2.- Manejo Y Cuidado Del Microscopio

PRÁCTICA # 2 “MANEJO Y CUIDADO DEL MICROSCOPIO” INTRODUCCIÓN: El microscopio es, sin lugar a dudas, el instrumento más importante en el laboratorio microbiológico. Se usa para aumentar el tamaño de la imagen aparente de los objetos, lo cuál hace posible ver los detalles estructurales de los microorganismos. Sus antecedentes más notables se remontan al s. XVII cuando Anthony Van Leewenhoek (Delft, Holanda, 1632 – 1723), reporta lo siguiente en una de las cartas que dirigió a la “British Royal Society” : “ En el año de 1675, descubrí criaturas vivientes en agua de lluvia que había permoneado sólo unos días en un recipiente… esto me invitó a observar más atentamente el agua, especialmente los pequeños animalejos que me parecían diez mil veces más pequeños que aquellos que pueden percibirse en el agua a simple vista”. Leewenhoek observó, entre otras cosas, bacterias y protozoarios en el agua de la lluvia, en infusiones diversas y en su sarro dental. Sus descripciones son, hasta la fecha excelentes y fácilmente reconocibles. El estudio microscópico de los organismos proporciona datos fundamentales para su identificación, como forma, tamaño, reacción a diferentes colorantes y estructuras celulares; orienta al microbiólogo cuando trata de aislar microorganismos y permite establecer características como pureza, presencia de contaminantes, variedad o edad de una población entre otras cosas. Por ello es tan importante saber utilizar este instrumento y desde luego, cuidarlo adecuadamente. Para ello, en esta practica se incluye la descripción de los componentes de un microscopio compuesto y las funciones de cada uno de ellos; asimismo. Se describen las características de las lentes amplificadoras y las condiciones en las que se puede utilizar cada objetivo, así como los pasos que se deben seguir para establecer una iluminación adecuada, el enfoque correcto y la forma precisa de manejar el microscopio.

OBJETIVOS: Mediante esta practica, el alumno lograra: ℘ ℘ ℘ ℘ ℘

identificar cada una de las partes de el microscopio iluminar correctamente el microscopio óptico de campo claro enfocar adecuadamente el microscopio en todos sus aumentos reportar correctamente las observaciones microscópicas cuidar esmeradamente el microscopio en todo momento, sobre todo, cuando lo utilice.

GENERALIDADES: En la actualidad existen dos tipos de microscopia, según la forma en que se amplifica la imagen:

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La microscopia óptica: en esta la imagen se amplifica sucesivamente por una seria de lentes. Este sistema permite obtener aumentos de 100 a 1000 diámetros y en algunos casos, hasta 2000 según el tipo de luz que se utilice y la forma de iluminar el objeto en estudio o preparación. Los microscopios ópticos pueden ser de campo claro, de campo oscuro, de contraste de fases, de fluorescencia y de ultravioleta. El de campo claro es el mas utilizado para el estudio microbiológico en general. La microscopia electrónica: es aquella en la cual la amplificación de la imagen se obtiene mediante un haz de electrones (que sustituye la luz) y un campo magnético (que hace las veces de lentes) produce imágenes con aumentos de 200000 a 400000 diámetros.

MICROSCOPIO ÓPTICO DE CAMPO CLARO: En la microscopia de campo claro, el campo microscópico o área observada esta brillantemente iluminada y los objetos en estudio aparecen más oscuros al fondo. Un microscopio óptico de fondo claro esta integrado por un sistema óptico que permite iluminar el objeto en estudio y amplificar su imagen, y un sistema mecánico que da soporte y movimiento a los componentes ópticos, explicado de manera muy concisa, el fundamento de su funcionamiento es el siguiente: la luz procedente de la lámpara y del condensador atraviesa la preparación (en la cual se encuentra el objeto en estudio) y permite que la primera lente (objetivo) forme una imagen aumentada de lo que hay en ella; antes de ser vista, esta imagen es amplificada nuevamente por otra lente (ocular). A continuación se describen brevemente las funciones de los componentes fundamentales del microscopio:

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° Base,

soporte y cuerpo del tubo, sirven para mantener en posición a todos los componentes del microscopio y son gruesos y fuertes, para disminuir la vibración.

° Tubo

intercambiable del microscopio: Se encuentra insertado en la parte superior del cuerpo del tubo, soporta el ocular y permite alinearlo con el objetivo seleccionado para una observación.

° Platina: En ella se coloca la preparación o portaobjetos de estudio, la platina esta equipada con pinzas para sujetar la preparación y dos tornillos 3.1, para desplazarla en sentido vertical y horizontal, lo que facilita la localización del objeto y la revisión de la preparación.

° Revólver: Es el disco que soporta a los objetivos y se gira para colocar el objetivo requerido bajo el tubo. ° Tornillo micrométrico o de enfoque preciso: Con este se puede desplazar el tubo en forma más lenta, lo que permite hacer los movimientos finos que se requieren para obtener el enfoque exacto y preciso.

° Tornillo

macrométrico o de enfoque aproximado: Este permite desplazar el tubo del microscopio (o ala platina en algunos modelos) acercando el objetivo a la preparación, lo que permite localizar la imagen y lograr un enfoque aproximado.

Sistema óptico: Esta integrado por una fuente luminosa, una lente condensadora de luz que la dirige hacia el espécimen y dos juegos de lentes que ayudan a la amplificación de imagen. ° Interruptor

° Fuente de luz : Es una lámpara que se encuentra colocada debajo de el objeto y emite la luz que pasa por el condensador, para después iluminar la preparación, para regular la intensidad de la luz algunos microscopios tienen integrado a la lámpara, un diafragma, el que se abre o se cierra, en otros únicamente regula el voltaje. ° Diafragma de campo

° Condensador: Esta interpuesto entre la fuente de luz y la muestra, el condensador recibe la luz de la lámpara, rectifica los rayos de luz y los concentra o enfoca en un cono de luz sobre el campo donde se sitúa la muestra, de tal manera que los rayos después de atravesar la preparación, penetra a la lente de el objetivo con el mejor ángulo posible, para ello el condensador se baja o se sube hasta alcanzar una posición que origine un foco preciso.

