ЗАГАЛЬНІ ЗАКОНОМІРНОСТІ УФ-ПОГЛИНАННЯ БІЛКІВ ТА НУКЛЕЇНОВИХ КИСЛОТ. Амінокислотні залишки в поліпептидному ланцюгу поглинають світло в дальній УФ-області спектру (190-230 нм). Це поглинання пов’язане значною мірою з поглинанням пептидних зв’язків. В ближній УФ-області (240-300 нм) поглинають світло лише тирозин, триптофан та фенілаланін. Ці хромофори складають незначну частину від загальної кількості амінокислот, що входять до складу білку. Поглинання кожного хромофору відбувається незалежно. Згідно закону Ламберта-Бера, інтенсивність світла, що пройшло крізь шар речовини товщиною l, записується як I = I o × e− Elc (1) де Іо - інтенсивність падаючого світла, с - концентрація речовини, що поглинає (моль/л) Е - молярний коефіцієнт поглинання (моль-1) Що ж визначає спектри поглинання білків та нуклеїнових кислот та впливає на них? Емпірично встановлено певні кореляції між хімічною будовою сполуки та її спектром поглинання. 1. Чим більше подвійних зв’язків містить молекула, тобто, чим більш делокалізовані π - електрони, тим більш довгохвильове положення займає максимум спектру поглинання в ближній УФ-області (наприклад, для тирозину, триптофану та фенілаланіну). 2. На спектр поглинання впливає наявність диполів та стан йоногенних груп. На спектрофотометрах вимірюють спектри пропускання або ж спектри T = ln
поглинання розчину. Пропускання розчину I
I . Io
Поглинання розчину
1
характеризується оптичною густиною D = ln I = T . Тоді закон Ламберта-Бера в o логарифмічній формі записується як D = Elc (2) а. УФ-спектри поглинання ароматичних амінокислот. З 20 найбільш поширених амінокислот в ближньому УФ поглинають світло тільки деякі: триптофан, тирозин та фенілаланін. Незначний вклад в поглинання вносять також цистеїн та гістидин. CH2 N
CH
COOH
CH2
OH
CH
CH
COOH
COOH
Cys
CH NH 2
Tir
Phe
CH
C
N NH 2
CH2
NH 2
NH 2
Trp HS
CH2
CH2
NH C H
CH NH 2
His
COOH
COOH
В областіф далекого (вакуумного, менш як 210 нм) ультрафіолету сильно поглинають всі амінокислоти а також пептидні зв’язки. Дослідження в цій області потребують спеціальної складної техніки і тому ми її розглядати не будемо. Всі амінокислоти не поглинають світло у видимій області спектру. Для ароматичних амінокислот характерні два максимуми поглинання: основний, який знаходиться в області дальнього (200-210нм) і другий в ближньому (260-280нм) ультрафіолеті. Ці максимуми обумовлені π − π * переходами в площині ароматичного кільця. В області ближнього УФ спектри хромофорів є характеристичними. Не зважаючи на значне перекривання спектрів, вони помітно відрізняються один від одного за структурою та положенням максимумів, за абсолютним значенням молярного коефіціента екстинції, за напівшириною смуг поглинання, а також за тонкою структурою спектру (рис.1). ε ·10‾³
ε ·10‾³
λ ,нм λ ,нм Рис.1. Спектри триптофану (а), тирозину (б), фенілаланіну (в), гістидину (г). (рН 7.0, t=200С) Спектральні параметри амінокислот в ближньому УФ. АМІНОКИСЛОТА E λ СМ-1 × МОЛЬ-1 ГОЛОВНИЙ МАКСИМУМ Триптофан 5600 279,5 Тирозин 1380 275 Фенілаланін 180 257 Гістидин 80 240 На спектр поглинання амінокислоти може впливати наявність заряджених груп. Для амінокислот у вільному стані такий вплив виявляється помітним, оскільки вони містять вільні карбоксильні та аміногрупи. У тирозину при зміні рН (в лужному середовищі рН=11) відбува.ться також іонзація іоногенної фенольної групи, що призводить до зсуву спектру, тобто до зміни положення його максимуму від 275 до 293 нм, а також зміни значення Е макс. Іонізовані тирозинові молекули називають тирозинатами.
