Usmp Enzimas

Reacciones químicas Enzimología :Cinética enzimática Papel Clínico

Reacciones químicas Reacción de primer orden. Su velocidad es directamente proporcional a la concentración del reactivo. A B La reacción inversa de B a A es muy pequeña. El equilibrio está desplazado a formar B La Velocidad de la reacción (V) como formación de producto B o desaparición de sustrato A V= d(B)/dt = -d(A)/dt= k1(A) Conforme se consume A la velocidad de reacción se reduce

Velocidad de una reacción de primer orden

Reacciones químicas Reacciones de segundo orden: Se produce siempre que dos moléculas deban entrar en contacto para formar productos. 2A

k2

B

V = d(B)/dt = k2(A)2

La Velocidad es proporcional a la segunda potencia de la concentración de sustratos, ya que sólo se produce cuando colisionan dos moléculas

¿Que determina la velocidad de una reacción? Barrera de energía libre, estado activado o de transición.

Un ejemplo es la transformación de un anillo de piranosa de forma bote a silla...

La energía libre estándar de activación....

Es la energía libre adicional que han de alcanzar las moléculas para llegar al estado de transición. Si la necesidad de energía es alta, sólo una pequeña fracción tendrá energía suficiente para superarla. Una vez que se alcanza la activación la transición puede llevarse a cabo para cualquier lado dependiendo de la concentración.

Qué es una enzima? Es un tipo de proteína que actúa como catalizador de reacciones químicas. Incrementa la velocidad de reacción sin cambiar el punto de equilibrio. Como catalizador: Es específico para cada reacción. No necesariamente para un solo sustrato, aunque muchas enzimas lo son. Tiene gran poder catalítico, transformando hasta 103 a 104 moléculas por segundo. Está sujeto a diversos mecanismos de regulación de modo tal que no genere más producto que el necesario.

¿qué hace un catalizador? Reduce la barrera de energía para una reacción por lo que más moléculas alcanzan la energía de transición. No tiene efecto sobre la posición de equilibrio

¿Como lo hace? Forzando la molécula a un estado intermediario que se parece al de transición pero de menor energía. Puede reunir dos moléculas reactivas en la orientación adecuada, aumentando su reactividad Orienta partes de la molécula de forma adecuada para alcanzar la transición.

Modelos de actividad enzimática.... Enzima y sustrato se unen a través de un sitio activo. Este es una hendidura en la proteína, rodeada de cadenas laterales de aminoácidos que se unen al sustrato y de otras cadenas laterales que intervienen en la catálisis. El ajuste es muy estrecho por lo que explica la especificidad. Modelo cerradura-llave: explica la especificidad, pero no la catálisis. Emil Fischer Modelo de ajuste inducido.la enzima no acepta simplemente el sustrato, sino que exige que este se distorsione a algo cercano al estado de transición.

Actividad enzimática Es la forma de medida de una enzima. La ecuación general de las reacciones enzimáticas es:

E + S + Cof1 ⇔ ES ⇒ E + P + Cof 2 Donde la enzima se une al sustrato para generar un producto. Algunas veces con el auxilio de un cofactor que se modifica durante la reacción. La actividad enzimática se mide por la reacción catalítica bajo la forma de desaparición del sustrato por unidad de tiempo. También por formación de producto o modificación del cofactor. Unidades: katal = moles de sustrato/segundo. Unid. Internacionales: umol/minuto. 1 U= 16,7 nkat.

Modificaciones de componentes de la reacción enzimática

Actividad catalítica Las enzimas aceleran la velocidad de reacción por las siguientes razones: La unión de sustrato y enzima incrementa la concentración efectiva de sustrato en las inmediaciones del sitio activo. Hay también un cambio conformacional que orienta al sustrato. La unión enzima sustrato tiene un nivel más alto de energía y las modificaciones de longitud y ángulo del sustrato asemejan a la forma del estado transitorio. Algunos de los residuos del sitio activo, participan de la reacción donando y aceptando protones. Algunos residuos catalíticos tienen grupos que ayudan a romper enlaces covalentes.

Clasificación de enzimas Clase de enzima Tipo de reacción catalizada Oxidoreductasas Transferasas Hidrolasas Liasas Isomerasas Ligasas

Reacciones que transfieren electrones de un sustrato a otro.Óxido reducción Transfieren un grupo funcional de una molécula a otra. Grupos como metilos, acilos, fosfatos etc Rompen enlaces entre carbonos u otras moléculas con la adición de una molécula de agua. Rompen enlaces C-C, C-S, C-N sin el ingreso de una molécula de agua. Transforman un isómero en otro transfiriendo un grupo funcional de una posición a otra. Forman enlaces C-C, C-N, C-O y C-S uniendo dos moléculas con gasto de energía.

