Validasi Metode Uji 2018.pdf

VALIDASI METODE UJI HERAWATI POLITEKNIK AKA BOGOR e-mail: [email protected] Hp. 082115471014

METODE ABSOLUT & PERBANDINGAN • Metode Absolut – Gravimetri – Titrimetri • Metode Perbandingan – Spektrofotometri (UV/Vis, AAS, Spektrofluorometri) – Kromatografi (TLC, GC, HPLC)

Untuk apa Metoda Uji

Penentuan Kualitatif Atau Identifikasi

Penentuan Kuantitatif

Verifikasi Akurasi dan Presisi Perhatikan matrik

Verifikasi Limit Deteksi dan Spesifisitas Perhatikan matriks

Verifikasi Linearitas dan Rentang Evaluasi Hasil dan bandingkan Dg Persyaratan metoda

3

Laporkan secara Formal dan buat Kesimpulan dapat digunakan dan memenuhi persyaratan metoda

Verifikasi Batas Deteksi Alat Dan Batas Deteksi metoda

Evaluasi Hasil dan bandingkan Dg Persyaratan metoda

validasi dan verifikasi

“ sebuah metode harus di-”validasi” untuk memastikan kelayakan teknisnya, unjuk kerjanya, keterbatasannya, dan kelayakannya untuk digunakan sesuai tujuan tertentu “

“ sebuah metode yang telah ditetapkan sebelumnya (misalnya: metode baku, modifikasi metode baku yang telah divalidasi, metode pengembangan sendiri yang telah divalidasi) harus dievaluasi untuk mem-”verifikasi” bahwa - unjuk kerjanya pada saat diterapkan pada kondisi yang dimiliki oleh pengguna tersebut - memenuhi persyaratan sesuai tujuan penggunaannya dan berada di dalam batas-batas data “validasi” metode tersebut”

4

BAGAIMANA MELAKUKAN VERIFIKASI METODA UJI. Laboratorium harus memastikan kesesuaian antara persyaratan yang ditetapkan dalam metoda uji dengan kondisi atau kemampuan yang dimiliki mulai dari ruang-lingkup penerapan(Scope), preparasi sampel, peralatan, reagent, pelaksanaan prosedur pengujian, perhitungan, presisi dan bias. Atau jaminan mutu dan pengendalian mutu. Khusus untuk Presisi dan Bias/Akurasi, laboratorium harus melakukan melalui pengujian sehingga diperoleh Nilai presisi atau repetabiliti dan nilai Akurasi

6

Kapan Suatu Metode perlu di Validasi ? Apabila metode tersebut baru dikembangkan untuk suatu permasalahan yang khusus Apabila metode yang selama ini sudah rutin, direvisi untuk suatu pengembangan atau diperluas untuk memecahkan suatu permasalahan analisa yang baru Apabila hasil QC menunjukkan bahwa metode yang sudah rutin tersebut berubah terhadap waktu (QC charts) Apabila metode rutin digunakan di laboratorium yang berbeda, atau dilakukan oleh analis yang berbeda atau dilakukan dengan peralatan yang berbeda

Perencanaan Validasi

Tentukan Matriks yang Dapat diterapkan mengunakan metoda dimaksud

Tentukan Parameter Validasi yang akan dilakukan, lihat tabel.

Tentukan Kriteria Keberterimaan hasil validasi

Tentukan Teknik statistik dan evaluasi Hasil Validasi

Laporkan secara Formal dan buat Kesimpulan dapat digunakan dan memenuhi persyaratan metoda 9

ANALYTICAL METHOD VALIDATION (AMV) PRESISI AKURASI LIMIT DETEKSI (LOD) : IDL; MDL

LIMIT QUANTITASI PARAMETER /UNJUK KERJA VALIDASI METODE UJI

KONFIRMASI IDENTITAS SPESIFISITAS SELEKTIVITAS

LINEARITAS & SENSITIVITAS DAERAH KERJA/ RANGE

ROBUSTNESS UNCERTAINTY/ KETIDAKPASTIAN

precision and accuracy

setiap pengukuran selalu memiliki ketidakpastian ketidakpastian berkaitan dengan random error dan systematic error estimasi ketidakpastian memerlukan informasi tentang:

variabilitas pengukuran (jangka pendek maupun jangka panjang); dan tingkat penyimpangan dari (taksiran) nilai benar

precision and accuracy dapat dievaluasi melalui replika analisis terhadap standar, bahan acuan, atau bahan acuan bersertifikat Variasi data yang dihasilkan dari replika mencerminkan akumulasi random

error dan systematic error dari metode ukuran sebaran data (standar deviasi) dapat digunakan sebagai taksiran ketidakpastian secara experimental dari metode 11

