Tugas Metpen.docx

TUGAS METODOLOGI PENELITIAN MENGARTIKAN JURNAL INTERNASIONAL “Norepinephrine Transporter (NET) is Expressed in Cardiac Sympathetic Ganglia of Adult Rat”

PRAMUDIA WARDANI

152210101003

DOSEN : Prof. Drs. Bambang Kuswandi, M.Sc, PhD

UNIVERSITAS JEMBER 2019

Pengekspresian Norepinefrin Transporter (NET) dalam Ganglia Simpatis Jantung Tikus Dewasa Sistem saraf simpatis (SNS) memainkan peran penting dalam mengatur fungsi jantung baik dalam kesehatan maupun penyakit melalui pelepasan neurotransmitter norepinefrin (NE). Dalam sistem saraf pusat (SSP), neurotransmisi NE diakhiri melalui reuptake neurotransmitter yang dilepaskan oleh Na+, transporter norepinefrin Cl-dependent (NET) pada membran pra-sinaptik (Amara, 1993; Blakely, Felice and Hartzell, 1994). Meskipun serapan NE dipelajari dengan baik di hati, tetapi dasar molekuler untuk itu masih kurang jelas (Ganguly et al., no date; Scientific et al., 1990; Nozawa et al., 1998). Peneltian menunjukkan bahwa mereka tidak dapat mendeteksi mRNA spesifik NET dalam miokardium yang diselidiki (FEI et al., 2006). Mereka menyatakan bahwa protein transporter norepinefrin dapat disintesis dalam sel neuronal yang terletak jauh dari jantung dan kemudian diangkut ke saraf jantung yang berakhir melalui transpor akson. Dalam penelitian ini, kami membuktikan bahwa NET diekspresikan di kompleks ganglion stellat-serviks tengah (MC-SG) tikus dan juga menunjukkan bahwa tingkat ekspresi NET yang berbeda antara ganglion kiri dan kanan. MATERIAL DAN METODE Binatang Tikus Sprague-Dawley jantan dengan berat 180-200 g. Setelah masa aklimatisasi, tikus dikorbankan dan mengisolasi MC-SG kompleks dan bagian miokardium ventrikel kiri dengan cepat. Kemudian segera dibekukan dalam nitrogen cair dan disimpan pada suhu -70oC. Persiapan Ekstraksi RNA dan cDNA Total RNA yang diekstraksi dari MC-SG kompleks dan miokardium ventrikel kiri menggunakan TRIzol (GIBCO). Setelah perawatan alikuot RNA akhir dengan DNase I untuk menghilangkan kontaminasi DNA genom, 1 μg dari RNA digunakan untuk transkripsi balik (RT) menjadi cDNA dengan M-MLV (GIBCO). Kloning PCR dari NET tikus Reaksi PCR dilakukan sebanyak 35 siklus pada 94oC selama 1 menit, 65oC selama 1 menit, dan 72oC selama 3 menit. Kemudia, produk dianalisis pada gel agarosa 1,8%. Pita DNA yang telah dimurnikan kemudian dikloning menjadi pBluscript KS dan diurutkan dengan metode dideoxynucleotide. Analisis Northern blot dari NET Produk PCR dari NET diberi label dengan 32p-dATP dan digunakan sebagai probe untuk Northern blot. 12 mg RNA total dari ganglia (n = 5) dan miokardium LV (n = 5) dimasukkan dalam gel agarose-formaldehyde 1% dan dipindahkan ke membran Hybond-N (Amersham Co). Pra-hibridisasi dan hibridisasi dilakukan sesuai dengan metode standar dengan probe NET. Setelah hibridisasi, membran dicuci dua kali dalam 2xSSC pada suhu kamar, sekali dalam 1xSSC pada 42oC selama 20 menit, kemudian 20 menit dalam 0,1xSSC pada 65oC. Setelah paparan autoradiografi, membran dilucuti dan hibridisasi ulang dengan probe cDNA b-aktin berlabel 32P. Sinyal hibridisasi pita spesifik NET diukur dengan densitometri, dan

