Tugas Bioteknologi Pertanian.docx

Tugas Bioteknologi Pertanian

Regenerasi Efektif Embrio Somatik Kakao Dalam Media DKW Dilengkapi Kinetin dan Penilaian Variasi Somaklonal Menggunakan Penanda SSR

Oleh : Ni Kadek Emi Sintha Dewi NIM : 1706541104

PROGRAM STUDI AGROEKOTEKNOLOGI FAKULTAS PERTANIAN UNIVERSITAS UDAYANA 2019

BAB I PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang Kakao (Theobroma cacao L.) adalah satu-satunya tanaman yang banyak digunakan untuk memproduksi cokelat. Permintaan dunia terhadap kakao terus meningkat karena meningkatnya pertumbuhan ekonomi dan kesadaran masyarakat tentang manfaat kesehatan dari makan cokelat. Produk kakao mengandung fenol, flavonoid dan aktivitas antioksidannya lebih tinggi daripada teh hitam, teh hijau atau anggur merah (Subhashini et al., 2010). Meskipun permintaan kakao global telah meningkat secara signifikan, namun tidak produksinya tidak meningkat dan ada defisit pasokan kakao dunia dalam beberapa tahun terakhir (International Cocoa Organization, 2014). Perubahan iklim global, serangan hama dan penyakit dan penurunan produktivitas akibat penuaan telah menyebabkan ketidakstabilan produksi kakao dunia. Produksi kakao yang stabil penting bagi banyak negara penghasil kakao untuk menjaga stabilitas ekspor dan untuk memastikan kesinambungan pasokan bahan baku industri ke industri cokelat. Kakao memiliki peran ekonomi penting sebagai sumber devisa di Indonesia. Namun demikian, sejumlah kendala dalam produksi kakao di Indonesia, seperti: hasil rendah, serangan hama dan penyakit, kualitas biji rendah dan dalam pengembangan industri kakao hilir. Produktivitas rata-rata kakao baru-baru ini di Indonesia mencapai 837 kg / ha / tahun (Kementerian Pertanian Indonesia, 2014), yang jauh lebih rendah dari rata-rata potensi hasil biji kakao yang diperkirakan 2.000 kg ha-1 tahun-1. Secara umum, biji atau bibit cangkokan digunakan sebagai bahan penanaman kakao. Karena kakao secara alami diserbuki silang, bahan penanaman kakao dari biji biasanya menunjukkan latar belakang genetik yang sangat heterogenBahan-bahan penanaman kakao diperbanyak secara klonal melalui okulasi menghasilkan laju perbanyakan yang rendah dan banyak pertumbuhan seperti semak yang tidak diinginkan. Pemuliaan kakao biasanya memakan waktu lama karena siklus hidup yang panjang dan latar belakang genetik yang terbatas (Brown et al., 2007). Memanfaatkan teknologi kultur jaringan tanaman dan biologi molekuler diharapkan dapat mempercepat kendala dalam mencapai program pemuliaan kakao. Teknik in vitro membantu pembibitan kakao dengan menghasilkan berbagai variasi genetik dalam waktu singkat dan dalam

ruang kecil karena dilakukan pada tingkat sel. Transformasi genetik juga membutuhkan teknologi kultur jaringan untuk meregenerasi tanaman transgenik. Karena alasan itu, ketersediaan sistem regenerasi kakao in vitro yang efisien sangat penting. Embriogenesis somatik adalah metode in vitro yang efisien untuk meregenerasi plantlet karena memiliki laju multiplikasi yang tinggi. Metode regenerasi kakao melalui genesis embrio somatik telah dikembangkan menggunakan thidiazuron (TDZ) (Ajijah et al., 2014). Namun keberhasilan pembentukan embrio somatik kakao masih rendah (25%) dan terbatas pada klon tertentu (Sca 6). Meskipun TDZ telah dilaporkan efektif untuk menginduksi embriogenesis somatik kakao (Li et al., 1998), harganya terlalu mahal untuk sebagian besar laboratorium di negara berkembang. Oleh karena itu pengembangan metode alternatif regenerasi embrio somatik kakao menggunakan regulator pertumbuhan tanaman (Plant Growth Regulator, PGR) yang lebih murah diperlukan. Metode pengembangan embriogenesis somatik dapat digunakan untuk melakukan perbanyakan klon-klon kakao yang diinginkan, membantu pemuliaan kakao in vitro, atau transformasi genetik kakao.

