Unidad 1 Version Estudiantes

Unidad I

Estructura bioquímica de los ácidos nucleicos

ácidos nucleicos son las moléculas que determinan lo que es y hace cada una de las células vivas

ADN polímero especializado en

almacenar y transmitir la información genética (huella genética)

ARN - molécula intermediaria responsable de transcribir la información genética para convertirla en proteínas.

La información genética que determina todas las características de una especie se encuentra contenida en todas sus células (Genoma). Por lo general, nos referimos al ADN contenido en el núcleo, organizado en cromosomas. Sin embargo, también debemos incluir el material genético presente en mitocondria y en cloroplastos.

Transcripción

Procesamiento post transcrpcional Traducción

Maduración

Dogma central de la biología molecular •

A partir del ADN se sintetiza ARN y a partir del ARN se sintetizan proteínas

•

El ADN puede replicarse y, por tanto, reproducirse para transmitir la información genética a la descendencia

Polímero de nucleótidos de doble cadena

Polímero de nucleótidos en cadena sencilla

Polímero de aminoácidos

Replicac ión DNA

Transcripció n Transcripción reversa Traducció n

Proteín a

componente s Estructuralmente son cadenas poliméricas de nucleótidos* unidos covalentemente unos a otros en arreglos definidos (secuencias). Base nitrogen ada

P

enlace fosfodiester

azúc ar

enlace glucosídico

Base nitrogen ada

P azúc ar

nucleótidos* unidades mínimas que conforman los ácidos nucleicos

azúcar (5 C) + molécula de fosfato + base nitrogenada

ADN

ARN

Azúcar: Pentosa (5C)

Ribosa

2 Desoxiribos a

Bases nitrogenadas

PIRIMIDÍ NICAS

PURÍNICA S

Adenina

(componentes variables)

Guanina

A, G y C T U

Citosina

ADN y ARN Solo ADN Solo ARN

Timina

Uracilo

Enlace glicosídico: Unión entre el C1 de la pentosa y el N en posición 1 (pirimidínicas) o en posición 9 (purínicas) de la base nitrógenada

PIRIMIDÍNICAS

NUCLEÓSI DO

PURÍNICAS

6 8

7

5

9

4 3

1 2

Enlace fosfoéster

ácido fosfórico

Unión entre el grupo OH del C5 de la pentosa con el grupo fosfato

+

nucleósido

NUCLEÓTI DO 2-desoxiriboadenosin-5monofosfato

Nucleósido BASE + AZUCAR = NUCLEOSIDO

Nucleótido

BASE + AZUCAR + FOSFATO = NUCLEOTIDO

Bases nitrogenadas citosi na

timin a

uracilo

PIRIMID INAS

PURIN AS

adenin a

guanin a

Azúcares (pentosas)

β-Dribosa

azúcar de 5 carbonos

β-D-2 desoxirribosa

Fosfatos Unidos al grupo OH del C-5 del azúcar. Presentes como mono, di o trifosfatos. El grupo fosfato confiere una carga negativa al nucleótido. adenosin monofosfato (monofosfato de adenosina)

Nucleótido Subunidades mínimas de los ácidos nucleicos

base

fosfato

azúcar

La base esta unida al mismo C (C1) usado en las uniones entre azúcares.

Unión nucleótido nucleótido Los nucleótidos se unen entre si mediante el enlace fosfodiester, a través de los átomos de la posición C5´ y C3´ para formar los ácidos nucleicos.

