Tugas_biokim_4.docx

Laporan Praktikum Biokimia Umum

Hari/ tanggal Waktu PJP Asisten

: Kamis/ 17 Maret 2016 : 12.00 – 14.30 WIB. : Puspa Puspita J, S.Si, M.Sc. : 1. Andi Mulyadi 2. Eldi Ramdhani 3. Muhminah 4. M. Fakhri R

UJI PROTEIN I

(Uji Millon, uji Hopkins-Cole, uji ninhidrin, uji belerang, uji xantoproteat, dan uji biuret) Kelompok 3 1. Sutisno 2. Resti Indana 3. Nais Nashiatul K

B04150042 B04150052 B04150187

FAKULTAS KEDOKTERAN HEWAN (FKH) INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2016

PENDAHULUAN Protein adalah polimer alami yang terdiri dari beberapa unit asam amino yang mempunyai ikatan amida dan peptida. Di dalam protein terdiri atas asam amino α, asam karboksilat dengan gugus amino pada atom karbon C α. Peptida dan protein merupakan polimer kondensasi asam amino dengan penghilangan unsur air dari gugus amino dan gugus karboksil (Winarno 2002). Asam amino dengan protein yang terdapat di alam umumnya merupakan asam amino dengan atom C-α yang mengikat 4 gugus yang berbeda (asimetris). Konfirmasi atom C-α asam amino penyusun protein termasuk L, sedangkan bentuk D secara alamiah jarang dijumpai di alam seperti asam amino nonprotein pada senyawa antibiotika yang dihasilkan oleh bakteri tanah. Berdasarkan bisa tidaknya asam amino disintesis oleh tubuh manusia, maka asam amino dibedakan menjadi asam amino esensial dan nonesensial (Poedjiadi 1994). Asam amino merupakan unit pembangun protein yang dihubungkan melalui ikatan peptida pada setiap ujungnya. Protein tersusun dari atom C, H, O, dan N, serta kadang-kadang P dan S. Dari keseluruhan asam amino yang terdapat di alam hanya 20 asam amino yang biasa dijumpai pada protein. Protein merupakan biopolimer yang multifungsi, yaitu sebagai struktural pada sel maupun jaringan dan organ, sebagai enzim suatu biokatalis, sebagai pengemban atau pembawa senyawa atau zat ketika melalui biomembran sel, dan sebagai zat pengatur (Hawab 2004). Struktur umum asam amino mempunyai dua gugus pada tiap molekulnya, yaitu gugus amino dan gugus karboksil, yang digambarkan sebagai struktur ion dipolar. Gugus amino dan gugus karboksil pada asam amino menunjukkan sifatsifat spesifiknya. Karena asam amino mengandung kedua gugus tersebut, senyawa ini akan memberikan reaksi kimia yang yang mencirikan gugus-gugusnya. Sebagai contoh adalah reaksi asetilasi dan esterifikasi. Asam amino juga bersifat amfoter, yaitu dapat bersifat sebagai asam dan memberikan proton kepada basa kuat, atau dapat bersifat sebagai basa dan menerima proton dari basa kuat (Lehninger 1988). Melalui reaksi hidrolisis protein telah didapatkan 20 macam asam amino yang dibagi berdasarkan gugus R-nya, berikut dijabarkan penggolongan tersebut: asam amino non-polar dengan gugus R yang hidrofobik, antara lain Alanin, Valin, Leusin, Isoleusin, Prolin, Fenilalanin, Triptofan dan Metionin. Golongan kedua yaitu asam amino polar tanpa muatan pada gugus R yang beranggotakan Lisin, Serin, Treonin, Sistein, Tirosin, Asparagin dan Glutamin. Golongan ketiga yaitu asam amino yang bermuatan positif pada gugus R dan golongan keempat yaitu asam amino yang bermuatan negatif pada gugus R. Dari ke-20 asam amino yang ada, dijumpai delapan macam asam amino esensial yaitu valin, leusin, Isoleusin, metionin, Fenilalanin, Triptofan, Treonin, dan Lisin. Asam amino essensial ini tidak bisa disintesis sendiri oleh tubuh manusia sehingga harus didapatkan dari luar seperti makanan dan zat nutrisi lainnya (Rismaka 2009). Tujuan dari praktikum ini adalah untuk mengetahui sifat dan struktur asam amino dan protein melalui uji-uji kualitatif serta mempelajari beberapa reaksi uji terhadap asam amino dan protein.

