Achr Univ 2006-comp

Мышечные и нейрональные никотиновые ацетилхолиновые рецепторы : от электрического ската Torpedo до пресноводной улитки Lymnaea за 30 лет.

Идентификация и выделение рецепторов и ионных каналов с помощью нейротоксинов ____________________________________________________________________________________________ рецептор/канал

токсин

____________________________________________________________________________________________ никотиновый холинорецептор

α-нейротоксины змей

Na+-канал

нейротоксины скорпиона

К+-канал

апамин (нейротоксин из яда пчелы)

рецептор глицина

стрихнин

Cа2+-каналы

ω-конотоксин (нейротоксин из яда ракушек Conus)

____________________________________________________________________________________________ ___

План лекции –

АХР ската: прообраз всех никотиновых холинорецепторов и ряда других лиганд-управляемых каналов.

–

пространственная структура рецептора Torpedo: 1981-2001 гг. (до установления кристаллической структуры ацетилхолин-связывающего белка).

–

мышечные, нейрональные и «прочие» холинорецепторы; разнообразие комбинаций субъединиц и функции различных подтипов рецепторов.

–

заболевания, связанные с нарушением функций холинорецепторов.

–

структура и функции доменов холинорецепторов.

– 2001 г.: открытие ацетилхолин-связывающего белка и установление его кристаллической структуры; построение моделей лиганд-связывающих доменов холинорецепторов улучшение разрешения электронной микроскопии рецептора Torpedo.

Схема межнейронных и нервно-мышечных синапсов.

Межнейронный синапс

Электрический синапс. Проходят ионные токи и низкомолекулярные соединения (ATP, вторичные мессенджеры)

Нервно-мышечный синапс

Общая форма молекулы ацетилхолинового рецептора из электрического органа ската Torpedo californica по данным электронной микроскопии

R.Stroud et al., 1981

Основные этапы исследования никотиновых ацетилхолиновых рецепторов 1940 (D.Nachmanson) : Установление холинергической природы ответа электрического органа ската Torpedo 1957 ( (B.Katz, S.Thesleff): Использование микроэлектродных методик и доказательство кооперативности в активации рецептора ацетилхолином 1975-1978 : Исследование «доза-ответ» для ацетилхолиновых рецепторов методом пэтч-клэмпа 1972-1974 (J.-P.Changeux) :Выделение рецептора с помощью аффинной хроматографии на нейротоксинах змей 1978 (A.Karlin): Определение молекулярной массы (250 kDa) и субъединичного состава (α2βγδ) 1980 (M.Raftery) : Определение N-концевых последовательностей субъединиц 1981 ( R.Stroud) : Установление общей формы рецептора Torpedo с помощью электронной микроскопии 1978-1985 (A.Karlin, J.-P.Changeux) : Аффинные модификации 1982 (S.Numa): Клонирование субъединиц, модель топологии (М1-M4) 1986-1987 (F.Hucho, J.-P.Changeux) : Идентификация остатков, связывающих блокаторы канала, модель организации канала из MII спиралей

Модель структуры ацетилхолинового рецептора Torpedo

Никотиновые ацетилхолиновые рецепторы Рецепторы мышечного типа из электроцитов Torpedo

α 2βγδ

из мышц млекопитающих эмбриональная форма зрелая форма

cвязывают α-бунгаротоксин и другие нейротоксины змей, блокируются α-конотоксинами G1 и M1

α 2βγδ α 2βεδ

Нейрональные рецепторы

(α 2-10)x(β2-4)y

связывают ‘нейрональные” бунгаротоксины, α-конотоксин MII

x +y =5

(α7)5

связывают α- бунгаротоксин, α-конотоксин ImI

(α8)5 , (α9)5 Проблемы: мышечные дистрофии, нейродегенеративные заболевания, никотиновая зависимость, создание новых инсектицидов

Модели структурной организации гетеромерных и олигомерных нейрональных никотиновых ацетилхолиновых рецепторов

