Validasi Metode.docx

Validasi metode Tujuan validasi metode analisis adlh untuk mengetahui bahwa metode analisis sesuai dgn tujuan penggunaannya. United States Pharmacopeia (USP): validasi metode dilakukan untk menjamin bahwa metode analisis akurat,spesifik, reprodusibel dan tahan pada kisaran analit yg akan dianalisis. • Menurut USP ada 8 langkah validasi metode analisis, sedangkan International Conference on Harmonization mensyaratkan 9 parameter. Parameter validasi metode No USP 1 Presisi 2 Akurasi 3 Batas deteksi 4 Batas kuantitasi 5 Spesifitas 6 Linieritas dan rentang 7 Kekasaran (Ruggedness) 8 Ketahanan (Robutness)

No 1 2 3 4 5 6 7 8 9

ICH Presisi Akurasi Batas deteksi Batas kuantitasi Spesifitas Linieritas Kisaran (Range) Ketahanan (Robutness) Kesesuaian sistem

Parameter Validasi Metode Analisis Sebelum dilakukan analisis, maka dicari kondisi optimum analisis yaitu selektifitas/spesifisitas 1. Selektifitas/spesifitas Selektivitas adalah kemampuan suatu metode analisis untuk mengukur analit secara akurat dan spesifik bila analit berada bersama-sama dengan komponen lain dalam matriks sampel seperti pengotor, produk degradasi dan komponen matrik (USP 30, 2007; Snyder et al., 2010). Pada Spektrofotometer : Pengukuran pada panjang gelombang maksimum untuk satu senyawa. Pengukuran pada titik isobestik untuk senyawa campuran. 2. Linieritas Linieritas metode analisis merupakan kemampuan suatu metode untuk memberikan hasil2 uji secara langsung atau melalui transformasi matematika, proposional terhadap kadar analit (USP 30, 2007). Persamaan garis regresi y= bx + a Untuk evaluasi kelurusan garis regresi tidak direkomendasikan hanya dgn perhitungan koefisien korelasi (r), krn r tdk menunjukkan linieritas, kecuali r > 0,999 (Shabir, 2003; Yuwono &

Indrayanto, 2005; Araujo, 2009). Bila nilai r < 0,999, untuk evaluasi garis regresi harus menggunakan parameter lain, misalnya perhitungan SD relatif Vxo, pengujian ANOVA linier atau F-test (Yuwono dan Indrayanto, 2005; Araujo, 2009). Pada Spektrofotometer :  Hukum Lambert-Beer : A= abc  Dr Hk Lambert-Beer dpt diketahui bahwa hubungan kadar dan Absorbansi linier LOD & LOQ pada Spektrofotometer  Diamati serapan 10 kali dari blanko kemudian tentukan SD  Dibuat satu seri konsentrasi yang mengikat (C1 –CN) : y = bx+a (slope = b)  LOD /LOQ = k.Sb/Sl Sb : SD blanko Sl : slope  Carr and Wahlich (1990): k = 3 (LOD) k= 10 (LOQ) 3. Rentang (range) Rentang suatu metode adalah interval kadar terendah dan tertinggi dimana suatu metode menunjukkan akurasi, presisi dan linieritas yg memenuhi persyaratan (Harmita, 2004). Range adalah selang antara konsentrasi terbesar dan terkecil dari analit pada sampel, dimana telah dibuktikan bahwa metode yang akan dipakai mempunyai harga akurasi ,presisi dan linieritas yang memenuhi persyaratan (USP XXIII, ICH 1993 ). Rentang kadar yang diuji tergantung pada metode dan kegunaannya, pada industri farmasi biasanya rentangnya antara 80% sampai 120% dari kadar target teruji (Yuwono dan Indrayanto, 2005). 4. Batas Deteksi & Batas Kuantitasi Batas Deteksi : jumlah analit terkecil yang dapat memberikan respon yang signifikan dibandingkan degan blanko. Batas Kuantitasi : jumlah analit terkecil yang dapat ditentukan dengan presisi dan akurasi tertentu. BD dan BK mutlak harus ditentukan kalau analit yang akan dianalisis konsentrasinya relatif kecil, seperti obat dalam cairan tubuh, metabolit sekunder dalam kalus, dsb. Perhitungan batas deteksi dan batas kuantitasi dihitung melalui persamaan regresi y = bx + a dari kurva linieritas (Miller, 1991; Harmita,2004).