CH2
CH NH 2
Tir
OH
COOH
CH2
CH
COOH
NH 2
O - Na+
водний розчин 0.1н NaOH Е275 = 1380 см‾¹·моль‾¹ Е293 = 2400 см‾¹·моль‾¹ Вважають, що зміна рН середовища практично не впливає на спектр триптофану. Але в дуже кислому середовищі при концентрації Н2SO4 в діапазоні 5 - 13М відбувається довгохвильовий зсув і зміна форми спектру вільного триптофану. Це явище не пов’язане з вільними -NH2 i -СООН групами, а обумовлене протонуванням пірольного кільця молекули. При цьому іонізується NH - група, яка має слабкі основні властивості рК=6,23. б.УФ-спектри поглинання білків. Для розчинів білків при нейтральних значеннях рН спектр поглинання білку добре співпадає зі спектром поглинання еквімолярної суміші амінокислот, що входять до його складу. Але слад розуміти, що в даному випадку ми нехтуємо двома обставинами: деяким вкладом поглинання пептидних зв’язків в поглинання ьбілку, а також змінами в спектрах амінокислот при їх включенні в білок. При включенні амінокислот в білки зникає тонка структура спектру, а також відбувається невеликий зсув спектрів на 1-4 нм в короткохвильову область для фенілаланіну і в довгохвильову для тирозину та триптофану. В ближньому УФ (250-300нм) оптичне поглинання білку представляє собою суму поглинання трьох ароматичних амінокислот: Do=Dtrp+Dtir+Dphe (3) в. Врахування вкладу розсіювання в спектрах поглинання білків. Для спектрів амінокислот та білків характерно те, що значення D при 310350нм практично дорівнює нулю, але при вимірюванні спектрів поглинання деяких білків, наприклад, міозину, альбумінів при довжинах більше 310нм відрізняється від нуля. Спостерігається так званий довгохвильовий «хвіст». Він зумовлений розсіюванням УФ-випромінювання великими молекулами білків, розміри яких - одного порядку з довжиною хвилі даного випромінювання. (Молекулярна маса міозину = 480000). Оптичну густину розчину білку можна представити як суму вкладів істиного поглинання і розсіювання світла: D=Dпог+Dрозс (4) Коректна робота вимагає врахування вкладу розсіювання при знаходженні істинних спектрів поглинання білків. Теорія розсіювання світла для випадку, коли розсіюючі частинки однієї величини з довжиною хвилі, розроблена Релєєм. Тому подібне розсіювання має назву релєєвського. Воно описується рівнянням: Dрозс=a/ λn (5) де λ - довжина хвилі
а - константа, яка залежить від параметрів розсіюючих частинок, їх кількості та об’єму. n - показник ступеню. Принцип методу та послідовність операцій такі: 1. Нехай спектр поглинання деякого розсіюючого розчину представлено на рис.2.1. 2. Логарифмування аналітичного виразу (5) дає лінійну функцію: lgDрозс=lga-nlg λ (6) а графік 2 має вигляд, представлений на рис.3, де відрізок на осі ординат є lgа, а показник ступеню n - тангенс кута нахилу графіка. D Рис.2 lgDрозс Рис.3
3: Dроз λ2 λ lgλ Істинний спектр поглинання даного білкового розчину (рис.2.2.) знаходимо, віднімаючи від виміряних значень оптичної густини графічно знайдені значення Dрозс по всьому діапазону довжин хвиль. Істинні спектри поглинання дозволяють визначити молярні коефіцієнти екстинції білку Е з формули Ламберта-Бера. Для цього необхідно знати Dпогл, молекулярну масу і концентрацію даного білку в розчині. Точне приготування розчину певної концентрації вимагає старанного висушування білкового препарату до постійної маси. Для білкових розчинів характерні фотодеструктивні процеси, які йдуть під дією ультрафіолетового опромінення. При значних дозах опромінення спектр досліджуваної речовини може змінюватись за рахунок протікання фотохімічних реакцій. Визначення вмісту в білках тирозину й триптофану. Реєструють спектр поглинання (рис.4) білку (рН12). Рис.4
