1ra Y 2da Practica Bio

PONTIFICIA UNIVERSIDAD CATOLICA MADRE Y MAESTRA FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD DEPARTAMENTO DE MEDICINA BIOLOGIA CELULAR Y GENETICA DRA. MARIANA MORENO - Guia para la discusión 1. Partes del Microscopio Optico 2. Concepto de Poder de resolucion de un Microscopio. 3. Tecnicas para preparar el Tejido para ser estudiado en el Microscopio Optico a- Fijación ( formalina al 10%) b- Inclusión en parafina. c- Corte en el Microtomo d- Tincion ( Hematoxilina – Eosina H-E) 4. Similitudes y diferencias entre el Microscopio Optico y el Microscopio Electronico. 5. Microscopia Electronica de Transmisión y Microscopioa Electronica de Barrido. a- Contraste negativo. b- Sombreado metalico. c- Criofractura – réplica. 6. Citoquimica 7. Histoquímica. 8. Inmunohistoquimica. 9. Fraccionamiento Celular. 10. Tecnica Western (Electroforesis de Proteinas) 11. Tecnica de hibridación de Acidos Nucleicos. 12. Tecnica de Hibridación In situ. 13. Tecnica Southern ( Localizacion de genes o secuencias de DNA) 14. Tecnica Northern ( Localizacion de genes o secuencias de RNA) 15. Reaccion en Cadena de Polimerasa ( PCR ) 16. Cultivo de Celulas y Tejidos.

PONTIFICIA UNIVERSIDAD CATOLICA MADRE Y MAESTRA FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD DEPARTAMENTO DE MEDICINA BIOLOGIA CELULAR Y GENETICA DRA. MARIANA MORENO 1RA PRACTICA BIOLOGIA CELULAR EL MICROSCOPIO El ojo humano no logra distinguir objetos de menos de 50 micras de diámetro ni consigue resolver dos líneas separadas por menos de 100 micras (es decir, las ve como una sola línea). Para observar elementos tan pequeños es necesario disponer de lentes de aumento. Estas lentes se conocen desde tiempos de Arquímedes, pero la óptica como disciplina se comenzó a desarrollar en el siglo XIII con el monje franciscano Roger Bacon. Anton Van Leeuwenhoek (Holanda, 1632-1723), un pulidor de lentes aficionado, logró fabricar lentes lo suficientemente poderosas como para observar bacterias, hongos y protozoos, a los que llamó "animálculos". El primer microscopio compuesto fue desarrollado por Robert Hooke. A partir de éste, los avances tecnológicos permitieron llegar a los modernos microscopios de nuestro tiempo, los que existen de varios tipos y son usados con diferentes fines.

TIPOS DE MICROSCOPIOS MICROSCOPIOS ÓPTICOS Microscopio de campo claro: es el microscopio óptico compuesto utilizado en la mayoría de los laboratorios. Para formar una imagen a partir de un corte histológico usa luz visible, por esto la muestra debe ser lo bastante fina como para que los haces de luz puedan atravesarla. También se usan métodos de tinción, según las necesidades, con el fin de aumentar los detalles en la imagen. Microscopio de contraste de fase: posibilita la observación de muestras sin colorear, por lo que resulta útil para estudiar especímenes vivos. Microscopio de interferencia: es una modificación del anterior que permite la cuantificación de masa en los tejidos. Microscopio de interferencia diferencial: también es una modificación del microscopio de contraste de fase, que permite estudiar las propiedades de superficie de las células. Microscopio de fluorescencia: permite la observación de estructuras fluorescentes, ya sea naturales o artificiales. Microscopio de barrido confocal: se usa para estudiar la estructura de sustancias biológicas. Combina partes de un microscopio de campo claro con equipo fluorescente y un sistema de barrido que emplea un rayo láser. A través de una computadora se reconstruye la imagen tomada por planos, a una imagen tridimensional. Microscopio de luz ultravioleta: sus resultados se registran fotográficamente ya que la luz U.V. no es visible y daña la retina. Se utiliza en la detección de ácidos nucleicos, que absorben esta luz. Microscopio de luz polarizada: es una modificación del microscopio de campo claro. Debido al fenómeno de birrefringencia se pueden observar sustancias cristalinas y moléculas fibrosas.