° Diafragma Iris: Controla el diámetro del circulo de luz que sale de el sistema condensador, al mover la palanca

del diafragma iris, es posible controlar la cantidad de luz que entra al condensador y regular el paso de la luz para dar nitidez a la imagen, el propósito de el diafragma no es controlar la intensidad de la luz que llega al objeto, sino asegurar que la que sale del condensador llene exactamente la lente de el objetivo, si el diafragma es demasiado grande, parte de la luz pasara alrededor del objeto y originara brillo reduciendo la claridad de la imagen.

° Objetivos:

Son las lentes que amplifican la imagen del campo del microscopio y por lo tanto, del objeto en estudio, la mayoría de los microscopios tiene tres objetivos que proporcionan diferentes aumentos, siendo los mas comunes el 10x, 40x, 90x y 100x , la lente de bajo poder de aumento abarca un campo microscópico con una superficie mayor, se utiliza para localizar los objetos de interés y para seleccionar al espécimen a observar, la lente de 40x permite la visualización detallada de microorganismos grandes, como algas, protozoarios y hongos, la lente de 90x 0 100x ( que se emplea con aceite de inmersión ) se utiliza para observar bacterias o microorganismos eucariontes pequeños. Cuando el microscopio es par focal, las distintas lentes están ajustadas de tal manera que, al enfocar el espécimen con una lente, así permanece al cambiar a otros objetivos, de esta manera se puede enfocar con el objetivo de poco aumento y cambiar a los objetivos de mayos aumento sin volver a enfocar o realizando ajustes menores.

° Ocular:

Esta lente amplifica aun más la imagen procedente del objetivo y permite que el ojo la perciba, el ocular se encuentra insertado en el tubo intercambiable.

La función de los sistemas de lentes amplificadoras interpuestas entre la muestra y el ojo (objetivo y ocular) consiste, en gran parte, en aumentar el ángulo aparente que forman con el ojo los objetos que estas dentro del campo microscópico. Para hacer una buena observación es muy importante que la imagen aumentada no se encuentre distorsionada, de manera que retenga los detalles esenciales del espécimen, en la microcopia óptica, especialmente en la de pequeño aumento existen varios tipos de distorsiones que resultan de las propiedades de las lentes por lo que, en los microscopios modernos, cada sistema de lentes (condensador objetivo y ocular) consiste en un juego de varias lentes de diversas formas y dimensiones, cuyo diseño permite corregir las distintas distorsiones, de este modo la amplificación y la calidad de la imagen quedan determinadas por : ∼ las características y calidad de las lentes ∼ la longitud de onda de luz empleada ∼ el medio que atraviesa la luz antes de llegar al objetivo (aire, agua, aceité de inmersión).

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Estas a su vez determinan la capacidad amplificadora y el poder de resolución del microscopio. En el ocular se indica su coeficiente de aumento individual, por ejemplo 10x, que significa que su poder de aumento es 10 veces o 10 diámetros. En el objetivo hay cuatro datos: 40 X = Coeficiente de aumento 0.65 = Apertura numérico 160 = (Mm.) la longitud mecánica del tubo (medida desde la superficie de la rosca del objetivo hasta la base del ocular) 0.17 = Requiere cubre ojos de 0.17mm. de espesor (cubreobjetos num. 1) En lugar de 0.l7 puede estar marcado: //0 /0.11

= Acepta cubreobjetos desde 0.17 (num. 1) a 0.22 (num. 2) de espesor = No requiere cubreobjetos = 0.27 (Korr) es ajustable a los diferentes espesores de los cubreobjetos (desde 0.11 hasta 0.27 mm. ).

Características del ocular y los objetivos: Los coeficientes de aumento de los oculares y de los objetivos, permiten calcular el aumento total o capacidad amplificadora de un microscopio, que es igual a: producto de los coeficientes de aumento del ocular y del objetivo que se utilizan; por ejemplo: en un microscopio con un ocular de 6x y objetivos de 10x y 40x y 100x, la imagen se amplifica 60, 240 y 600 veces respectivamente. Mediante la utilización de oculares con mayores coeficientes de aumento, es posible obtener mayores amplificaciones de la imagen, aunque esta tiene un límite al que se conoce como aumento útil de un microscopio. El aumento útil del microscopio esta dado por las propiedades físicas de la luz (que establecen el limite fijo de la amplificación efectiva) y una característica del sistema de lentes, conocida como apertura numérica, las que en conjunto dan lugar a una propiedad conocida como poder de resolución. Apoca resolución, las estructuras se ven juntas, entre mayor es la resolución, mayor es el detalle con que se observan. Resolución de dos puntos: El poder o límite de resolución de una lente, corresponde a su capacidad para presentar distintos y separados dos puntos adyacentes, determinando la máxima amplificación útil que se puede obtener con un microscopio óptico. El poder de resolución (δ) se expresa mediante la siguiente ecuación: δ = longitud de onda / Apertura numérica De acuerdo con la teoría óptica, la resolución mas alta posible en un microscopio de luz compuesto permitirá ver con claridad objetos cuyo diámetro sea de casi 0.2 mm. Lo anterior significa el poder de resolución es igual al diámetro de la estructura visible mas pequeña, de este modo en un microscopio óptico compuesto los objetos de dimensiones menores alas señaladas, al ser amplificados, darán lugar a imágenes difusas. La amplificación que aumenta el tamaño, pero no su detalle, se denomina amplificación o aumento vacío. Efecto de la longitud de onda sobre el poder de resolución, cuanto mas corta sea la longitud de onda empleada, mas pequeña será la estructura visible (mayor poder de resolución), en este sentido, la luz aportara mayor poder de resolución que la luz roja, sin embargo puesto que el espectro de luz visible es relativamente estrecho el aumento de la resolución disminuyendo la longitud de onda de la luz empleada, tiene un valor limitado. El mayor aumento de la resolución de un microscopio se consigue aumentado la apertura numérica La apertura numérica de la lente es función del diámetro real del objetivo en relación con su distancia focal, lo que determina el Angulo (u) de los rayos de luz más oblicuos que pueden entrar al objetivo y el poder de desviar el rayo luminoso, índice de refracción (N) del medio que hay entre la muestra y el objetivo. Existe correspondencia entre la amplificación del objetivo y su apertura numérica, las lentes con mayor coeficiente de aumento, por lo general, tienen mayor apertura numérica, pero como se indica en la formula el medio por el que pasa la luz también influye en la apertura numérica; de este modo, cuando el objetivo esta separado del objeto por aire, su apertura nunca puede ser mayor de 1.0 debido a que el índice de refracción del aire es menor que el de el vidrio, los rayos luminosos se refractan o desvían cuando pasan por el portaobjetos al aire, por lo que se pierde la mayor parte de los rayos luminosos, para alcanzar valores mayores el objetivo debe estar inmerso en un medio con un índice de refracción mayor que el del aire y similar al del