λ На спектрі поглинання з’являються два піки при 280 та при 294,4нм (поглинання тирозинатів). Проводиться дотична до цих двох піків і потім будується прямокутний трикутник з катетами а й в. Бенц і Шмідт знайшли зв’язок між співвідношенням тирозину до триптофану і параметром S, який знаходиться зі спектру поглинання (рис.4). a b
S=10-3 Dmax де Dmax - оптичне поглинання білку при 280нм. В таблиці наведено отримані результати, котрі показують, яке буде значення тир/три для одержаного в експерименті параметру S. ТИР/ТРИ S ТИР/ТРИ S 0,1 -17,5 1,0 -2,8 0,2 -14,7 1,1 -1,8 0,3 -12,6 1,3 0,11 0,4 -10,7 1,5 1,5 0,5 -9,0 2,0 4,8 0,7 -6,1 2,5 8,4 0,9 -3,9 3,0 11,9 г. УФ-поглинання нуклеїнових кислот. Поглинання нуклеїнових кислот в близькій УФ-області обумовлено пуриновими і піримідиновими основами. Максимум поглинання всіх нуклеотидів, крім цитидіну, знаходиться біля 260нм, а у цитидіну при 270нм (рис 5 і 6). ε ·10‾³ ε ·10‾³
λнм
λнм
У ДНК й РНК в результаті накладання спектрів поглинання мономерів одержується смуга поглинання з максимумом при 260нм. Молярний коефіцієнт екстинції, як відомо, змінюється в залежності від природи сполуки, що поглинає, від природи розчинника, від рН. Значення Е при 260нм (Е × 10-3). АДЕНІН 13,4 Гуанін 7,2
Цитозин 5,55 Урацил 8,2 Тимін 7,4 д.Гіпохромізм та гіперхромізм. Нативна, дволанцюгова ДНК поглинає світло при 260нм значно слабше, ніж можна було б чекати, виходячи з сумарного поглинання компонентів, що входять до її складу.Це явище називається гіпохромним ефектом. Спочатку гіпохромний ефект намагались пояснити за рахунок горизонтальних водневих зв’язків, які виникають між комплементарними парами в подвійній спіралі ДНК. Але виявилось, що й для одноланцюгового полінуклеотиду полі-А поглинання суттєво менше, ніж для мономерів АМФ, тобто для полі-Ф також спостерігається гіпохромний ефект. Аналіз впорядкованої структури ДНК вказує на те, що площини основ розміщуються майже паралельно. Компланарне розміщення (стек) обумовлює вертикальні взаємодії і в результаті спостерігається гіпохромний ефект (зникнення поглинання в нативній ДНК). При тепловій денатурації ДНК оптична густина зростає. Явище, яке пов’язане зі збільшенням оптичної густини ДНК, називається гіперхромним ефектом. Гіперхромний ефект, як правило, виражають в процентах і визначають:Г.Е.(%)=(Ddenat-Dnat/ Dnat )·100% Гіперхромізм збільшується при збільшенні довжини ланцюга. Денатурація ДНК визначається найбільш зручно за допомогою гіперхромного ефекту. Теплова денатурація ДНК супроводжується значним (від 20% до 60% в залежності від препарату ДНК) збільшенням оптичної густини при 260нм. З. Температура плавлення ДНК. Денатурація ДНК відбувається , як правило, у вузькому інтервалі температур. Такий вузький перехід формально аналогічний плавленню простого органічного кристалу і тому теплову денатурацію ДНК часто називають плавленням ДНК. Крива залежності