MICROSCOPIOS ELECTRÓNICOS Microscopio electrónico de transmisión (MET): utiliza un haz de electrones para producir la imagen. Permite la observación de detalles a escala macromolecular.

Microscopio electrónico de barrido (MEB): en este caso el haz de electrones no atraviesa la muestra, sino que choca contra su superficie. Permite una gran magnificación de las imágenes.

EL MICROSCOPIO DE CAMPO CLARO Es el principal medio que utilizaremos a lo largo de toda la materia para observar la morfología de los tejidos a estudiar, por lo que debemos conocer en detalle sus partes y el funcionamiento de cada una de ellas. Sistema Mecánico Pie Vastgo o columna Tornillos de ajuste macrométrico Micrométrico Tubo Platina Subplatina Sistema Óptico De Observación Ocular Objetivo De iluminación condensador Espejo Fuente de luz

SISTEMA MECÁNICO Este sistema sostiene al sistema óptico y aloja los elementos necesarios para la iluminación y enfoque del preparado. Pie: brinda apoyo y estabilidad al aparato. Vástago: soporta la platina, tubo y tornillos de ajuste macro y micrométrico. Tornillo de Ajuste: provocan el desplazamiento del tubo o la platina en sentido vertical, lo que permite el enfoque. Tubo: en su extremo superior se halla el ocular, y en el inferior el objetivo. Se trata de un cilindro metálico cuyo interior se encuentra pintado de negro, lo que evita la reflexión de la luz. Normalmente tiene una longitud de 170 mm. Platina: es una plataforma horizontal sobre la cual se coloca y sujeta el preparado a observar, tiene un orificio central que permite el paso de la luz y un venier que posibilita la relocalización de los detalles de interés. Subplatina: sostiene al condenador y se ubica por debajo de la platina.

SISTEMA ÓPTICO Se compone de un sistema óptico de observación y un sistema óptico de iluminación; el primero consta de: Objetivo: está formado por un sistema de pequeñas lentes ubicadas muy cercanas una de la otra, la que se halla en el extremo distal del objetivo se denomina lente frontal. Los objetivos pueden ser objetivos a seco (no hay ninguna sustancia interpuesta entre la lente frontal y el preparado), u objetivos de inmersión (entre la lente frontal y el preparado se coloca una sustancia cuyo índice de refracción es muy similar al del vidrio).

Ocular: es un tubo cilíndrico con un diafragma fijo en el centro y una lente en cada extremo, la superior se denomina lente ocular y la inferior lente colectora. El sistema óptico de iluminación consta de: Condensador: concentra el haz de luz sobre el plano del objeto que se encuentra en la platina. Debajo de él se encuentra el diafragma iris que regula la cantidad de luz que llega al condensador. Fuente de Luz: es una lámpara que está ubicada en la parte inferior del aparato, en caso de no poseerla debe ubicarse una fuente de luz externa (lámpara incandescente común) aproximadamente a 30 cm. del espejo.