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vidrio, de esta manera se disminuye la desviación y un porcentaje mayor de rayos luminosos procedentes de la muestra pasan directamente al objetivo, proporcionando una mayor resolución y una imagen mas clara. El aceite de inmersión aumenta la cantidad de luz que pasa a la lente del objetivo La apertura numérica (AN) permite calcular los límites de aumento útil multiplicándola por 500 y por 1000. Ej. Si el objetivo tiene una apertura numérica de 0.65 por lo que pueden usarse aumentos totales de 325 a 650 diámetros, fuera de esos limites se obtienen “aumentos vacíos “en forma comparable a lo que suceda cuando se observan un mosaico tan lejos que solo se ven colores pero no figuras delimitadas, o tan cerca que se ve cada piedrecilla pero se pierde el conjunto Otros factores relacionados con el sistema de la lente utilizada son la profundidad de campo y el área de campo, la primera es el espesor del espécimen en foco de cualquier momento y es mayor con menor poder de aumento, con la inmersión en aceite, la profundidad de campo es muy superficial, por lo común menor de 1mm, el área de campo es mayor con el menor aumento y es por esta razón que las lentes de bajo coeficiente de aumentos son útiles para localizar objetos. Datos ópticos sobre las lentes objetivos de uso común: Hay que insistir en que el sistema de iluminación es de suma importancia, en especial cuando se emplean objetivos de alto poder de amplificación, la cantidad de luz que entra en el sistema debe enfocarse en el espécimen y para este propósito, se usa el sistema de lentes del condensador y el diafragmas, el primero permite obtener un foco preciso en tanto que, el segundo, controla el circulo de luz que sale de el condensador. Relación entre la distancia de trabajo de las lentes y el ajuste del diafragma Iris: Cuanto mas corta es la distancia de trabajo, más abierto esta el diafragma. MICROSCOPIA DE CONTRASTE DE FASES: Aun cuando los objetos biológicos no absorben diferencialmente la luz visible, sus distancias estructurales tienen correlación en forma inversa con la velocidad de propagación de luz, cuando mayor sea el índice de refracción, menos será dicha velocidad, esta propiedad, aplica en la microscopia de contraste de fases, permitiendo hacer visibles estructuras que de otra manera no lo serian o resultarían poco visibles. Suponiendo un haz de luz que incide sobre dos estructuras transparentes A y B las cuales poseen índices de refracción (N) distintos y espesores iguales NA y NB , la onda que atraviesa la capa B se retrasa en relación con la que atraviesa la capa A , el ojo no percibe este retraso y los dos medios parecen igualmente transparentes. En el microscopio de contrastes de fases, se introducen elementos ópticos para aprovechar la diferencia de retardos, que esta dada por las diferencias en los índices de refracción del objeto. Para ello se separa la radiación dirección directa difractada, y se produce en esta ultima, un retraso de fase respecto a la primera para formar una imagen con la suma de los dos. Los pequeños cambios de fase que se producen en el objeto se amplían y se producen en cambios de intensidad de la imagen viéndose en estas partes más o menos oscuras. La microscopia de fase se usa como un método de rutina en la observación de células vivas. En la práctica, el contraste de fase (PH) se integra de la siguiente forma: dentro del condensador se monta un diafragma anular (PH) cuya imagen se forma en el plano focal del objetivo, donde se encuentra otro PH (este diafragma es otro filtro neutro en forma de anillo). La radiación difractada procedente del objeto atraviesa el anillo PH en la zona semitransparente, en donde se produce un retrazo de aproximadamente ¼ de longitud de onda. Los elementos ópticos para el contraste de fases son los siguientes: A.- Condensador especial PH o condensador revolver con PH B.- Objetivo 10/0.25 PH 1 Con anillo de fase 1 Objetivo 40/0.65 PH 2 con anillo de fase 2 Objetivo 100/1.25 oil PH 3 con anillo de fase 3 C.- Ocular auxiliar Ajuste del microscopio para el contraste de fases 1) Iniciar la técnica de iluminación según Kohler en la posición J del condensador revolver (campo claro) 2) Ajustar el condensador revolver en la posición PH correspondiente al objetivo PH (PH 1 con 1, PH 2 con 2 etc.) 3) Sustituir el ocular normal por el auxiliar y hacer el enfoque de los dos anillos de fases (negro el del objetivo y blanco el del condensador)