METODE PRAKTIKUM Waktu Praktikum Praktikum mengenai uji protein 1 (Uji Millon, uji Hopkins-Cole, uji Ninhidrin, uji Belerang, uji Xantoproteat, dan uji Biuret) dilaksanakan di Laboratorium Biokimia pada hari Kamis, tanggal 10 Maret 2016 pukul 12.00-14.30 WIB. Alat dan Bahan Alat-alat yang digunakan dalam praktikum ini antara lain: tabung reaksi, pipet tetes, penangas air, pipet volumetrik, bulb, gelas piala, dan stopwatch. Bahan-bahan yang digunakan dalam praktikum ini antara lain: albumin 2%, gelatin 2%, kasein 2%, pepton 2%, fenol 2%, pereaksi millon, pereaksi hopkinscole, larutan ninhidrin, pereaksi belerang, H2SO2 pekat, HNO3 pekat, NaOH 10%, Pb-asetat 5% dan CuSO4 0,1%. Prosedur Percobaan Uji Millon. Larutan albumin 2%, gelatin 2%, kasein 2%, pepton 2% dan fenol 2% masing-masing sebanyak 3 ml ditambahkan 5 tetes pereaksi millon kedalam tabung reaksi kemudian di panaskan. Uji Hopkins-Cole. Larutan albumin 2%, gelatin 2%, kasein 2% dan pepton 2% masing-masing sebanyak 2 ml di campur dengan pereaksi Hopkins-Cole dalam tabung reaksi. Asam pekat 3 ml ditambahkan melalui dinding tabung sehingga membentuk lapisan dari cairan, setelah beberapa detik akan terbentuk cincin violet (ungu) pada pertemuan kedua lapisan cairan jika mengandung triptofan. Uji Ninhidrin. Larutan ninhidrin 0.1% ditambahkan sebanyak 0,5 mL kedalam 3 ml larutan albumin 0.02%, kasein 0.02%, gelatin 0.02%, dan pepton 0.02%. dipanaskan selama 10 menit, amati perubahan warna yang terjadi. Uji Belerang. Larutan albumin 0.02%, kasein 0.02%, gelatin 0.02%, dan pepton 0.02% masing-masing sebanyak 2 mL di tambah 5 mL NaOH 10% dipanaskan selama 5 menit. Kemudian ditambah 2 tetes larutan larutan Pb-asetat 5%, pemanasan dilanjutkan, diamati warna yang terjadi. Uji Xantoproteat. Larutan albumin 2%, kasein 2%, gelatin 2%, pepton 2% dan fenol 2% masing-masing sebanyak 2 mL ditambahkan 1 mL HNO3 pekat, dicampur, kemudian dipanaskan, di amati timbulnya warna kuning tua. Didinginkan, ditambahkan larutan NaOH 10% sebanyak 3 mL sampai larutan menjadi basa. Diamati perubahan warna yang terjadi. Uji Biuret. Larutan 1.5 mL albumin 2%, kasein 2%, gelatin 2%, pepton 2% dan fenol 2% ditambahkan 0.5 mL NaOH 10%, kocok lalu tambahkan 1 tetes larutan CuSO4 0,1%, kocok kembali dan jika tidak timbul warna tambahkan lagi CuSO4 0,1% hingga terbentuk warna ungu.

HASIL DAN PEMBAHASAN Keistimewaan dari protein adalah strukturnya yang mengandung N, disamping C, H, O (seperti karbohidrat dan lemak), S dan kadang-kadang P, Fe dan Cu (sebagai senyawa kompleks dengan protein). Dengan demikian maka salah satu

