18941286-null

Akta Kimindo Vol. 2 No. 2 Oktober 2007: 109-112

Akta Kimindo Vol. 2 No. 2 April 2007: 109 – 112

AKTA KIMIA

INDONESIA

Isolasi Enzim Lipase Termostabil Dari Bakteri Termofilik Isolat Air Panas Banyuwedang Kecamatan Gerogak, Buleleng Bali‡ I Nyoman Tika1,*, I W Redhana1 dan Ni Putu Ristiati2 1Jurusan 2Jurusan

Pendidikan Kimia,FPMIPA, IKIP Negeri Singaraja, Jl. Udayana, Singaraja Pendidikan Biologi, FPMIPA, IKIP Negeri Singaraja, Jl. Udayana, Singaraja

ABSTRAK Isolasi enzim lipase termostabil dari bakteri termofilik dari sumber air panas Banyuwedang Kecamatan Gerogak Buleleng Bali telah dilakukan. Seleksi bakteri termofilik penghasil lipase dengan menggunakan media sensitive plate assay mengandung Rhodamin B ditemukan 4 koloni bakteri yang berpendar (BYW1, BYW2, BYW3 dan BYW4). Isolat lokal Banyuwedang ditumbuhkan dalam media cair ½ LB (Lauria Bertani) pada suhu 50ºC. Aktivitas spesifik ekstrak enzim kasar masing-masing isolat BYW1, BYW2, BYW3 dan BYW4 Banyuwedang berturut-turut sebesar 0,87 unit/mg; 1,12 unit/mg; 0,55 unit/mg; dan 0,35 Unit/mg. Kata kunci : Bakteri termofilik, enzim lipase, air panas Banyuwedang ABSTRACT Isolation of thermostable lipase enzym from thermophillic bacteria isolated from hot spring Banyuwedang Kecamatan Gerogak Buleleng was carried out. Thermophilic bacteria were selected using Rhodamin B media sensitive plate assay. It was found four colonie flourecence bacteria (BYW1, BYW2, BYW3 and BYW4). Isolated bacteria from Banyuwedang were grown in Lauria Bertani (LB) media at temperature 50oC. The specific activity of lipase crude enzymes isolated from Banyuwedang : (BYW1, BYW2, BYW3 and BYW4) were 0.87 unit/mg; 1.12 unit/mg; 0.55 unit/mg and 0.35 Unit/mg, respectively. Keywords : - thermophilic bacteria, lipase enzyme, hot spring Banyuwedang PENDAHULUAN Enzim lipase termostabil atau asilgliserol hidrolase (E.C 3.1.1.3) merupakan enzim yang dapat menghidrolisis rantai panjang trigliserida. Enzim ini memiliki potensi untuk digunakan memproduksi asam lemak, yang merupakan prekursor berbagai industri kimia. Produksi asam lemak secara industri menggunakan katalis kimia menghasilkan efek samping bagi lingkungan. Selain itu enzim lipase telah banyak dikenal memiliki cakupan aplikasi yang amat luas dalam bidang bioteknologi, seperti biomedikal, pestisida, pengolahan limbah, industri makanan, biosensor, detergen, untuk industri kulit dan industri oleokimia (memproduksi asam lemak dan turunannya) (Macrae,A.R.,1983). ‡ Makalah ini disajikan pada Seminar Nasional Kimia VIII, di Surabaya 8 Agustus 2006 * Corresponding author. Tel. : 0362-25072-; Fax : 036225735 ; e-mail : [email protected]

