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Tema 6: transcripción La transcripción es el proceso encargado de la síntesis de una molécula de RNA a partir de la información genética contenida en una región codificante te DNA de doble cadena. . Esta catalizado en todos los organismos por RNA polimerasas dependientes de DNA (transcriptasas) cuyo molde es el ADN y el producto el ARN. (No confundir con transcriptasas inversas cuyo molde es el ARN y el producto ADN). El RNA que se obtiene tiene una secuencia de bases complementaria y antiparalela a la de una de las cadenas del DNA (hebra molde). (Se utiliza la región doble hebra de la región codificante, aunque luego se use una cadena solo. El ADN da lugar a ARN que puede ser mensajero (producto intermedio) transferente o ribosómico (productos finales). ANALOGIAS ENTRE REPLICACION Y TRANSCRIPCION (requerimientos, apareamiento de bases lectura 3’-5’ y síntesis 5’-3’, fases de inicio, elongación y terminación)

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Ambos procesos requieren DNA molde en estructura desenrolladla, 4 tipos de nucleótidos 5’-trifosfato e iones de Mg+. Polimerasas: Las enzimas que llevan a cabo la obtención de RNA son también polimerasas: RNA polimerasas. La RNA polimerasa elonga una cadena de RNA por adición de unidades de ribonucleótido al extremo 3’-OH de la cadena. La síntesis del RNA transcurre siempre en dirección 5’3’ y la lectura del DNA en dirección 3’5’. La reacción global es: (RNA)n + NTP   (RNA)n+1 +PPi Idénticas reglas de selección de nucleótidos (apareamiento de bases): A=U, C=G. En este caso también hay fase de unión e iniciación, elongación y terminación.

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DIFERENCIAS ENTRE TRANSCRIPCION Y REPLICACION: 1. Las RNA polimerasas no requieren un cebador para iniciar la síntesis. La síntesis del RNA comienza generalmente con un residuo ATP o GTP. El trifosfato se mantiene, no tiene porque desaparecer. 2. Durante la replicación se copia el cromosoma entero, dando un DNA hijo que es idéntico al DNA parental. Todas las moléculas de la célula se replican a la vez, y lo hacen una sola vez durante el ciclo celular. Sin embargo, la transcripción es SELECTIVA: No todos los genes se transcriben a la vez durante la vida de la célula. En un momento determinado se transcribe sólo un gen determinado o un grupo de genes.

3. La transcripción es ASIMÉTRICA: solamente se transcribe una de las dos cadenas del DNA para cada gen. Se transcriben zonas de una cadena y zonas de otra, estando el gen solamente en una de las dos cadenas que se transcribirá para dar lugar a esos transcritos. (la replicación es simultanea e idéntica n las dos hebras). Además en la replicación se da lugar a una sola molécula hija mientras que en la transcripción se dan lugar a múltiples cadenas de ARN para distintos fines.

4. La transcripción utiliza ribonucleótidos 5'-trifosfato (ATP, GTP, UTP y CTP) en lugar de desoxirribonucleótidos 5'-trifosfato (dATP, dGTP, dTTP y dCTP).

5. La RNA polimerasa carece de actividad correctora exonucleasa 3'5'. Así durante la transcripción se producen más errores que en la replicación del DNA pero tiene menos consecuencias para la célula ya que de un solo gen se producen muchas copias de RNA que serán finalmente degradadas y remplazadas por otras.

6. En la fase de elongación, el extremo en crecimiento de la nueva cadena de RNA se aparea temporalmente con el DNA molde, originando una doble hélice híbrida RNA-DNA de ~ 8 pb de longitud. El RNA en este dúplex híbrido se separa poco después de su formación.

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ORIENTACION Y NOMENCLATURA DE LAS CADENAS EN RELACION A LA SINTESIS DE RNA (EXAMEN) En un gen, las dos hebras de DNA tienen papeles diferentes en la transcripción: 

La hebra que sirve de MOLDE se denomina como hebra molde, hebra (-), hebra no codificante…. Siempre tiene que tener orientación contraria al transcrito.

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La cadena que NO ES MOLDE tiene la misma secuencia de bases que el RNA producto de la transcripción (excepto por la sustitución de U por T). Por eso a dicha hebra se denomina hebra codificante o hebra (+). Misma orientación que el transcrito.