CARACTERISTICAS DE LOS OBJETIVOS: ESCALA DE REPRODUCCIÓN: relación lineal que existe entre el tamaño del objeto y su imagen, por ejemplo, 4:1, 40:1, 65:1, etc. PODER DEFINIDOR: es la capacidad del objetivo de formar imágenes de contornos nítidos. LÍMITE DE RESOLUCIÓN: es la menor distancia que debe existir entre dos objetos para que puedan visualizarse por separado. PODER DE RESOLUCIÓN: es la capacidad de mostrar la imagen en sus detalles más finos. Está en relación inversa con el límite de resolución. PODER DE PENETRACIÓN: es la propiedad de permitir la observación simultánea de varios planos del preparado. Es inversamente proporcional a la escala de reproducción o aumento. DISTANCIA FRONTAL: es la distancia de la lente frontal al preparado colocado en la platina, cuando está enfocado. Disminuye cuando aumenta la escala de reproducción del objetivo. AUMENTO TOTAL: Debemos notar que el ocular también tiene un aumento, por lo tanto el aumento total de la imagen que observamos es el producto entre el aumento del objetivo y el del ocular. Ejemplo: si tenemos colocado el objetivo cuya escala de reproducción es 40:1 y nuestro ocular tiene un aumento de 10x, entonces el aumento total será 40 x 10 = 400. USO CORRECTO DEL MICROSCOPIO DE CAMPO CLARO 1. Lo primero es conseguir una buena fuente de iluminación. Si la misma está incorporada al microscopio, enfocamos con el objetivo de menor aumento, cerramos el diafragma de campo y movemos el condensador hacia arriba y hacia abajo hasta que el contorno del diafragma se vea nítido. El diafragma se centra con los tornillos que lo sujetan a la subplatina. Luego se quita el ocular y se verifica que la luz esté centrada. A medida que se abre el diafragma su contorno desaparece del campo observado. Si la fuente de luz es externa, se quita el ocular, se coloca el objetivo de menor aumento, y se mueve el espejo hasta centrar la luz. Recordemos que si tenemos condensador debemos usar la cara plana del espejo.

2. Volvemos a colocar el ocular y, siempre con el objetivo de menor aumento, colocamos el preparado sobre la platina. Utilizando el tornillo el ajuste macrométrico enfocamos lo más claramente posible. 3. El condensador debe estar en la posición más alta y el diafragma abierto. Esto si el preparado está coloreado, sino el diafragma debe estar cerrado. 4. Con el tornillo micrométrico se logra el enfoque fino según nuestra visión. 5. Modificamos la apertura del diafragma hasta obtener la cantidad de luz deseada. 6. Luego de estudiado el preparado con este objetivo, podemos pasar gradualmente a objetivos de mayor aumento, corrigiendo la apertura del diafragma para cada uno de ellos. 7. En caso de utilizar el objetivo de inmersión, se coloca una pequeña gota de aceite sintético sobre el preparado y luego se enfoca con sumo cuidado, recordando que este objetivo es el de menor distancia frontal y corremos el riesgo de estropear el preparado y la lente frontal. Al finalizar el uso de este objetivo se deben retirar los restos de aceite con un papel de carilina o una gasa embebida en xilol o solvente especial para limpieza de lentes, nunca se debe dejar sucio el objetivo. 8. Cuando se termina de utilizar el microscopio se lo debe dejar de la siguiente manera: - fuente de luz apagada - condensador al tope - diafragma abierto - platina alta - objetivo de menor aumento en posición - todas las lentes limpias.

PONTIFICIA UNIVERSIDAD CATOLICA MADRE Y MAESTRA FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD DEPARTAMENTO DE MEDICINA BIOLOGIA CELULAR Y GENETICA DRA. MARIANA MORENO

