Week 7

I PERICOLI DEL DOGMA: I GENI ESPRIMONO SE STESSI COME PROTEINE

V

V

MA LA COMPLESSITA’ DI UNA SPECIE CORRISPONDE CON IL NUMERO DEI GENI NEL SUO GENOMA?

DNA codificante: ≈ 2%

3x109 basi (introni+ DNA intergenico)

IL NOSTRO GENOMA:

“in un certo qual modo assomiglia al vostro garage/camera da letto/frigorifero/vita: altamente individualista, ma mal tenuto; poca evidenza di organizzazione; molte cianfrusaglie accumulate (chiamate da non iniziati “spazzatura”); praticamente non viene mai scartato niente ed i pochi articoli chiaramente di valore sparsi in giro indiscriminatamente, senza cura.

Gallagher & Dennis (2001)

AL CONTRARIO, LA QUANTITA’ DI DNA NON CODIFICANTE AUMENTA CON LA COMPLESSITA’

National Human Genome Research Institute

1194 SEGMENTI GENOMICI ALTAMENTE CONSERVATI

20% DNA codificante proteine

70% DNA intronico

DNA intergenico

DNA NON CODIFICANTE PROTEINE

IL GENOMA NASCOSTO DNA codificante RNA

RNA

(RNA-only genes)

Proteine

X

GENE

UNITA’ TRASCRIZIONALE = qualunque segmento di DNA che viene trascritto a RNA

GENI RNA-ONLY

PSEUDOGENI

RIBOSWITCHES

DNA DELL’ELICA COMPLEMENTARE

INTRONI

RNA interference

PSEUDOGENI Il caso di makorin1-p1 Topo transgenico per sex-lethal (gene dello sviluppo sessuale in drosophila)

Costruzione di una genoteca genomica e screening con una sonda omologa a sex-lethal per individuare il punto di inserzione

Sex-lethal inserito all’interno di makorin1-p1

-Knock-out di makorin1-P1 impedisce l’espressione del gene makorin1 -Makorin1-p1: copia accorciata del gene Makorin1 (gene ancestrale a funzione ignota)

-Nel topo esistono molti pseudogeni di makorin1, ma nessuno produce proteine -lo pseudogene controlla l’espressione del gene “vero”, di cui simula la sequenza, anche se collocato su un diverso cromosoma. Come?

Hp1: meccanismo RNA-mediato: l’RNA pseudogenico compete con il genico come substrato per una RNAsi

Hp2: meccanismo DNA-mediato: elementi regolatori dello pseudogene competono per repressori della trascrizione

GENI RNA-only CHE GUIDANO LA FUNZIONE DI PROTEINE

Displasia metafisaria senza ipotricosi Mappatura della patologia in una regione del cromosoma 9: nessuna mutazione nei 10 geni codificanti proteine presenti 2001. Mutazione puntiforme del gene RNA-only RMRP

RMRP: l’RNA trascritto assume una conformazione tridimensionale mediante la quale si lega ad una proteina per formare un enzima attivo nel mitocondrio

I RIBOSWITCH

LA SCOPERTA DELL’RNA INTERFERENCE (RNAi)

TG: Calcone sintasi: enzima per la sintesi delle antocianine

L’espressione del transgene spegneva anche l’espressione del gene endogeno: CO-SOPPRESSIONE

E’ MEDIATA DA UN INTERMEDIO A dsRNA

IL SILENZIAMENTO GENICO OPERATO DA dsRNA E’ STATO SCOPERTO NEI NEMATODI

I DNA e gli RNA ANTISENSO

L’esperimento di Guo e Kemphues (1995) Antisense RNA

RNA sintetizzato in vitro

RNA Senso (Controllo)

Iniettato nelle gonadi del verme

to the wor

Antisense RNA mG

Par-1 mRNA

RNA Senso (Controllo)

dsRNA

A

AAAAAAAAA

mG

RNAm di Par-1

AAAAAAAAA

Mortalità embrionale ???