cara terpenting yang cukup spesifik untuk menentukan jumlah protein secara kuantitatif adalah dengan penentuan kandungan N yang ada dalam bahan makanan atau bahan lain. Molekul protein sendiri merupakan rantai panjang yang tersusun oleh matarantai asam-asam amino. Asam amino adalah senyawa yang memiliki satu atau lebih gugus karboksil (-COOH) dan satu atau lebih gugus amino (-NH2) yang salah satunya terletak pada atom C (Hamdan 2007). Berdasarkan sifat fisiknya dan bentuknya, albumin termasuk kedalam protein globural yaitu protein yang tersusun atas asam amino yang bertumpuk rapat sehingga berbentuk bulat padat. Uji kualitatif dilakukan terhadap barbagai jenis protein, mengacu pada reaksi yang terjadi antara pereaksi dan komponen protein (asam amino) yang gugus R-nya spesifik pada reaksi-reaksi tertentu. Albumin merupakan protein terpenting yang disintesis oleh hati dan hati adalah satu-satunya tempat sintesis protein. Albumin merupakan unsur utama yang terdapat pada putih telur. Albumin mempunyai berat molekul tinggi (66000) dan mengandung 584 asam amino. Produksi albumin yang normal dalam rentang 120-200 mg per kg per hari (Sabiston 1987). Gelatin ialah protein hewani yag tidak lengkap, diambil dari jaringa hewani, seperti tulang dan jaringan ligament. Dapat dijumpai dalam beberapa sari daging dan dalam beberapa kaldu. Juga didapati dalam sayuran tertentu, sebuah contoh ialah agar-agar yang digunakan dalam pembuatan jeli dan kaldu (Pearce 2009). Kasein merupakan senyawa fosfo-gliko protein berbentuk misela (diameter 0,1 mikro), berikatan dengan kalsium fosfat dan sitrat yang meliputi 75% protein dalam susu sapi.Kasein alami terdiri atas protein 94%, kalsium (Ca) 35%, fosfor (P) 2,2%, asam sitrat (0,5%) dan magnesium (Mg 0,1%). Kasein mengandung lysine, kekurangan sistin (0,4%), tetapi kaya akan metionin (kira-kira 3%) dan dapat dihidrolisis menjadi oligopeptida yang larut dan mudah dicerna (Djarir 2002). Fenol merupakan senyawa aromatic dengan satu atau beberapa gugus hidroksil yang terikat secara langsung pada cincin benzene. Senyawa tersebut mudah mengalami oksidasi. Senyawa fenol terdiri atas fenol (C6H5OH), kresol, xylenol, klorfenol, katekol, hidroquinon, timol, naftol, dan sebagainya. Senyawa fenol dihasilkan dari proses pemurnian minyak, industry kimia, tekstil, plastic, dan lain-lain (Effendi 2003). Protein derivat merupakan hasil pemecahan protein alam sebelum menjadi asam alfa amino. Pemecahan protein umumnya melalui hidrolisis. Hidrolisis berat diperoleh protein derivate sekunder, salah satunya ialah pepton. Struktur kimia pepton jauh lebih sederhana daripada proteosa. Pepton ikut larut dalam air dan tak menggumpal apabila dipanaskan (Sumardjo 2006). Uji Millon berfungsi untuk mengetahui adanya gugus phenol dalam protein. Pereaksi Millon terdiri dari merkuri nitrit (HgNO2) dan merkuri nitrat (Hg(NO3)2). Protein yang mengandung gugus hidroksil Phenil (-OH) dapat bereaksi dengan larutan mercuri nitrat dapat menghasilkan larutan atau endapan berwarna putih kemudian berubah warna menjadi merah setelah dipanaskan (Sutresna 2008). Pereaksi Millon merupakan larutan merkuri yang ada di dalam asam nitrat. Uji ini dilakukan pada senyawa turunan monofenol yang mengandung hidroksifenil. Jika larutan yang mengandung hidroksifenil bereaksi dengan peraksi Millon maka akan dihasilkan endapan putih. Jika suhu campuran ini dinaikkan maka warna larutan akan berubah menjadi warna merah. Warna merah yang terbentuk disebabkan oleh garam dari hasil nitrasi tirosin.

