Verificacion De Espectrofotometro.docx

INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS INGENIERÍA BIOQUÍMICA LABORATORIO DE METODOS DE ANALISIS PRACTICA: VERIFICACIÓN DEL FUNCIONAMIENTO DE UN ESPECTROFOTÓMETRO. ALUMNO: SALVADOR HERNANDEZ JUAN GRUPO: 4IM2

SECCION: 3

PROFESOR: FRANCISCO CARMELO FERNÁNDEZ LÓPEZ

OBJETIVOS  

Evaluar el rendimiento instrumental de un espectrofotómetro Verificar la exactitud de la escala de longitud de onda, la presencia de radiación dispersa, el ancho de banda, la exactitud fotométrica, la proporcionalidad de respuesta y el rendimiento global del instrumento.

FUNDAMENTO La obtención de resultados confiables empleando métodos espectrofotométricos, requiere en primer lugar, verificar que el instrumento de medición está funcionando correctamente. La revisión del rendimiento de los espectrofotómetros UV – VIS es indispensable en el control de calidad. Para llevar a cabo este tipo de comprobaciones es común el empleo de substancias estándar, cuyas propiedades espectrales han sido estudiadas cuidadosamente, Posteriormente, se evalúa el funcionamiento del instrumento en función de los resultados obtenidos del análisis de estos estándares. Aunque no se han definido claramente cuáles son los parámetros que deben valorarse para asegurar un funcionamiento optimo, algunos fabricantes y usuarios han acordado evaluar los criterios que se describen a continuación: Exactitud en la escala de la longitud de onda. •

En condiciones normales de operación, la mayoría de los instrumentos mantendrá por un tiempo indefinido una correspondencia entre la radiación que atraviesa una muestra y el valor de longitud de onda señalado en el indicador respectivo, sin embargo hay situaciones que es necesario verificarlo.

•

La absorbancia de un cromóforo es medida a la longitud de onda de máxima absortividad. Si la longitud de onda de calibración de un instrumento cambia, la absorbancia cambia. La magnitud del error depende de la localización relativa del punto en el espectro y además del tipo de espectro si es ancho o estrecho.

Luz dispersa •

Luz dispersa, luz parásita, luz espuria hace referencia a toda la radiación no contemplada en el control del monocromador, que cruza por la rendija de salida sin haber pasado a través de la muestra, produciéndose así una alteración en las estimaciones de absorbancia.

•

La radiación parásita se suma al haz transmitido que es captado por el detector. Con altas concentraciones el error es significativo ya que se producirán desviaciones negativas a la Ley de Beer.

•

La radiación parásita puede originarse de múltiples maneras: reflexiones dentro del instrumento, polvo acumulado sobre las lentes, espejos sucios o corroídos o rallados, grietas o una abertura en el gabinete.

•

Dispersión por partículas de polvo.

Puede aumentar por el uso de lámparas y/o detectores inapropiados por tener mejor respuesta a un rango distinto al de interés •

Métodos para detectar radiación parásita: 1. Filtros de corte rápido 2. Soluciones

Estos materiales tienen una alta transmisión en una parte del espectro pero súbitamente se vuelven opacos (absorben la mayor parte de la radiación) a partir de una longitud de onda límite. Si la cantidad de luz transmitida en presencia de estos filtros se incrementa más allá del 1% se considera la presencia de luz dispersa. Exactitud fotométrica Se define como la exactitud en la medida de Absorbancia, o del % de Transmitancia en la escala de un espectrofotómetro. La exactitud en los valores de absorbancia es fundamental cuando no se trabajan estándares. Un estándar de absorbancia debe tener una absorbancia constante y estable a una determinada longitud de onda, ser insensible al ancho de banda. Métodos empleados: 

Filtro de vidrio neutro que proporciona transmitancias o absorbancias constantes en un intervalo de longitud de onda.



Soluciones

Dicromato de potasio Sulfato de cobalto amónico Ancho de banda Denota la fracción de longitudes de onda que cruzan la rendija de salida y producen una lectura del 50% T alrededor de la longitud de onda de máxima transmitancia. Algunos espectrofotómetros permiten modificar el ancho de banda, otros lo tienen fijo, sin embargo es conveniente verificarlo ya que la acumulación de polvo en las ranuras del monocromador puede provocar su reducción

Muchas desviaciones negativas de la ley de Beer puede deberse al uso de instrumentos con un ancho de banda muy amplio. Proporcionalidad o linealidad fotométrica Es la capacidad de un sistema fotométrico para dar una relación lineal entre la potencia radiante incidente a su detector y la lectura. Es deseable una relación lineal entre ambas magnitudes. La linealidad instrumental es un prerrequisito para la exactitud fotométrica, así como para la exactitud analítica. Se pueden utilizar soluciones que sigan la ley de Beer. 