Por convención, cuando se indica una cadena de DNA, se muestra siempre la cadena codificante (ídem secuencia RNA) y el transcrito mRNA en 5’→3’ (en examen siempre

poner extremos). En cada uno de los genes la dirección de transcripción puede ser distinta, por lo que de eso depende cual es la cadena molde y la codificante. GENES SOLAPANTES: En algunos casos, las dos hebras de una misma región de DNA, participan en la transcripción de dos genes distintos, pero de forma independiente y NO simultanea y portando mensajes genéticos diferentes. Se dice entonces que esas regiones contienen genes solapantes. La secuencia de nucleótidos de una cadena da lugar a productos totalmente distintos a su cadena complementaria

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En la doble hélice de ADN la cadena codificante no es una en concreto, no es una propiedad del cromosoma sino que varía y es dependiente de cada gen.

RECONOCIMIENTO DE LA RNAPOLIMERASA DE LAS REGIONES DE TRANSCRIPCION En el DNA existen secuencias reguladoras específicas que indican el principio y el final de las regiones que se han de transcribir, así como la cadena que actúa de molde. El inicio de la transcripción tiene lugar cuando la RNA polimerasa reconoce las secuencias específicas (promotores) sin desenrollar el DNA y se une a dichas secuencias.

La transcripción comienza en el nucleótido +1. En dirección 3’ siempre son números positivos y en dirección 5’ son números negativos. El nucleótido +1 es el primer nucleótido que aparece en el transcrito. Inmediatamente a él, en sentido opuesto aparece el nucleótido -1.

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Las regiones promotoras siempre aparecen en la hebra codificante. Son regiones muy homogéneas que indican la presencia de una región codificante y responsables de que comience la transcripción. Estas regiones son distintas en procariotas y eucariotas, pero tienen el mismo nombre (promotores) y la misma función. Es necesario que exista también una señal de terminación para que la célula deje de transcribir genes. Esta señal es distinta en procariotas que en eucariotas.

TRANSCRIPCION EN PROCARIOTAS:

Es mucho más rápida que la transcripción eucariota, y se suele acoplar a la traduccion, sin necesidad de que haya acabado. Esto significa que el ARNm en procariotas no requiere un proceso de maduracion, sino que es una molec ula madura. En eucariotas el ARNm ha de madurar despues de trasncribire entre otras cosas para poder salir del nucleo al citoplasma donde lleva a cabo su funcion.

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RNA polimerasas en procariotas En PROCARIOTAS y en orgánulos subcelulares de eucariotas (mitocondrias y cloroplastos) se utiliza una sola RNA polimerasa para sintetizar todos los RNA (mRNA, tRNA y rRNA). En las bacterias hay unas 3000 moléculas de la RNApol; en cada momento la mitad de ellas se encuentran implicadas en la transcripción. Esta enzima añade alrededor de 30 nt/s, con una tasa de error de 1 en 105 y elevada procesividad. A diferencia de eucariotas, la misma polimerasa se encarga de transcribir todos los genes. La polimerasa necesita de cofactores Mg+2 y una molecula de ADN molde La RNA polimerasa de E. coli es un enzima muy grande y complejo La enzima completa (HOLOENZIMA), está formada por 5 tipos de subunidades distintas a (2), σ, b, b', w. (alfa, sigma, beta y beta prima y omega) • Las subunidades a2, b, b', w forman el núcleo de la enzima y contiene el centro catalítico. • Las 2 subunidades a, ensamblan el núcleo de la enzima y se unen a secuencias reguladoras (regiones UP). Función estructural. • Las subunidades bb' (su región aminoacidica) constituyen el sitio catalítico de la elongación (actividad polimerasa): b participa en la formación de los enlaces fosfodiéster y b' se une al DNA molde y participa en el inicio de la transcripción(cataliza la unión de los primeros nucleótidos). • No se conoce la función de la subunidad w (ensamblaje y regulación expresión???). Parece que protege a la polimerasa de la desnaturalización, siendo necesaria para devolver a la polimerasa a su estado nativo Para iniciar la transcripción, la enzima núcleo requiere la unión de otro polipéptido independiente, la subunidad σ, que participa reconociendo las secuencias promotoras en el DNA, o sitios de inicio de la transcripción. Hay distintos tipos de subunidades s (para reconocer las distintas regiones promotoras de los diferentes genes .La mayoría utilizan la misma unidad sigma pero hay genes que codifican para productos funcionales específicos que necesitan sigmas específicos de reconocimiento de regiones especificas) (s 70 es la más común): colaboran en el reconocimiento de la secuencia promotora específica donde comienza la transcripción, participa en el inicio de la síntesis del RNA. Una vez iniciada la transcripción, la subunidad σ se disocia y la enzima núcleo continúa elongando el RNA. 6