PARAMETER PRESISI Kedekatan beberapa nilai pengukuran dari sampel yang homogen pada kondisi normal (sampel yang sama dan diuji secara berurutan) Terdiri atas : Repeatability, intermediate precision, dan reproducibility

Faktor yang mempengaruhi Reprodusibilitas • Perbedaan suhu kamar dan kelembaban • Operator dengan pengalaman dan pengetahuan

berbeda • Peralatan dengan karakteristik berbeda • Variasi bahan dan kondisi instrumen • Umur pakai alat yang berbeda • Pelarut, pereaksi dan bahan lain dengan mutu

berbeda 5/1/2018

TAHAPAN UJI PRESISI Langkah – langkah : •Siapkan sampel sesuai dengan metode yang akan validasi/verifikasi •Hitung kadar analit dalam sampel sebanyak minimal 7 kali •Hitung standar deviasi (SD), presisi (RSD), atau koefisien variansi (CV%) dengan menggunakan rumus sebagai berikut :

Lanjutan : •Bandingkan hasil percobaan (SD atau %RSD atau %CV) dengan yang terdapat pada metode acuan.

•Jika pada metode uji tidak terdapat nilai acuannya, maka dibandingkan dengan CV(%)Horwitz. Persyaratan hasilnya harus lebih rendah dari 2/3 CV(%) Horwitz

%CV HORWITZ = 2 dimana: C adalah fraksi konsentrasi

1-0,5Log C

PRESISI Untuk presisi yang dilakukan 2 kali pengulangan pengujian, evaluasi berdasarkan hasil RPD (( Relative Percent Difference ) yang dirumuskan sebagai berikut :

Dengan pengertian : X = Rerata hasil pengujian X1= Hasil pengujian pertama x2= Hasil pengujian kedua

PRESISI

reproducibility Between lab precision Memastikan bahwa metode menyediakan hasil yang sama di lab. yang berbeda Mengetahui kehandalan/kinerja lab Presisi yang mengukur keragaman nilai hasil uji dari sampel yang sama pada kondisi operator, peralatan, lab dan waktu yang berbeda Validasi reprodusibilitas penting dilakukan jika metode akan digunakan di lab yang berbeda

PARAMETER AKURASI • Akurasi didefinisikan sebagai kesesuaian antara hasil uji analisis dengan nilai benar analit (true value atau nilai acuan analit yang dapat diterima). • Adanya penyimpangan nilai rata-rata hasil pengukuran dari nilai sebenarnya disebabkan adanya bias Bias : perbedaan hasil analisis rata-rata dengan nilai acuan Bias : (A – B) x 100 ; A = nilai acuan; B = rata-rata uji A Nilai keberterimaan : bias (-2.0) % s.d (+ 2,0) % • Uji Akurasi dapat ditentukan melalui berbagai cara: – Pengukuran CRM (evaluasi : uji t-tunggal, Recovery atau Bias) – Perbandingan dengan metode lain (evaluasi : uji t-beda nyata) – Pemakaian jumlah sampel yang berbeda (evaluasi : uji t-beda nyata) – teknik Spiking ( evaluasi : Recovery)

AKURASI ( Penggunaan CRM ) • Yang diuji : CRM masing-masing dianalisis 10 kali memakai metode yang divalidasi • Yang dihitung : Hasil rata-rata CRM dikoreksi hasil rata-rata blanko pelarut Evaluasi akurasi dapat terdiri atas : ✓ (hasil rata-rata CRM – nilai sertifikat) bias ✓ atau Uji t tunggal ✓ Recovery (nilai percobaan terhadap nilai benarnya) atau (nilai percobaan terhadap nilai teoritisnya)

AKURASI ( Penggunaan CRM ) Cara Menghitung Akurasi • Nilai benar kandungan benzoat dalam bahan acuan juice jeruk misal 50 ppm • Hasil analisis memberikan data sebesar 49,24 ppm • Bias (%) = /50 - 49,24/ x 100 % 50 = 1,52%