Субъединичная структура никотиновых рецепторов

Химерный никотиновый-серотониновый рецептор, сочетающий лиганд-связывающие свойства и канальные характеристики этих рецепторов. Eisele JL, Bertrand S, Galzi JL, Devillers-Thiery A, Changeux JP, Bertrand D. (1993) Nature 366,479-83

Мутации в канальной части нейронального никотинового рецептора превращают катионную ионную селективность в анионную. Galzi JL, Devillers-Thiery A, Hussy N, Bertrand S, Changeux JP, Bertrand D 1992. Nature 359,500-505

Локализация генов субъединиц никотиновых рецепторов на хромосомах

Никотиновые ацетилхолиновые рецепторы Мышечные рецепторы 1. Миастения (myasthenia gravis): аутоантитела гл.обр. против области 67-76 лиганд– связывающего домена α-субъединицы 2. Конгенитальные миастенические синдромы («каналопатии»): мутации в канальной части рецептора.

Нейрональные рецепторы 1. Эпилепсия : (autosomal dominant nocturnal frontal lobe epilepsy, ADNFLE) - мутация Ser248Phe или вставка Leu259 в α4 АХР. 2. Повышенная реакция на звуковые сигналы (auditory gating deficit): уменьшение содержания α7 АХР 3. Болезнь Альцгеймера: нарушение холинергической передачи и когниционных способностей, уменьшение числа никотинсвязывающих центров; непосредственное взаимодействие α7 АХР с β-амилоидным пептидом, активация МАРК каскада 4. Болезнь Паркинсона: утрата дофаминовых нейронов и никотин-связывающих центров 5. Никотиновая зависимость: индуцирование никотином увеличения содержания определенных подтипов АХР и их десенситизация 6. Боль: поиск новых избирательных агонистов АХР; разработка анальгетиков: агонистов α4β2 АХР (Abbot) и α7 селективных агонистов (TS21, Taiho Pharmaceuticals)

Мышечные никотиновые ацетилхолиновые рецепторы • Миастения (myasthenia gravis): аутоиммунное заболевание: антитела против AChR способствуют деградации рецепторов. MIR (main immunogenic region) –а.к. остатки 67-76 (главная иммуногенная область) Диагностика: ИФА с использованием радиоактивных токсинов. Домен 1-210, экспрессированный в E.coli: диагностика и лечение интраназальное введение).

(пероральное и

AMC (arthrogryposis multiple congenita) – у матери антитела против AChR плода (т.е. антитела против α/γ участков рецепторов).

• «Каналопатии» (channelopathies, congenital myathenic syndromes): мутации в самих ацетилхолиновых рецепторах вызывают нарушения мышечной деятельности

Мутации в холинорецепторах при миастении и эпилепсии

Электронная микроскопия комплекса рецептора Torpedo с антителами против MIR (главной иммуногенной области)

Beroukhim & Unwin (1995) Neuron 15, 323-331

Мутации в нейрональных AChRs и психические заболевания •ADNFLE – autosomal dominant nocturnal frontal lobe epilepsy Мутации в α4

AChR:

- Ser248 Phe – ускорение десенситизации и замедление ре-сенситизации - Инсерция Leu259 (снижение проницаемости для Са2+) Механизм действия: снижение скорости выброса ингибирующих трансмиттеров?

•Шизофрения (auditory gating deficit): уменьшение содержания α7 AChR.

Нейрональные никотиновые ацетилхолиновые рецепторы в норме и при патологиях Knockout отдельных субъединиц у мышей: α3 -/-

дефекты нервной системы, летальна 1-7 дней постнатально

α4 -/-

утрата способности связывать никотин и эпибатидин; снижение чувствительности к антиболевому действию никотина

α7 -/- исчезновение быстро десенситизирующихся никотиновых токов в гиппокампе, поведенческие реакции не изменяются β2 -/- утрата высокоаффинных центров связывания никотина и ухудшение способности к обучению β3 -/- утрата чувствительности к α-конотоксину MII, ингибирующему стимулируемое никотином высвобождение

дофамина, увеличение

локомоторной подвижности β4 -/- уменьшение вызываемых никотином токов β2 и β 4 -/- дефекты нервной системы, летальна 1-3 недели постнатально

