Article 23 Presentation

Для сигнал-специфичного связывания и транспорта необходим белковый комплекс Вайдман Бриджит, Сакаи Хидеаки, Дэвис Терри и Вайдман Мартин

Nature, 1994, Vol. 370, 11th August, p. 434-440

Ключевые слова  NAC

(nascent-polypeptide-associated complex)  SRP (signal recognition particles)  Signal peptide  Nascent chain  Cytosol-depleted  Ribosome-associated nascent polypeptide

Методы  Система

трансляции in vitro у эукариот  Получение стабильных комплексов рибосома - растущий полипептид  Обнаружение связывания растущего полипептида с NAC и SRP  Различение сигнал-специфичного и неспецифичного связывания  Локализация NAC относительно рибосомы  Обнаружение транспорта в ЭР

Система трансляции in vitro у эукариот  Использует

очищенные от мембранных органелл клеточные экстракты, обогащённые тРНК, рибосомами, аминокислотами и факторами трансляции

В

данной работе использована система wheat-germ – экстракт из зародышей пшеницы

Получение стабильных комплексов рибосома - растущий полипептид  сДНК,

кодирующая необходимый белок (урезанный с С-конца до нужного размера и без стоп-кодона) встраивалась в плазмиду и транскрибировалась РНКполимеразой E. coli  Данный транскрипт транслировался в бесклеточной системе экстракта зародышей пшеницы

Различение сигнал-специфичного и неспецифичного связывания fffLuc – пероксисомальная люцифераза  pF1β – пре β субъединица митохондриальной АТФазы  САТ – хлорамфеникол ацетилтрансфераза  pCOXIV – пре 4 субъединица митохондриальной цитохромоксидазы  pPL – бычий пре-пролактин  pPl-M – не переносящийся SRP мутант препролактина  Opsin *Цифра вначале показывает длину полипептида 

Обнаружение связывания растущего полипептида с NAC и SRP  Вместо

лизина использовалось фотоактивируемое производное лизина с TDBA (3-фторметилдиазирин-4 –бензоат) – при освещении ковалентно пришивается к субстрату за счёт образования карбенов (время полужизни 1 нс). Молекулярную массу связанного комплекса (и его наличие) определяли на денатурирующем форезе в полиакриламидном геле.

Механизм

Локализация NAC относительно рибосомы  Экстракция

NAC ацетатом калия из комплекса с растущим полипептидом – – –

L - 150mM M – 250mM H – 500mM

 Обработка

пуромицином для отделения растущего полипептида от рибосомы

Обнаружение транспорта в ЭР

 При –

–

добавлении фракции ЭР

Появление полосы, соответствующей гликозилированному производному используемых пептидов Появление устойчивости к протеиназе К

Что связывается с комплексом растущий пептид-рибосома? Несколько белков экстракта, но больше всего – белок с массой около 33К

* - флуоресцирующий продукт массой от массы полипептида до 33К hxv – была ли фотоактивация

Является ли этот белок коровым белком рибосомы?

Является ли этот белок коровым белком рибосомы?  Нет,

так как экстрагируется 500mM ацетатом калия

 Образование

комплекса с растущим полипептидом полностью обратимо, так как восстанавливается при добавлении 3х разных бесклеточных экстрактов (зародышей пшеницы, мозга коровы и сабачьей поджелудочной железы)

Выделе ние и очистка NAC

Выделение и очистка NAC  Обнаружено –

–

2 белка

α субъединица – 33К. В человеческом геноме обнаружен в виде 3-х перекрывающихся фрагментов. β субъединица – 21К. В человеческом геноме соответствует BTF3b – белку с неизвестной функцией

 NAC

представляет собой гетеродимер этих белков

NAC предотвращает ошибочное связывание SRP с пептидом

NAC предотвращает ошибочное связывание SRP с пептидом

NAC предотвращает ошибочное связывание SRP с пептидом

NAC предотвращает ошибочное связывание SRP с пептидом и его транспорт в ЭР

NAC предотвращает ошибочное связывание SRP с пептидом и его транспорт в ЭР