Recovery Latar Belakang • Dalam suatu pengujian sampel, analit yang terkait dalam matriks sampel harus dilarutkan/diekstraksi/dibebaskan sebelum dapat diukur. • Agar hasil pengujian akurat maka efisiensi pelarutan/ekstraksi itu harus 100% • Selain itu, analit tidak boleh hilang (menguap, masih terikat pada kolom pemisahan, lolos pada penyaringan dsb.) selama proses preparasi contoh berlangsung. • Uji Recovery ini terdiri dari : 1. Pengujian atas CRM 2. Pengujian sampel yang diperkaya (spike) dengan sejumlah kuantitatif standar analit yang akan ditetapkan. Pada uji Recovery teknik spiking ini dibutuhkan : - Sampel - Standar analit

Permasalahan pada Teknik Recovery • Kapan recovery harus diperhitungkan dalam metode analisis? Apabila prosedur pre-treatment sampel atau preparasinya metode yang digunakan cukup panjang • Bagaimana Jika preparasi sampel simple/pendek ?

pada

Sebagai ilustrasi, recovery tidak perlu diperhitungkan jika sampel hanya disaring dengan membran dan setelah itu siap diinjeksikan pada kolom HPLC.

Faktor-faktor yang dapat dievaluasi dari teknik recovery 1. Efisiensi desktruksi, ekstraksi terhadap lepasnya analit dari matriksnya (apa 100%?) 2. Kerusakan analit dalam hidrolisa sejauh mana, sehingga berpengaruh pada pengukuran analit. 3. pre treatment yang panjang seperi residu pestisida (apakah analit ada yang hilang??)

1. Recovery Menggunakan CRM CRM selalu disertai dengan sertifikat CRM tersebut • Pada sertifikat tertulis, konsentrasi analit = C.CRM (ppm) ± μ(ppm) μ adalah nilai ketidakpastian konsentrasi • Untuk percobaan recovery, diambil sejumlah tertentu CRM, analisis menggunakan metode yang akan divalidasi. Jika hasil analisisnya adalah : Canalisis (ppm) Ulangi percobaan diatas minimal 7 kali • Hitung nilai rata-rata Canalisis (ppm) Recovery dihitung sebagai berikut: Recovery metode = (Crata2 analisis/C.CRM) x 100%

Studi Kasus Percobaan Recovery menggunakan CRM dari unsur logam Pb dalamCRM Logam Alloy

• CCRM = (7,911 ± 0,005) µg/g

• Dari 6 kali analisis yang dilakukan laboratorium menggunakan metode yang sedang divalidasi, diperoleh data bahwa konsentrasi rata-rata logam Pb dalam CRM Logam Alloy adalah: • Crata-rata = 7,123 µg/g • Recovery Metode = (7,123/7,911) x 100 % = 90,04 %

2. Recovery dengan teknik spiking : • Mula-mula sampel diuji dan hasil pengujian = C1 • Kepada sampel yang sama ditambahkan (spiking) sejumlah analit yang diketahui banyaknya, misalnya konsentrasi = C2, lalu dilakukan pengujian dengan hasil C3 • Analit yang diperoleh kembali = (C3 – C1) dari banyaknya yang ditambahkan (C2)

• Nilai perolehan kembali/Recovery (%) = (C3 – C1) x 100 C2 • Apabila dalam pengujian ini tidak ada kesalahan sistematik maka recovery tidak akan berbeda secara signifikan dari 100%

recovery

recovery analit dapat diestimasi melalui analisis spiked sampel dengan konsentrasi analit yang telah diketahui sampel harus di-spiked dengan analit yang dimaksud paling sedikit dengan 3 konsentrasi analit yang berbeda, yaitu dekat limit deteksi, dekat dengan batas maksimum konsentrasi (batas atas range) dan di tengah-tengah range penggunaan metode

26

CONTOH : LANGKAH KERJA UJI RECOVERY TEKNIK SPIKING 1. Penetapan Fe dalam sampel

100 mL

0,01 - 1 g sampel alloy

Ukur Absorban Sebagai Kadar Fe dlm sampel (C1)

2. Uji Recovery

5 mL Fe 100 mg/L Spike Fe stdr ..... % (C2) bobot sampel alloy yg ditimbang (0,01 g)

100 mL

Dilakukan pengenceran 10x Ukur Absorban Kadar Fe dlm (sampel + spike) (C3)