© Kimia ITS – HKI Jatim

Enzim lipase termostabil dari bakteri termofilik merupakan enzim yang sangat potensial untuk mengatasi kendala teknis industri, namun masih ditemukannya kendala lain, dalam hal perolehan hasil (yield) enzim lipase termostabil dari mkroorganisme termofilik yang sangat rendah. Untuk mengatasi kendala itu beberapa pendekatan ditempuh sebagai berikut : pertama pencarian sumber baru enzim lipase termostabil dari mikroorganisme termofilik yang tumbuh dari habitat yang unik. Kedua, suhu fermentasi yang sesuai untuk menghasilkan lipase termostabil. Dan ketiga, rekayasa genetika untuk menghasilkan enzim lipase termostabil dengan ekspresi tinggi. Pendekatan dengan mencari sumbersumber enzim baru dari mikroorganisme termofilik yang diisolasi dari lingkungan unik merupakan langkah yang paling memungkinkan dilakukan, karena Indonesia memiliki banyak sumber air panas yang potensial dan unik. Sumber air panas yang ada di Bali sudah dikembangkan sebagai obyek wisata namun 109

Nyoman, Redhana dan Ristiati - Isolasi Enzim Lipase Termostabil Dari Bakteri Termofilik Isolat Air Panas Banyuwedang

belum digali sebagai sumber mikroorganisme termofilik. Penelitian mikroorganisme termofilik sumber air panas masih belum banyak dilakukan. Beberapa diantaranya telah diteliti isolasi bakteri termofilik untuk menghasilkan enzim DNA polimerase ( Akhmaloka, dkk., 2000, Suharto dkk, 2002. Tika dkk., 2003) Pendekatan ini merupakan langkah yang menarik untuk mengungkap biodiversitas komunitas mikroorganisme termofilik Indonesia. Oleh karena itu tujuan penelitian ini adalah untuk mendapatkan isolat-isolat bakteri termofilik dari sumber air panas, dan khususnya isolat-isolat bakteri termofilik yang dapat menghasilkan enzim lipase termostabil dari sumber air panas di Propinsi Bali.

water bath. Emulsi yang terbentuk dicampur minyak olive dan 50 mL bufer posfat. Diinkubasi pada suhu 50°C. Reaksi dihentikan dengan penambahan 6 N HCl (1 mL) dan isooktan 5 mL, lalu cairan ditambah isooktan 4 mL dipindahkan ke tabung analisis, ditambahkan reagen Cu (tembaga) dan larutan tembaga II asetat 1-hidrat pH 6,1 yang mengandung piridin. Larutan pada lapisan atas tabung diukur pada panjang gelombang 715 nm.

ALAT DAN BAHAN Bahan–Bahan yang digunakan Rhodamin B untuk sensitive plate assay, phytagel. Substrat yang digunakan adalah minyak olive dan bahan kimia lain dengan derajat proanalisis.

HASIL DAN PEMBAHASAN HASIL Penelitian Lokasi Banyuwedeng air panas 60-70 derajat Celsius, dan sering berubah karena bercampur dengan sumber air tawar yang juga digunakan oleh penduduk, serta adanya rembesan air payau dari pantai. Hal yang sama juga terjadi untuk sumber air panas Toya Bungkah, resapan air danau menyebabkan suhu relatif tidak tinggi.

PROSEDUR PENELITIAN Identifikasi bakteri termofilik dan isolasi enzim lipase Identifikasi bakteri termofilik isolat lokal (Bali) penghasil lipase meliputi uji enzim lipase, morfologi dan pewarnaan gram. Uji aktivitas dilakukan menurut Sensitive Plate Assay (Kouker and Jaeger, 1987) dan titrasi. Koloni tunggal yang tumbuh pada media padat LB ditumbuhkan pada media yang mengandung Rhodamin B. Diinkubasi selama 2 x 24 jam pada suhu 50oC. Selanjutnya disinari dengan sinar UV dan diukur halo yang terbentuk. Uji aktivitas lipase termostabil Aktivitas enzim lipase termostabil menggunakan metode yang dikembangkan oleh Kwon et al., 1986. Ada tiga tahap, pertama, filtrat kultur (1 mL) dikocok dengan emulsi 2,5 mL (1:1,v/v) minyak olive (70% residu oleate). Kedua 20 µL CaCl2 0,02 M yang dikocok 200 rpm dalam

Penentuan Kadar Protein Kadar protein larutan enzim ditentukan dengan menggunakan metode Bradford, (Braford, 1976) dengan reagen dari Bio-Rad Protein Assay, dengan menggunakan bovin serum albumin (BSA) sebagai standar.