dinormalisasi dengan sinyal hibridisasi yang sesuai dari β-aktin untuk memperbaiki perbedaan dalam pemuatan dan transfer. RESULTS Transporter neurotransmitter memainkan peran penting dalam mengendalikan transmisi sinyal saraf, disfungsi dalam ekspresi gen transporter neurotransmitter dapat menyebabkan penyakit yang berbeda (Fei, 2001). Untuk menentukan apakah NET diekspresikan dalam sistem simpatis jantung, RT-PCR dilakukan dari total RNA miokardium tikus dan ganglia simpatis jantung. Gambar 1 menunjukkan bahwa produk PCR dalam ukuran yang diinginkan diperoleh dari MC-SG diamplifikasi dengan primer NET.

Produk merupakan gel yang telah dipurifikasi dan dikloning dan telah diurutkan sebagian. Hal ini identik dengan urutan yang diharapkan dalam NET (data urutan tidak ditampilkan). Sebaliknya, tidak ada pita spesifik yang dapat diamplifikasi dari miokardium tikus (n = 3), walaupun b-aktin sebagai kontrol sama-sama ada pada semua cDNA. Untuk menentukan adanya perbedaan dalam ekspresi NET mRNA di kiri dan kanan MC-SG, dilakukan pengujian Northern blot. Gambar 2 menunjukkan bahwa tingkat NET mRNA di sebelah kanan adalah 2,2 kali lebih tinggi daripada di sebelah kiri (p = 0,01, n = 5).

SNS mengatur fungsi organ efektor dengan melepaskan neurotransmitter NE (Esler, 1990). Transmiter yang dilepaskan berikatan dengan reseptor pada membran postsinaptik melalui difusi, di mana sinyal ditransmisikan. Setelah itu, NE harus segera dihilangkan dari celah sinaptik. Dalam CNS, hal ini dikerjakan oleh protein membran plasma dari transporter NE-dependen natrium (NET) yang telah dikloning sebelumnya (Pacholczyk, 1991). Namun, mekanisme pengambilan NE dalam sistem jantung tidak jelas.

Penelitian terbaru dari Ungerer dan kawan-kawan melaporkan bahwa mereka tidak dapat mendeteksi ekspresi NET mRNA dalam miokardium. Oleh karena itu, dapat diasumsikan bahwa NET mRNA mungkin diekspresikan, jika terdapat di soma sel neuron, yang terletak agak jauh dari jantung. Selanjutnya, Matsuoka, dan kawan-kawan juga menunjukkan tingkat tinggi NET mRNA di kultur ganglia serviks superior (SCG) (Matsuoka, Kumagai and Kurihara, 1997). Atas kerja mereka, kami menyelidiki ekspresi NET dalam sistem saraf simpatis jantung, percobaan ini dengan jelas menunjukkan bahwa ekspresi NET mRNA terlihat di kompleks MC-SG tetapi tidak di miokardium. Hasil ini mendukung pendapat bahwa sistem pengambilan NE dalam miokardium dibentuk oleh NET yang dibawa jauh dari jantung dan juga menunjukkan bahwa SNS dalam jantung memiliki mekanisme pengaturan konsentrasi NE yang sama dengan CNS. Informasi ini mungkin berguna untuk pengembangan obat baru yang menargetkan NET untuk pengobatan penyakit jantung. Ganglia simpatis jantung tikus adalah MCSG. Hal ini dibuktikan dengan eksperimen pelacak retrograde. Persarafan terutama ipsilateral (sekitar 60%) dengan kontribusi kontralateral yang signifikan (Scientific et al., 1990; Pardini, Lund and Schmid, 1989). Penelitian sebelumnya memberikan saran bahwa saraf simpatis jantung kanan dan kiri mungkin memiliki efek yang berbeda dan spesifik pada rangsangan jantung (Brown, 1976; Stone et al., 1976). Serat postganglionik dari ganglia stellata kanan (RSG) memainkan peran yang lebih penting daripada serat dari ganglia stellata kiri (LSG) dalam mempertahankan kekuatan kontraktil, terutama denyut jantung. Pelemahan detak jantung secara tidak teratur diamati ketika ganglia stellate kanan (RSG) terganggu, tetapi ganglionektomi stellate kiri (LSG) tidak terdapat efek pada iregularitas interval jantung. Dimana LSG dianggap mampu mempengaruhi inotropisme jantung daripada kronotropisme (Lipsitz et al., 1997). MIBG (metaiodobenzylguanidine) diperkirakan memiliki mekanisme untuk membagi jumlah serapan, penyimpanan, dan mekanisme pelepasan yang sama dengan NE pada terminal saraf adrenergik (Glowniak et al., 1993). Nozawa dan rekan melaporkan bahwa jumlah serapan dan akumulasi MIBG lebih besar pada miokardium ventrikel kanan daripada di kiri pada tikus (Nozawa et al., 1998). Dalam percobaan kami, menunjukkan bahwa ekspresi NET lebih tinggi pada ganglia simpatis jantung kanan tikus dewasa. Hasil ini memberikan bukti biologis molekuler untuk menjelaskan perbedaan antara RSG dan LSG dan untuk kapasitas yang lebih besar dari pengambilan NE dari miokardium kanan atau kiri.