D260 від температури називається кривою плавлення ДНК. Температура, при якій гіперхромний ефект дорівнює половині свого максимального значення, називається температурою плавлення нуклеотиду Тп. Ширина інтервалу плавлення Т визначається як відстань між точкою, в якій гіперхромний ефект складає 18% , та симетричною точкою, в якій гіперхромія складає 82% від максимальної . Т становить 3,0 для гомополімерних нуклеотидів і фагових ДНК, 4-5 для бактеріальних ДНК і 7-8 для ДНК тваринних клітин. Величина Т відображає гетерогенність ДНК за складом і збільшується при наявності денатурованих ділянок. Різні ДНК відрізняються температурою плавлення в залежності від походженняю. Температура плавлення (Тпл ) лінійно залежить від вмісту ГЦ пар в ДНК: Т п = Тат + (Тгу - Тат ) * х , де Тат і Тгу - температура плавлення АТ - і ГЦ - пар , Х - мольна доля ГЦ - пар в ДНК. Встановлено, що Тат =337,3 К і Тгу =337 К.
Визначення Тал ДНК при строго фіксованих значеннях рН і йонної сили розчину дозволяє дуже точно визначити її нуклеотидний склад.. Мармур і Доті запропонували формулу, яка зв’язує вміст ГЦ пар в ДНК в розчиннику, який умовно позначається ISSC/ 0,15 M NaC - 0,015 M цитрат-Na/ : Х(%) =2,44 tn - 169, де tn - в шкалі Цельсія. tn ДНК не залежить, як правило, від її молекулярної ваги. ж. Ренатурація нуклеїнових кислот При охолодженні нагрітих зразків ДНК величина шіпохромного ефекту в значній мірі відновлюється. Ренатурацією називається відновлення комплементарної спіраьної структури нуклеїнової кислоти при припиненні дії денатуруючого фактору. Щоб перевірити, що відбулася дійсно ренатурація, ДНК нагрівають повторно. Якщо перехід спіраль-клубок буде тким же різким, як і припершому нагріванні, то ренатурація істинна. Якщо перехід розмитий по великому інтервалу температур, то мало місце неспецифічне спарювання. УФ-спектроскопія широко використовується для визначення концентрації і чистоти ДНК. При роботі з ДНК і РНК, як правило, не користуються молярними коєфіцієнтами екстинкції, оскільки працюють з препаратами різної молекулярної ваги. Користуються молярним коефіцієнтом поглинання, розрахованим на 1 середню мономерну одиницю. (М.М. 300), 1 позначають його Dр . Для нативної ДНК він має значення Dр =6600 при йонній силі μ= 0,1 - 0,2, для високомолекулярної РНК - 7800. Таким чином одна оптична одиниця відповідає 40 мкг РНК або 47 мкг ДНК. Наявність домішок в досліджуваних перпаратах робить такі виміри ненадійними. Для таких сумішей розроблено ряд кількісних методів, основаних на кольорових специфічних реакціях на компоненти нуклеїнових кислот 1 білків. Практичні завдання Експериментальна робота проводиться на спектрофотометрах СФ-16 або СФ-46. Завдання 1. Вимірювання спектрів поглинання аромтичних амінокислот: а) записати в оптимальних умовах (D=0.5) спектри поглинання аромтичних амінокислот (тирозину та триптофану) в водних розчинах; Примітка. Знаючи коефіцієнт екстинції (для певної довжини хвилі) та молекулярну масу досліджуваної речовини, легко приготувати розчин цієї речовини з заданою оптичною густиною. Потрібно скористатися законом Ламберта-Бера, який описує залежність між концентрацією (с), оптичною густиною (D), коефіцієнтом екстинкції (ε) та товщиною шару розчину (l). Ця залежність виражається простою формулою D=ε·l·c. Для товщини шару розчину 1см (товщина кювети) можна знайти концентрації тирозину та триптофану необхідні для приготування розчину з заданою D, c =