Mortalità embrionale

Surprisingly, injection of in vitro synthesized sense RNA from the cDNA ZC22 also induced par-7 phenotypes at a high frequency among the progeny of injected worms.

It is not clear what accounts for this effect.

(Guo et al, Cell. 1995)

Hp) La degradazione indotta da dsRNA può essere dovuta ad meccanismo cellulare di difesa da virus a RNA o da eventi di trasposizione indesiderati.

VIE DI SOMMINISTRAZIONE DI dsRNA NEL C.elegans

1

3

Il verme viene inzuppato in una soluzione contenente dsRNA

Potent and aspecific genetic interference by double-stranded RNA in C.elegans Fire et al, Nature, 1998 dsRNA (GFP) introdotto oralmente

embrioni

-Il dsRNA è fino a 100 volte più potente del ssRNA -Il silenziamento viene trasmesso nella linea germinale anche per alcune generazioni - Il silenziamento può diffondere da tessuto a tessuto

IN CHE MODO SI PU0’ GENERARE dsRNA?

Introducing chalcone Synthase transgenes

IL CASO DELLA CO-SOPPRESSIONE

PROBLEMI NELL’INTEGRAZIONE DEL TRANSGENE

Riconoscimento dell’RNAm transgenico RNApol-RNA-dipendente

asRNA

dsRNA

sRNA Accumulo di difetti nella processazionedell’RNAm? Marcatura della cromatina del transgene prima dell’integrazione?

IL dsRNA SI FORMA ANCHE PER MECCANISMI NATURALI

DNA DELL’ELICA COMPLEMENTARE

RNA ANTISENSO

CompuGen: almeno 1600 geni umani hanno un corrispondente sull’altra elica che può essere trascritto in RNAas

La comparazione con l’espressione genica di C.elegans resistenti all’RNAi porta all’isolamento dei geni coinvolti nell’RNAi

Il confronto dei geni individuati con altri organismi indica che tutti i meccanismi di silenziamento hanno in comune un meccanismo di base, che ha la propria origine in un ancestrale progenitore comune a funghi, piante ed animali.

DICER

1) Dicer riconosce e lega dsRNA e lo processa in siRNA Regione RNAsi III-simile Dominio per il legame a dsRNA RNA elicasi

siRNA • Lunghi circa 21-26nt • Gruppo fosfato in 5’ e OH in 3’ • 2-3nt sporgenti in 3’ • Prodotti di Dicer

(short interfering RNA)

SILENZIAMENTO DEL GENE PER METILAZIONE DELLA CROMATINA RITS

oppure

Modificazione della cromatina (metilazione delle C) Eterocromatizzazione e SILENZIAMENTO GENICO 2) Si forma un complesso multiproteico inattivo (siRNA/proteine) 3) Il complesso diventa attivo (RISC = RNA-induced silencing complex)

• E’ coinvolta attività elicasica • L’incorporazione del siRNA antisenso attiva RISC

4) IL COMPLESSO USA L’RNAas PER INDIVIDUARE L’RNAm OMOLOGO

SILENZIAMENTO PER TAGLIO DELL’RNAm

5) RISC taglia l’RNAm

silenziamento

IL SILENZIAMENTO PUO’ DUNQUE ESSERE A PIU’ LIVELLI: IL siRNA INDUCE, SIA DISTRUZIONE DELL’RNAm, SIA INATTIVAZIONE DEL GENE SPECIFICO

Come si spiega che pochissime molecole di dsRNA sono sufficienti per indurre -in C.elegans e nelle piante- un RNAi completo, sostenuto nel tempo e propagato nelle generazioni e nei tessuti?