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4) Con la ayuda de los botones de ajuste situado en el condensador, hacer coincidir el anillo de fases blanco con el negro. 5) Retirar el ocular auxiliar y colocar nuevamente el ocular normal, insertar un filtro verde para aumentar el contraste de los grises. 6) Al cambiar el objetivo, solo adaptar el diafragma de campo luminoso al tamaño del campo visual y cambiar la posición del condensador al que corresponde, según el nuevo objetivo, ejemplo PH 2 con 2 y PH 3 con 3. MICROSCOPIA DE CAMPO OSCURO La microscopia del campo oscuro se consigue situando una pantalla circular opaca en la entrada del condensador de ABBE, de manera que se oscurezca la parte central, o bien, empleando tipos especiales de condensadores (paraboide o cardioide), la preparación se ilumina con un haz de luz suficientemente fino, bajo un ángulo agudo, de forma que no incida en la lente frontal del objetivo. ej. Se muestra como el haz de luz ilumina oblicuamente al espécimen y alcance el objetivo, el campo aparecerá uniformemente oscuro y cada partícula se vera como un punto luminoso por efecto de difusión de la luz que incide sobre ella. Dirección del haz de luz en un microscopio de fondo oscuro La apertura numérica del objetivo debe ser suficientemente baja para excluir la luz directa del condensador, para el trabajo con aceite de inmersión, se usa un objetivo con un diafragma de iris incorporado, por medio de la cual la apertura numérica puede reducirse. Esta técnica se emplea para observar preparaciones biológicas sin colorear y entre otras cosas, permite observar el movimiento browniano y los flagelos, así como estudiar células en acción y los movimientos implicados en procesos tales como la mitosis y la migración celular. Elementos ópticos para campo oscuro: 1.- Posición D de condensador revolver 1.4 AN, o ultra condensador 1.2/1.4 AN oil Además existen condensadores para campo oscuro sin aceite con los que se obtienen aumentos menores. AN 0.8/0.9 para objetivos con apertura numérica de 0.6- 0.7, y condensadores 0.7/0.85 para objetivos con AN de 0.4-0.6 2.- Objetivos con diafragma de iris 100/1.25 oil iris 40/1.0 oil iris 3.- Sin filtro 4.- Doble inmersión de aceite (sobre la preparación y el condensador), solamente en condensadores con 1.4 AN o 1.2/1.4 AN MICROSCOPIA DE FLUORESENCIA La fluorescencia la propiedad que tienen algunas sustancias para emitir luz después de haber sido expuestas a una radiación del longitud de onda corta a la que se denomina radiación excitadota (UV). La luz fluorescente emitida tiene una longitud de onda mas larga que la radiación con la cual se irradia la sustancia fluorescente (ley de Stokes). La radiación emitida por la sustancia fluorescente tiene menor energía que la radiación inicial o de excitación. Consecuentemente, una sustancia fluorescente puede ser excitada por una radiación invisible como la luz ultravioleta, para ser vista en el especto visible, o bien, puede excitarse con radiación cuya longitud de onda corresponde a la azul o al verde y la luz que se emite tendrá una longitud de onda mas larga que corresponde a la fluorescencia verde, amarilla o roja. La microscopia de fluorescencia es particularmente útil en la búsqueda de agentes etiológicos como bacterias y virus que no florecen, por lo tanto, hay que ponerlos en condiciones de emitir radiación fluorescente útil para su observación. Existen algunas sustancias que poseen fluorescencia propia, ala que se denomina fluorescencia primaria, Por ejemplo de estas que tienen: la clorofila, las porfirinas, algunas vitaminas, ceras y aceites de inmersión (solo que contengan di felino policromado BCB). La fluorescencia de microorganismos o de estructuras biológicas que no fluorecen por si mismas se consiguen por medio de los fluorocromos, los que en principio son considerados como colorantes (chorna = color). Dependiendo de la composición química y de las características de la tinción, los fluorocromos se depositan en zonas específicas del espécimen y dejan otras si teñir. Este proceso se conoce como fluorocromacion y la fluorescencia que genera se denomina Fluorescencia secundaria. Actualmente se conoce una gran variedad de fluorocromos y, entre los mas usados se encuentran: la auramina, la rodamina, el isotiocianato, fluoresceína, la criflavina y el naranja de acridina. Elementos importantes de n microscopio de florescencia:

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° Fuente de luz, la luz emitida por la fuente debe tener la suficiente radiación de aquellas longitudes de onda requeridas para la excitación de los fluorocromos. Generalmente se usa una fuente de mercurio a alta presión (HBO50). Cuando se quiere excitar con la luz azul, se usa una lámpara incandescente potente de alógeno (ejemplo Hal 100w).

° Filtro de excitación. El filtro de excitación debe permitir el paso de la radiación necesaria o útil para el método usado y retener todas aquellas longitudes de onda de la emisión de la fuente de luz, que son útiles para la excitación.

° Filtro supresor selectivo o filtro barrera. Este retiene la luz de excitación de longitud de onda corta (UV)

que

no es absorbida por el espécimen y que podría llegar a los ojos del observador y ocasionarle daño. Cuidado y limpieza del microscopio Como todo instrumento de precisión, el microscopio debe cuidarse con esmero. Lo principal desde luego, es manejarlo con precaución, solo debe moverse lo indispensable, sujetándolo firmemente con ambas manos y depositándolo con suavidad. Forma correcta de transportar el microscopio: Todos los componentes del microscopio deben embonar perfectamente y moverse con suavidad y facilidad; nunca debe forzarse la colocación de la pieza en su movimiento .Debe evitarse el polvo, ya que tiene a depositarse en las cremalleras y en las lentes. También debe resguardarse de la humedad y el calor excesivos. Las lentes deben conservarse lo mas limpias posibles, evitando que se ensucien con las preparaciones y con la grasa de las manos y pestañas. Para limpiar las lentes se utiliza un pincel suave, libre de grasa. Si es necesario exhale sobre la superficie antes de la lente de usar el pincel. Si no basta el agua de vaho puede usarse una pequeñísima cantidad de éter muy puro, pero nunca alcohol ni otros disolventes, porque pueden disolver el pegamento de las lentes. El pincel para limpiar las lentes se lava de vez en cuando con éter puro. El sistema mecánico se limpia con un paño que no suelte pelusa, perfectamente limpio y humedecido con agua destilada; después de limpiar el sistema mecánico, se seca perfectamente.

