Article 23 Presentation

  • November 2019
  • PDF

This document was uploaded by user and they confirmed that they have the permission to share it. If you are author or own the copyright of this book, please report to us by using this DMCA report form. Report DMCA


Overview

Download & View Article 23 Presentation as PDF for free.

More details

  • Words: 492
  • Pages: 23
Для сигнал-специфичного связывания и транспорта необходим белковый комплекс Вайдман Бриджит, Сакаи Хидеаки, Дэвис Терри и Вайдман Мартин

Nature, 1994, Vol. 370, 11th August, p. 434-440

Ключевые слова  NAC

(nascent-polypeptide-associated complex)  SRP (signal recognition particles)  Signal peptide  Nascent chain  Cytosol-depleted  Ribosome-associated nascent polypeptide

Методы  Система

трансляции in vitro у эукариот  Получение стабильных комплексов рибосома - растущий полипептид  Обнаружение связывания растущего полипептида с NAC и SRP  Различение сигнал-специфичного и неспецифичного связывания  Локализация NAC относительно рибосомы  Обнаружение транспорта в ЭР

Система трансляции in vitro у эукариот  Использует

очищенные от мембранных органелл клеточные экстракты, обогащённые тРНК, рибосомами, аминокислотами и факторами трансляции

В

данной работе использована система wheat-germ – экстракт из зародышей пшеницы

Получение стабильных комплексов рибосома - растущий полипептид  сДНК,

кодирующая необходимый белок (урезанный с С-конца до нужного размера и без стоп-кодона) встраивалась в плазмиду и транскрибировалась РНКполимеразой E. coli  Данный транскрипт транслировался в бесклеточной системе экстракта зародышей пшеницы

Различение сигнал-специфичного и неспецифичного связывания fffLuc – пероксисомальная люцифераза  pF1β – пре β субъединица митохондриальной АТФазы  САТ – хлорамфеникол ацетилтрансфераза  pCOXIV – пре 4 субъединица митохондриальной цитохромоксидазы  pPL – бычий пре-пролактин  pPl-M – не переносящийся SRP мутант препролактина  Opsin *Цифра вначале показывает длину полипептида 

Обнаружение связывания растущего полипептида с NAC и SRP  Вместо

лизина использовалось фотоактивируемое производное лизина с TDBA (3-фторметилдиазирин-4 –бензоат) – при освещении ковалентно пришивается к субстрату за счёт образования карбенов (время полужизни 1 нс). Молекулярную массу связанного комплекса (и его наличие) определяли на денатурирующем форезе в полиакриламидном геле.

Механизм

Локализация NAC относительно рибосомы  Экстракция

NAC ацетатом калия из комплекса с растущим полипептидом – – –

L - 150mM M – 250mM H – 500mM

 Обработка

пуромицином для отделения растущего полипептида от рибосомы

Обнаружение транспорта в ЭР

 При –



добавлении фракции ЭР

Появление полосы, соответствующей гликозилированному производному используемых пептидов Появление устойчивости к протеиназе К

Что связывается с комплексом растущий пептид-рибосома? Несколько белков экстракта, но больше всего – белок с массой около 33К

* - флуоресцирующий продукт массой от массы полипептида до 33К hxv – была ли фотоактивация

Является ли этот белок коровым белком рибосомы?

Является ли этот белок коровым белком рибосомы?  Нет,

так как экстрагируется 500mM ацетатом калия

 Образование

комплекса с растущим полипептидом полностью обратимо, так как восстанавливается при добавлении 3х разных бесклеточных экстрактов (зародышей пшеницы, мозга коровы и сабачьей поджелудочной железы)

Выделе ние и очистка NAC

Выделение и очистка NAC  Обнаружено –



2 белка

α субъединица – 33К. В человеческом геноме обнаружен в виде 3-х перекрывающихся фрагментов. β субъединица – 21К. В человеческом геноме соответствует BTF3b – белку с неизвестной функцией

 NAC

представляет собой гетеродимер этих белков

NAC предотвращает ошибочное связывание SRP с пептидом

NAC предотвращает ошибочное связывание SRP с пептидом

NAC предотвращает ошибочное связывание SRP с пептидом

NAC предотвращает ошибочное связывание SRP с пептидом и его транспорт в ЭР

NAC предотвращает ошибочное связывание SRP с пептидом и его транспорт в ЭР

Related Documents

Article 23 Presentation
November 2019 10
Article 23
May 2020 10
Article 23
May 2020 14
Presentation 23
June 2020 1
Article 24 Presentation
November 2019 19