Tarea Investigar otras bases nitrogenadas presentes en los nucleótidos de algunos ácidos nucleicos Modificaciones al dogma central de la biología molecular (lunes)

ADN - historia

1868: Friedrich Miescher – primera extracción de ácidos nucléicos

solución alcalina

lavado de vendajes (pus*) con solución salina

* Leucocitos = globulos blancos

NUCLEÍ NA lisis celular y precipitación del núcleo

Comprobó su presencia en otros tipos de células

1890: Albrecht Kossel - descubrió la existencia los carbohidratos y de las bases nitrogenadas (adenina, guanina, citosina y timina). Premio Nobel de Fisiología y Medicina (1910)

1911: Theodore Levene - demostró que carbohidratos eran pentosas (ribosa o desoxirribosa), utilizando a partir de entonces los nombres de ácido RIBONUCLEICO (RNA), y ácido DESOXIRRIBONUCLEICO (DNA). También descubrió que el RNA no poseía timina, pero si uracilo.

1934: Levene aisló NUCLEOTIDOS (pentosa, base nitrogenada y ácido fosfórico) a partir de ácidos nucleicos.

Década de los 40: Feulgen, Caspersson, Mirsky, Sager y otros desarrollaron técnicas de tinción que permitieron estudiar la localización celular de los ácidos nucleicos. DNA en el núcleo y RNA repartido en el citoplasma. Se comprobó la existencia de DNA en los cromosomas, viéndose una cantidad de DNA constante y propia de cada especie. Surge la idea de que podría existir una relación entre el DNA y los genes o factores hereditarios.

1944: Avery, Macleod and McCarty - “Principio transformante” confirmación de que el DNA portaba información genética

X

aislamiento distintas fracciones

Cepa no virulenta

X

X X

Cepa virulenta inactivada por calor

X

X

carbohidr atos

lípid os

ARN

?

X

Cepa virulenta inactivada por calor

X

X

Cepa virulenta

Cepa no virulenta

Experimento Fred Grifith (1928)

no virulentas

proteína ADN s

transformació n con distintas fracciones de células no virulentas

virulent as

1950s: Rosalind Franklin y Maurice Wilkins - comenzaron a elucidar la estructura de ADN.

Difracción de rayos X de ADN  La molécula de DNA es una cadena extendida con una estructura altamente ordenada  Presenta forma helicoidal y está compuesta por dos cadenas

1953: Francis Crick y James Watson presentaron el modelo tridimensional de la estructura del ADN (doble hélice)

Premio Nobel de Fisiología y Medicina (1962)

1955: Francis Crick presenta y defiende el “Dogma Central de la Biología Molecular” ADN AR Proteína N 1957: Meselson y Stahl demostraron que la replicación del ADN es semiconservativa PremioKornberg Nobel de Fisiología y Medicina 1959: Arthur descubre la polimerasa (síntesis enzimática (1959) DNA) Premio Nobel de Fisiología y Medicina 1961-65: Nirenberg,(1968) Khorana y Holley

descifran el código genético.

1972: Primera clonación de un fragmento de ADN (Cohen y Boyer) 1977: SePremio clona el primer gen humano* Nobel en Química (1980) 1980: Métodos rápidos de secuenciación (Sanger) Premio Nobel en Química (1993)

1983: Mullins inventa el PCR (reacción en cadena de la polimerasa) http://dnai.org/timeline/index. html

ADN – estructura primaria extre mo 5´

•

Se trata de la secuencia de desoxirribonucleótidos que conforman una cadena. La información genética está contenida en el orden exacto de los nucleótidos.

•Esqueleto

formado por un arreglo de pentosas y fosfatos de manera alternativa, a través de un enlace fosfodiester.

•

El enlace fosfodiester se refiere a las uniones formadas entre el C5 y 3 de la pentosa con el grupo fosfato.

extre mo 3´

•

Cada molécula tiene una orientación definida, por lo que la cadena es 5´-> 3´.

•

Estructura secundaria

pento sa base s

En la naturaleza el ADN se

encuentra en forma de dos cadenas de nucleótidos.