Oxihemoglobina



Sulfato de cobalto amónico



Sulfato de cobre.

Una respuesta no lineal entre absorbancia y concentración indica: -Falla en la fuente de radiación o en el monocromador. -Falla en el detector -Radiación dispersa RESULTADOS A) Exactitud de la escala de longitud de onda

A.1) Método de filtro de tierras raras (Didimio)

Tabla No..1 Espectro de transmisión del filtro de didimio Longitud de onda (nm.)

%T

Longitud de onda (nm.)

%T

400

43.5

500

52

410

53.5

510

40

420

55.5

520

29

430

59

530

34

46

540

50

450

47.2

550

65

460

47

560

54

470

44.5

570

30

480

49.5

580

9

490

57.2

590

7

%T

440

Espectro de transmisión del filtro de didimio 70 60 50 40 30 20 10

0 380

430

480

530

580

630

λ (nm) Grafica No. 1 Espectro de transmisión del filtro de didimio

Observar el espectro obtenido y señalar aquellas longitudes de onda donde se presentaron picos y valles. Maximos (nm) 420 490 550

minimos (nm) 440 470 520

¿Coincidieron los máximos y/o mínimos con las longitudes de onda informadas por el fabricante? ¿En qué longitudes de onda no fue así? Todos los máximos, dos de los valles también coincidieron, pero uno de éstos no coincidió que fue el de 440 nm y deberia ser a 400 nm. Método de la solución de estándar (NiSO46H2O al 20%) a) Informe los valores de %T de la solución de NiSO46H2O al 20% Tabla 2. Espectro de transmisión de la solución de NiSO4 (6H2O) al 20%. Longitud de onda (nm)

%T

Longitud de onda (nm)

%T

380

3

490

83.5

390

3.5

500

87

400

3.8

510

86

410

4.5

520

83

420

8

530

79

430

19

540

75.7

440

31.5

550

72

450

42

560

66

460

54

570

59.2

470

67

580

51

480

76

590

41.5

%T

Espectro de transmición de la solución de NiSO46H2O al 20% 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 350

400

450

500

550

600

650

λ (nm) Grafica No. 2 Espectro de transmisión de la solución de NiSO4 (6H2O) al 20%.

Verificar la longitud de onda en la que se obtuvo el valor máximo de %T Fue la de 500 nm Describe ventajas y desventajas de los métodos empleados en la práctica para estimar la exactitud de la escala de longitud de onda Filtro de didimio, ventajas: es preciso y exacto, de rápida determinación, Solución de NiSO4: es de fácil acceso y preparación. Desventaja: Para el equipo que se utilizó al ser muy antiguo el filtro es costoso y difícil de conseguir si se llegara a dañar.

Proporcionalidad fotométrica Tabla 3. Proporcionalidad entre A y λ para el NiSO4 (6H2O) al 20%. Longitud de onda (nm)

A

530

0.1023

540

0.1209

550

0.1426

560

0.1804

570

0.2276

A=2-log%T= 2-log79= 0.1023

A

Grafica A vs. λ (NiSO4 (6H2O) al 20%.) 0.25 y = 0.0031x - 1.5508 R² = 0.9607

0.2

0.15

0.1

0.05

0 525

530

535

540

545

550

555

560

565

570

575

λ (nm) Gráfica 3: Absorbancia contra longitud de onda de NiSO4 (6H2O) al 20%.