1.2 Tujuan Tujuan dilakukannya penelitian ini adalah : 1.2.1 Mengembangkan sistem regenerasi in vitro kakao melalui embriogenesis somatik menggunakan medium DKW yang dilengkapi dengan Kinetin dan 2,4D. 1.2.2 Memperkirakan frekuensi variasi somaklonal di antara planlet yang diregenerasi dari embrio somatik kakao menggunakan penanda SSR.

BAB II METODELOGI PENELITIAN 2.1 Tempat Penelitian Percobaan dilakukan di Laboratorium Kultur Jaringan, Badan Penelitian dan Pengembangan Pertanian Indonesia (Badan Litbang Pertanian) dan analisis molekuler dilakukan di Laboratorium Biologi Molekuler Pusat Penelitian dan Pengembangan Bioteknologi Pertanian dan Sumber Daya Genetik, Bogor.

2.2 Bahan Kuncup bunga kakao tertutup berumur sekitar 3 minggu yang dikumpulkan dari Jampang-Sukabumi, Jawa Barat.

2.3 Prosedur Penelitian 

Kuncup bunga disterilkan di permukaan selama 10 menit dengan larutan natrium hipoklorit 5%, kemudian dibilas dengan air suling steril masing-masing selama 10, 5 dan 5 menit.



Stamenoid dan kelopak basal dibedah menggunakan pisau bedah steril.



Eksplan dikultur pada medium inisiasi kalus (CI) selama 14 hari, dan kemudian dipindahkan selama 14 hari dalam medium pertumbuhan kalus sekunder yang dimodifikasi (SCG).



Medium CI terdiri dari garam dasar DKW yang dilengkapi dengan 9 μM 2,4-D dan 0,58, 1,16 atau 2,32 μM kinetin (kin). Rasio molar dari kinetik: 2,4-D tersebut adalah 1,0: 15,5, 1,0: 7,8 atau 1.0: 3.9. Media SCG yang dimodifikasi terdiri dari garam basal WPM yang dilengkapi dengan 9 μM 2,4-D dan 1,16 atau 2,32 μM kin. Rasio kinetik: 2,4-D molar tersebut adalah 1,0: 7,8 atau 1,0: 3,9. Rasio kin: 2,4-D 1,0: 7,8 dengan 2 kali periode kultur standar (2 X 14 h) dalam media SCG juga dievaluasi.



Kalus ditransfer ke media pengembangan embrio (ED) dan kalus disubkultur setiap 2 minggu ke dalam media yang sama sampai embrio kotri matang terbentuk. Media ED terdiri dari garam basal DKW (ED1), DKW + campuran asam amino (AA) (ED2), DKW + AA + 0,185 μM adenin (ED3), DKW + 0,1%

(b / b) arang aktif (ED4) ) atau garam basalt WPM + AA + 0,185 μM adenin (ED5). AA terdiri dari L-arginin (0,435 mg L-1), L-glisin (0,187 mg L-1), Lleusin (0,328 mgL-1), L-lisin (0,456 mg L-1) dan triptofan (0,510 mg L-1). 

Sembilan genotipe kakao mewakili kelompok genetik Forastero (Sca 6, Pa 300), Trinitario (UIT1, ICS13, GC7, DR2, ICCRI2) dan dua genotipe dari kelompok genetik yang tidak diketahui (Cimanggu 1 dan Cimanggu 2) diuji untuk respon embriogenesis somatik mereka menggunakan berbagai kin: 2,4-D rasio molar 1,0: 3,9 dalam medium CI dan 1,0: 7,8 dalam medium SCG.