PROMOTORES PROCARIOTAS:

La transcripción se inicia en secuencias específicas del DNA denominadas promotores. El primero nucleótido (+1) que aparece en la transcripción suele ser un nucleótido de adenina o guanina. El análisis comparativo de muchos promotores bacterianos diferentes ha puesto de manifiesto similitudes en dos secuencias cortas (de 6 pb) localizadas a 10 y 35 pb, hacia el lado 5' del punto de inicio de la transcripción. Las secuencias no son idénticas en todos los promotores bacterianos, pero ciertos nucleótidos se encuentran con más frecuencia que otros. Los nucleótidos que se repiten con mayor frecuencia constituyen las SECUENCIAS CONSENSO. La secuencia consenso en la región -35 es TTGACA y en la región -10 en la denominada caja tata TATAAT. La presentación de las secuencias promotora se hace sobre la hebra codificante del ADN Por convención se da el número +1 al primer nucleótido de la molécula de RNA sintetizada, por lo que estas secuencias del promotor se denominan normalmente regiones -10 (Prinbow box) y -35. Estas secuencias son reconocidas por las subunidades s de la RNA polimerasa. Además, desde la posición -40 a -60 existe una zona rica en A/T denominada elemento UP, que es reconocida por las subunidades alfa de la polimerasa núcleo: este elemento se encuentra en promotores de genes con un alto nivel de expresión. Esta región no aparece en todos los procariotas.

La frecuencia con que se transcribe un gen en E. coli viene dada por la similitud de sus secuencias promotoras con las secuencias consenso y del espaciado entre ellas. (Se ha averiguado hace poco tiempo que el que no todos los procariotas tengan los 6 pares de bases de la región -10 y -35 idénticos, no siempre es algo fortuito. Se ha visto que aquellos que tienen más diferencias con respecto a la secuencia consenso, está relacionado con la frecuencia o potencia o fuerza que tiene dicho promotor: cuanto más parecida o idéntica es esa región o las dos a la consenso, con más potencia se produce la unión a la RNA polimerasa y el proceso de transcripción se ve favorecido, por lo que está relacionado con genes que necesitan alto nivel de transcripción, se une con mas afinidad y una unión más estable a sigma. Si la secuencia se aleja de la consenso, la unión con la RNA polimerasa no será tan fuerte. Esto no significa que sea peor, sino que será algo más débil y aparecerá en genes que no tengan un alto nivel de transcripción.)Si se produce una mutación puntual en una de las bases de las regiones promotoras, puede ocurrir que: 1. Si la mutación produce que se parezca más a la secuencia consenso se transcribirá con mayor frecuencia 2. Si la mutación hace que difiera más de la secuencia consenso se transcribirá con menor frecuencia.

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ETAPAS DE LA TRANSCRIPCION: La situación que se está produciendo en la célula antes de transcribir: La enzima núcleo está interaccionando con el DNA mediante una interacción electrostática, no flota libre en el núcleo. De esta forma va recorriendo la cadena del DNA y está siempre cerca para cuando tiene que empezar la transcripción. Entonces llega sigma: podemos decir de 2 maneras lo que hace: o Desestabiliza la unión no específica, de baja afinidad o O intensifica la interacción, permite el reconocimiento de la región promotora y dirige al núcleo de la holoenzima a donde tiene que tener lugar el inicio de la transcripción. La transcripción es un proceso secuencial que se divide en tres etapas: 1. Inicio: que a su vez se divide en dos: unión e inicio. Ambas son las etapas preferentes de regulación 2. Elongación 3. Terminación 1º INICIO:  Fase de unión: sigma reconoce la secuencia previa al comienzo de la transcripción (promotor) y permite la apertura de la hélice. La unión correcta depende del factor sigma. El núcleo de la ARNpol tiene una gran afinidad a unirse a la hélice de DNA y al encontrarse unida con sigma, éste disminuye la afinidad de la holoenzima por el ADN y le permite viajar a lo largo de la cadena de ADN hasta encontrar la secuencia promotora y sintetizar los nucleótidos correspondientes al producto del transcrito (región codificante). La RNA polimerasa, al unirse al DNA abarca TODA la región del promotor e incluso se extiende hasta el nucleótido -70. Al encontrar la secuencia promotora en la región -35, se una a la doble hélice del ADN formando el complejo cerrado. La subunidad sigma asegura la especificidad del reconocimiento del promotor por la ARN polimerasa. Al llegar a la región -10 se desenrolla la doble hélice del ADN (secuencia rica en A/T) en unos 17 pb hasta la posición +2, +3. Se forma así un complejo abierto, con el DNA parcialmente desenrolladlo en esa región dejando al descubierto la hebra molde en el sitio de inicio.