2DA PRACTICA BIOLOGIA CELULAR INTRODUCCIÓN A LAS TÉCNICAS HISTOLÓGICAS Se define técnica histológica al conjunto de operaciones a que se somete una materia organizada, a fin de posibilitar su estudio al microscopio. El examen al microscopio se hace generalmente por luz transmitida, lo que significa que la luz debe "atravesar" el objeto a examinar para llegar, después de haber pasado por las distintas lentes del aparato, a impresionar a nuestro órgano visual. Por esa causa, debe ser reducido a láminas muy delgadas y transparentes, las cuales lograremos efectuando una serie de operaciones que serán descriptas más adelante. OBTENCIÓN DE LA PIEZA El material a utilizar puede ser extraído de los diversos animales de laboratorio, o bien puede tratarse de material humano. Entre los animales de observación se eligen aquellos que por su semejanza con el ser humano pueden sustituirlo sin grandes diferencias, y cuya obtención y crianza puede ser fácilmente efectuada en el laboratorio. Fases en la obtención de material animal: - Muerte del animal: podemos producirla valiéndonos de un traumatismo brusco, o por la intoxicación a causa de una dosis exagerada de narcótico. - Extracción de los órganos: conociendo la anatomía del animal, debemos dirigirnos directamente a los órganos que nos interesan estudiar. En el caso de que estos sean varios, es conveniente extraer primero los que más fácilmente se descomponen, estos son el páncreas y la porción inferior del tubo digestivo. - Reducción a piezas: teniendo en cuenta que para el tamaño de las piezas debemos considerar muy especialmente las cualidades del fijador a usar, hablaremos de este asunto cuando tratemos la fijación. Obtención de material humano: El hombre no es sujeto de experimentación, esta verdad indiscutible hace que sólo en casos excepcionales se pueda obtener material humano en condiciones de ser estudiado histológicamente. De tres fuentes puede provenir el material humano: las necropsias, las biopsias y las piezas operadas. De éstas, sólo la primera puede darnos material normal; las dos últimas proporcionarán tejidos patológicos. - Necropsias: son las piezas que se obtienen de un cadáver. Para histología normal es necesario que se trate de un cadáver fresco y que no haya sido atacado por ninguna lesión, por lo menos el órgano que se quiere estudiar. - Biopsias: son trozos de tejido que se obtienen de un sujeto con vida con el objeto de estudiarlos al microscopio y efectuar un diagnóstico histopatológico. - Piezas operadas: los tejidos que han sido extraídos de las intervenciones quirúrgicas, generalmente tumores u órganos inflamados, también pueden darnos material de investigación pero, como en el caso anterior, sólo servirán para anatomía patológica. FIJACIÓN La fijación tiene por objeto matar las células y conservarlas, hasta donde sea posible, en el estado en que se encontraban durante la vida. Por lo tanto es un método histológico destinado a obtener preparados duraderos que conservan la estructura morfológica y química de las células y tejidos al

estado vivo y que permite realizar, posteriormente, los procedimientos de coloración o de identificación que facilitan el completo conocimiento de su constitución íntima. Se llaman fijadores a las sustancias químicas o a los agentes físicos que se utilizan para tal fin. Cualidades que debe tener un fijador: 1. Actuar con rapidez, matando y fijando a las células antes de que aparezcan los fenómenos agónicos o post-mortem (autólisis, desintegración, etc.). 2. Poseer alto poder de penetración para asegurar la fijación correcta hasta en las capas profundas de la pieza a fijar. 3. Conservar, en lo posible, los detalles estructurales que presentaban in vivo. 4. Permitir o favorecer el empleo de los procedimientos necesarios para su observación ulterior (ejecución de cortes, coloración, etc.). 5. Impedir la desaparición de los elementos solubles durante la fijación o después de ella. 6. No provocar o impedir la producción de estructuras artificiales. 7. No retraer excesivamente los tejidos ni volverlos friables o quebradizos. Manera de actuar de los fijadores Varía con la composición o naturaleza de los mismos: coagulando las proteínas sin combinarse con ellas (alcohol, ácido pícrico, yodo, calor), formando combinaciones químicas con las sustancias orgánicas (ácido crómico y sus sales), o reduciéndose en contacto con las mismas y originando en su seno un precipitado sumamente fino (ácido ósmico, bicloruro de mercurio, cloruro de oro). La mayor parte de los fijadores actúan como oxidantes, favoreciendo así la coloración ulterior de los tejidos (recuérdese que éstos, en su mayoría, son reductores que muchos colorantes se transforman en leucobases incoloras al combinar una molécula de hidrógeno con su cromóforo). Fijadores químicos Son los más utilizados; pueden ser fijadores simples, constituidos por una sola sustancia química, y fijadores compuestos o mezclas fijadoras cuando varias sustancias intervienen en su constitución. FIJADORES SIMPLES: a) Formol al 10%, es el más usado. Su empleo es aconsejable en todos los casos en que no se disponga de un fijador especial, principalmente cuando se trata de fijar órganos o tejidos para estudios histológicos topográficos. b) Alcohol etílico absoluto o de 96%, se usa generalmente en microquímica. c) Alcohol metílico, se lo emplea con frecuencia para fijar frotis desecados (sangre, médula ósea, ganglio, bazo, líquidos de punción, etc.). d) Ácido ósmico al 1 ó 2%, es poco penetrante pero enérgico, conserva muy bien estructuras celulares. e) Bicromato de potasio al 3-5%. FIJADORES COMPUESTOS: En su composición intervienen un número variable de fijadores simples racionalmente elegidos con el fin de completar la acción de cada uno de ellos o atenuar sus defectos. a) Líquido de Fleming, mezcla cromo-osmio-acética. b) Líquido de Zenker, mezcla bicromato-sublimado-acética. c) Líquido de Helly, mezcla Zenker-formol. d) Líquido de Bouin, mezcla picro-formos-acética.