•

Estas

cadenas

5´

no

idénticas

son sino

complementarias apareamiento

de

en las

fosfat o

el

G

A

T

G

C

bases

A -T G-C El arreglo de ambas cadenas

es en forma antiparalela, una cadena tiene orientación 5´-3´ y su complementaria 3´-5´

3´

A

T

nitrogenadas:

•

C

3´

5´

A-T están unidas por dos puentes Hidrógeno y C-G por tres. A= T G=

Reglas de Chargaff (composición de bases en el ADN) 3.A=T en cualquier especie (G=C) 4.La suma de purinas (A+G) = suma de pirimidinas (C+T) 5.El % de C+G no es necesariamente igual al % de A+T 6.El contenido de GC o AT es única para cada especie 7.Independiente del tejido la composición de GC (AT) siempre es la misma

G+C entre 25 y 75% diferentes especies de bacterias proporción mas constante entre especies relacionadas por ejemplo entre mamíferos encontramos 39 y 46%

puente de hidrógen o 1 vuelta = 3.4nm 10 pares de bases  por cada vuelta de la hélice esqueleto pentosafosfato

base

2n m

A-T están unidas por dos puentes de hidrógeno y C-G por tres

la doble hélice •

Hélice constituida por dos

cadenas

•La hélice se enrolla hacia la derecha (sentido de las manecillas del reloj)

•

Las dos cadenas corren en

direcciones opuestas

•

Hay 10 pares de bases  por

cada vuelta de la hélice

• Las bases nitrogenadas están en un arreglo perpendicular al eje en 1000 nucleótidos dede bases) ≈ hélice 100 vueltas ≈ la parte(pares central la hélice 0.3 µm largo 1 nucleótido ≈ peso molecular de 330

Estructura tridimensional Los grupos fosfato se unen a los azúcares y se proyectan fuera de la cadena.

ZURCO MENOR

ZURCO MAYOR

Estructura • terciaria Formas de compactación

del

ADN (torsión o enrollamientos) • Importante en procesos de empaquetamiento o confinamiento celular así como en la replicación • Enzimas involucradas: Topoisomerasas y girasas relajad superenrolla o do

Fotografía al microscopio electrónico de un DNA circular relajado y con distintos grados de superenrollamiento

OTRAS ESTRUCTURAS Doblamientos ligeros ADN doble cadena con repetidos de 5 adeninas en la misma cadena

Función: regulación genética, zonas de interacción con proteínas

REPETIDOS INVERTIDOS : FORMACION DE TALLO-ASA EN CRUZ

Tarea

Formas A, B y Z del ADN (martes) Describir y explicar el experimento de Hershey-Chase (lunes)

Uracilo (U)

Guanina (G)

Dihidrouridina (D)

1-metilguanosina (m´G)

Inosina (I)

Bases nitrogenadas ligeramente diferentes de las bases normales presentes en otros ARN, ya que se encuentran frecuentemente metiladas.

Bases poco usuales son la seudouridina, inosina, dihidrouridina, ribotimina, metil guanosina etc. Estas modificaciones son necesarias para conseguir un ARNt funcional.

modificaciones al dogma central de la biología molecular

elementos que implican la ampliación de este dogma: priones, ribozimas y la enzima transcriptasa inversa (RT).

Priones:

proteínas libres de ácido nucleico, se propagan en su naturaleza polipeptídica, simplemente afectan a proteínas de su misma secuencia, previamente existentes, alterando su conformación. Las enfermedades por priones conocidas hasta ahora son fatales, afectan al sistema nervioso y se cree que también a los músculos.