Tabel 1 Hasil uji Millon Albumin Sampel Uji 2% Pengamatan + Bening Warna keruh

Gelatin 2% Bening

Kasein 2% Pepton 2% Bening

Bening keruh

Fenol 2% Bening

Gambar

Keterangan: (+) mengandung asam amino, (-) tidak mengandung asam amino Prinsip dari uji millon adalah pembentukan garam merkuri dari tirosin yang ternitrasi. Tirosin merupakan asam amino yang mempunyai molekul fenol pada gugus R-nya, yang akan membentuk garam merkuri dengan pereaksi millon. Dari hasil percobaan diketahui bahwa albumin, gelatin, kasein, dan fenol tidak mengandung tirosin, sedangkan pepton mengandung tirosin. Seharusnya fenol, albumin, dan kasein positif dalam uji millon karena tirosin memiliki molekul fenol pada gugus R-nya dan albumin serta kasein mengandung tirosin sebagai salah satu asam penyusunnya, namun pada percobaan tersebut tidak dihasilkan hasil positif. Penyimpangan tersebut terjadi karena kesalahan kerja pada praktikan, bahan yang telah terkontaminasi (Handini 2009). Hasil percobaan, diketahui bahwa protein albumin dan kasein mengandung Tirosin sebagai salah stu asam amino penyusunnya, sedangkan gelatin dan pepton tidak. Uji terhadap fenol negatif, walaupun secara teori tidak. Alasan yang mungkin untuk hal ini adalah kesalahan praktikan dalam bekerja atau kualitas alat yang telah menurun. Uji Hopkins-Cole dilakukan untuk mengetahui apakah senyawa protein mengandung salah satu asam amino triptofan atau tidak. Percobaan uji HopkinsCole dengan bahan yang sama dengan uji sebelumnya, didapatkan reaksi yang positif terhadap senyawa albumin, gelatin, kasein, dan pepton. Triptofan akan berkondensasi dengan aldehid bila ada asam kuaat sehingga membentuk cincin berwarna ungu. Hal ini berarti senyawa gelatin,albumin,kasein dan pepton mengandung triptofan dengan ditunjukan oleh adanya cincin berwarna ungu. Tabel 2 Hasil uji Hopkins-Cole Sampel Uji Pengamatan Warna

Albumin 2%

Gelatin 2%

Kasein 2%

Pepton 2%

+ Kuning pucat

+ Kuning

+ Kuning pucat

+ Kuning bening

Fenol 2% Bening

Gambar

Keterangan: (+) mengandung asam amino, (-) tidak mengandung asam amino

Tabel 3 Hasil uji Ninhidrin Sampel Uji Pengamatan Warna

Albumin 2%

Gelatin 2%

Kasein 2%

Pepton 2%

+ Biru

+ Bening

Kuning

+ Biru pekat

Fenol 2% + Ungu

Gambar

Keterangan: (+) mengandung asam amino, (-) tidak mengandung asam amino Uji Ninhidrin akan positif jika senyawa tersebut mengandung sedikitnya satu gugus karboksil dan asam amino bebas atau alfa asam amino maupun gugus hidroksil. Uji yang positif akan ditandai dengan terbentuknya warna biru ungu dan untuk prolin,hidroksiprolin berwarnakuning. Berdasarkan hasil percobaan, hasil positif ditunjukkan oleh albumin, gelatin, kasein, pepton. Pada percobaan albumin, gelatin, dan pepton membentuk warna biru ungu karena dapat bereaksi dengan Ninhidrin. Hal ini menandakan ketiga zat uji tersebut mempunyai gugus asam amino bebas. Semakin banyak ninhidrin pada zat uji yang dapat bereaksi, semakin pekat warnanya. Hal ini juga mendasari bahwa uji Ninhidrin dapat digunakan untuk menentukan asam amino secara kuantitatif dan fenol menunjukkan hasil yang negatif serta kasein menunjukkan hasil yang positif dengan membentuk warna kuning Karena kasein mengandung gugus prolin atau hidroksiprolin. Ninhidrin merupakan oksidator yang menyebabkan dekarboksilasi oksidatif dari asam amino yang menghasilkan CO2, NH3, dan aldehid yang rantainya lebih pendek 1 C dari asam amino asalnya. Ninhydrin yang tereduksi akan bereaksi dengan NH3 sehingga membentuk senyawa kompleks berwarna biru dengan absorpsi warna maksimum pada panjang gelombang 570 nm (Hamdan 2007). Setelah dilakukan percobaan dengan bahan yang sama seperti uji sebelumnya, didapatkan senyawa yang positif yaitu senyawa albumin, gelatin, pepton dan fenol. Uji ini akan positif jika ada senyawa-senyawa yang didalamnya mengandung sedikitnya satu gugus karboksil dan asam amino bebas atau α-asam amino. Uji ninhidrin yang positif akan ditandai dengan terbentuknya warna biru. Pada uji ini, hanya kasein yang menunjukan hasil yang negatif. Hal ini disebabkan karena kasein tidak mengandung asam amino bebas atau salah satu gugus karboksil. Uji belerang dilakukan untuk mengetahui apakah di dalam bahan-bahan yang diujikan terdapat asam amino sistein atau metionin atau tidak. Sistein dan metionin merupakan asam amino yang mengandung S pada molekulnya. Reaksi Pb-asetat dengan asam amino tersebut akan membentuk endapan berwarna hitam atau kelabu. Penambahan NaOH dalam percobaan tersebut ialah untuk mendenaturasi protein sehingga ikatan yang menghubungkan atom S dapat terputus oleh Pb-asetat dan membentuk garam PbS. Berdasarkan hasil percobaan albumin dan kasein yang berwarna gelap atau kuning gelap, sehingga kasein dan albumin megandung metionin atau sistein (Handini 2009).