PARAMETER (LOD) LIMIT DETEKSI • Limit deteksi (LD) menurut Greenberg, A.E dkk adalah konsentrasi terendah dari analit dalam sampel yang dapat dideteksi diatas noise atau blanko dalam suatu prosedur analisis untuk confidence limit (batas kepercayaan) tertentu. Confidence limit perlu ditentukan agar kesalahan deteksi dan tidak terdeteksi peluangnya kecil yaitu maksimum 5%. • Menurut Greenberg, A.E dkk , beberapa istilah yang digunakan untuk menyatakan Limit deteksi khusus sbb : - LOD (IDL) (Instrument Detection Limit) - MDL (Method Detection Limit) - LOQ (Limit of Quantitation) Seringkali IDL digunakan sebagai pedoman untuk menetapkan MDL. Hubungan antara Limit-Limit tersebut seperti berikut : LOD(IDL) : MDL : LOQ = 1 : 4 : 10

Beberapa Blanko Sampel : • Pada penetapan residu pestisida dalam beras, sebagai blanko sampel dapat dipakai beras organik • Pada penetapan kadar antibiotika dalam ikan; sebagai blanko sampel dapat digunakan ikan yang dibudidayakan tanpa penambahan antibiotika atau ikan yang ditangkap di tengah laut lepas • Pada penetapan aditif dalam juice jeruk, blanko sampel dibuat dari buah jeruk yang diperas.

CARA MENETAPKAN LIMIT DETEKSI (LOD)

1. LOD berdasarkan analisis kualitatif (visual evaluation) 2. LOD berdasarkan pengukuran larutan blanko (n > 20 untuk blanko; n > 10 untuk blanko sampel). Rumus yang digunakan : LOD teoritis = nilai rata-rata konsentrasi blanko + (3SDblanko);

kemudian LOD tersebut dikonfirmasi kembali melalui pengujian. (LOD ini merupakan LDI karena menggunakan instrumentasi) 3. LOD (LDI teoritis) berdasarkan persamaan kurva kalibrasi, kemudian LOD tersebut dikonfirmasi kembali melalui pengujian LODteoritiS = (3Sy/x)/b ; b = slope kurva 4. LOD berdasarkan signal terhadap noise (2:1) atau (3:1)

1. Evaluasi LOD berdasarkan analisis kualitatif :

• Ukur blanko yang ditambahi analit dengan berbagai konsentrasi yang berbeda, dimana untuk masing-masing konsentrasi 10 buah, semua diukur @ 1 kali • Tentukan tingkat konsentrasi di bawah mana identifikasi analit menjadi kurang andal

5/1/2018

Lanjutan 1. Contoh : Limit deteksi analisis kualitatif : • Kons analit (mg/L) 200 100 75 50 25

Replikasi analisis 10 10 10 10 10

Hasil +/-

10/0 10/0 5/5 1/9 0/10

Di bawah konsentrasi 100 mg/L identifikasi yang positif menjadi kurang andal

5/1/2018

2. Evaluasi LOD berdasarkan pengukuran larutan blanko a.

Deret Standar Fe ( mg/L ) 0.00 0.25 0.50 1.00 2.00 3.00 4.00

Rata - rata Abs

Ulangan blanko Abs sampel 1 0.0106 2 0.0100 3 0.0100 4 0.0091 5 0.0095 6 0.0108 7 0.0100 8 0.0090 9 0.0105 10 0.0089 Rerata SD 3 SD LOD Fe teoritis (mg/L)

b.

0.0047 0.0316 0.0633 0.0949 0.2033 0.3079 0.3884

Kurva Kalibrasi Fe

0.50

Absorban

0.40 0.30 y = 0.0970x + 0.0073 0.20

Conc Fe ( mg/L ) 0.0340 0.0278 0.0278 0.0186 0.0227 0.0361 0.0278 0.0175 0.0330 0.0165 0.0278 0.0066 0.0198

0.05

Dilanjutkan dengan pengujian konfirmasi LOD Teoritis yang diperoleh

0.10 0.00 0.00

1.00 Konsentrasi 2.00Standar 3.00 Fe ( µg/mL ) 4.00

5.00

2. lanjutan Evaluasi LOD berdasarkan pengukuran blanko

larutan

• Kasus : pada penetapan Fe, berdasarkan hasil pengukuran blanko diperoleh LOD teoritis sbb : LOD teoritis dengan rumus = nilai rata-rata konsentrasi blanko sampel + (3 SD) yaitu : 0,05 mg/L; maka dibuat 7x ulangan konsentrasi Fe 0,05 mg/L dan diukur kembali, hasil yang diperoleh sbb :