REPORTE: Historia del microscopio: El microscopio se invento, hacia 1610, por Galileo, según los italianos, o por Jansen, en opinión de los holandeses. La palabra microscopio fue utilizada por primera vez por los componentes de la "Academia dei Lincei" una sociedad científica a la que pertenecía Galileo y que publicaron un trabajo sobre la observación microscópica del aspecto de una abeja. Sin embargo las primeras publicaciones importantes en el campo de la microscopia aparecen en 1660 y 1665 cuando Malpighi prueba la teoría de Harvey sobre la circulación sanguínea al observar al microscopio los capilares sanguíneos y Hooke publica su obra Micrografía. A mediados del siglo XVII un comerciante holandés, Leenwenhoek, utilizando microscopios simples de fabricación propia describió por primera vez protozoos, bacterias, espermatozoides y glóbulos rojos. Durante el siglo XVIII el microscopio sufrió diversos adelantos mecánicos que aumentaron su estabilidad y su facilidad de uso aunque no se desarrollaron mejoras ópticas. Las mejoras mas importantes de la óptica surgieron en 1877 cuando Abbe publica su teoría del microscopio y por encargo de Carl Zeiss mejora la microscopía de inmersión sustituyendo el agua por aceite de cedro lo que permite obtener aumentos de 2000A principios de los años 30 se había alcanzado el limite teórico para los microscopios ópticos no consiguiendo estos, aumentos superiores a 500X o 1000X sin embargo existía un deseo científico de observar los detalles de estructuras celulares ( núcleo, mitocondria... etc.). El microscopio electrónico de transmisión (T.E.M.) fue el primer tipo de microscopio electrónico desarrollado este utiliza un haz de electrones en lugar de luz para enfocar la muestra consiguiendo aumentos de 100.000 X. Fue desarrollada por Max Knoll y Ernst Ruska en Alemania en 1931. Posteriormente, en 1942 se desarrolla el microscopio electrónico de barrido (SEM).

Tipos de microscopio: • •

Microscopio binocular: el que tiene dos oculares. Microscopio compuesto: el que consta de varias lentes o sistemas de ellas, unas situadas cerca del objeto (objetivo) y otras cerca del ojo del observador (ocular). La primera da una imagen real e invertida del objeto y la segunda una imagen virtual ampliada de la real. se utiliza mayormente para el estudio de objetos de aproximadamente uno a 2000 micrómetros, aunque se pueden ver cosas aun más pequeñas con el empleo de técnicas especiales.

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Microscopio corneal: un microscopio especialmente adaptado a una lámpara de hendidura para examinar la córnea in vivo e in situ. Microscopio de barrido: microscopio electrónico en el cual las radiaciones realizan un rastreo o barrido de la superficie de la muestra lo que ofrece una imagen en relieve de la misma. Microscopio de contraste de fases: microscopio óptico que, por las modificaciones de la fase de luz, debidas a la diferencia del índice de refracción, permite distinguir las estructuras de objetos incoloros o poco contrastados. Microscopio de rayos X: el que utiliza rayos x. Microscopio electrónico: un microscopio que utiliza haces de electrones y proporciona aumentos de 200.000 diámetros y en el cual un campo magnético permite enfocar los rayos catódicos (electrones) y obtener una imagen en la pantalla fluorescente o placa radiográfica. Microscopio fluorescente: el provisto de filtros que permiten observar, con luz ultravioleta, sustancias teñidas con colorantes fluorescentes. Microscopio operatorio: microscopio binocular que se utiliza en técnicas de microcirugía. Microscopio simple: el formado por un solo sistema de lentes. Microscopio ultrasónico: el que utiliza la reflexión de ondas ultrasónicas para observar detalles estructurales de lo observado Microscopio ultravioleta: el que utiliza ondas.

Partes del microscopio:

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base : sostén del instrumento columna o brazo: sostiene los oculares y objetivos platina: superficie para colocar la laminilla ajuste mecánico de la platina: para mover la laminilla revólver: contiene los objetivos objetivos: lentes principales del microscopio; son parafocales, pues al cambiar de un objetivo a otro, la imagen queda casi en foco y sólo es necesario un leve ajuste; objetivos: a) rastreo: cuatro magnificaciones o 4x

b) c)  

Baja potencia : 10x Alta potencia: 40x

cabezal: contiene los oculares oculares: el microscopio es binocular, pues hay dos lentes oculares; son de diez magnificaciones o 10x; para determinar la magnificación de la imagen que observas a través del microscopio, multiplica la magnificación de los oculares por la del objetivo en uso; con nuestros microscopios la magnificación de la imagen puede ser de 40x, de 100x o de 400x



anillo de enfoque del ocular izquierdo: se usa para compensar la diferencia de visión que existe entre los dos ojos  ajuste de distancia interpupilar

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tornillo macrométrico o ajuste grueso: para subir y bajar la platina rápidamente; se usa solamente con los objetivos de 4x y 10x



tornillo micrométrico o ajuste fino: para subir y bajar la platina muy lentamente; se usa con todos los objetivos para perfeccionar el enfoque de la imagen



iluminador: provee iluminación con intensidad variable  interruptor  indicador de encendido