D . Знаючи ε ×l
концентрації речовин легко знайти наважки які необхідні для приготування цих концентрацій. Mr(trp)=204.2, ε=5600cм-1·М-1 Mr(tir)=181.2, ε=1380см-1·М-1 б) перевірити справедливість закону Ламберта-Бера (лінійну залежність оптичної густини (D) від концентрації), для розчину триптофану при нейтральних значеннях рН; в) по одержаних значеннях D розрахувати молярні коефіцієнти екстинції(ε -1· (см М-1)) триптофану та тирозину при нейтральних значеннях рН для довжини хвилі 280 нм; г) Зменшивши концентрацію водневих іонів в розчині (рН 12), прописати спектр поглинання іонізованої форми тирозину — тирозинату, порівняти одержаний спектр з спектром тирозину і пояснити зміни, що відбулися при залужненні розчину. Завдання 2. Спектри поглинання білків: а) виміряти спектр поглинання сироваткового альбуміну бика САБ) в концентрації, яка б відповідала оптичній густині білку 0.5 D; б) врахувати вклад розсіювання в спектр поглинання САБ і знайти його істинний спектр поглинання; Примітка. Для знаходження істинного спектру поглинання білку користуються законом Релея для розсіювання, яке по імені відкривача називають Релеєвським. Таке розсіювання в істинних розчинах спостерігається коли його частинки мають розмір близький до довжини хвилі світла. Закон описується формулою Dр =
А де А та n постійні, а λ — довжина хвилі. Експериментально врахування λn
вкладу розсіювання проводять прописуючи спектр поглинання білку в ділянці 300320нм де він не повинен поглинати. Але в цій ділянці спостерігається поглинання білком світла, це свідчить про наявність Релеєвського розсіювання. Знаходиться залежність lgD від lgλ на ділянці 300-320нм і будується графік залежності. Проводиться екстраполяція цієї залежності в ділянці спектра де знаходиться спектр поглинання білка. Антилогарифм від lgDp дає величину Dp в ділянці поглинання білка. Істинний спектр знаходиться шляхом віднімання D-Dp=Dістинне. Завдання 3. Визначення вмісту в білку САБ тирозинових і триптофанових залишків: а) Визначити вміст в САБ залишків ароматичних амінокислот користуючись методом Гудвіна-Мортона Мtyr=10-3(0.592·ε294-0.263·ε280) Mtrp=10-3(0.263·ε280-0.170·ε294) де ε —коефіцієнти екстинкції на довжинах хвиль 280 і 294нм;
б) Визначити вміст в САБ залишків ароматичних амінокислот користуючись методом Бенда-Шмідта. Розчин САБ залужнюється і по величині піків в спектрі (як показано на малюнку) знаходиться співвідношення між тирозином і ab
3 триптофаном. Знаходиться коефіцієнт S: S = 10 × D 280 . За допомогою таблиці max
визначається співвідношення між кількістю тирозинових та триптофанових залишків в білку. Дані двох методів порівнюються. Таблиця відповідності між S та Tyr/Trp Tyr/Trp S 0.1 -17.5 0.2 -14.7 0.5 -9.0 1 -2.8 1.1 -1.8 1.5 1.5 2.0 4.8 4 18.4 Література. 1. Костюк П.Г., Гродзинский Д.М., Зима В.Л., Магура И.С., Сидорик Е.П.,
Шуба М.Ф. Биофизика. - К., Вища школа, 1988. С. 76-80. 2. Демченко А.П. Ультрафиолетовая спектрофотометрия и структура белков. - К., Наукова думка, 1981, с.26-43, 158 - 160. 3. Кантор Ч., Шиммел П. Биофизическая химия. -М.., Мир, 1984, т.2, с.1062.