1. Tahap pertama : Jika 7 x pengulangan pengukuran larutan uji dengan konsentrasi 0,05 mg/L diperoleh data sbb: (0,03; 0,10; tt; 0,03; 0,08; tt; 0,1) mg/L; maka Buatlah larutan uji standar Fe kembali dengan konsentrasi > 0,05 mg/L sebanyak 7x ulangan (misalkan dibuat 0,10 mg/L) dan evaluasi kembali. 2. Hasil tahap kedua : Jika hasil 7x pengukuran larutan uji untuk LOD Fe dengan konsentrasi 0,10 mg/L diperoleh data sbb: (0,15; 0,20; 0,17; 0,05; 0,09; 0,18; 0,08 ) mg/L; maka 0,10 mg/L adalah LOD Fe.

3. Evaluasi LOD berdasarkan persamaan kurva kalibrasi Deret stdr

Fe stdr (mg/L)

rerata Abs (Yi)

yC

(yi - yC)2

1

0.00

-0.0308

-0.0196

0.00012555

2

1.00

0.0963

0.0827

0.00018615

3

2.00

0.1792

0.1849

0.00003258

4

3.00

0.3016

0.2872

0.00020854

5

4.00

0.3791

0.3894

0.00010631

6

5.00

0.4908

0.4917

0.00000074

∑

0.00065987

n=6 slope = b

0.1023

S(y/x) = √∑(yi-yC)2/(n-2) LDI ppm = (3Sy/x)/b

0.01284 0.38

LOD teoritis Fe yang diperoleh sebesar 0,38 mg/L; maka dibuat larutan uji standar Fe dengan konsentrasi 0,38 mg/L sebanyak 7x ulangan dan diukur kembali; Jika hasil pengujian 7x ulangantersebut diperoleh sebagai berikut (0,15; 0,05; 0,10; 0,40; 0,09; 0,35; dan 0,27) mg/L; maka LOD Fe sebesar 0,38 mg/L

4. LOD berdasarkan signal terhadap noise 0.5 ng/mL std 0 .5

p p b

m ix

Oxolinic Acid

1 5 .1

0 1 0 1 1 5 _ 1 6 1 0 0

S m

(S G , 2 x 2 ) 8 .1 1 3 7

2 : M R M

o f 5

0 .5

C h a n n e ls E S + 2 6 2 .1 2 > 1 6 0 .0 2 8 4 5 A re a

%

p p b

Danofloxacin

m ix

0 1 0 1 1 5 _ 1 6 1 0 0

1 5 .1

S m

(S G , 2 x 3 ) 2 .1 4 2 6

1 : M R M

o f 6

C h a n n e ls E S + 3 5 8 .0 8 > 9 5 .9 1 5 4 1 A re a

%

3 7 7 .0 0

T im e 7 .5 0

8 .5 0

9 .0 0

6 1

9 .5 0

1 .5 0

IDL 0.24 ng/mL)

0.25 ng/mL std 0 .2 5

8 .0 0

m ix

0 1 0 1 1 5 _ 1 9 1 0 0

1 5 .1

S m

(S G , 2 x 2 ) 8 .1 1 2 9

2 : M R M

o f 5

2 .5 0

3 .0 0

T im e 3 .5 0

IDL 0.30 ng/mL) 0 .2 5

p p b

2 .0 0

C h a n n e ls E S + 2 6 2 .1 2 > 1 6 0 .0 2 6 5 4 A re a

p p b

m ix 1 5 .1

0 1 0 1 1 5 _ 1 9 S m 2 .1 0 1 0 0 1 4

(S G , 2 x 2 )

1 : M R M

o f 6 C h a n n e ls E S + 3 5 8 .0 8 > 9 5 .9 1 5 2 3 A re a

% %

3 .2 9 1 1

5 0

T im e 7 .0 0

5/1/2018

8 .0 0

9 .0 0

6 7 1 .5 0

T im e 2 .0 0

2 .5 0

3 .0 0

3 .5 0

LOQ • Limit kuantisasi ( LOQ ) atau biasa disebut juga limit pelaporan (limit of reporting) adalah konsentrasi terendah analit dalam sampel yang dapat ditentukan dengan tingkat presisi dan akurasi yang dapat diterima, dibawah kondisi pengujian yang disepakati LoQ = nilai rata-rata blanko + (10 SD)