Clasificación de enzimas: oxido reductasas

AH2 + B

A + BH2

Clasificación de enzimas: transferasas

A-B + C

A + C-B

Clasificación de enzimas: hidrolasas A-B + H2O

lactosa + agua

AH + B-OH

glucosa + galactosa

Clasificación de enzimas: liasas, ligasas

A-B

A+B+ XTP

A+B

A-B + XDP + Pi

Clasificación de enzimas: isomerasas

Especificidad y sitio activo Las reacciones se inician cuando el sustrato se une al sitio activo de la enzima. El sitio activo es una porción espacial de la enzima creada por la coincidencia de varias cadenas laterales de aminoácidos específicos. Estos pueden no estar en secuencia, pero los dobleces de la proteína enzimática los aproximan. Existen: residuos de captura y residuos de catálisis.

enzima

enzima

sustrato

productos

Localización enzimática Na/K ATPasa membrana

Retículo endoplasma Glucosa 6 fosfatasa

Alfa manosidasa Complejo Golgi

Las enzimas ejercen su función predominantemente en el interior celular. Mas aún lo hacen en determinado organelo de la célula. Las enzimas que se encuentran en el plasma o líquidos diversos corresponden a aquellas que se están eliminando y muy pocas como la LCAT (Lecitina colesterol acil transferasa), LLP (Lipasa lipoproteica), ejercen su función a nivel plasmático.

Catalasa

Succinato deshidro-

Peroxisoma

genasa.Citocromo oxidasa Mitocondria

Factores que modifican la reacción enzimática La velocidad de una reacción mediada por enzimas está influenciada por: Temperatura del medio El pH del medio Concentración de la enzima Concentración del sustrato

No existe actividad enzimática a -273°C o cero absoluto. A partir de esa temperatura los incrementos provocan mayor actividad enzimática. La que se expresa como coeficiente de temperatura o Q10. Esto es, el incremento de actividad por cada 10°C de aumento de temperatura. En términos generales Q10 = 2, es decir que por cada 10°C de temperatura la velocidad se dobla. Existe una temperatura óptima tras la cual los aumentos provocan desnaturalización de la proteína enzimática y pérdida de la actividad.

actividad

Temperatura

0

temperatura

70

pH

Los extremos de pH afectan la ionización de los centros activos (-COO- (glutamico, aspartico) NH3+ (arginina, lisina,histidina) SH (Cisteina, metionina)).

actividad

Cada enzima tiene un pH óptimo de trabajo, el cuál es variable. Las enzimas intracelulares trabajan entre 5 y 9 , las enzimas digestivas pueden trabajar en pH diferentes.

0

Enzima

X −H Y −H

pH ácido (inac)

⇒ Enzima

X Y −H

pH óptimo (activo)

14

pH

⇒ Enzima

X Y

pH alcalino (inac)

Concentración de la enzima y constante de equilibrio La concentración de la enzima incrementa la velocidad de la reacción, pero no modifica la constante de equilibrio. Así, si la reacción se produce en ausencia de la enzima... K1

S⇔P K −1

K1 ( P) Keq = = K − 1 (S )

La constante de equilibrio será:

Y, si la reacción se produce en presencia de la enzima... K1

Enz + S ⇔ Enz + P K −1

La constante de equilibrio será:

Keq =

K1 K −1

=

( Enz )( P ) ( Enz )( S )

=

(P) (S )

Cinética química: cinética enzimática Las reacciones químicas son: De primer orden si son dependientes de la concentración de sustrato De orden cero si son independientes de la concentración de sustrato

La cinética enzimática estudia la velocidad de las reacciones catalizadas por enzimas, manteniendo condiciones óptimas en la mayoría de factores: pH temp, tiempo, concent.de enzima, conc. De sustrato etc

Cinética enzimática.....

Concentración del sustrato Si se aumenta la concentración del sustrato, manteniendo constante las demás variables, la velocidad inicial de reacción (Vi) aumenta hasta un valor máximo (Vmax) el que se estabiliza. Se dice bajo estas condiciones que la enzima está saturada con el sustrato. Esto se produce de acuerdo a la afinidad enzima sustrato.