Gambar 1. Isolat bakteri termofilik Banyuwedang pada media Rhodamin B , suhu 65 oC, sedangkan E.coli tidak ditemukan

Tabel.1. Aktivitas masing masing biakan terhadap uji SPA (Media Rhodamin B)

No. 1.

Isolat dari Sumber air panas Banyuwedang

Indeks (Halo) (mm)

Jumlah koloni yang aktif Uji SPA

Jumlah Isolat koloni aktif terhadap Uji SPA.

4

BYW1

0,8

BYW2

0,9

BYW3

0,5

BYW4

0,3

Keterangan: SPA = Sensitive Plate Assay 110

© Kimia ITS – HKI Jatim

Akta Kimindo Vol. 2 No. 2 Oktober 2007: 109-112

Tabel 2. Aktivitas enzim ekstraseluler crude enzim lipase isolat lokal (Bali) No.

1. 2. 3. 4.

Isolat

Aktivitas (unit/mL)

Volume (mL)

Protein Total (mg)

24

4,37

1,6 x 10-4

4,90

BYW1 BYW2

25

BYW3

25

BYW4

9,10

22

5,66

Aktivitas spesifik (Unit/mg)

Aktivitas Total (unit) 3,84 x 10 -3

0,87

2,2 x

10-4

5,50 x 10

-3

1,12

2,0 x

10-4

5,00 x 10

-3

0,55

0,9 x

10-4

1,98 x 10

-3

0,35

Satu unit aktivitas lipase didefinisikan sebagai aktivitas enzim lipase yang dapat membebaskan 1 µmol asam lemak per menit.

Aktivitas relatif (%)

100 75 50 25 0 BYW1

BYW2

BYW3 BYW4 Isolat Banyuwedang

Gambar 2. Perbandingan aktvitas enzim ekstrak kasar lipase bakteri termofilik hasil isolasi dari sumber air panas Banyuwedang). 1

2

3

4 5

KDa 94 67 40 30 24 14

Gambar 3. Elektroforegram SDS-Page ekstrak enzim kasar isolat Banyuwedang (1) Standar : Ekstrak kasar lajur (2) BYW4, (3) BYW3, (4) (BYW2, (5) BYW1. Dalam teori BM lipase berkisar antara 3060 Kda, pita tebal pada lajur 4 diduga adalah lipase termostabil, hal ini sesuai dengan Halo yang ditunjukkan terbesar pada isolat BYW2. Pembahasan Mikroorganisme penghasil lipase tersebar luas di alam, termasuk sumber air panas, karena © Kimia ITS – HKI Jatim

telah ditemukan beberapa bakteri yang memiliki sifat termostabil. Ketahanan beberapa jenis bakteri pada suhu tinggi karena mampu membentuk spora (endospora) (Madigan,et al., 1997; Breithaupt, 2001) Endospora genus Bacillus memunculkan dugaan bahwa Bacillus termasuk salah satu kelompok mikroorganisme sel purba, karena sebarannya amat luas di muka 111

Nyoman, Redhana dan Ristiati - Isolasi Enzim Lipase Termostabil Dari Bakteri Termofilik Isolat Air Panas Banyuwedang