STUDI KASUS LOQ • Jika 6 x pengulangan pengukuran larutan uji dengan konsentrasi 5,57 ppb diperoleh data sbb: (5,3; 5,5; 5,7; 5,2; 5,8; 5,9) ppb maka 5,57 ppb adalah LOQ karena: KV dari kumpulan data adalah 5,04 %, Sedangkan persyaratan KV yang memadai untuk repeatabilitas 23,07% • Hasil 6 x pengulangan pengukuran larutan uji dengan konsentrasi 5,73 ppb diperoleh data sbb: (6,4; 5,5; 9,3; 3,2; 5,8; 4,2) ppb karena KV kumpulan data tersebut = 36,58%, Persyaratan yang memadai adalah 22,96% Maka : Buatlah contoh untuk penetapan LOQ dengan konsentrasi > 5,73 ppb

LIMIT DETEKSI METODE (LDM) atau MDL ▪ Konsentrasi terkecil analit yang diinginkan setelah melalui metode analisis secara lengkap. Nilainya akan lebih besar dari limit deteksi terendah ▪ Konsentrasi terbaik dari analit yang dapat dideteksi atau dapat menghasilkan respon yang nyata dibanding blanko ▪ Tergantung matriks ▪ Dinyatakan untuk masing-masing matrik ▪ Analisis replikat dari 7 sampel yang dispike pada satu konsentrasi tertentu. Konsentrasi standar spike kira-kira sama dengan 5 kali IDL dibagi faktor konsentrasi metode MDL = rata-rata konsentrasi blanko sampel + (t .tabel x SDsampel) MDL =(t .tabel x Sdsampel ) (jika respon blanko negatif)

5/1/2018

sensitivity, limits of detection and reporting

sensitifitas metode dapat didefinisikan sebagai kemiringan (“slope” atau “gradient”) dari fungsi: y = f(x) sensitifitas pada umumnya bervariasi terhadap konsentrasi batas bawah konsentrasi yang dapat dideteksi merupakan “limit of detection”

“limit of detection” adalah konsentrasi terendah analit di dalam sampel yang dapat dideteksi (belum tentu dapat dikuantifikasi) dalam kondisi pengujian tertentu

“limit of quanification (reporting)” adalah konsentrasi terendah analit di dalam sampel yang dapat ditentukan pada tingkat akurasi metode dalam kondisi pengujian tertentu

40

PARAMETER LINIERITAS • Kemampuan suatu metode analisis untuk menghasilkan hasil yang proporsional terhadap perubahan respon alat dengan konsentrasi analit dalam sampel pada kisaran yang ada. • Mengetahui kemampuan standar dalam mendeteksi analit dalam sampel • Uji ini dilakukan dengan suatu seri larutan baku yang terdiri dari minimal 6 konsentrasi yang menaik dengan rentang/kisaran (0–150)% atau (50–150)% dari konsentrasi komponen uji • Diharapkan respon linier terhadap konsentrasi larutan baku dengan nilai koefisien korelasi mendekati 1,00

linearity and range

linieritas adalah kemampuan metode untuk memberikan hasil uji yang proporsional terhadap konsentrasi analit dalam sampel pada rentang konsentrasi tertentu

Linieritas metode dapat diamati dengan melakukan plot (secara grafis) hasil uji sebagai fungsi konsentrasi analit : y = a + bx

b dan varian y memberikan ukuran matematis linieritas dan a memberikan ukuran bias potensial dari metode

range (rentang) aplikasi metode adalah interval di antara tingkat konsentrasi analit tertinggi dan terendah yang dapat memberikan hasil uji dengan precision, accuracy dan linearity yang dipersyaratkan untuk kondisi pengujian tertentu 42

Least Square

Sensitivitas /kepekaan Metode Analisis: • Menunjukkan kemampuan dari metode atau instrumen dalam membedakan konsentrasi-konsentrasi suatu anali yang perbedaannya kecil. • Ukuran kualitas metode yang menggambarkan kemampuannya untuk mendeteksi adanya suatu komponen (analit) dalam contoh yang dianalisis • Ratio antara perubahan respons alat ukur terhadap perubahan konsentrasi analit yang diukur. • Sensitivitas dibedakan menjadi : - sensitivitas kalibrasi (IUPAC) adalah Slope = m dari kurva kalibrasi pada konsentrasi yang diinginkan. - sensitivitas analitik; merupakan nilai yang tergantung pada simpangan baku hasil analisis tidak tergantung pada satuan signal atau respon alat.