Вызываемое никотином увеличение числа никотиновых рецепторов • Увеличение числа центров связывания никотина и/или α-бунгаротоксина. • Различие этого эффекта для разных подтипов АХР: α4β2 - наиболее сильная положительная регуляция (ингибирование при хроническом воздействии) α7 - положительная регуляция α3β2 - не ингибируются при хроническом действии • Быстрая десенситизация (уцелеет только α3) • Возможность необратимой инактивации рецепторов

Разноообразие нейрональных никотиновых ацетилхолиновых рецепторов. •

Постсинаптические

•

Пресинаптические: являются кальциевыми каналами, способствуют выбросу везикул с нейромедиаторами.

•

Существует популяция пресинаптических α7 холинорецепторов, для которых медиатором служит холин.

•

Нейрональные или «нейрональноподобные» ацетилхолиновые рецепторы присутствуют и в других тканях:в кератиноцитах кожи, эпителиальных клетках, в клетках карциномы легких

Структурно-функциональные исследовния изолированных доменов ацетилхолинового рецептора

“Reductionist approach” in structural studies on acetylcholine receptor Removal of the extramembrane domains

PAGE/HPLC separation of individual subunits

Proteinase K

Goerne-Tschelnokov et al (1994) EMBO J. 13, 338-341

Peptide synthesis and NMR

M3

Heterologous expression C

1 M1

Lugovskoy et al. (1998) Eur.J.Biol. 255, 455-461

M2

M3

M4

Kasheverov et al. (1998) Protein Expression and Purification 12, 226-232.

Alexeev et al. (1998) Eur.J.Biochem. 259, 310-319

ЭМ домена АХР, собранного из доменов 1-210 α, β, γ и δ субъединиц, экспрессированных в клетках насекомых

M.L.Tierney and N. Unwin. (2000) J.Mol.Biol. 303, 185-196

Кривые КД белков , сборка которых проведена в разных условиях

Protein

Detergent content in refolding buffer

Concentration, mg/ml

Calculated secondary structure, % R α β

GST-α7(1-208)

-

0.20

43

12

45

-

0.10

44

27

29

0.1% SDS

0.16

29

36

35

monomeric form

0.0005% SDS

0.13

39

23

38

GST-α7m(1-208) (C116S mutant)

-

0.21

21

44

35

-

0.84

20

47

33

0.1% SDS

0.20

19

47

34

monomeric form

0.0005% SDS

0.12

29

40

31

GST

-

0.20

28

35

37

0.1% SDS

0.90

27

31

42

Tsetlin V., Dergousova N., Azeeva E., Kryukova E., Kudelina I., Shibanova E., Kasheverov I., Methfessel C. Eur .J. Biochem.264, 2801-9(2002)

2001: Выделение и установление кристаллической структуры пентаолигомера ацетилхолинсязывающего белка из пресноводной улитки

Ацетилхолин-связывающий белок из глии L.stagnalis модулирует нейропередачу. A.B.Smit et al. (2001) Nature 411, 261-268

Кристаллическая структура ацетилхолин-связывающего белка как модель лиганд-связывающих доменов. K.Brejc et al (2001) Nature 411, 269-276

Замещение гидрофобной цистиновой петли 128-145 в α7 АХР на гидрофильную петлю из АХСБ и экспрессия в дрожжах приводят к растворимому олигомерному лиганд-связывающему домену

V.Avramopoulou, A.Mamalaki, S.J.Tsartos (2004) J.Biol.Chem. 279, 38287-38293.

Активация никотинового ацетилхолинового рецептора вызывает изменения в конформации α-субъединиц. N.Unwin et al. (2002). J.Mol.Biol.319, 1165-1176.

Miyazawa A, Fujiyoshi Y, Unwin N. (2003) Structure and gating mechanism of the acetylcholine receptor pore. Nature 424, 949-955.

Sine SM, Engel AG. Recent advances in Cys-loop receptor structure and function. Nature. 2006 ;440(7083):448-55. Review.

Unwin N. Refined structure of the nicotinic acetylcholine receptor at 4A resolution. J Mol Biol. 2005 ;346(4):96789.