Kalus embriogenik kemudian dipindahkan ke media ED1 untuk pembentukan dan pengembangan embrio somatik.

2.4 Tenik Pengumpulan Data Data dikumpulkan dari setidaknya 3 ulangan dengan sepuluh eksplan per unit eksperimen. Efek perawatan ditentukan oleh analisis varian (ANOVA) menggunakan perangkat lunak statistik SPSS 20.

2.5 Analisis SSR DNA diekstraksi dari daun segar dari 19 planlet dan tanaman induk Cimanggu 2 mengikuti protokol yang dimodifikasi untuk ekstraksi DNA kakao. Polimorfisme DNA terdeteksi oleh Polymerase Chain Reaction (PCR) menggunakan 20 penanda SSR. Reaksi PCR dilakukan dalam volume 12,5 μl, terdiri dari 2 μl sampel DNA sebagai templat, 6,25 μl campuran PCR, 2,75 μl MQ air dan 0,75 μl masing-masing primer maju dan mundur. Amplifikasi DNA dilakukan dalam thermocycler DNA, menggunakan langkah-langkah berikut: 

Langkah pra-denaturasi 3 menit pada 95oC



35 siklus denaturasi selama 15 detik pada 95oC



anil selama 15 detik pada 51 - 62oC tergantung pada lokus mikrosatelit dan ekstensi pada 72oC selama 5 detik



perpanjangan akhir di 72oC selama 10 menit. Produk

PCR

dipisahkan

pada

gel

poliakrilamida

8%

non-denaturasi

menggunakan elektroforesis vertikal pada 80 volt selama 150 menit. Gel didokumentasikan menggunakan sistem gel

Chemidoc setelah pewarnaan

menggunakan etidium bromida. Planlet yang menunjukkan profil alel SSR berbeda dari tanam tanaman induk ("tipe off") dievaluasi ulang untuk memastikan bahwa itu berupa varian.

BAB III HASIL DAN PEMBAHASAN

Pembentukan kalus terjadi 5-7 hari setelah pembiakan dan didahului oleh pembengkakan eksplan. Dua minggu setelah pembiakan, semua eksplan yang responsif telah membentuk kalus, yang diamati yaitu kalus kompak putih non-embriogenik dan kalus nodular kekuningan embriogenik yang membentuk embrio somatic. Tingkat kinetik atau rasio kinetik: 2,4-D dalam media CI dan interaksinya dengan jenis eksplan tidak secara signifikan mempengaruhi kalus dan pembentukan kalus

nodular

sedangkan

jenis

eksplan

mempengaruhi.

Persentase

rata-rata

pembentukan kalus dari stamenoid secara signifikan lebih tinggi dibandingkan dengan yang dari kelopak basal. Meskipun secara statistik tidak berbeda nyata, peningkatan kadar kinetik atau kinetik: 2,4-D dalam media CI meningkatkan pembentukan kalus dan kalus nodular (Tabel 1).

Tabel 1. Pengaruh rasio kinetik: 2,4-D dalam media CI dan jenis eksplan dari klon Sca 6 pada persentase eksplan pembentuk kalus dan pembentukan kalus nodular Factors

Callusing

Evaluated

explants (%)

Nodular callus (%)*

Kin:2,4-D 1: 15.5

85.00

± 6.19

80,23

± 8.34

1:7.8

87.46

± 4.40

92,63

± 4.66

1:3.9

90.00

± 3.65

94.58

± 3.56

P-val

0.370

0.131

Explants Basal petals

79.42

± 2.91

83.85

± 3.94

Stamenoids

95.56

± 2.42

94.44

± 5.56

P-val

0.001**

0.139

Keterangan: *) Data diamati 14 hari setelah eksplan dikultur pada media SCG dengan rasio kin: 2,4-D 1,0: 7,8. Nilai mewakili rata-rata ± SE dari setidaknya tiga ulangan. ** Secara signifikan berbeda menurut uji t (P <0,05).