Retrovir us (RT)

Priones síntesis in vitro

Ribozimas virus

Los retrovirus poseen dos copias de un RNA. La información genética contenida en estos RNA genómicos es copiada en reverso para generar una copia de DNA viral de doble cadena, que se integra al genoma o DNA celular, dando origen a un mRNA y proteínas virales. Para realizar el proceso de síntesis de este DNA viral o transcripción inversa- es decir, síntesis de DNA a partir de RNA-, estos retrovirus poseen una enzima DNA polimerasa RNA dependiente, llamada La transferencia de información genética comúnmente transcriptasa inversa. ocurre de acuerdo a: i) RNA + ---> DNA - ---> DNA + ii) DNA +- ---> mRNA ---> PROTEÍNAS iii) DNA +- ---> RNA V

ADN – desnaturalización Cuando la temperatura alcanza el punto de fusión del ADN, la agitación térmica es capaz de separar las dos hebras y producir una desnaturalización. Durante este proceso se rompen los puentes de hidrógeno que unen las cadenas y se produce la separación de las mismas (sin romper los enlaces fosfodiester covalentes que forman la secuencia de la cadena). La desnaturalización puede ocurrir, también por variaciones en el pH. La desnaturalización es un proceso reversible, ya que al bajar la temperatura se puede producir una renaturalización*.

Efecto hipercrómico aumento en la absorbancia en ADN de cadena sencilla. La separación de las cadenas durante la desnaturalización modifica las propiedades físicas del ADN (absorción de luz UV).

1.0 absorbancia λ

260

Una solución de ADN (doble cadena) con una concentración de 0.05mg/ml presenta una absorbancia (DO) λ ADN cadena doble = 50µ 260 de 1.0

260

ADN cadena sencilla =

g/ml 1.0 absorbancia λ

Temperatura de desnaturalización (Melting tempeture Tm) = temperatura a la cual el 50% del ADN se encuentra en forma de cadena sencilla (parcialmente desnaturalrizada). Tm= 16.5(log[Na+] + 0.41(%GC) + 81.5°C

En función del contenido de CG y del tamaño (número de nucleótidos) Tm en moléculas cortas y/o ricas en AT

Tm=2(AT) + 4 (GC) Cálculo solo para moléculas de 15-30 bases

Ejemplo -CGTATTACGATCCCAT TGCAT=10 GC=9 Tm= 2(10) + 4(9) =20+36 = 56°C

ARN – estructura primaria Al igual que el ADN, se refiere al arreglo (secuencia) de los nucleotidos en la molécula

A diferencia del ADN:

• •

es una molécula de una sola cadena contiene URACILOS en vez de

timinas

•

el azúcar es RIBOSA en vez de

desoxirribosa

Estructura secundaria egiones en la misma cadena con secuencias complementarias capaces de aparearse.

estructura de horquilla

Tipos de ARN RN MENSAJERO (ARNm)

cadena larga sencilla que incluyen en su secuencia la información que se traduce en aa, es sintetizado a partir de un molde de ADN.

RN de transferencia (ARNt) Son cadenas cortas (70 nucleótidos) dispuestos en una secuencia única para cada aa.

RN Ribosómico (ARNr) onstituyente esencial de los ribosomas, su función es leer los ARNm y formar la proteína correspondiente.

ARNm •

Se asocian con algunas proteínas

para

intrones y exones

prevenir

(según su grado de

formación de estructuras

madurez)

secundarias y proteger de

•

endonucleasas. Constituye el

Presencia de

Cola de poliA

5% de

CAP en el

extremo 5´

(mayor

resistencia a la

ARN total.

hidrólisis)

•

Cola poli A

(formada hasta por 250 residuos de adenilato)

procario tas

eucariot as

ARNt

•

Transporta los aa para la

síntesis de proteínas

•

Presenta plegamientos

(bucles u horquillas) y puentes de hidrógeno entre sus bases complementarias

• •

Peso molecular ≈25 000Da Formado por 70 a 90

nucleótidos

•

Constituye el 45% de ARN

total de la célula

• estructura secundaria

Se sintetiza en el núcleo y

sale hacia citoplasma para realizar su función

•

estructura terciaria

En su estructura secundaria

se distingue el brazo aceptor de aa abierto (extremos 5´ y 3 ´) y un bucle anticodón (triplete

ARNr • • •

Elemento constitutivo de los ribosomas Comprende el 50% del ARN total Su estructura secundaria presentan horquillas y bucles los cuales condicionan su interacción con las proteínas

horquillas tallos

estructura secundaria

El tamaño de una molécula de ARN se mide normalmente en razón de la movilidad de la molécula cuando se la somete a un campo centrífugo a alta velocidad. El método se denomina análisis de sedimento zonal, y la velocidad de sedimentación se mide en Svedberg, abreviadamente, S. Cuanto mayor es el ARN mayor es su S.