Vmax

Vmax/2

Km. Primer orden

S Orden cero

Leonor Michelis y Maud Menten (1913)

Ecuación de Michaelis Menten

La relación entre velocidad de reacción y concentración de sustrato se describe en la fórmula:

v=

Vmax[ S ] Km +[ S ]

Bajo estas condiciones Vmax se observa cuando todos los sitios activos están llenos de sustrato. Toda la enzima está bajo la forma de [ES] y la Km se define como concentración de sustrato a Vmax/2 Vmax: es un índice de la eficiencia de una enzima. Es la velocidad cuando todos los sitios activos están saturados, y es proporcional a la concentración de la enzima. Sus unidades son unidades de velocidad. Km: es una medida inversa de la afinidad de la enzima por el sustrato. Una baja Km indica alta afinidad entre enzima y sustrato. Las unidades de Km son unidades de concentración.

Km: expresión de afinidad Vmax

Vmax/2

Km. Km Hexoquinasa (cerebro)

Glucoquinasa (hígado)

S

La aplicación de la ecuación de Michaelis Menten se basa en... K1

K3

K2

K4

E + S ⇔ ES ⇔ E + P La concentración de sustrato es tan grande con respecto a la de enzima, que la formación de ES no altera significativamente la concentración de sustrato. Al inicio de la reacción la concentración del producto es tan insignificante que la velocidad descrita como k4 puede ser ignorada. La velocidad de transformación de ES en E+P(k3) es el factor limitante de la reacción. La formación de ES es rápida y reversible y es igual a la velocidad de desaparición de ES.

Reacciones de multisustrato Captación indistinta..Cada sustrato será captado en su momento, generalmente uno es preferente:

Hexoquinasa, glucosa? Galactosa?

Reacciones de multisustrato Captación ordenada de sustratos… para unir un sustrato debe unirse otro primero

Reacciones de oxidorreducción cocatalizadas por NAD

Reacciones de multisustrato Mecanismo ping-pong … cuando existe una secuencia catalítica. La enzima se modifica por persistencia de un fragmento del primer sustrato.

Enzimas proteolíticas

Gráfica de Lineweaver Burk La gráfica de Lineweaver Burk es usada para obtener Vmax y Km. Se usa la inversa de la ecuación de Michaelis Menten.

1/v

1 km 1 1 = . + v Vmax [ S ] Vmax Cuando 1/v se grafica frente a 1/s se obtiene una recta, donde la pendiente es Km/Vmax. La intersección en el eje de y es igual a 1/Vmax y la del eje de x es igual a 1/Km.

1/Vmax -1/Km

1/[S]

Inhibidores competitivos Estructuras semejantes al sustrato que compiten con él por el mismo centro activo. Sus efectos pueden revertirse si se incrementa la concentración del sustrato hasta ocupar todos los centros activos.

La Vmax no cambia, pero si el Km porque se necesita más sustrato. 1/V

v

inhibidor 1/Vmax

[S]

-1/Km

1/[S]

Inhibidores competitivos

Inhibidores no competitivos Estructuras diferentes al sustrato por lo que se unen a un sitio independiente de la enzima. Ambos, sustrato e inhibidor pueden unirse a la enzima al mismo tiempo. Su efecto no puede revertirse aumentando la concentración del sustrato.

No tiene efecto sobre la Km pero sí sobre la Vmax.

1/V V inhibidor 1/Vmax

[S]

-1/Km

1/[S]

Inhibición no competitiva

Inhibidores irreversibles Reaccionan covalentemente con la cadena lateral de un aminoácido de la enzima, para formar un complejo estable permanentemente inactivado. Se les llama también substratos suicidas. Su efecto es igual al de un inhibidor no competitivo.

Efecto clínico de los Inhibidores Droga Lovastatina 5-fluouracil Metrotexate Alopurinol Cumadin Aspirina Captopril

Uso terapéutico Hipercolesterolemia Cáncer Cáncer Gota Anticoagulante Antiinflamatorio Hipertensión art.