Rumus batas Deteksi (BD) dan batas Kuantitasi (BK) adalah : 𝐵𝐷 =

3𝑆𝑦/𝑥 𝑏

𝐵𝐾 =

10𝑆𝑦/𝑥 𝑏

5. Akurasi Akurasi suatu metode analisis, adalah seberapa dekat hasil analisis yg didapatkan terhadap nilai yang sebenarnya (USP 30, 2007). Pengukuran akurasi dpt dilakukan dgn penentuan %recovery, untuk sampel spiked pada matrik blanko, disarankan menggunakan sampel dengan 5 kadar yang berbeda, dengan rentang 80120%, atau 75-125%, dari kadar target (Yuwono & Indrayanto, 2005). Untk validasi metode bioanalisis, evaluasi akurasi paling sdkt mengukur tiga tingkat kadar dgn lima replikasi (Araujo, 2009; Snyder 2010) 6. Presisi Presisi atau ketelitian metode analisis adalah ukuran yg menunjukkan derajat kesesuaian antara hasil uji individual bila prosedur diterapkan secara berulang pd sampel homogen (Harmita, 2004; USP 30, 2007). Presisi dibagi tiga kategori yaitu: keterulangan (repeatibility), presisi antara (intermediate precision) dan ketertiruan (reproducibility). Keterulangan adalah penentuan berulang yang dilakukan pada satu laboratorium dengan satu peralatan tertentu, oleh seorang analis dalam interval waktu yang pendek. Presisi metode analisis ditunjukkan oleh harga Koefisien Variasi (KV). Presisi dikatakan baik bila KV ≤ 2%. Tergantung pada kadar analit, jumlah sampel dan kondisi laboratorium (Yuwono dan Indrayanto, 2005). Menurut Buick et al. (1990), untuk validasi dengan kadar kecil (zat cemaran), harga KV dibawah 10% masih cukup memadai. 7. Ruggedness dan Robbustness Ruggedness adalah derajat reprodusibilitas hasil (akurasi dan presisi) dari suatu metode analisis untuk sampel yang sama pada variasi kondisi analisis yang normal.  Menurut USP XXIII : Variasi meliputi perbedaan alat, perbedaan merk pereaksi, perbedaan waktu analisis dan perbedaan analis yang mengerjakan. Robustness adalah kemampuan metode analisis untuk tetap memberikan hasil yang dapat dipercaya pada perubahan kecil yang disengaja ( USP XXIII, ICH 1993 ).

Contoh perubahan ini adalah : jumlah standar yang ditimbang, waktu untuk vorteks, volume untuk melarutkan, dsb. Tahapan ini menurut Hokanson 1994 cites by Yuwono et al 1999 ) merupakan uji validasi lanjut. Menurut Yuwono perubahan ruggedness atau robbustness tidak lebih dari 2 – 5 %.Jika variasinya lebih besar dari 5 % , maka harus dicari penyebabnya.

Daftar Pustaka Araujo, P., 2009, Key aspects of analytical method validation and linearity evaluation, Journal of Chromatography B, 877, 2224- 2234 Harmita, 2004, Petunjuk pelaksanaan validasi metode dan cara perhitungannya, Majalah Ilmu Kefarmasian, 3, 117-135 Miller J.C. and Miller J.N., 1988, Statistics for Analytical Chemistry, 2nd Edition, John Wiley & Sons, New York. Shabir, G.A., 2003, Validation of high-performance liquid chromatography methods for Pharmaceutical analysis. Understanding the differences and similarities between validation requirement of the US Food and Drug Administration, the US Pharmacopeia and International Snyder, L.R., Kirkland, J.J., Glajch, J.L., 2010, Introduction to Modern Liquid Chromatography, 3rd edition, John Wiley & Sons, Inc, New York. The United States, Pharmacopeia XXX, The National Formulary XXIII (2007), Volume 2. Yuwono, M., Indrayanto, G., 2005, Validation of Chromatographic Methods of Analysis Profiles of Drug Substances Exipients, and Related Methodology, 32, 243-258.