  

ajuste de iluminación: se usa para controlar la intensidad de iluminación

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diafragma: para controlar el diámetro del cono de luz que llega al objetivo, no para controlar la intensidad de iluminación; al disminuir la apertura del diafragma se aumenta el contraste y la profundidad de foco, pero se disminuye la resolución; para lograr la mejor imagen posible es necesario cambiar la apertura del diafragma al cambiar el objetivo



filtro azul: absorbe el exceso de luz roja y amarilla del iluminador para que la iluminación sea más similar a la luz natural

condensador: enfoca la luz en el plano de la laminilla ajuste del condensador: para subir y bajar el condensador; para nuestro uso el condensador debe estar un poco por debajo de su posición más alta

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

cordón eléctrico: al guardar el microscopio se debe evitar la posibilidad de tropezar, doblando el cordón alrededor de la base del microscopio o enrollándolo y colocándolo alrededor de uno de los oculares

Uso y cuidado del microscopio: Al usar el microscopio es importante no solamente observar cuidadosamente la imagen sino también interpretar correctamente lo que se ve con este instrumento. Con el microscopio compuesto, la imagen de un objeto se ve muchas veces más grande y de manera invertida. La profundidad de foco es limitada, especialmente con los objetivos de mayor magnificación; por esto es esencialmente bidimensional o en un solo plano. Sin embargo, los organismos biológicos son tridimensionales. Para apreciar la estructura tridimensional se puede estudiar una serie de laminillas que representan cortes sucesivos o cortes perpendiculares; además, en una misma laminilla se puede enfocar ligeramente hacia arriba y hacia abajo. El uso correcto del microscopio requiere varios tipos de ajuste, los cuales son necesarios para que se vea con claridad y en todo su detalle cada objeto que se estudie. Es imprescindible saber cómo usar correctamente este instrumento: Es responsabilidad individual y colectiva de todos los instructores y estudiantes mantener estos instrumentos en óptimas condiciones. Al llevar el microscopio de un lugar a otro es importante sostenerlo siempre con ambas manos, una colocada debajo de la base y la otra agarrando la columna o el brazo del instrumento. Cuando se deposita el microscopio sobre la mesa debe hacerse con suavidad, sin que haga ruido. Tampoco debe arrastrarse sobre la mesa o dentro del gabinete, pues esto produce vibraciones que con el tiempo sacan de alineamiento la delicada óptica del instrumento. Antes de usar el microscopio se verifica que los lentes oculares y objetivos estén limpios. Si es necesario limpiar los lentes u otras partes del microscopio (como el condensador o el filtro azul) se debe usar papel de lente seco; la única humedad que puede emplearse es la del aliento para empañar el lente y luego frotarlo suavemente. Si la laminilla está sucia o si está mojada por debajo, se puede usar un «Kimwipe» para limpiarla. Una de las principales causas de una imagen borrosa y poco definida es la presencia de sucio en los lentes o en la laminilla, especialmente polvo y huellas digitales en los oculares. No se debe tocar los lentes o la parte central de la laminilla con los dedos. Se pueden localizar «sucios» de la siguiente manera: ∼si el sucio se mueve al mover la laminilla, está en la laminilla ∼si el sucio se mueve al mover los oculares, está en los oculares ∼si el sucio desaparece al cambiar el objetivo, está en el objetivo anterior ∼si el sucio entra y sale de foco al subir y bajar el condensador, está en el condensador

∼si el sucio no se mueve y no está en ninguno de los lugares anteriores, puede estar dentro del microscopio; se debe notificar al instructor de laboratorio; no remover ninguna parte del microscopio Uso correcto del microscopio: Enchufar el microscopio. Prender el iluminador; la luz roja debe indicar que está encendido, aunque puede ser que no se vea iluminado. Ajustar la intensidad de luz a un nivel cómodo. Hay que volver a ajustar la intensidad de luz al cambiar el objetivo o la laminilla. Si la luz no funciona, avisar al instructor de laboratorio para que se cambie la bombilla. Ajustar la distancia interocular para adaptar la distancia entre los oculares a la distancia entre los ojos, moviendo lateralmente la base de los oculares hasta que se vea claramente una sola imagen. El propósito principal de los dos oculares es el de minimizar la interferencia de luz ambiental y de otras imágenes y, consecuentemente, la fatiga visual. Los dos oculares no proporcionan una imagen estereoscópica, porque hay un solo objetivo. La distancia interpupilar varía para cada persona; por lo tanto, hay que hacer este ajuste al principio de cada laboratorio. Enfocar el microscopio. Mirando por fuera el objetivo para que no toque la laminilla, usa el tornillo macrométrico para subir la platina a la posición más alta (no hagas esto con el objetivo de 40x en la posición vertical). Mirando entonces por los oculares (los estudiantes con espejuelos pueden removerlos para facilitar el uso del microscopio), usa el tornillo macrométrico para bajar la platina hasta que el objeto esté en foco. Cerrando el ojo izquierdo, usa el tornillo micrométrico para lograr una imagen en perfecto foco. Cerrando el ojo derecho, usa el ajuste en el ocular izquierdo para corregir el foco. Este ajuste es necesario al principio de cada laboratorio.

MATERIAL    

Microscopio Portaobjetos Cubreobjetos Pipeta pasteur

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 Preparaciones proporcionadas por el profesor  Pincel fino para limpiar el microscopio

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Paño limpio de lino o de otro material que no suelte pelusa Pañuelos desechables Agua del lago de chapultepec Pulque Yakult

METODOLOGÍA:

1.