Tabel 4 Hasil uji Belerang Albumin Sampel Uji 0.02% Pengamatan + Warna Hitam

Gelatin 0.02% Kuning

Kasein 0.02% kuning

Pepton 0.02% Kuning

Fenol 0.02% Kuning

Gambar

Keterangan: (+) mengandung asam amino, (-) tidak mengandung asam amino Berdasarkan hasil pengamatan didapatkan bahan-bahan yang positif terhadap uji ini adalah senyawa albumin. uji ini dilakukan untuk mengetahui apakah didalam bahan-bahan tersebut terdapat asam amino sistein dan metionin atau tidak. Sistein dan metionin merupakan asam amino yang mengandung atom S pada molekulnya. Reaksi yang positif ditandai oleh adanya endapan garam PbS berwarna kelabu. Hal ini karena adanya reaksi antara Pb-asetat dengan asam-asam amino tersebut. Penambahan NaOH dalam hal ini adalah untuk mendenaturasikan protein sehingga ikatan yang menghubungkan atom S dapat terputus oleh Pb-asetat membentuk PbS. Uji Xantoproteat. Uji ini merupakan uji kualitatif protein. Positif untuk protein yang mengandung asam amino dengan inti benzena, misalnya tirosin, triptofan, dan fenilalanin. Pada uji Xantoproteat ini, larutan asam nitrat pekat (HNO3) ditambahkan dengan hati-hati ke dalam larutan protein. Setelah dicampur terjadi endapan putih yang dapat berubah menjadi kuning apabila dipanaskan kemudian menjadi warna jingga bila dibuat alkalis (basa) dengan larutan NaOH. Reaksi yang terjadi ialah nitrasi atau reaksi substitusi atom H pada benzena yang terdapat pada molekul protein oleh gugus nitro. Inti benzena dapat ternitrasi oleh asam nitrat pekat menghasilkan turunan nitrobenzena. Hasil uji menunjukkan bahwa dari semua bahan, hanya kasein yang tidak mengandung asam amino yang mempunyai inti benzena pada molekulnya. Tetapi hal ini patut dipertanyakan, karena dari data-data yang diperoleh pada uji millon dan uji Hopkins-Cole, kasein mengandung tirosin dan triptofan. Salah satu alasan yang mungkin adalah karena kesalahan kerja praktikan dalam mengamati warna yang terbentuk selama reaksi atau dapat juga disebabkan karena kurangnya pengalaman kerja serta kualitas alat dan bahan yang sudah berkurang.