BACTERI A

EUCARI OTA

23S ARNr (3200 nucleótidos)

16S ARNr (1540 nucleótidos)

28S ARNr (4700 nucleótidos)

18S ARNr (1900 nucleótidos)

Resumen ADN

ARN

Almacén y transmisor de información genética

Intermediario entre el ADN y las proteínas

Mayor estabilidad

Poca estabilidad (fácilmente degradado por enzimas)

Cadenas dobles (bicatenario) con morfología de hélice Pentosa = desoxirribosa

Cadena sencilla (monocatenario)

(carece de un O en el C-2), de ahí el nombre ácido

(OH en el C-2)

Bases nitrogenadas Purinas = A y G Pirimidinas = T y C

Bases nitrogenadas Purinas = A y G Pirimidinas = U y C

En eucariotas mayoritariamente en el núcleo, también en mitocondrias, cloroplastos y centriolos.

En eucariotas en núcleo y citoplasma, también se encuentra en mitocondrias y cloroplastos.

Pentosa = Ribosa

Empaquetamiento del ADN

ARN

VIRU S

proteína

Fago filamentoso M13

Virus del mosaico del tabaco estructura linear 6400 nucleotidos

Virus ADN de cadena sencilla estructura linear 6400 nucleótidos DNA cadena doble

ADN de ØX174 Virus ADN de cadena sencilla estructura circular 5400 nucleótidos

Bacteriofago λ ADN doble cadena estructura linear 48 514 bases

PROCARIO TAS

Genoma bacteriano: molécula circular cerrada y empaquetada en una estructura superenrrollada en arreglos o dominios estabilizados por proteínas específicas

Nucleína: Forma característica de agregados de DNA dentro de la célula

Detalle en microscopía. Tinción nucleína en E. coli

Genomas completos varían entre 1000 y 9000 kilobases

Algunos datos Diferentes cromosomas humanos - 3.2 X109 pb (3 200 000 000) Organismos diploides - 6.4 X109 pb A 34nm distancia entre bases = 6 400 000 000 pb X (34nm) = 2.1m ADN total en el núcleo Tamaño núcleo = 5-10µm Grado mayor de empaquetamiento (mitosis) el ADN se contrae 10 000 veces aproximadamente.

EUCARIOT El ADNAS se enrolla (dos vueltas) alrededor de un octámero de proteínas histónicas formando un nucleosoma estos quedan separados por secuencias de ADN de hasta 80 pb, formando un "collar de perlas"  o más correctamente denominado fibra de cromatina Los nucleosomas se organizan, en fibras de 30nm (solenoide), girando a manera de resorte alrededor de un eje virtual. Esta estructura es mantenida por la interacción de las H1 de nucleosomas cercanos. En el siguiente nivel de empaquetamiento, las fibras de 30nm se organizan en una serie de bucles o asas superenrolladas. Estos bucles se estabilizan gracias a la interacción con las proteínas de la matriz nuclear o andamiaje nuclear Continua el enrollamiento al grado de mayor espiralización y compactación, formando un denso paquete de cromatina (un cromosoma)

+

*Estas proteínas básicas son ricas en residuos de arginina y lisina (cargados+). Por esta razón se unen estrechamente con los P (cargados-) del ADN.