Cuidado del microscopio e identificación de sus componentes: 1.1. Recibir el microscopio, sujetándolo firmemente con ambas manos y depositarlo sobre la mesa con suavidad. 1.2. Revisar los componentes del microscopio y verificar que todos embonen perfectamente, para ello, mediante movimientos suaves, desplazar el tubo del microscopio y la platina; girar el tubo intercambiable y el revolver. 1.3. Identificar cada uno de los componentes del microscopio. 1.4. Observar los datos del microscopio e identificar. °En el ocular, el coeficiente de aumento. °En el objetivo: °El coeficiente de aumento °La apertura numérica °La longitud mecánica del tubo °El espesor del portaobjeto a emplear 1.5. Calcular el total de amplificación que se puede obtener con los diferentes objetivos 1.6. Calcular el aumento útil de los diferentes objetivos 1.7. Limpiar las lentes con un pincel libre de grasa 1.8. Exhalar sobre la superficie de cada una de las lentes y limpiar con una hoja de papel seda 1.9. Alinear el objetivo de menor aumento con el tubo del microscopio 1.10.Con el tornillo micrométrico, acercar al máximo la platina al objetivo, observando lateralmente para que no lleguen a chocar. 2. Iluminación (Técnica según Kohler): 2.2.Encender la lámpara (luz amarilla o bajo voltaje) 2.3.Abrir diafragmas (de campo y de iris) 2.4.Subir el condensador 2.5.Seleccionar el objetivo de 10 x o 40 x o 100 x 2.6.Enfocar con el macrométrico y micrométrico ° Ajustar la distancia interpupilar (distancia entre ojos) ° Ajustar la misma cifra de distancia interpupilar a cada uno de los porta oculares (para tubos binoculares, se ajusta desplazándose horizontalmente) ° Ajustar dioptrías (agudeza visual) en el porta ocular izquierdo, o bien el ocular enfocable izquierdo. 2.7.Cerrar el diafragma de campo. 2.8.Descender ligeramente el condensador, hasta ver nítido el borde del diafragma de campo 2.9.De ser necesario, centrar el condensador con la ayuda de sus dos tornillos laterales (anteriores o posteriores), una vez centrado el condensador, abrir el diafragma de campo, agregar el filtro azul (algunos modelos de microscopio carecen del sistema de filtros) e intensificar un poco mas la luz 3. Enfoque de la preparación: 3.1 Colocar la preparación en la platina. 3.2 Con el tornillo macrométrico llevar la platina lo mas cercano posible al objetivo (observando lateralmente) 3.3 Observar por el ocular, mover lentamente el tornillo macrométrico para separar el objetivo de la preparación hasta que aparezca la imagen del objeto. Como la profundidad de campo es poca y se reduce aun mas con aumentos mayores, el enfoque se logra solo en una pequeña zona, si se mueve mas el tornillo de enfoque, la imagen desaparece 3.4 Para mejorar la nitidez de la imagen (dependiendo del modelo de microscopio) * Disminuir la intensidad de la luz, cerrando el diafragma de la lámpara o bajando ligeramente el voltaje de la misma. * Regular el contraste de la imagen con ayuda del diafragma de iris del condensador. 3.5 Colocar el objeto de interés (que debe estar perfectamente enfocado) en el centro del campo microscópico, moviendo ligeramente la platina. 3.6 Girar el revolver, y alinear el objetivo de 40X con el tubo del microscopio 3.7 Observar por el ocular y verificar que la imagen permanece enfocada y que solo es necesario mover el tornillo micrométrico o de precisión 3.8 Girar el revolver colocar sobre la preparación una gota de aceite de inmersión y continuar girando hasta alinear el objetivo de 100X

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3.9 Observar por el ocular y verificar que la imagen permanece enfocada y solo es necesario mover el tornillo micrométrico en la mayoría de los casos aumentar la intensidad de la luz NOTA: El microscopio tiene la propiedad de ser parfocar por lo que al enfocar uno de los objetivos, los demás quedan en foco 3.10 Iluminar el microscopio varias veces y enfocar tantas preparaciones como sea posible 3.11 Observar primero las letras, después del colorante seco y luego las preparaciones de microorganismos proporcionadas por el profesor 3.12 Después de retirar la preparación, limpiar el aceite que queda en el objetivo con un pañuelo desechable, separando sus dos hojas y usando las partes interiores que no sueltan pelusa, no utilizar algodón por que deja fragmentos que ensucian las lentes 3.13 Dejar el microscopio con el objetivo de menor aumento alineado con el tubo y lo mas cercano posible a la platina GUIA DE OBSERVACION Procedimiento: ℘ ℘ ℘ ℘ ℘ ℘

Identificar las partes del microscopio compuesto Enfocar, iluminar y observar las preparaciones proporcionadas; hacer esquemas. A partir de la muestra del agua del lago realizar preparaciones en fresco y observar a 10x a 40x Tratar de localizar protozoarios y algas microscópicas y esquematizar. A partir de la muestra de pulque, realizar una preparación en fresco y observar a 40x y 100x a inmersión. Diluir una gota de yakult en 9 gotas de agua y realizar la preparación en fresco. Observar lactobacilos.

RESULTADOS:

1. 2. 3. 4.

6. 7.

ocular revólver objetivo mecanismo de enfoque tornillo de enfoque fino platina espejo

8.

condensador

5.

1) Partes del Microscopio:

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ANÁLISIS DE RESULTADOS:  Primero en el laboratorio se identificaron cada una de las partes que componían al microscopio utilizado en laboratorio, para su uso correcto.  Una vez identificadas las partes, se prosiguió a colocar muestras previamente preparadas para su observación en el microscopio; para esto se tuvo que enfocar primero las imágenes en el microscopio, iniciando por el menor aumento (en este caso los aumentos eran de 5x, 10x, 40x y 100x) y hacia el objetivo con mayor aumento. Se observaron las muestras y se dibujaron.