e) Liquido de Duboscq-Brasil, o Bouin alcohólico. FIJADORES FÍSICOS: 1. Desecación. 2. Calor seco. 3. Calor húmedo. 4. Frío. 5. Congelación y desecación. DESHIDRATACIÓN E INCLUSIÓN EN PARAFINA Deshidratación Las piezas al ser retiradas del fijador, o después de haberlas lavado, están embebidas en agua; impidiendo que sean penetradas por la parafina. Por lo tanto, en primer lugar, debemos deshidratar los tejidos sumergiéndolos en líquidos anhidros, ávidos de agua. Para evitar alteraciones provocadas por una deshidratación brusca, se aconseja proceder escalonadamente utilizando, preferentemente, alcohol etílico de graduación creciente. Impregnación por un disolvente de la parafina (aclaración) Las piezas perfectamente deshidratadas se sumergen en el disolvente, xilol o toluol (este último es el que nosotros utilizamos). Al agregar el toluol, no debe aparecer ninguna turbidez. Si se pone blancolechoso es que la deshidratación no ha sido bien lograda y debemos repetir el baño de alcohol absoluto cerciorándonos que realmente lo sea: una gota de alcohol agregada a unos ml de toluol no debe enturbiarlo. Penetración de la parafina Se sumergen las piezas en parafina (56-58º de punto de fusión), mantenida líquida en la estufa a no más de 62ºC. Después de 1 a 2 horas se renueva la parafina. Inclusión definitiva o formación del bloque En moldes de papel o de metal ad-hoc (barras de Leuckart) se vierte la parafina fundida, del mismo punto de fusión de la que ha servido para la penetración. Se colocan las piezas orientándolas y luego se pone el molde en heladera. A los 15-30 minutos la parafina se habrá solidificado completamente, recortamos los bloques en forma de pirámide cuadrangular truncada, lo adherimos a un taquito de madera mediante una espátula calentada con la llama de un mechero y ya podemos realizar los cortes con el micrótomo.

OBTENCIÓN DE CORTES El objeto de la inclusión que hemos descripto anteriormente es hacer posible la reducción del tejido a cortes lo suficientemente delgados como para permitir el paso de la luz para examinarlo al microscopio. Los micrótomos son instrumentos de gran precisión que nos proporcionan cortes delgados parejos y de espesor graduable. Los cortes más corrientes son los de 4-6 micrones. Consideraremos cuatro tipos de micrótomos: el de deslizamiento, el tipo Minot, el de congelación, y el crióstato o criótomo. - Tipo deslizamiento: en este caso la pieza queda fija mientras la cuchilla se desliza por unas guías especiales merced a un soporte al que se sujeta la cuchilla con unos tornillos.