Fase de inicio: Incluye la síntesis de RNA, casi siempre con una purina (A o G) y el posterior desalojo del promotor. Se añaden los primeros nt y una vez formados unos cuantos enlaces fosfodiéster se disocia la subunidad s dejando que el resto del enzima (núcleo de la RNA pol) complete la elongación del RNA. Empieza a replicar la hebra molde, de forma que sólo pasa por el interior de la abrazadera de la RNA polimerasa la hebra molde. Empieza el escape del núcleo de la RNA polimerasa desde el promotor y se sigue sintetizando la cadena. El promotor nunca se transcribe. 8

2ºELONGACION: Se centra en la cadena molde dehndo de lado a la cadena codificante, que es esencial para la colocación de la burbuja de transcripción. Durante la elongación, el núcleo de la polimerasa se desplaza a lo largo del DNA. A medida que se desplaza, desenrolla el DNA dejando al descubierto la hebra molde para la síntesis del RNA. Simultáneamente, el DNA se vuelve a enrollar por detrás del enzima a medida que se transcribe el RNA (por acción de topoisomerasas). La RNA polimerasa mantiene en todo momento unos 17 pb desenrollados para formar una la denominada burbuja de transcripción que se va desplazando por el DNA. En la zona desenrollada se forma un híbrido corto de RNA-DNA (~ 8 pb de longitud). La elongación transcurre a una velocidad de unos 50-90 nt por segundo. Hay mayor tasa de error ya que las RNApol no tienen actividad exonucleasa que tenia la ADNpol. Hay una cierta capacidad de reparación de errores. Algunos autores apuntan a que se realicen mediante hidrolisis u otro productos proteicos, que rompen los enlaces fosfodiester entre nucleótidos. 3ºTERMINACION: En la fase de terminación de la transcripción se producen 3 acciones antes de que aparezcan las dos clases de señales de terminación: Se detiene la formación de enlaces fosfodiéster: para favorecer que la RNA polimerasa deje de Unir nucleótidos. Favorecer que se disocie el híbrido RNA-DNA. Favorecer que la RNA polimerasa se suelte del DNA. La terminación está controlada con tanta exactitud como el inicio gracias a la presencia de secuencias específicas de terminación en las regiones transcritas de los moldes de DNA.Se encuentran en el extremo 3’ del RNA. E. coli presenta al menos dos clases de señales de terminación: 1. Terminación intrínseca: es la más sencilla. Consiste en una secuencia rica en G=C, que aparece en el transcrito, cuyas bases se pueden emparejar para formar una estructura en horquilla, al encontrarse libre de la burbuja de transcripción. La estructura en horquilla esta favorecida por el elevado contenido en G≡C (los pares C≡G son mas estables que los pares A=U). Se cree que la formación de la horquilla desestabiliza el híbrido de RNA-DNA en el complejo de transcripción. El RNA naciente se disocia del molde y luego del enzima. La horquilla viene seguida de una secuencia de 4 o más residuos de U. que dará lugar a una interacción menos estable en el híbrido de la cadena recién formada de RNA y la hebra molde de DNA. Así se favorece el proceso para que la terminación tenga lugar. El transcrito de RNA finaliza en ellos. 9

Un factor s se vuelve a unir al núcleo para formar de nuevo el holoenzima que puede unirse a un promotor en el que iniciar un nuevo tránscrito. Pero este mecanismo no es universal, aunque es el que tienen la mayoría de procesos de terminación en procariotas. Pero no siempre se puede terminar asi porque no siempre existe la secuencia que favorece este proceso: - O bien le faltan las G=C que facilitan la estructura en chupete - O bien le faltan las secuencias de A en el DNA que dan lugar a los residuos U en el RNA. Secuencias de terminación: C/G y UUU. Entonces aparece el factor ro: una proteína reguladora específica el segundo mecanismo de terminación.