Se observó en el agua del lago algunos protozoarios que se movían constantemente (5x), en el 10x, se observaron protozoarios y una euglena que se movía constantemente sobre sí misma. En el 40x, se observó un paramesium, los protozoarios y algunas algas más cerca, se observaba su pared celular muy definida y algunos flagelos. En el 100x, se observaron mejor las algas marinas, y como los protozoarios se movían en sí mismos circularmente, se observaba su pared celular y en el paramesium se logró observar mejor su pared celular, los flagelos y como se había comido algunos protozoarios y otras bacterias; esta especie a comparación de las demás observadas, fue la de tamaño más grande.  En el pulque se lograron observar cocos (solos), diplococos, cocos en cadena, protozoarios y bacilos de leumococo.  Por último en el yakult se observaron los lactobacilos, aunque nos costo mucho trabajo encontrarlos ya que aún con el aumento de 100x , fueron demasiado pequeñas las especies.

CUESTIONARIO:

1) ¿Qué es el movimiento browniano? 2)

El movimiento que lleva a cabo una partícula muy pequeña que está inmersa en un fluido, se llama movimiento browniano. Este movimiento se caracteriza por ser continuo y muy irregular. La trayectoria que sigue la partícula es en zigzag. ¿Cómo funciona el microscopio de campo oscuro? La microscopia del campo oscuro se consigue situando una pantalla circular opaca en la entrada del condensador de ABBE, de manera que se oscurezca la parte central, o bien, empleando tipos especiales de condensadores (paraboide o cardioide), la preparación se ilumina con un haz de luz suficientemente fino, bajo un ángulo agudo, de forma que no incida en la lente frontal del objetivo. ej. Se muestra como el haz de luz ilumina oblicuamente al espécimen y alcance el objetivo, el campo aparecerá uniformemente oscuro y cada partícula se vera como un punto luminoso por efecto de difusión de la luz que incide sobre ella.

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3) ¿En qué consiste el microscopio de contraste de fases?

microscopio óptico que, por las modificaciones de la fase de luz, debidas a la diferencia del índice de refracción, permite distinguir las estructuras de objetos incoloros o poco contrastados

4) Principales aportaciones a la ciencia gracias al microscopio: Algunos descubrimientos en la historia de la microscopía óptica 1611

Kepler sugirió la manera de construir un microscopio compuesto

1655

Hooke utilizó un microscopio compuesto para describir unas pequeñas celdillas en los cortes de corcho a las que denominó "células".

1674

Leeuwenhoek informó sobre su descubrimiento de protozoos. Nueve años más tarde observó por primera vez bacterias.

1833

Brown publicó sus observaciones microscópicas de las orquídeas, y describió claramente el núcleo celular.

1838

Schleiden y Schwann propusieron la teoría celular, afirmando que la célula nucleada es la unidad estructural y funcional de las plantas y los animales.

1857

Kolliker describió las mitocondrias de las células musculares.

1876

Abbé analizó los efectos de la difracción en la formación de la imagen en el microscopio y mostró la manera de optimizar el diseño de los microscopios.

1879

Flemming describió con gran claridad el comportamiento de los cromosomas durante la mitosis de las células animales

1881

Retzius describió muchos tejidos animales con una precisión que aún no ha sido superada por ningún especialista en microscopía óptica. En las dos décadas siguientes, tanto él como Cajal y otros histólogos, diseñaron métodos de tinción y establecieron las bases de la anatomía microscópica.

1882

Koch utilizó colorantes de anilina para teñir microorganismos e identificó las bacterias que causan la tuberculosis y el cólera. En las dos décadas siguientes, otros bacteriólogos, como Klebs y Pasteur, identificaron los agentes causantes de otras muchas enfermedades examinando al microscopio preparaciones teñidas.

1886

Zeiss hizo una serie de lentes, siguiendo las leyes de Abbé, que permitieron a los especialistas en microscopía la resolución de estructuras situadas en los límites teóricos de la luz visible.

1898

Golgi observó por primera vez el aparato llamado "de Golgi", impregnando células con nitrato de plata.

1924

Lacassagne y sus colaboradores desarrollaron la primera técnica autorradiográfica para localizar el polonio radiactivo en las muestras biológicas.

1930

Lebedeff diseñó y construyó el primer microscopio de contraste interferencial. En 1932, Zernicke inventó el microscopio de contraste de fases. Estos dos adelantos permitieron observar por primera vez células células vivas no teñidas en detalle.

1941

Coons utilizó anticuerpos acoplados a colorantes fluorescentes para detectar antígenos celulares.

1952

Nomarski ideó y patentó el sistema de contraste interferencial para el microscopio óptico., que aún lleva su nombre.

1981

Allen e Inoué perfeccionaron la microscopía óptica de contraste video-amplificada.

N.T. Generalmente se considera que el primer microscopio compuesto fue construido por los holandeses H. Jansen y Z. Jansen en 1590.

CONCLUSIONES: Por medio de esta práctica se identificaron cada una de las partes del microscopio, para después lograr una buena iluminación y enfoque del mismo al realizar algunas pruebas para este fin con algunas muestras preparadas y otras preparadas por nosotros mismos para observar algunos microorganismos y lograr enfocarlos correctamente, para su posterior estudio. Esta es una práctica indispensable y muy importante ya que uno de los elementos indispensables en microbiología es el microscopio, debido a que en esta materia su principal objetivo de estudio son los

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organismos microscópicos, para los que se requiere este aparato y si no se sabe utilizar correctamente, será muy difícil lograr una buena práctica en laboratorio.

REFERENCIAS: ° http://personales.mundivia.es/mggalvez/micro2.htm

°

TablaAlberts, Bruce, Biología Molecular de la Célula (2da. Edición, Ediciones Omega, Barcelona, 1994) ° Atlas, R.M. (1990) Microbiología, fundamentos y aplicaciones. CECSA: México *Manual de microbiología general: ° Departamento de Microscopia de Carl Zeiss (1980) La microscopia desde el principio. México

°

Madigan, M. T.; Martinko, J.M. Y Parker, J. (1997) Block. Biología de los microorganismos. 8ª ed. Prentice Hall. Iberia, España.

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