5/1/2018

Sensitivitas Kalibrasi : • Sensitivitas kalibrasi (IUPAC) berdasarkan nilai Slope = m pada kurva kalibrasi, S = mc + Sbl • Bila grafiknya linier dan memiliki persamaan y = bx + a, maka sensitivitasnya adalah b = (y-a)/x • Bila a = 0 (grafik melewati titik nol, maka sensitivitasnya b = y/x atau respons alat ukur dibagi dengan konsentrasi analit • Ratio y/x (1 : 1) antara perubahan respons alat ukur terhadap perubahan konsentrasi analit yang diukur merupankan nilai proporsional ditunjukkan derajat kemiringan kurva kalibrasi mendekati 45o (tg 45o =1) 5/1/2018

Ilustrasi :

Berapa derajat kemiringannya?

5/1/2018

Contoh : Untuk instrument AAS; Sensitivitas konsentrasi analit yang memberikan respon absorban 0,0044 (ASTM E 663-86 (Reapproved 1991) Langkah – langkah:

• Pilih larutan standar yang nilai absorbansi 0,0044 (daerah linier pengukuran) atau larutan standar yang memberikan nilai absorbansi (0,2 – 0,4) • ukur serapan-masuknya (absorbans) sebanyak 10 kali • Hitung absorbansi rata-rata dan menghitung nilai sensitifitasnya dengan menggunakan rumus berikut:

• Bandingkan dengan sensitivitas yang ada pada manual book batas keberterimaan sensitifitas (TOLERANSI ± 30%)

Working range dan daerah linear range Instrument response

LOL

LOQ => limit of quantitative measurement

LOL => limit of linear response

LOQ Useful range

Concentration

interferences and matrix effect

selectivity, atau specivity metode adalah kemampuan metode untuk dapat menentukan secara akurat dan spesifik analit yang dimaksud dengan adanya komponen lain dalam matriks sampel dalam kondisi pengujian tertentu bila diketahui atau diduga terdapat interferensi, pengaruhnya terhadap metode uji dapat dievaluasi dengan menganalisis sampel dengan konsentrasi diketahui

yang ditambahkan interferensi tertentu yang diduga berpengaruh terhadap metode uji prosedur ini harus dilakukan terhadap sampel yang mengandung analit pada rentang konsentrasi yang diharapkan akan ditemui pada kondisi pengujian yang sebenarnya 50

Uji Ruggedness/Robustness Metode • Ukuran bagi suatu metode analisis dalam mempertahankan unjuk kerjanya dalam situasi dimana pengaturan kondisi analisis tidak sesempurna seperti yang ditetapkan dalam metode yang bersangkutan • Dalam metode analisis ada tahap-tahap kritis dimana bila tidak dikerjakan secara hati-hati akan menimbulkan kesalahan yang besar • Dilakukan dengan memvariasikan kondisi analisis sedemikian rupa dan mengukur pengaruhnya terhadap presisi dan akurasi yang dicapai. • Membantu dalam mengantisipasi dan mengeliminasi sumber kesalahan yang mungkin

• Mendemonstrasikan bahwa metode stabil terhadap perubahan kondisi metode yang kecil

Uji Ruggedness (inter lab variation) Robustness (intra lab variation) ❖ Ketahanan suatu metode terhadap perubahan kecil ±(10–20) % dari kondisi pada prosedur, misalnya : jenis pelarut, konsentrasi pelarut, perubahan pH, waktu ekstraksi, perbedaan kolom, perubahan temperatur ❖ Ketahanan metode uji dievaluasi dengan uji standar keberterimaan akurasi dan presisi atau dengan uji-T dan uji F atau ❖ Cara pengujian : - dilakukan pengujian pada sampel uji berulang (minimal 7x) pada kondisi normal dan kondisi perubahannya. - kemudian dievaluasi terhadap standarkeberterimaan (akurasi dan presisi) sesuai syarat keberterimaan yang digunakan.

Parameter Validasi Metoda” USP” Parameter validasi

Kategori I

Kategori II Batas Tes

Kategori II Kuantitatif

Kualitatif/ID

Kategori III

Batas Deteksi

Tidak

Ya

Tidak

Yes

*

Batas kuantitasi

Tidak

Tidak

Ya

No

*

Linearitas

Ya*

Tidak*

Ya

No

*

Rentang

Ya*

*

Ya

No

*

Presisi

Ya

Tidak

Ya

No

Ya

Akurasi

Ya

*

Ya

No

*

Spesifisitas/Selektif itas

Ya*

Ya

Ya

Yes

*

Kehandalan/ Robustness/ Ruggedness.

