Una Tercera Clase 12ago09-

Ingeniería Genética Tercera Clase Dr. Keilor Rojas Jiménez 12 agosto 2009

ADN

BASES MOLECULARES genoma DE LA VIDA Célula cromosomas genes

ADN

proteínas

las proteínas actúan solas o en complejos para realizar las funciones celulares

ADN

ARN PROTEÍNAS los genes contienen instrucciones para hacer proteínas

Dogma Central Nueva visión: un gen es una secuencia de ADN genómico o de ARN que es esencial para especificar una determinada función. •No necesariamente necesita ser traducido a proteína, y a veces ni siquiera necesita ser transcrito.

Variación del tamaño de genoma en organismos

Ingeniería Genética • Técnicas que modifican las características hereditarias de un organismo en un sentido predeterminado mediante la alteración de su material genético. • Posibilita la creación de nuevas especies, la corrección de defectos genéticos y la fabricación de numerosos compuestos.

Ingeniería Genética „ La Ingeniería Genética se basa en

la clonación molecular. „ Un fragmento de DNA se recombina con un vector y se introduce en un hospedador adecuado. „ En 1973 los investigadores Stanley Cohen y Herbert Boyer producen el primer organismo recombinando partes de su ADN en lo que se considera el comienzo de la ingeniería genética.

Técnicas del ADN recombinante TÉCNICA

PROPÓSITO

Enzimas Restricción

Cortan ADN en puntos específicos, hacen fragmentos de ADN

ADN Ligasa

Une fragmentos de ADN

Vectores

Virus o fagos: llevan ADN a las células y aseguran replicación

Plasmidos

Clase común de vector

Marcadores Genéticos Identifican a las células que han sido transformadas PCR

Amplifica la cantidad de ADN de muestras pequeñas

ADNc

Copia de ADN a partir de ARN mensajero

Sondas de ADN

Para identificar y marcar una pieza de ADN conteniendo cierta secuencia

Síntesis Génica

Para hacer un gen de una base de datos

Gel Electroforésis

Para separar fragmentos de ADN

Secuenciación ADN

Para leer la secuencia de bases de un segmento de ADN

Enzimas de Restricción „ En 1953 se encontró que

ciertos fagos no son capaces de infectar algunas cepas de bacterias „ Fenómeno fenómeno se denominó restricción. „ Son endonucleasas que cortan el ADN: tijeras moleculares. „ EcoRI, HindIII, BanHI

Ligasas • Enzimas capaces de unir extremos de moléculas doble hebra de ADN • Juegan roles en diversos procesos celulares (replicación del ADN, reparación, recombinación) • El mecanismo implica la formación de enlaces covalentes entre las hebras a expensas de gasto de ATP • La enzima del fago T4 es comúnmente usada en el laboratorio

Vectores de clonado „ Son moléculas de ADN utilizadas para introducir

ADN foráneo a un organismo de interés „ Están diseñados para facilitar la formación de moléculas recombinantes „ Varios tipos: Tamaño máximo del inserto: „ „ „ „ „

Plásmidos Virus (bacteriófagos) Cósmidos BACs YACs

10 kb 20 kb 50 kb 250 kb 3000 kb

Plásmidos „ Moléculas de ADN

extracromosómico de origen bacteriano „ Los plásmidos han sido modificados para ser usados como vectores de clonado: „ Origen de replicación „ Marcador de selección „ Sitio de clonado múltiple

MCS

Reacción en cadena de la polimerasa Es un proceso cíclico (cada ciclo consta de 3 pasos) 94ºC desnaturalización (separación de las dos hebras de ADN) 50ºC Anillamiento de "cebadores" 72ºC copia de cada una de las hebras de ADN por la ADN polimerasa

Clonación „ En 1973 se realizó uno de los primeros experimentos de

ingeniería genética. Se transfirieron genes de ARNr de rana a células bacterianas. „ Digestión del ADN genómico con EcoRI. „ Inserción en plásmidos bacterianos (pSC101). „ Sitio de corte único para EcoRI y resistencia a tetraciclina.

Pasos de la clonación 1

2 Extremos cohesivos

Plásmido

gen de resistencia a la ampicilina

3

Molécula de ADN recombinante

Defosforilación y limpieza ADN

Sistemas de transferencia genética: Procariontes 1. Trasformación. A través de huecos en la membrana. (Células competentes químicas o electroporadas) 2. Conjugación: Se ponen cepa donadora y cepa receptora en contacto físico. 3. Transducción: A través de fagos 1

2

3

Sistemas de transferencia genética: Eucariontes 1. Agrobacterium. La bacteria conteniendo el inserto, infecta las células de la planta produciendo la recombinación genética. 2. Acelerador de Partículas (Gene Gun). Un cañón artificial bombardea micropartículas con el inserto, sobre la célula. 3. Electroporación. Uso de carga eléctrica para que el ADN atraviese la membrana nuclear. 4. Polietilenglicol. Exposición de las membranas al PEG, facilita el movimiento de las moléculas de ADN.

núcleo cromosoma

célula vegetal

Sistemas de transferencia genética 5. Silicon Wiskers. Inyección con fibras microscópicas, que atraviesan las membranas con los insertos. 6. Microinyección. Una célula es adherida a una pipeta bajo un microscopio y el ADN foráneo es inyectado directamente en el núcleo usando una micropipeta muy fina. Se usa cuando hay pocas células disponibles, tale como células fertilizadas de huevo animal. 7. Liposomas. Los vectores pueden ser encapsulados en pequeñas vesículas de membrana para introducir el ADN in vivo en la célula.

Hospedero „ Organismos utilizado para obtener grandes

cantidades del ADN clonado. „ Características deseadas: Crecimiento rápido, medio de cultivo sencillo, no patógeno, estabilidad en el cultivo. „ Células procarióticas como E. coli y B. subtilis „ Células eucaritóticas como Sacharomyces, células vegetales, células de insecto, células humanas.