Level kin atau rasio kin: 2,4-D dalam medium, jenis eksplan dan efek interaksi antara dua faktor dalam medium CI secara signifikan mempengaruhi pembentukan

embrio somatik. Dua jenis eksplan merespons secara berbeda terhadap rasio kin: 2,4Dimana eksplan stamenoid tampaknya lebih responsif terhadap rasio kin: 2,4-D yang lebih tinggi daripada kelopak basal. Tidak ada embrio somatik yang terbentuk dari eksplan stamenoid ketika rasio kin: 2,4-D 1,0: 15,5 digunakan dalam medium. Di sisi lain, embrio somatik dibentuk dari kelopak basal pada rasio kin: 2,4-D. Ketika rasio kin: 2,4-D ditingkatkan dari 1,0: 15,5 menjadi 1,0: 3,9, persentase rata-rata eksplan yang membentuk embrio somatik dari stamenoid dan kelopak basal dan jumlah embrio per eksplan stamenoid meningkat 76, 2,7 dan 10 kali lipat. Namun, meningkatkan rasio kin: 2,4-D tidak secara signifikan meningkatkan jumlah rata-rata embrio per eksplan basal. Respons yang berbeda dari kedua jenis eksplan tersebut kemungkinan disebabkan oleh perbedaan kadar hormon endogen. Kadar hormon endogen dianggap sebagai faktor utama dalam menentukan respon seluler (Feher et al., 2003) dan faktor penting dalam mempengaruhi potensi embriogenik eksplan (Jimenez, 2005). Hasil dari penelitian ini menunjukkan penambahan rasio kin: 2,4-D 1,0: 3,9 dalam media CI adalah yang terbaik untuk menginduksi embrio somatik baik dari eksplan kelopak atau stamenoid. Rasio kinetik: 2,4-D rendah (1,0: 7,8) dalam medium SCG diperlukan untuk meningkatkan pembentukan embrio somatik kakao. Jumlah rata-rata eksplan yang membentuk embrio somatik dan jumlah embrio somatik per eksplan responsif menurun ketika tingkat kin atau rasio kin: 2,4-D dalam medium SCG meningkat dari 1,0: 7,8 ke 1,0: 3,9 dan periode kultur diperpanjang menjadi 2 X 14 hari. Tidak ada efek interaksi antara kerabat: rasio 2,4-D dalam media SCG dan jenis eksplan. Kin rasio rendah: 2,4-D 1,0: 7,8 selama 14 hari dalam medium SCG sudah cukup untuk menginduksi embrio somatik baik dari eksplan kelopak atau stamenoid. Penelitian ini menemukan bahwa kinetin dalam kombinasi dengan 2,4-D juga efektif untuk menginduksi embriogenesis somatik kakao menggunakan protokol berbasis media DKW. Media garam basal DKW dilaporkan lebih sesuai untuk embriogenesis somatik kakao daripada media garam basal MS (Li et al., 1998) karena mengandung kadar kalsium, sulfur dan magnesium yang lebih tinggi. Kinetin adalah jenis turunan sitokinin aminopurin (adenin). Bersama dengan auksin, sitokinin memiliki peran yang sangat penting dalam embriogenesis somatik