Enzima afectada HMGCoA reductasa Timidilato sintetasa Dihidrofolato reductasa Xantino oxidasa Glutamil carboxilasa Ciclooxigenasa Enz.convert.angiotensina

Tipo de inhibidor Competitiva Irreversible Competitiva Irreversible Competitiva Irreversible Competitiva

Coenzimas: co sustratos? Muchas enzimas necesitan de otros pequeños compuestos para facilitar las reacciones. Enzima + coenzima = holoenzima Las vitaminas del complejo B son precursoras de vitaminas

Coenzimas.. ejemplos

Papel Clínico de las Enzimas Si bien es cierto las enzimas cumplen su actividad en el interior celular, es posible encontrarlas en los líquidos biológicos con cierta frecuencia. Todas las enzimas plasmáticas, las del LCR, del L. Ascítico o Pleural se encuentran en bajos niveles de concentración –actividad- provenientes de los tejidos ricos en ellas y generalmente de paso a un proceso de destrucción hepática o eliminación renal. Únicamente algunas enzimas como las del metabolismo de lípidos (LCAT, LLP) o los factores de coagulación ejercen su actividad en el plasma o suero.

Elevación enzimática en el plasma... La actividad enzimática en el plasma y otros líquidos biológicos se produce por: Necrosis: destrucción celular y vaciamiento de las enzimas como en el infarto de miocardio, hepatitis viral. Permeabilidad: aumento de permeabilidad de membrana igual a necrosis. Sobre producción: mayor metabolismo en un tejido -neoplasia-. Menor eliminación: no se elimina normalmente -obstrucción biliar-. Incremento de células inflamatorias: en líquidos como Pleural y Ascítico los exudados se acompañan de aumento de actividad enzimática.

Origen de las enzimas en el plasma Enzimas Específicas del plasma Secretadas Del metabolismo celular

Ejemplos Protrombina, plasminógeno,ceruloplasmina, Lipasa Lipoproteica,colinoesterasa Amilasas, fosfatasa prostática, pepsinógeno Láctico deshidrogenasa, aldolasa, aspartato y alanina transferasa.

Enzimas de uso diagnóstico

GOT GPT GLDH SDH CPK LDH

Enzima Fosfatasa ácida Fosfatasa alcalina Amilasa Aspartato amino transferasa Alanina amino transferasa Creatino fosfo quinasa Dehidrogenasa láctica

Uso diagnóstico Cancer de próstata Enf. hepática y osea Enf. pancreática Enf. hepática y cardiaca Enf. hepática Enf. muscular y cardiaca Infarto de miocardio

Papel de las enzimas en la medicina Establecer un diagnóstico, como en el caso de las enzimas del infarto de miocardio (CPK y LDH). Valorar la magnitud de la lesión Monitorizar la mejoría del paciente. Mostrar la repetición del fenómeno (reinfarto)

CPK TGO

LDH

2

4

6

8

10

Días después del infarto de Miocardio.

Isoenzimas Enzimas que realizan la misma función pero difieren en su estructura química y propiedades cinéticas. Las formas isoenzimáticas distintas pueden pertenecer a distintos tejidos revelando sus modificaciones el tejido que le dio origen. Generalmente son estructuras oligoméricas con varios tipos de cadenas proteicas -dímeros o tetrámeros- .

Isoenzimas LDH

Bazo

Pulmones

Eritrocitos

Músculo

Miocardio

Riñón

LDH1 LDH2 LDH3 LDH4 LDH5 Hígado

100% % 90% 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0%

Dehidrogenasa láctica Existen cinco isoenzimas de la deshidrogenasa láctica (LDH). Cada una es un oligómero con cuatro protómeros de los tipos H y M y tiene un PM de 34 000. Los protómeros se combinan de manera distinta y se originan en distintos tejidos con preferencia. El suero tiene un contenido representativo de todos los tejidos.

Isoenzima SubunidadesTejido predominante LDH1 HHHH corazón LDH2 HHHM corazón LDH3 HHMM riñón, pulmón LDH4 HMMM hígado LDH5 MMMM hígado

normal

infarto

Creatino fosfokinasa Isoenzima CK1 Ck2 CK3

Subunidades BB MB MM

Existen tres isoenzimas de la creatino fosfokinasa. Cada una es un dímero formado por la combinación de protómeros M y B. Cada dímero representa a un tejido en particular.

Tejido predominante Cerebro Músculo cardiaco Músculo esquelético (+) CK1 CK2 CK3

(-)

Tipos de especificidad enzimática Modelo de molde rígido En este modelo el sitio activo tiene una estructura rígida, se le llama de llave y cerradura. Es complementaria del sustrato. Explica la especificidad de sustrato aún a nivel de isómeros (estructuras casi idénticas).

Modelo de molde inducido Aquí el sitio activo es más flexible, se le llama de mano y guante. Cuando el sustrato se acerca a la enzima se producen cambios conformacionales que llevan a una exacta unión entre ambos. Modelo que explica mejor la especificidad de sustrato.

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