•

RNA-dependent RNA Polymerase (RdRP)

•

LA PCR DEGRADATIVA

I miRNA (micro-RNA)

-Derivano da introni che hanno subito splicing o da altro DNA non codificante, singolo o organizzato in tandem, e strettamente clusterizzato. -Sono meno omologhi al loro RNAm bersaglio rispetto ai siRNA -I pri-mi-RNA vengono tagliati a pre-mi-RNA da DROSHA, una RNA-pol di tipo III -Vengono ulteriormente processati da Dicer a mi-RNA di 21bp con 5’-P e 3’-OH sporgente -Bloccano la traduzione anche senza distruzione dell’RNAm, che rimane associato ai ribosomi

Taglio dell’RNAm

Blocco della traduzione

3 modi per effettuare l’RNAi

Quali sono le funzioni dei miRNA?

250

>>

-L’appaiamento impreciso tra i miRNA e l’RNAm bersaglio suggerisce che ciascun miRNA possa legarsi ad un ampio spettro di diversi RNAm: enorme potenziale di regolazione -Pochissimi dei geni bersaglio dei miRNA identificati negli insetti corrispondono a quelli degli ortologhi miRNA dei vertebrati, sebbene la loro sequenza (e quindi quella della sequenza del sito complementare) si sia conservata attraverso grandi distanze filogenetiche: flessibilità evolutiva

100

Cluster miR-290/-295: mantenimento della totipotenza delle ES nel topo

L’ RNAi COME METODICA PER IL SILENZIAMENTO DELL’ESPRESSIONE DI GENI SPECIFICI NEI MAMMIFERI

dsRNA lunghi

PKR (Protein cinasi dsRNA-dipendente) Produzione di interferoni

Distruzione di RNAm aspecifici Blocco generalizzato della sintesi proteica

TUTTAVIA….

-I componenti della via dell’RNAi sono conservati anche nei mammiferi -dsRNA lunghi possono innescare risposte gene-specifiche quando vengono introdotti in cellule embrionali di mammifero (risposta antivirale aspecifica al dsRNA non è prevalente)

Risposta difensiva sequenza-aspecifica

X

?

RISPOSTA AL dsRNA

RNAi sequenza-specifico

dsRNA PIÙ PICCOLI DI 30bp INDUCONO RNAi SENZA ATTIVAZIONE DI PKR

I siRNA e gli shRNA (short hairpin RNA)

siRNA da sintesi in vitro possono essere introdotti nelle cellule attraverso qualunque delle convenzionali metodiche di trasfezione

(siRNA)

Gli shRNA sono codificati da vettori di espressione a DNA che vengono trasfettati. Possono avere promotori inducibili

La maggiore efficacia dell’uno o dell’altro dsRNA varia da caso a caso

siRNA -facile reperibilità -alta efficienza di entrata -massima concentrazione del silenziatore genico

-effetto transiente (diluizione durante le divisioni cellulari. Assenza di meccanismi propagativi e amplificativi nelle cellule di Mammifero) -resistenza di certi tipi cellulari alla trasfezione -alterazione della fisiologia cellulare dovuta alla trasfezione stessa

shRNA -effetto repressivo sostenuto nel tempo (possibilità di integrazione nel cromosoma) -trasmissibilià alle cellule figlie -vettori di espressione siRNA propagabili indefinitamente

-ancora troppo preliminari le conoscenze che consentono di disegnare shRNA molto efficienti

PROSPETTIVE TERAPEUTICHE DELL’RNAi Terapia antivirale

Proteine virali e/o proteine cellulari necessarie per il ciclo del virus (es: HIV, epatite C)

Terapia anticancro

Oncogeni, fattori di crescita, proteine antiapoptotiche

Patologie su base genetica

IL TOPO KNOCK-OUT Permette di studiare l’impatto di un gene endogeno sullo sviluppo e sul metabolismo di un organismo superiore, attraverso la sua soppressione. Permette di ottenere modelli animali per la compresione delle malattie umane

E’ ESSENZIALE PILOTARE LA REGIONE DOVE INSERIRE LA CASSETTA DI ESPRESSIONE MEDIANTE GENE-TARGETING

Knock-out-/- di HIF1α

Assenza di vascolarizzazione della regione neurale e scarsa vascolarizzazione dei somiti. Visualizzazione delle cellule endoteliali con un marcatore per CD31