Los nucleosomas están formados por un centro o "core" de histonas. Dicho centro posee dos copias de cada una de las siguientes histonas: H2A; H2B; H3 y H4 Alrededor del centro de histonas, 146 pares de bases del ADN se enrollan en dos vueltas. La unión de las histonas al ADN no depende de una secuencia particular de nucleótidos, sino de la

Genes, cromosomas y genomas Un gen es una secuencia lineal

de nucleótidos (4kb) en la molécula de ADN que contiene la información necesaria para la síntesis de una macromolécula con función celular específica (ARN mensajero -proteína, ARN ribosómico o de transferencia). Es considerado como la unidad de almacenamiento de información y unidad La cantidad aldetransmitir información codificada en miles de genes de herencia esa información presentes en una sola molécula de ADN requiere a la descendencia. necesariamente de una organización. En los eucariotes, este primer nivel de organización es el cromosoma. Los genes se disponen, a lo largo de los cromosomas, este arreglo facilita la recombinación y la diversidad genética. Cada gen ocupa en el cromosoma una posición determinada llamada locus. El conjunto de cromosomas de una especie se

1. En eucariotas, entre especies existe una gran variación de la cantidad de ADN presente en la célula Mayor complejidad mayor tamaño 2. En todas las células existe una gran cantidad de ADN del cual se desconoce su función. Genoma

Tamaño aproximado (millones 4.64 de pb) 13

Número de cromosomas (haploide) -

3 400

23

Aphiuma sp (salamandra) Arabidopsis thaliana

76 500

14

167

5

Oryza sativa (arroz)

430

12

4500

10

Escherichia coli Saccharomyces cerevisiae Homo sapiens

Zea mays (maíz)

16

Organización de los genes en un cromosoma humano Comprende el 1.5% del genoma. Región rica secuencias repetidas de DNA

Obscuro - genes identificados Claro – posibles genes

Rojo – exones (codificantes) Gris- intrones

tamaño, forma y número de cromosomas en microorganismos organismo Bacteria Mycoplasma penumoniae Haemophilus influenzae Escherichia coli Archae Thermococcus celer Haloferax mediterranei Methanococcus voltae Eucariota (unicelulares) Giardia lamblia Saccharomyces cerevisiae Tetrahymena thermophila

cromosoma

comentario

tamaño (pb)

neumonía

7.8 x 105

1

gram-neg , vías respiratorias

1 830 137

1

gram-neg, modelo genético

5.0 x 106

1

crece altas temperaturas

1.9 x 106

1

crece alta concentración de sal metanógeno

2.9 x 106

1

1.9 x 106

1

Gastroenteritis aguda Uso industrial y científico

1.2 x 107

4

12 057 500

16

Protozoario ciliado

2.1 x 108

5

númer o

forma

Comparación en tamaño de genomas

METODOS Aislamiento de ADN total (genómico)

1.Lisis – liberar el ADN del núcleo 2.Extracción – eliminar macromoléculas y proteínas asociadas al ADN 3.Precipitación* - recuperación del ADN * reacción química en la cual a partir de un líquido se obtiene un sólido

La elección del protocolo a utilizar depende de varias consideraciones:

2)De qué material voy a partir para hacer la extracción: (tejido vegetal hoja, raíz, semilla; tejido animal , sangre, cultivos celulares, bacterias) 2) Para que voy a utilizar después mi ADN: (PCR, bibliotecas genómicas, hibridaciones etc) 3) Me interesa considerar el rendimiento, el tamaño promedio de fragmentos obtenidos y la pureza

Extracción ADN lisar células liberar ADN del núcleo

separación de proteínas y restos celulares

centrifugaci ón

centrifugaci ón

Extracto crudo (proteínas , DNA, RNA, lípidos y carbohidratos) Precipitación de Bacterias – lisozima + proteínas con EDTA Plantas y hongos cloroformo o – daño mecánico o fenol*, enzimas eliminación de Células animales RNA con Rnasas, detergentes tratamiento con despolarizar

precipitación ADN con isopropanol (etanol) en presencia de Na+, K+ o NH4+

secar y resuspender menor volumen posible

centrifugaci ón

Eliminación de sales con lavados de etanol al 70%

Extracción ADN plasmídico Desnaturalización alcalina

fragmentos cromosomal es

desnaturaliza cion

renaturalizac ion

plásmido

DNA cromosómico en fragmentos lineares, DNA plasmídico en círculo cerrado covalentemente