2. Terminación dependiente de rho:

La proteína rho está presente en el citosol en forma de hexámero. Es una ATPasa muy activa con afinidad por el RNA monocatenario y que actúa como una RNA-DNA helicasa: se une al RNA monocatenario en una secuencia específica del mismo (el sitio rut ), migra a lo largo del transcrito hasta alcanzar el complejo de transcripción. Una vez allí, lo disocia de la RNA polimerasa y del molde de DNA (con gasto de ATP). Se desconoce el mecanismo exacto por el que la proteína facilita la liberación del transcrito.

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TRANSCRIPCION EN EUCARIOTAS: •Es más compleja que en procariotas: El genoma eucariota es más grande, con mucha más información, agrupada en un nº variable de cromosomas •Es un proceso de mucha discriminación (según el tejido o etapa del desarrollo serán los genes que se van a transcribir) •La maquinaria de la transcripción debe tener en cuenta la compleja estructura de la cromatina eucariota. El DNA está unido a histonas •Necesita varios tipos de RNA polimerasas (para dar lugar a los distintos tipos de ARN) •La RNA polimerasa requiere de proteínas reguladoras adicionales llamadas factores de transcripción para iniciar la transcripción , esencial diferencia con procariotas. Regulan la expresión génica. Los factores de trasncripcion no fomran parte de la RNApolimerasa en si misma •El producto primario de la transcripción del mRNA, el hnRNA (RNA heterogéneo nuclear),es el transcrito primario, que debe ser procesado para dar lugar a un mRNA maduro y funcional. Importante diferencia con procariotas. •La transcripción y la traducción se llevan a cabo en compartimentos celulares distintos

RNAPOLIMERASAS EUCARIOTAS: Los eucariotas tienen 3 RNA polimerasas diferentes, designadas I, II y III. Difieren en su especificidad hacia el molde y en su localización en el núcleo. Cada una tiene una función específica y se unen a diferentes secuencias promotoras mediante sus factores de transcripción. Las secuencias promotoras son ditintas en cada tipo de ARNpolimerasa, y dentro del mismo tipo difieren de unos genes a otros. (diferencia con procariotas donde las secuencias promotoras eran bastante homogéneas y conservadas). Ninguna RNA polimerasa de eucariotas se une directamente al DNA: las interacciones entre la polimerasa y el DNA requieren la presencia de proteínas accesorias denominadas factores de transcripción. Los factores de transcripción se unen a secuencias del DNA y modulan la interacción más o menos fuerte de la RNA polimerasa con el promotor. RNA polimerasa I: es la responsable de la síntesis del ARN prerribosomico (pre-rRNA) que es el precursor de 3 los 4 tipos de RNA ribosomales (rRNA) 18S, 5,8S y 28S. Tiene 12 subunidades. Se localiza en el NUCLEOLO. Necesita al menos 2 factores de transcripción para iniciar el proceso . Los factores de transcripción suelen llamarse TF- nº de la polimerasa (I, II, III) y otro letra. Estos factores no solo permiten que se produzca el proceso. También influyen en los procesos de regulación.

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RNA polimerasa II: (Pol II), transcribe todos los genes de proteínas, tiene la función de sintetizar los hnRNA (transcrito primario de lo RNA mensajeros (mRNA), así como algunos RNA especializados (snoRNA y snRNA). Puede reconocer miles de promotores de secuencias muy variables, aunque muchos de ellos presentan características comunes (caja TATA, secuencia Inr). Tiene 12 subunidades. Se localiza en el NUCLEOPLASMA. Intervienen al menos 7 factores de transcripción: TFIIA, TFIIB, TFIID, TFIIE, TFIIF, TFIIH y TFIIJ. El factor crítico es TFIID que se une a la caja TATA que es el equivalente eucariota a la región -10 procariota. RNA polimerasa III: (Pol III) sintetiza el rRNA 5S, todas las moléculas de RNA de transferencia (tRNA) y otros RNA especializados (snRNA y miRNA). Tiene 17 subunidades. Se localiza en el NUCLEOPLASMA. Los RNAmi y RNAsn son ARN pequeños nucleares provenientes del denominado ADN basura.