- Tipo Minot: en este caso la cuchilla queda fija y es la pieza la que se desliza sujeta a una platina, ésta se desliza verticalmente cuando se hace girar una manivela. Permite obtener cortes seriados en forma de cinta.

- Tipo congelación: se parece al de deslizamiento, pero la cuchilla o navaja, en lugar de deslizarse, gira sobre un eje. Por otra parte, el aparato se caracteriza por tener un sistema de congelación colocado debajo de la platina que utiliza la expansión brusca del anhídrido carbónico contenido en un cilindro con el cual se comunica. - Crióstato: consta de un micrótomo tipo Minot incluido en una cámara de congelación. El volante de inercia que controla la realización del corte permanece en el exterior, mientras que la cuchilla y el mecanismo de avance están situados dentro de la cámara fría (normalmente a -20º C). Pese a la disposición horizontal de la cuchilla, la obtención de secciones seriadas es posible gracias a la existencia de un sistema anti-enrollamiento que obliga al corte a deslizarse sobre la superficie de la cuchilla. En los modelos más modernos es posible optar por el corte manual o motorizado, así como enfriar rápidamente la muestra a -60º C gracias a la existencia de una placa de congelación instantánea. Frente al micrótomo convencional de congelación, el crióstato posee la gran ventaja de permitir la obtención de cortes mucho más delgados (por lo general de 4 µm y, en manos experimentadas, hasta 2 µm). Los cortes de parafina se extienden, al obtenerlos del micrótomo, en agua tibia contenida en un cristalizador. En ese mismo agua se introducen portaobjetos, previamente desengrasados, cubiertos con una capa de adhesivo de Mayer y, con la ayuda de una aguja histológica, se colocan los cortes sobre el portaobjetos y a continuación se lo levanta. COLORACIÓN Luego de realizado el corte, se procede a rehidratarlo para permitir su coloración. Colorantes: reciben esta denominación las sustancias que pueden conferir color a otros cuerpos. Coloración: es el proceso mediante el cual un cuerpo es teñido por una sustancia colorante, sin perder el color cuando es lavado con el disolvente utilizado al preparar la solución colorante. Clasificación de los colorantes: Según su origen se clasifican en: COLORANTES NATURALES: - Animales (carmín) - Vegetales (hematoxilina, orceína, azafrán) COLORANTES ARTIFICIALES O SINTÉTICOS (COLORES DE ANILINA): - Ácidos: sales cuya base es incolora y su ácido es coloreado (eosina o eosinato de sodio). Son colorantes citoplasmáticos. - Básicos: sales cuya base es coloreada y el ácido es incoloro (azul de metileno o clorhidrato de azul de metileno). Son colorantes nucleares. - Neutros: sales en las que tanto el ácido como la base son coloreados. Tiñen el núcleo de un color y el citoplasma de otro. - Indiferentes: no forman sales. Tiñen aquellas sustancias que tienen un poder disolvente superior al del líquido que ha servido para preparar la solución colorante (Sudán lll, rojo escarlata). Por otro lado, las coloraciones pueden ser: - Ortocromáticas: los tejidos adquieren un color igual al de la solución colorante empleada. - Metacromáticas: una sustancia o un componente celular se tiñe con un color diferente al del colorante empleado.