tanaman. Hasil menunjukkan rasio molar kinetin ke 2,4-D juga memiliki efek signifikan pada embriogenesis somatik kakao. Rasio tinggi kin: auksin pada 1,0: 3,9 pada media CI dan rasio rendah kin: auksin 1,0: 7,8 pada media SCG memberikan hasil yang lebih baik untuk pembentukan embrio somatik kakao daripada rasio lainnya. Kalus nodular embriogenik diinduksi dari kelopak basal klon Sca 6-1 pada media CI yang dilengkapi dengan rasio kin: 2,4-D pada 1,0: 3,9 dan media SCG ditambah dengan rasio kin: 2,4D pada 1,0: 7,8 dikultur pada beberapa komposisi media pengembangan embrio. Hasil penelitian ini menunjukkan komposisi medium berpengaruh signifikan terhadap diferensiasi sel embriogenik untuk membentuk embrio somatik. Pemilihan komposisi media basal yang tepat sangat penting dalam fase ini. Persentase rata-rata embrio pembentuk eksplan dan jumlah embrio somatik per eksplan lebih tinggi pada media DKW saja (ED1) dibandingkan dengan pada media DKW yang diperkaya dengan asam amino, adenin atau arang aktif (Tabel 2). Persentase rata-rata embrio pembentuk eksplan dan jumlah embrio per eksplan secara signifikan menurun ketika media WPM digunakan, dengan atau tanpa pengayaan dengan asam amino dan adenin (ED5) (Tabel 2). Media WPM memiliki konten yang lebih rendah dari semua makro dan mikro dari pada media DKW (da Costa Pinto, 2007).

Tabel 2. Pengaruh komposisi medium pada pembentukan embrio somatik dan jumlah embrio per eksplan Sca 6-1 klon ED medium

Embryo forming explants (%)

Number of embryos per explants

DKW

23.99

± 5.25a

1.36

± 1.09a

DKW + amino acids

21.25

± 9.73a

1.01

± 0.41a

DKW + amino acids + 0.185 µM adenine

21.94

± 6.44a

0.74

± 0.20a

DKW + 0.1% activated charcoal

10.13

± 4.13ab

0.41

± 0.19ab

WPM + amino acids + 0.185 µM adenine

1.67

± 1.67b

0.03

± 0.03b

P-val

0.010

0.023

Keterangan: Nilai mewakili rata-rata ± kesalahan standar (SE) setidaknya tiga ulangan. Untuk setiap variabel, berarti dengan huruf yang berbeda secara signifikan berbeda menurut DMRT (P <0,05) Embrio somatik hanya terbentuk dari permukaan tipe kalus nodular yang berubah kecoklatan setelah disubkultur pada medium tanpa pengatur tumbuh. Berdasarkan pengamatan mikroskop, sekitar 200 μm pro-embrio transparan mulai

berkembang setelah 5 minggu kultur, atau satu minggu setelah kalus nodular disubkultur pada media ED. Embrio Globular berkembang lebih jauh ke bentuk jantung, torpedo, dan kotiledon. Embrio somatik muda berwarna kekuningan atau putih dan berubah menjadi warna putih susu (kadang-kadang dengan kotiledon merah muda) setelah mencapai pematangan embrio somatik. Dalam media kultur, embrio berkembang secara tidak sinkron dan dalam vial kultur yang sama berisi berbagai tahap perkembangan embrio somatik.

Respon Genotipe Sembilan genotipe kakao yang diuji menunjukkan kemampuan yang berbeda untuk menginduksi embriogenesis somatik dan respons mereka bergantung pada tipe eksplan. Klon kakao GC 7, ICCRI 2 dan Cimanggu 2 menunjukkan respons yang lebih tinggi dari induksi embrio-genesis somatik ketika kelopak basal digunakan sebagai eksplan daripada stamenoid. Sebaliknya, eksplan stamenoid dari klon kakao Sca 6, ICS 13 dan DR 2 menunjukkan respons yang lebih tinggi dari embriogenesis somatik dibandingkan dengan kelopak basal. Hasil tersebut menunjukkan bahwa pemilihan eksplan yang sesuai diperlukan untuk mendapatkan embrio somatik dari eksplan yang berasal dari genotipe kakao yang berbeda. Studi ini juga menunjukkan bahwa Sca 6 adalah genotipe yang paling responsif untuk regenerasi embrio somatik di antara sembilan genotipe kakao yang diuji. Embriogenesis somatik adalah proses yang sangat ditentukan oleh faktor genetik. Baik kelopak dan stamenoid dapat digunakan sebagai eksplan untuk menginduksi embrio-genesis somatik kakao. Namun, tanggapan kedua eksplan terhadap media induksi embrio somatik umumnya tergantung pada genotipe dan tipe eksplan.

