческом геноме соответствует BTF3b – белку с неизвестной функцией
NAC
представляет собой гетеродимер этих белков
NAC предотвращает ошибочное связывание SRP с пептидом
NAC предотвращает ошибочное связывание SRP с пептидом
NAC предотвращает ошибочное связывание SRP с пептидом
NAC предотвращает ошибочное связывание SRP с пептидом и его транспорт в ЭР
NAC предотвращает ошибочное связывание SRP с пептидом и его транспорт в ЭР