Daftar Pustaka Amara, S. G. (1993) ‘Neurotransmitter Transporters ’:, pp. 73–93. Blakely, R. D., Felice, L. J. D. E. and Hartzell, H. C. (1994) ‘Molecular Physiology of Norepinephrine and Serotonin Transporters’, 281, pp. 263–281. Brown, A. M. (1976) ‘Experimental Effects of Unilateral Ventricular Cardiac Sympathetic Threshold Denervation on the Fibrillation’, 37(June), pp. 1034–1040. Esler, Murray. et al. (1990). 'Overflow of Catecholamine Neurotransmitters to the Circulation : Source, Fate, and Functions'. (2018), 70(4). Fei, J. (2001) ‘Overexpression of -Aminobutyric Acid Transporter Subtype I Leads to Susceptibility to Kainic Acid-Induced Seizure in Transgenic Mice Overexpression of Γ -Aminobutyric Acid Transporter Subtype I Leads to Susceptibility to Kainic AcidInduced Seizure in Transgenic Mice’, (April 2014). doi: 10.1038/sj.cr.7290067. FEI, J. et al. (2006) ‘Norepinephrine Transporter (NET) is Expressed in Cardiac Sympathetic Ganglia of Adult Rat’, Cell Research, 11(4), pp. 317–320. doi: 10.1038/sj.cr.7290102. Ganguly, P. K. et al. (no date) ‘Differential Changes in Sympathetic Activity in Left and Right Ventricles in Congestive Heart Failure After Myocardial Infarction’, pp. 340– 345. Glowniak, J. V et al. (1993) ‘Evaluation of Metaiodobenzylguanidine Uptake by the Norepinephrine, Dopamine and Serotonin Transporters’, (May 2018). Lipsitz, L. A. et al. (1997) ‘Preliminary Evidence for The Evolution in Complexity of Heart Rate Dynamics During Autonomic Maturation in Neonatal Swine’, pp. 1–9. Matsuoka, I., Kumagai, M. and Kurihara, K. (1997) ‘Differential and Coordinated Regulation of Expression of Norepinephrine Transporter in Catecholaminergic Cells in Culture’, Brain Research, 776(1–2), pp. 181–188. doi: 10.1016/S0006-8993(97)01016-0. Nozawa, T. et al. (1998) ‘Dual-Tracer Assessment of Coupling Between Cardiac Sympathetic Neuronal Function and Downregulation of g-Receptors During Development of Hypertensive Heart Failure of Rats’. Pardini, B. J., Lund, D. D. and Schmid, P. G. (1989) ‘Organization of The Sympathetic Postganglionic Innervation of The Rat Heart’, 28, pp. 193–201. Pacholczyk, Tadeusz. Blakely, R. D., Amara, S. G., (1991). 'Expression Cloning of A Cocaine and Antidepressant-Sensitive Human Noradrenaline Transporter'. Scientific, E. et al. (1990) ‘Innervation Patterns of The Middle Cervical- Stellate Ganglion Complex in The Rat’, 117, pp. 300–306. Stone, H. L. et al. (1976) ‘Experimental and Laboratory Reports’, 92(5), pp. 589–599.