Ordenada al origen: -1.5508 Pendiente= 0.0031 r2=0.9607 r= 0.9801 ¿Qué se puede concluir respecto a la proporcionalidad fotométrica en este intervalo de longitudes de onda? Se cumple la proporcionalidad fotométrica en el intervalo de onda de 530nm y 560nm. ¿Qué relación existe entre la absorbancia y la longitud de onda en ese intervalo de longitudes de onda? La absorbancia es directamente proporcional a la longitud de onda

C) luz dispersa Escribir los valores de %T obtenidos con los filtros de luz dispersa y la solución de NiSO4 (6H2O) al 20%. %T a 400nm=4% %T a 450nm=1.5% %T a 500nm=1% ¿Qué puede concluir respecto al instrumento que evaluó? Hay presencia de luz dispersa en el espectrofotómetro que se utilizó ya que los valores experimentales obtenidos son mas altos que los valores de referencia a excepción D) Ancho de banda. Escribir los datos de %T obtenidos con la solución de NiSO4 (6H2O) %T a 410nm= 86% ¿Qué puede concluir respecto al ancho de banda del instrumento? No se presentan problemas con el monocromador del espectrofotómetro. ¿Qué ocurre si él %T disminuye? Aumenta la absorbancia de la sustancia por lo que podría haber partículas de polvo en el monocromador y este polvo obstruye la salida de la luz.

E) Exactitud fotométrica. MÉTODO DEL FILTRO DE TRANSMISIÓN. Datos obtenidos de %T obtenido con el filtro de vidrio neutro. %T a 530nm= 86% ¿Qué puede concluir sobre la exactitud fotométrica del instrumento? Dado que el valor permitido va de 85% a 93%, 86% que fe el valor obtenido entra en el rango y el instrumento no presenta problema en cuanto exactitud fotométrica. ¿Qué otros métodos se utilizan comúnmente para verificar la exactitud fotométrica en el UV-visible? Se utilizan soluciones estándar de dicromato de potasio, para el espectro UV y de sulfato de cobre, para el espectro visible.

¿Qué puede ocurrir con la exactitud fotométrica si la escala de longitud de onda está mal calibrada? No se ve afectada puesto que el filtro da valores de absorbancia o transmitancia constantes en un intervalo determinado de longitudes de onda.

MÉTODO DE LA SOLUCIÓN DE ESTANDAR DE NiSO4 (6H2O) AL 20%. Tabla No. 4 Exactitud fotométrica. Método del NiSO4 (6H2O) al 20%. Longitud de onda.

400nm

500nm

Absorbancia esperada.

1.45

0.083

Tolerancia aceptada.

1.4-1.6

0.03-0.13

Absorbancia medida.

1.45

0.06

Parámetro.

Con base en el resultado obtenido, discuta si el espectrofotómetro tiene exactitud fotométrica. Si, ya que la absorbancia medida se encuentra dentro del límite de tolerancia de la absorbancia esperada.

F) Intervalo dinámico lineal de concentración. Tabla 6. Intervalo dinámico lineal de la concentración. Tubo.

Concentración de NiSO4(6H2O)

a

a´

1

1´

2

2´

A400 Serie a

Serie b

0M

0

0

9.5x10-3M

0.072

0.07

3

3´

0.0285M

0.15

0.155

4

4´

0.0665M

0.3

0.32

5

5´

0.1045M

0.47

0.475

6

6´

0.1425M

0.61

0.615

7

7´

0.152M

0.67

0.68

8

8´

0.171M

0.74

0.74

9

9´

0.1805M

0.77

0.76

10

10´

0.19M

0.8

0.8

C1V1=C2V2 𝐶2 =

0.19𝑀∗0.2𝑚𝐿 4𝑚𝐿

=9.5x10-3 M

A

Curva de calibración del NiSO4 0.9 0.8

y = 4.0426x + 0.0427 R² = 0.9979

0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 0

0.05

0.1

0.15

0.2

concentracion [M] Gráfica 4. Curva de calibración de NiSO4 (6H2O).

El intervalo dinámico lineal de concentración es el intervalo de concentraciones en el que se observa una respuesta lineal entre la absorbancia y la concentración ¿Cómo es el intervalo dinámico lineal con respecto al señalado por el profesor? El intervalo dinámico lineal señalado va desde 0M hasta 0.19M lo cual corresponde a lo que se reporta en la gráfica. ¿Qué puede indicar que el intervalo sea menor al esperado?

Un error al realizar la curva tipo o algún defecto el monocromador, fuente de radiación o detector. Tabla 7. Resumen de los resultados de evaluación del funcionamiento del espectrofotómetro.

Parámetro estudiado

Valores de Valores referencia experimental es

Exactitud de la escala de longitud de onda 1. Filtro de didimio Máximos (λ, nm)

Mínimos (λ, nm)

2. Solución NiSO4·6H2O al 20%

420 nm

420 nm

490 nm

490 nm

550 nm

550 nm

400nm

440nm

470 nm

470 nm

520 nm

520 nm Monocromado r.