Plásmido desnaturalizado permanece asociado mientras los fragmentos lineares se disocian

Plásmido vuelve al estado covalentemente cerrado mientras los fragmentos cromosomales se agregan y son fácilmente separados por centrifugación

Extracción ARN total lisar células Reactivo de lisis: Fenol, guanidina o tiocianato de amonio y agentes solubilizantes

Cloroformo (separación de proteínas)

precipitación ARN con isopropanol en presencia de Na+

centrifugaci ón

Tomar el sobrenadante (fase acuosa – RNA)

resuspender menor volumen posible de agua con DEPC

centrifugaci ón

Eliminación de sales con lavados de etanol al 75%

Pureza y cuantificación de ácidos nucleicos por absorción en el espectro UV ADN o ARN: λ 260 nm purinas y pirimidinas Proteínas: λ 280 nm aa aromáticos – tirosina, triptofano y fenilalanina

RELACION 260:280 = 1.8 2.0 ≠ contaminación proteínas 1 DO (λ 260nm) = 50µg/ml ADN 1 DO (λ 260nm) = 44µg/ml ARN Para que estas relaciones sea valida las lecturas de absorbancia deben ser mayores a 0.15

Ejemplo: 1. Volumen de ADN muestra = 100µl 2. Dilución para realizar lectura 1:50 10µl muestra + 490 µl de buffer* 3. Medir absorbancia de la dilución a λ 260nm DO = 0.2 4. Concentración de la muestra = 50µg/ml x DO x factor de dilución = 50µg/ml x 0.2 x 50 = 500µg/ml

* Buffer con pH neutral (Tris.Cl 10mM pH=7.5)

Experimento Hershey y Chase

Hershey y Chase demostraron que el ADN y no las proteínas eran responsables de dirigir la reproducción del Fago T2 durante su infección en E.coli

Fago T2 no marcado Adición del fago E. coli en medio radioactivo 32P y 35S

32

35

P

S

Los fagos de la progenie quedan marcados

Fagos marcados infectan a bacterias no marcadas

cubiertas no marcadas

Bacterias marcadas con 35 P

Se producen fagos viables marcados con 32P

cubiertas marcadas con 35 S

Bacterias no marcadas

Se producen fagos viables no marcados

Enzimas de restricción (endonucleasas)

Se une específicamente a DNA de doble cadena y lo escinde en sitios específicos dentro o adyacentes a una secuencia en particular conocida como secuencia de reconocimiento

900 enzimas de restricción aisladas a partir de 230 especies de bacterias

Nomenclatura: Basada en la bacteria de la cual fue aislada E

Escherichia

Primera letra del género

co

coli

Dos primeras letras de la especie

R

RY13

Primera letra de la cepa

I bacteria

Orden en que fue identificada en la (número romano)

Nombre enzima de restricción: EcoRI

Metiltransferasa: transferencia de grupo metilo a citosina o adenina de la molécula de DNA Enzima de restricción: escinde el DNA no metilado EcoRI

EcoRI metilasa

No corte

Clasificación de las enzimas de restricción Tipo I: posee actividad de restricción y metilación. Se une a la secuencia de reconocimiento y corta en sitios aleatorios Tipo II: sistema binario en donde una enzima de restricción corta una secuencia específica de nucleótidos y una metilasa modifica la misma secuencia (reconoce secuencias palíndromes) Tipo III: posee actividad de restricción y metilación. Corta el DNA en la secuencia de reconocimiento