Tabel 5 Hasil uji Xantoproteat Albumin Gelatin Sampel Uji 2% 2% Pengamatan + + Kuning Kuning Warna bening pekat

Kasein 2% Pepton 2% + Kuning berbusa

+ Kuning

Fenol 2% + Coklat

Gambar

Keterangan: (+) mengandung asam amino, (-) tidak mengandung asam amino Uji Biuret semua protein yang diujikan memberikan hasil positif. Biuret bereaksi membentuk senyawa kompleks Cu dengan gugus -CO dan -NH pada asam amino dalam protein. Fenol tidak bereaksi dengan biuret karena tidak mempunyai gugus -CO dan -NH pada molekulnya. Ketika suasana basa, Cu bereaksi dengan beberapa jenis protein dan menghasilkan senyawa kompleks, reaksi biuret dapat terjadi pada molekul yang mengandung dua gugus yang terikat pada 1 atom karbon/ atom nitrogen/ terikat langsung. Senyawa yang mengandung gugus diganti dengan gugus atau gugus -CH2NH2 juga positif dalam uji biuret. Uji Biuret merupakan uji karateristik dari protein. Tabel 6 Hasil uji Biuret Albumin Sampel Uji 2% Pengamatan + Ungu Warna

Gelatin 2% + Ungu

Kasein 2% Pepton 2% + Ungu

+ Ungu kuning

Fenol 2% + Ungu

Gambar

Keterangan: (+) mengandung asam amino, (-) tidak mengandung asam amino Percobaan uji biuret menunjukan semua protein yang diujikan memberikan hasil positif. Biuret bereaksi dengan membentuk senyawa kompleks Cu dengan gugus -CO dan -NH pada asam amino dalam protein. Fenol tidak bereaksi dengan biuret karena tidak mempunyai gugus -CO dan -NH pada molekulnya. Kegunaan serta fungsi protein pada hewan dengan manusia sama, hanya dalam pecernaannya saja yang berbeda. Diantara kegunaan protein bagi tubuh baik hewan maupun manusia diantaranya: sebagai enzim; alat pengangkut dan alat penyimpan; pengatur pergerakan; penunjang mekanis; pertahanan tubuh/imunisasi; media perambatan impuls saraf; dan pengendalian pertumbuhan.

KESIMPULAN Hasil dari percobaan yang telah dilakukan dapat disimpulkan bahwa uji Millon menunjukkan hasil positif pada pepton. Uji Ninhidrin menunjukkan hasil positif pada albumin, gelatin, kasein, dan pepton. Uji Belerang positif terhadap albumin dan kasein. Uji Xantoproteat positif terhadap albumin, gelatin, kasein, pepton, dan fenol. Uji Biuret positif terhadap albumin, gelatin, kasein, dan pepton. Pengendapan oleh logam dan pengendapan oleh garam positif terhadap albumin. Uji Hopkins-Cole negative pada fenol. Denaturasi protein positif seluruhnya terhadap albumin atau membentuk endapan.

DAFTAR PUSTAKA Djarir M. 2002. Kamus Istilah Pangan dan Nutrisi. Yogyakarta (ID): Penerbit Kanisius. Effendi H. 2003. Telaah Kualitas Air Bagi Pengolahan Sumber Daya dan Lingkungan Perairan. Yogyakarta (ID): Penerbit Kanisius. Hamdan A. 2007. Buku biokimia laboratorium dasar universitas trunojoyo. http://labdasar.trunojoyo.ac.id/buku%20biokimia.pdf [diunduh 14 Maret 2016]. Handini.

2009. Karbohidrat pada uji kualitatif. http://www.rismaka.net/2009/06/uji-kualitatif-protein-dan-asamamino.html [diunduh14 Maret 2016].

Hawab H. 2004. Pengantar Biokimia. Jakarta (ID): Bayu Media Publishing. Lehninger A. 1988. Dasar-dasar Biokimia. Jakarta (ID): Erlangga. Pearce E. 2009. Anatomi dan Fisiologi untuk Paramedis. Jakarta (ID): PT Gramedia Pustaka Utama. Poedjiadi A. 1994. Dasar-Dasar Biokimia. Jakarta (ID): Universitas Indonesia Pers. Rismaka. 2009. Uji kualitatif dan asam amino. http://www.rismaka.net/2009/06/uji-kualitatif-protein-dan- %20asam-ami no.html [diunduh14 Maret 2016]. Sabiston D. 1987. Buku Ajar Bedah Bagian 2. Jakarta (ID): Penerbit Buku Kedokteran EGC. Sutresna N. 2008. Get Succes Kimia. Jakarta (ID): Grafindo Media Pratama. Winarno F. 2002. Kimia Pangan Dan Gizi. Jakarta (ID): Gramedia.