Tabel 3. Perbedaan respon embriogenesis somatik dari kelopak dan stamenoid dari sembilan genotipe kakao Genotypes

Genetic

Explants producing embryos

Group

No. of embryos per explants

(%) Basal petals

Stamenoids

Basal petals

Stamenoids

Sca 6

Forastero

20.0

± 2.9abB 66.7

± 6.7aA

3.0 ± 0.6aB

24.0 ± 2.4aA

Pa 300

Forastero

22.0

± 11.3abA 13.1

± 2.3bcA

4.3 ± 2.5aB

15.6 ± 2.1bA

UIT 1

Trinitario

18.0

± 3.4abA 26.7

± 13.7bA

3.2 ± 1.0aA

ICS 13

Trinitario

6.7

± 3.3bA

± 4.0bA

2.7 ± 2.2aB

22.9

1.0 ± 0.5cA 11.5 ± 4.4bA

DR 2

Trinitario

8.3

± 5.0abA 24.2

± 3.4bA

0.7 ± 0.5aA

4.3 ± 1.50cA

GC 7

Trinitario

5.6

± 4.4bA

0.0

± 0.0cA

2.7 ± 2.1aA

0.0 ± 0.0cA

ICCRI 2

Trinitario

26.0

± 3.9aA

0.0

± 0.0cB

2.7 ± 0.7aA

0.0 ± 0.0cA

Cimanggu 1

Unknown

15.0

± 7.6abA 23.3

± 5.1bA

2.0 ± 1.0aA

1.7 ± 0.7cA

Cimanggu 2

Unknown

19.2

± 1.8abA 0.0

± 0.0cB

2.9 ± 1.0aA

0.0 ± 0.0cA

Keterangan: Nilai tersebut mewakili rata-rata ± SE dari setidaknya tiga ulangan. Untuk setiap variabel, berarti dalam kolom dengan huruf kecil yang berbeda dan yang berturutturut dengan huruf kapital berbeda secara signifikan berbeda menurut DMRT (P <0,05).

Perkecambahan dan Konversi Embrio somatik dewasa pada tahap kotiledon dipindahkan ke media perkecambahan yang terdiri dari garam basal DKW dan asam amino. Embrio somatik kakao yang berkecambah dipelihara di bawah 25-26oC dan periode foto 16-jam (cahaya) di bawah lampu fluoresen tubular putih dingin (40W, 220V, Philips) sekitar 1800 lux dan sub dikultur ke media yang sama setiap bulan sampai mereka bentuk daun. Prosedur ini menghasilkan perkecambahan embrio somatik 50% dan regenerasi plantlet. Rendahnya konversi embrio somatik menjadi planlet masih menjadi masalah dalam embriogenesis somatik kakao. Dalam penelitian ini laju perkecambahan embrio somatik mencapai 50%. Beberapa faktor dikaitkan dengan keberhasilan perkecambahan embrio somatik dan konversi plantlet, seperti: kualitas embrio somatik dan sumber karbon dalam medium perkecambahan. Hasil penelitian juga menunjukkan komposisi dan konsentrasi medium basal juga mempengaruhi tingkat perkecambahan embrio somatik.

Pengerasan Plantlet dengan minimal tiga daun dibilas dengan air keran untuk menghilangkan media residu dari planlet dan direndam dalam larutan fungisida 2% selama 15 menit. Plantlet ditransplantasikan ke pot plastik yang berisi campuran tanah, pasir dan cocopeat yang disterilkan (1: 1: 1 v / v). Pot plastik ditutupi dengan pot plastik transparan lainnya dan dipelihara di ruang kultur untuk aklimatisasi di bawah lampu neon putih dingin berbentuk tabung pada 25-26 oC. Setelah 1 bulan, planlet teraklimatisasi dipindahkan ke suhu kamar (27-29 oC) dan gelas plastik secara bertahap dihapus. Satu bulan kemudian, planlet ditransplantasikan ke pot plastik yang lebih besar

berisi campuran tanah dan pupuk kandang yang disterilkan (2: 1 v / v). Pengerasan planlet dengan tingkat kelangsungan hidup 65,3% (64/98) ketika dipertahankan pada suhu 28-30 oC diperoleh dengan menggunakan prosedur tersebut.