500 nm

490 nm

Mínimos (λ, nm)

390-400 nm

400 nm

Proporcionalidad Fotométrica Datos de regresión de m= 0 530 a 570 nm R=1

m= 0.0031 r = 0.9801

Luz Dispersa %T a 400 nm (Solución de NiSO4·6H2O al 20%)

Parte del instrumento a evaluar

Se cumplen los tres máximos, mientras que en cuestión de los mínimos dos de ellos se cumplen , pero no el de 400 nm diferido a 420nm. Por lo que no establece que haya un error considerable en el monocromador.

de

Máximos (λ, nm)

%T a 450 nm

Conclusión

0-1%T

2% 0

El máximo no cumple, el mínimo sí. Como r=0.959 y se acerca a 1, además la pendiente es muy cercana a 0 podemos decir que se cumple linealidad fotométrica.

Evalúa la capacidad de respuesta lineal del instrumento.

Como los valores de %T son cercanos a cero no hay presencia de luz dispersa.

Monocromado r. Espejos sucios.

%T a 500 nm

0

Grietas. Apertura en el gabinete.

Ancho de Banda

86%

84 ± 3

%T a 510 nm

86%

Exactitud fotométrica 1. Método del filtro de vidrio neutro %T a 530 nm

84%-93%

86%

Como el valor obtenido por el espectrofotómetro solo difiere en 0.9% al valor máximo reportado en el espectro de Monocromado absorción el r. monocromador no presenta problemas para este espectrofotómetro La escala del espectrofotómetro es exacta ya que el valor obtenido entra dentro del rango permitido.

2. Método de la solución de NiSO4·6H2O al 20%

Detector.

Absorbancia a 400 nm

1.5- 2

1.5

Entra en el intervalo, no hay error en exactitud.

Absorbancia a 500 nm

0.04- 0.06

0.06

No cumple con el intervalo establecido.

Intervalo dinámico Lineal de Concentración Datos de regresión lineal

Intervalo concentración

m= 0

m= 0.01

r= 1

r= 0.9993

de 0.0M 0.19M

– 0 M –0.19M

Se presenta una relación lineal por lo que existe una buena codificación por parte del lector.

Monocromado r Fuente radiación Detector.

de

DISCUSIÓN: Para evaluar la exactitud de la escala de longitud de onda se construyeron espectros de transmisión que posteriormente también fueron útiles para determinar otros parámetros como el ancho de banda. Además, se evaluó la proporcionalidad fotométrica obteniendo un valor de r=0.9801 por lo que se obtuvo una relación lineal entre la respuesta de mi equipo y la energía radiante absorbida

En la determinación de la exactitud fotométrica se observó que los valores experimentales coinsidian con los de referencia. En cuanto al ancho de banda, se supondría que el valor de transmitancia se leyó en 510nm porque son los valores a donde está referido el máximo de transmitancia, no se presentan problemas con el monocromador del instrumento ya que el limite eran más menos 3% y nuestra lectura fue de 86%. La mayor dificultad a la que nos enfrentamos fue que el espectrofotómetro al ser análogo, la escala no presentaba decimales para los valores de transmitancia y absorbancia lo que dificultó un poco decidir el valor adecuado para cada lectura. CONCUSIONES: -No existen errores significativos en cuanto a la exactitud de la escala de longitud de onda. - No hay presencia de luz dispersa en el espectrofotómetro. - El monocromador no presenta fallas en el espectrofotómetro evaluado. - Existe buena codificación por parte del detector. - El detector se encuentra en buenas condiciones. - Hay una relación lineal entre la respuesta de mi equipo y la energía radiante absorbida

BIBLIOGRAFIA: 

Anónimo, guía para la verificación de espectrofotómetros uv-visible utilizados en el análisis de suelo y agua, recuperado de: https://inta.gob.ar/sites/default/files/script-tmpguia_espectrofotmetros_uv.pdf (23/09/18)



Skoog. Principios de Análisis Instrumental. Ed. Mac Graw Hill. 2002. Pp.182, 201.

•

Whitten, K.W., Davis, R. E., Peck, M.L. Química General Editorial Cengage Learning 8va Edición. Mexico DF. Pp 1058.