PROMOTORES EUCARIOTAS DE CLASE II El promotor eucariota es una REGIÓN de la secuencia de DNA que se encuentra antes de la zona codificante y que se encarga de facilitar la unión de la RNA polimerasa para que tenga lugar la transcripción. La estructura de un promotor no es tan homogénea en todos los genes eucariotas. Incluso hay secuencias consenso pero se pueden permitir muchas más variaciones. El promotor está formado por varias secuencias, algunas de las que están intercaladas con las secuencias codificantes. Esto se debe a que, como hemos dicho antes, la RNA polimerasa necesita puntos de unión al DNA, que eran una serie de secuencias que la facilitan. Hay una región muy característica que rodea al nucleótido número uno, que es la secuencia de inicio. Esta es bastante común a los genes de los eucariotas.

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1. Promotor basal o elementos basales: elementos de secuencia muy próximos al sitio de inicio de la transcripción. Determinan el punto de origen, son imprescindibles para que ésta comience (TATA box y Inr). Se distribuyen hasta -30 o -40, según los casos, entre la posición -37 y + 32. Dentro de esta región se ubican, dependiendo del gen, distintas combinaciones de varias secuencias características, presentándose habitualmente entre 2 y 4 de ellas . Al promotor basal se le unen factores de transcripción generales.

2. Elementos proximales: en general el promotor basal requiere de la intervención adicional de otra región conocida como promotor proximal. Se encuentran dispersos, pero próximos al origen y al elemento basal. No especifican la posición de inicio sino que determinan la frecuencia de inicio de transcripción. Se distribuyen aproximadamente entre -30 y -200. Se una a el diversos factores de transcripción proximales que favorecen la interacción de la ARNpol en el punto de inicio de la transcripción y su actividad enzimática. En general las secuencias son más variadas que las basales, y las dos más características son: Caja o secuencia CAAT (-80 y -60). Caja GC: la caja CAAT puede aparecer flanqueada por dos tipos de secuencias ricas en GC o que solo la acompañen hacia el extremo 5’

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3. Elementos distales o de respuesta: próximos entre si pero alejados del origen . Son secuencias muy variadas y especificas para cada gen . Son regiones de unión de proteínas potenciadoras o silenciadoras (regulan la eficacia del inicio de la transcripción). Se distribuyen en un margen de unos 100 pb y pueden estar separados del promotor por varios miles de pb. Se les unos factores de transcripción inducibles.

RNA POLIMERASA II (pol II) Es una estructura grande, formada por 12 subunidades, que van a tener papeles definidos y característicos. Pero nunca va a interactuar directamente con el DNA que tiene que transcribir.

(Comparación entre RNApol bacteriana y RNApol eucariota.)

• La subunidad más grande se denomina RBP1: homóloga estructural de la subunidad b' bacteriana (inicio de la transcripción). Tiene un domino carboxilo terminal (CTD) susceptible de ser fosforilado. Está constituido por la secuencia consenso heptapeptídica Tyr-Ser-Pro-ThrSer-Pro-Ser. • La subunidad RBP2: homóloga estructural de la subunidad b bacteriana (formación de los enlaces fosfodiéster). • Las subunidades RBP3 y RBP11: homólogas estructurales de las 2 subunidades a bacterianas (unión a secuencias reguladoras). La Pol II requiere otros muchos factores proteicos para formar el complejo de transcripción activo. Los factores de transcripción generales (los que se unen a los elementos basales del promotor), denominados TFII se necesitan en todos los promotores de la Pol II y están muy conservados en eucariotas.