Penilaian Variasi Somaklonal Amplifikasi PCR positif di 19 dari 20 lokus SSR diamati dengan menggunakan tanaman induk dan planlet yang diregenerasi dari embrio somatik Cimanggu 2. Total 646 alel dihasilkan dari 19 planlet yang diregenerasi dari embrio somatik kakao. Tiga planlet yang diregenerasi (3/19 - 15,8%) menunjukkan pola alel SSR yang berbeda dari tanaman induk. Empat polimorfisme alel ditemukan pada 3 planlet tersebut, mengindikasikan ada planlet yang membawa lebih dari satu mutasi. Dua jenis polimorfisme diamati, seperti kehilangan alel dan pembentukan alel baru. Frekuensi mutasi yang diamati berdasarkan analisis penanda SSR adalah 6,2 X 10-3 (4 dari 646 peristiwa). Analisis cluster di antara planlet yang diregenerasi berdasarkan 19 lokus SSR menghasilkan tingkat kesamaan 0,97 - 100%. Frekuensi yang diamati dari variasi somaklonal dalam penelitian ini lebih rendah dari yang dilaporkan oleh penelitian sebelumnya. Lopez et al. (2010) melaporkan bahwa frekuensi variasi somaklonal dalam embriogenesis somatik primer kakao berkisar antara 35-50%, tergantung pada genotipe. Frekuensi perbedaan variasi somaklonal mungkin disebabkan oleh perbedaan genotipe atau PGR yang digunakan untuk menginduksi embriogenesis somatik kakao. Lopez et al., (2010) menggunakan TDZ untuk menginduksi embrio somatik kakao sementara dalam penelitian ini digunakan kinetin. Menurut Bidabadi et al. (2010) dan Jose et al., (2012), jenis dan konsentrasi PGR mungkin telah menyebabkan tingkat variasi somaklonal yang berbeda. Plantlet kakao regenerasi membawa frekuensi tinggi kehilangan alel dan banyak mutasi yang ditemukan dalam penelitian ini mendukung temuan sebelumnya yang dilaporkan oleh Lopez et al. (2010). Kultur jaringan yang diinduksi mutasi pada tanaman dikenal sebagai variasi somaklonal. Meskipun variasi somaklonal merupakan masalah potensial dalam perbanyakan pasangan, ini telah digunakan untuk meregenerasi variasi genetik di sejumlah tanaman (Yusnita et al., 2010; Yuliasti dan Sudarsono, 2011; Widoretno et al., 2003c; Purwati et al. ., 2007).

Regenerasi plantlet kakao melalui embriogenesis somatik dapat digunakan sebagai metode untuk perbanyakan klon kakao. Dalam hal demikian, perlu untuk mengurangi frekuensi variasi somaklonal hingga di bawah 10%. Di sisi lain, dapat digunakan untuk mendukung pemuliaan in vitro. Dalam kasus selanjutnya, persentase variasi somaklonal yang lebih tinggi lebih diinginkan. Di berbagai tanaman, variasi somaklonal di antara embrio somatik telah digunakan untuk mengidentifikasi toleran kekeringan (Rahayu dan Sudarsono, 2015), kuantitatif dan kualitatif (Widoretno et al., 2003b) dan varian resistensi penyakit (Yusnita et al., 2005).