Extremos que generan las enzimas de restricción

Extremos cohesivos

Extremos romos

Extremos cohesivos

Electroforesis ADN

Electroforesis:

técnica

separación

moléculas

de

para

la

(ácidos

nucleicos) según la movilidad de estas en un campo eléctrico a través de una matriz porosa, la cual finalmente las separa por tamaños moleculares y carga eléctrica

Grupo P (carga negativa)

Electrodo positivo (ánodo)

La agarosa es un polisacárido (originalmente obtenido de algas), que tiene la propiedad de permanecer líquido por encima de aprox. 50ºC y formar un gel, semisólido, al enfriarse. Este gel está constituido por una matriz o trama tridimensional de fibras polimericas, que retarda el paso de las moléculas de ácido nucleico. Al preparar el gel enfriando la agarosa en un molde adecuado, se dejan en él unos huecos o pocillos para poder introducir luego en ellos la muestra.

http://www2.uah.es/biomodel/biomodel-misc/anim/elfo/gel_electrophoresis.

http://www.dnalc.org/ddnalc/resources/electrophoresis.htm

Paso del DNA a través del poro formado en la matriz

Efecto de la topología

Visualización de ADN en gel de agarosa

Tinción con bromuro de etidio

Fluorece bajo luz UV

Para un ácido nucleico, la carga eléctrica es proporcional a la longitud en nucleótidos. El efecto de retardo debido al gel depende del tamaño molecular. La electroforesis separa los fragmentos de ácido nucleico según su tamaño o longitud, expresado en o en pares de bases. Es posible establecer una curva de calibrado que relacione la movilidad con la longitud en pb. Para conseguir una recta se suele representar tamaño frente a 1/movilidad (como en la figura) o log(tamaño) frente a movilidad.

Electroforesis de campos pulsados

Southern blot

El Southern Blot es una

técnica que permite la identificación de

secuencias específicas de DNA, mediante el uso de electroforesis en gel y de hibridación utilizando sondas especificas. Para analizar una muestra de DNA cromosomal ésta debe ser previamente fragmentada, por ejemplo utilizando enzimas de restricción. El nombre de la técnica Southern Blot deriva en parte del apellido Southern del investigador que la desarrolló y de la palabra en inglés Blot que significa traspasar.

1. Los fragmentos obtenidos se separan, de mayor a menor tamaño mediante una electroforesis en gel de agarosa. 2. Una vez terminada la electroforesis y sin teñir el gel, los fragmentos de DNA se traspasan a un filtro de nitrocelulosa ó a una membrana de nylon. 3. El filtro se incuba con una sonda marcada, específica para la secuencia que se desea identificar. Esta sonda es una secuencia de ácido nucleico, DNA o RNAm que reconocerá a la secuencia de DNA inmovilizada en el filtro, a través del reconocimiento de secuencias complementarias de ácidos nucleicos.

Transferencia por capilaridad

Membranas para transferencia de ácidos nucleicos Propiedad

Nitrocelulosa

Nylon neutro

Nylon cargado

Capacidad (μg ácido

80-120

~100

400-500

Tamaño del ácido nucleico para máxima unión

>400 pb

>50 pb

>50 pb

Buffer de transferencia

Alta fuerza iónica a pH neutro

Baja fuerza iónica a amplio rango de pH

Inmobilización

Hornear 80°C con vacío/2 h

nucleico/cm2)

Hornear 70°C/1 h o radiación UV (254 nm)

Factores que afectan la estabilidad de los híbridos Temperatura > temperatura → > astringencia Fuerza iónica > fuerza iónica → < astringencia iones Na+

Pasos para el análisis Southern blot •

Extracción del DNA genómico

•

Digestión del DNA genómico

•

Separación del DNA en gel de agarosa

•

Desnaturalización del DNA (NaOH)

•

Neutralización del DNA (NaCH3COOH)

•

Transferencia a membrana

•

Hibridación

•

Lavados

•

Revelado