Métodos de coloración: - Coloración directa: existe una verdadera afinidad entre el colorante y el objeto. - Coloración indirecta: requiere la intervención de intermediarios o mordientes para que la coloración tenga lugar. - Coloración progresiva: se hace actuar el colorante hasta que llegue a su punto óptimo. - Coloración regresiva: se realiza primero una sobrecoloración y luego se elimina el resto del colorante por medio de diferenciadores. A este proceso se lo denomina diferenciación. - Coloración simple: se colorean solamente algunos elementos del preparado (núcleo, fibras elásticas, etc.). - Coloración combinada: se tiñen los elementos nucleares y citoplasmáticos recurriéndose, generalmente, al empleo sucesivo de colores básicos y ácidos que contrastan por sus colores. - Coloración panóptica: es una coloración combinada realizada sucesivamente por colorantes neutros (May-Grünwald-Giemsa). - Coloración pancrómica: en un solo baño colorante actúan todos los colorantes neutros que se necesiten. Colorantes más utilizados en histología humana: HEMATOXILINA: - Es un colorante vegetal. - Para ser utilizada debe ser oxidada previamente. Los agentes oxidantes pueden ser: el aire (varios meses de exposición) u oxidantes artificiales (óxido de mercurio, permanganato de potasio, dicromato potásico, etc.) - Es un colorante directo, pero en la práctica se lo utiliza en forma de lacas hematoxilínicas (se utiliza alumbre de potasio o de sodio como mordiente para preparar la solución colorante), comportándose en este caso como un colorante indirecto. EOSINA: - Es un colorante artificial (se trata de derivados hidroxixanténicos halogenados con tres grupos arilo). - Presenta autofluorescencia espontánea. - Se la emplea tanto en soluciones acuosas como alcohólicas. Para colorear se emplea generalmente una batería de coloración. MONTAJE Luego de la coloración, se deshidrata el corte y se procede a la aclaración y montaje definitivo, dado que nos hemos propuesto hacer un preparado en condiciones de ser observado y protegido del ambiente para evitar su deterioro. La deshidratación se realiza con alcoholes de graduaciones crecientes. La aclaración se realiza con xilol o carboxilol. El objetivo de este paso es impregnar el corte con un disolvente del Bálsamo de Canadá, que al mismo tiempo le confiere un índice de refracción semejante al del vidrio. Para el montaje se limpia el portaobjeto alrededor del corte y se deposita sobre el mismo una gota de Bálsamo de Canadá disuelto en xilol y se cubre con un cubreobjeto. Se deja secar unas horas antes de su observación al microscopio. PROTOCOLO GENERAL A continuación se presenta el protocolo de trabajo utilizado por nuestra cátedra para la técnica de Hematoxilina - Eosína para preparados de uso didáctico: I. Fijación

En formol al 10% (1 parte de formol y 9 partes de agua destilada) por lo menos durante 6 hs. II. Corte Se le da el tamaño deseado a la pieza y se la coloca en una bolsa de gasa, con el fin de enjuagarla en agua corriente durante, por lo menos, 15'.

III. Deshidratación 1) 2) 3) 4) 5)

Alcohol 70º, 1h30'. Alcohol 96º, 1h30'. Alcohol 100º (l), 1h30'. Alcohol 100º (ll), 1h30'. Toluol, entre 1h30' y 3hs.

IV. Inclusión 1) 2) 3) 4) 5) 6)

Secado de la muestra con gasa. Parafina 56º (l), 1h30'. Parafina 56º (ll), 1h30'. Formación de la barra. 30' de frezzer. Fractura del taco

V. Corte VI. Coloración 1) Secado de los cortes en estufa a 58ºC, 15'. 2) Xilol o toluol (I), 15' en estufa. 3) Xilol o toluol (II), 2'. 4) Alcohol 100º, 30". 5) Alcohol 96º, 30". 6) Alcohol 70º, 30". 7) Alcohol 50º, 30". 8) Agua destilada, 30". 9) Hematoxilina, 1´30". 10) Agua corriente, 2´. 11) Alcohol 50º, 15". 12) Eosina, 30". 13) Alcohol 96º, 10". 14) Alcohol 100º, 10". 15) Xilol, 1´ por lo menos. 16) Montaje con Bálsamo de Canadá sintético.