BAB IV PENUTUP 4.1 Kesimpulan Media DKW ditambah dengan Kinetin dalam kombinasi dan 2,4-D secara efektif menginduksi embriogenesis somatik kakao. Kinetin ke 2,4-D pada rasio 1,0: 3,9 molar dalam medium induksi kalus dan 1,0: 7,8 pada medium pertumbuhan kalus sekunder menunjukkan hasil terbaik untuk menginduksi embrio somatik dari eksplan kakao. Respons genotipe kakao sangat tergantung pada eksplan. Hasil penelitian ini memberikan metode alternatif untuk menginduksi embriogenesis somatik primer tingkat tinggi (5,6-66,7%) menggunakan 2,4-D dan Kinetin dengan frekuensi sedang variasi somaklonal (16%).

LAMPIRAN

Gambar 1. Pengaruh kerabat: 2,4-D rasio dalam medium CI pada induksi embriogenesis somatik dari kelopak basal dan eksplan stamenoid dari klon kakao Sca 6. Huruf yang sama untuk setiap jenis eksplan menunjukkan respon tidak berbeda secara signifikan menurut DMRT (P <0,05). Balok menunjukkan kesalahan standar (SE) setidaknya tiga ulangan: stamenoid,: eksplan kelopak dasar.

Gambar 2. Pengaruh kerabat: 2,4-D rasio dan periode kultur dalam medium SCG pada embriogenesis somatik dari stamenoid dan kelopak basal klon Sca 6. Huruf yang sama

untuk setiap jenis eksplan tidak berbeda secara signifikan menurut DMRT (P <0,05). Balok menunjukkan kesalahan standar (SE) setidaknya tiga ulangan. : stamenoid,: kelopak basal.

Gambar 3. Pembentukan embrio somatik primer klon Sca 6 yang diinduksi menggunakan kinetin. (A) Stamenoid (st) dan (B) kelopak dasar (bp) dibedah dari kuncup bunga kakao. (C) Pembentukan kalus nodular embriogenik (nc) dari kelopak basal, 4 minggu setelah kultur. (D) Pembentukan pro- embrio (ditunjukkan oleh panah hitam) dari permukaan kalus nodular, 5 minggu setelah kultur. (E) Eksplan stamenoid ditutupi dengan embrio somatik pada berbagai tahap perkembangan, 9 minggu setelah kultur dan (F) Berbagai tahap embrio kotiledon, 12 minggu setelah kultur.

Gambar 4. Perkecambahan embrio somatik dan konversi embrio somatik menjadi planlet. Perkecambahan embrio somatik setelah 1 bulan (A), 1,5 bulan (B) dan 2 bulan (C) pada media perkecambahan. Planlet diregenerasi dari embrio somatik dengan akar tunggang dan tiga daun, 6 bulan setelah kultur (D, E); Pengerasan planlet dan bibit kakao dalam tanah (F, G) berasal dari embrio somatik

Gambar 5. Contoh produk amplifikasi PCR menggunakan templat DNA planlet yang diregenerasi dari embrio somatik primer (1-19) dan pasangan primer mTcCIR 213 SSR. Angka tersebut menunjukkan hilangnya alel pada plantlet no. 15. M: 100 bp Tangga DNA, MP: tanaman induk (Cimanggu 2), 1-19: sampel planlet diregenerasi dari embrio somatik primer Cimanggu 2.

Gambar 6. Hasil analisis klaster di antara planlet yang diregenerasi dari embrio somatik primer Cimanggu 2 berdasarkan 19 marka SSR. Kami menggunakan UPGMA menggunakan NTSYSpc versi 2.02 untuk melakukan analisis kluster. R1-R19 adalah planlet Cimanggu 2 yang diregenerasi dari embrio somatik dan MP adalah tanaman induk (Cimanggu 2)

DAFTAR PUSTAKA Ajijah, Nur. 2016. Effective Cacao Somatic Embryo Regeneration On Kinetin Supplemented DKW Medium And Somaclonal Variation Assessment Using SSRs

Markers.

Agrivita

Volume

38

No.

https://media.neliti.com/media/publications/56304-EN-effective-cacao somatic-embryo-regenerat.pdf Diakses pada 1 maret 2019.

1.