Ya*

Ya

Ya

No

Ya

Catatan : *

Sesuai kondisi

53

Parameter Validasi Metoda** Parameter validasi

Senyawa Utama Kuantitatif

Senyawa Utama dan Runutan Kuantitatif

Runutan Kualitatif

Runutan Kuantitatif

Batas Deteksi

Tidak

Tidak

Tidak

Tidak

Batas kuantitasi

Tidak

Ya

Ya

Ya

Linearitas

Ya*

Ya

Ya

Ya

Rentang

Ya*

Ya

Ya

Tidak

Presisi

Ya

Ya

Ya

Ya

Akurasi

Ya

Ya

Ya

Ya

Spesifisitas/Selektifitas

Ya*

Ya

Ya

Ya

Kehandalan/ Robustness/ Ruggedness.

Ya*

Ya

Ya

May Be

Catatan : *

Sesuai kondisi

54

karakteristik metode

karakteristik yang dievaluasi

Recovery/Akurasi

prosedur analisis spiked sampel pada konsentrasi tertentu

minimal triplikat ( 80, 100 dan 120 %) dari label

analisisi bahan acuan bersertifikat (CRM)

minimal 7 kali untuk setiap CRM

selectivity (interferences) analisis spiked sampel, matirx effect

bahan acuan atau bahan acuan bersertifikat

limit of detection

Analisis blanks dan low level spiked sampel

limit of quantification

jumlah penentuan

minimal 7 kali, masingmasing 3 tingkat konsentrasi untuk setiap jenis matrix sampel

Minimal 7 kali untuk setiap jenis matrix sampel 55

karakteristik metode

karakteristik yang dievaluasi

prosedur

jumlah penentuan

Presisi

replika analisis sampel

minimal 7 kali untuk setiap jenis matriks sampel

robustness

analisis sampel natural dan spiked dan bahan acuan sekunder

replika analisis (minimal 7 kali) oleh operator yang berbeda selama beberapa hari

reproduecability

analisis oleh operator dan peralatan yang berbeda (biasanya dengan inter-laboratory study)

replika analisis (minimal 7 kali) oleh operator yang berbeda, di laboratorium yang berbeda dengan peralatan yang berbeda 56

karakteristik metode

karakteristik yang dievaluasi

prosedur

jumlah penentuan

linearity and range

analisis standard

bias,

bahan acuan, atau bahan Minimal 7 kali replika acuan bersertifikat bila analisis untuk setiap ada bahan acuan atau CRM

systematic error, Accuracy

Minimal 3 kali, masingmasing dg 5 tingkat konsentrasi pada rentang kerjanya

(total error) (random and systematic error)

57

inter-laboratory collaborative studies

inter-laboratory collaborative studies (uji banding antar laboratorium atau uji profisiensi), merupakan salah satu cara yang dapat digunakan untuk

mengevaluasi: karakteristik metode; kelayakan metode; kompetensi analis; nilai acuan suatu bahan; perbandingan metode analisis

58

Laporan Validasi/Verifikasi 1. Tujuan dan ruang Lingkup metoda (applicability, Type). 2. Summary of Metodologi. 3. Jenis Senyawa yang dapat dianalis dan Matriks. 4. Semua bahan kimia, reagent, reference standar, grade, purity, sumber atau rincian instruksi preparasi.

5. Prosedur untuk cek mutu standar dan bahan kimia yang digunakan. 6. Perigatan Keselamatan. 7. Peralatan yang digunakan dan persyaratan kinerja yang diperlukan. 8. Rincian bagaimana percobaan dilakukan, termasuk preparasi sampel, 9. Perhitungan dan statistik yang digunakan. 59

Laporan Validasi/Verifikasi 10. Data-data pendukung seperti kurva, kromatogram, dll. 11. Kriteria keberterimaan hasil validasi. 12. Ketidakpastian. 13. Kriteria Re-validasi. 14. Personil yang melakukan.

15. Referensi yang digunakan, bila ada. 16. Ringkasan dan Kesimpulan. 17. Review terhadap hasil dan persetujuan. 18. Pengesahan atau persetujuan oleh nama, jabatan, tanggal dan tandatangan. 60

SEKIAN DAN TERIMA KASIH