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ETAPA 1: FORMACION DEL COMPLEJO DE INICIACION: • TFIID (factor de posicionamiento) reconoce la caja TATA del promotor y se une mediante su subunidad TBP que proporciona lugares de anclaje para otros TFII. Es el más significativo de todos los TF. Define el punto de inicio. •TFIIA se une al complejo TFIID para estabilizar la unión con el DNA. • El factor TFIIB se une a TFIID y al DNA. Recluta a la RNApol II y TFIIF • TFIIF se une a la RNA-Pol II para dirigirla a sus promotores específicos. •El complejo TFIIF-Pol II se une al complejo TFIIBTFIID. • Finalmente se unen TFIIE y TFIIH para completar el complejo cerrado. • TFIIH es un complejo proteico con doble actividad: helicasa y proteína quinasa. La helicasa desenrolla la región promotora cerca del sitio de inicio de la transcripción con gasto de ATP, formándose el denominado complejo abierto de transcripción.

ETAPA 2: ELONGACIÓN: • Una vez formado el complejo de inicio la actividad quinasa de TFIIH fosforila el extremo C-terminal de Pol II (CTD) Esta fosforilación provoca un cambio conformacional del complejo abierto, que determina el inicio de la transcripción. • Durante la síntesis de los primeros 60-70 nt del mRNA, TFIIB, TFIIE y TFIIH se liberan secuencialmente del complejo abierto. La polimerasa abandona el promotor para comenzar la elongación. • TFIIF permanece asociado a la Pol II durante toda la elongación. • Durante la elongación la actividad de la Pol II es potenciada por la unión de factores de elongación. Algunos de ellos se unen al CTD. Sin ellos no puede continuar el proceso. Son necesarios para que la doble hélice se siga abriendo y la RNA polimerasa II pueda seguir con la elongación. La adición de nucleótidos es igual que siempre, en sentido 5’3’ y la lectura en sentido 3’5’. • Para la terminación de la transcripción la RNA Pol II reconoce secuencias de terminación. Al terminar la transcripción del mRNA la Pol II se defosforila y se recicla para iniciar otro transcrito.

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ETAPA 3: TERMINACIÓN: La terminación se produce como consecuencia de la combinación de dos mecanismos: -La detención o pausa de la RNA pol -La desestabilización del híbrido RNA-DNA. La influencia de estos mecanismos es distinta para cada una de las 3 RNA-polimerasas. Los detalles de esta etapa están aún poco caracterizados. En todo caso, la etapa de terminación si está relacionada con las señales que marcan la poliadenilación del extremo 3’ de los mRNA. El complejo de transcripción responde a señales específicas (AAUAAA) para finalizar el proceso, separándose del RNA formado. El resultado final es la separación de los componentes del complejo de transcripción y la desfosforilación de la RNA pol II.

INHIBIDORES DE LA TRANSCRIPCION: La transcripción es objeto del desarrollo de muchos fármacos. Algunos antibióticos son inhibidores altamente específicos de los procesos biológicos mediante la inhibición de la transcripción. Entre ellos, la rifampicina y la actinomicina D, que lo lacen mediante vías diferentes.El diseño de los antibióticos está dirigido a afectar la transcripción de células procariotas sin afectar a las eucariotas. • La rifampicina inhibe específicamente la iniciación de la síntesis del RNA EN PROCARIOTAS bloqueando el canal por el qué debe pasar el híbrido RNA-DNA recién formado. La rifampicina no impide la elongación de la cadena una vez iniciada. Ya que una vez formado el híbrido y con la síntesis en marcha, se impide la unión del fármaco. NO afecta a las RNA polimerasas EUCARIOTAS •La actinomicina D inhibe la elongación en procariotas y eucariotas. - La porción sombreada de la actinomicina D es plana y se intercala en el DNA de doble hélice entre G≡C sucesivos, deformando el DNA. Esta alteración impide el movimiento de la RNA polimerasa a lo largo del molde. No se une a la hebra sencilla de DNA o RNA ni a los híbridos RNA-DNA. A bajas concentraciones, inhibe la transcripción sin un efecto significativo sobre la replicación del DNA o sobre la síntesis de proteínas, por lo que es utilizada como inhibidor específico de la síntesis de RNA. • La Amanita phalloides es una seta mortal porque produce una toxina llamada aamanitina que se une con gran afinidad a la RNA polimerasa II eucariota bloqueando la formación de mRNAs. Es un inhibidor específico de la etapa de elongación del mRNA eucariota pero no procariota. A concentraciones elevadas, la a-amanitina también inhibe la RNA polimerasa III. No afecta a la RNA polimerasa I ni a la RNA polimerasa bacteriana. 16