bumi dan ada beberapa jenis Bacillus yang dapat tumbuh baik pada suhu tinggi (Oskam,1963). Habitatnya yang luas memungkinkan genus ini mudah ditemukan baik di udara, air maupun di tanah. Enzim lipase yang dihasilkan oleh bakteri termofilik biasanya dihasilkan pada seluruh fase kehidupan mikroorganisme (Brockman, et al., 1988). Enzim ini digunakan untuk memecah lemak menjadi komponen asam lemak, yang amat dibutuhkan dalam metabolisme mikroorganisme yang bersangkutan. Enzim ini bersifat konstitutif artinya terus-menerus diekspresi tanpa membutuhkah induser. Ekspresi enzim lipase meningkat saat mikroorganisme memasuki fase kematian karena jumlah produk lemak dari sel-sel yang mati meningkat (Madigan, 1994). Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa aktivitas tertinggi ekstrak enzim kasar isolat Banyuwedang BYW2. Hal ini juga dibuktikan dengan reaksi antara Rhodamin B dengan asam lemak, dimana produk dari kerja enzim lipase yang dihasilkan oleh isolat BYW2 membentuk kompleks dan berpendar membentuk halo (Kauker and Jaeger, 1987, Pao and Omar, 2004). Makin besar diameter pendaran semakin banyak enzim lipase yang diekspresi oleh bakteri termofilik. KESIMPULAN Hasil isolasi enzim lipase termostabil dari bakteri termofilik yang berasal dari sumber air panas Banyuwedang Kecamatan Gerogak Buleleng Bali ditemukan 4 koloni bakteri yang berpendar dalam media Rhodamin B (BYW1, BYW2, BYW3 dan BYW4). Isolat lokal Banyuwedang ditumbuhkan dalam media cair ½ LB (Lauria Bertani) pada suhu 50 ºC. Aktivitas spesifik ekstrak enzim kasar masing-masing isolat BYW1, BYW2, BYW3 dan BYW4 Banyuwedang berturut-turut sebesar 0,87 unit/mg; 1,12 unit/mg; 0,55 unit/mg dan 0,35 Unit/mg. UCAPAN TERIMA KASIH Penulis menyampaikan terima kasih kepada Program Penelitian Dasar Dirjen Dikti, Depdiknas RI Tahun 2006.

112

DAFTAR PUSTAKA Akhmaloka, I.N.Tika, H.Pramono and M. Sindumarta (2000a), Isolation and characterization of DNA polymerase from a local thermophilic microorganism, J.M.S., 4, 335-343. Akhmaloka, H.Pramono, I.N.Tika, A.Suharto, D.S. Retnoningrum, M. Sindumarta, K.Padmawinata, dan B.L. Oei (2000b), Eksplorasi potensi bakteri termofilik isolat lokal : Studi kasus DNA polmerase termostabil, Proseding Seminar hasil penelitian dan pengembangan Bioteknologi II, Cibinong 7-9 Maret 2000: 31-39. Bradford, M. M. (1976), A rapid and and sensitive Method for the Quantitation of Microgram Quantities of protein utilizing the principle of protein–Dye Binding, Anal.Biochem., 72, 248-254. Breithaupt, H. (2001), The Hunt for living gold: The search for organisme in extreme yields useful enzymes for industry, EMBO report, 2(11): 968-971 Brockman, H.W., W.E. Morsen and T. Tsuijita (1988), The Biology, biochemistry and technology of lipase. J.Am. Oil Chem.Soc., 65, 891-896. Macrae,A.R. (1983), Extracelullar microbial lipases. In “Microbial Enzymes and biotecknology’, ed. Fogarty, W.M., Applied Science Publiser Ltd, England, pp.225-250. Madigan, M.T., J. M. Martindo and J.Parker (1997), Brock Biology of Microorganisms, Eight Ed., Prentice Hall Int., Inc, New York. Oskam, L. (1963), Characterization of plasmids for gene cloning in Bacilli at hight temperatures, Poefschrift, Rijksuniversiteit Groningen. Suharto, A.R. (2002), Identifikasi Mikroorganisme Termofilik Isolat Papandayan dengan penetuan urutan dan analisisa gen 16 rRNA, Skripsi, Dept. Kimia ITB. Bandung. Tika, I N., H. Pramono, M. Sindumarta, K. Padmawinata dan Akhmaloka (2003),Isolasi dan Karakterisasi Bakteri Termofilik dari Sumber Air Panas Cimanggu, Bandung, Jawa Barat, PIT, Permi., 29-30 agustus 2003.

© Kimia ITS – HKI Jatim