Translate Jurnal Mik.docx

Dalam beberapa tahun terakhir, ada minat yang semakin besar dalam meneliti dan mengembangkan antimikroba baru agen dari berbagai sumber untuk memerangi resistensi mikroba. Karena itu, perhatian yang lebih besar telah dibayarkan untuk penyaringan aktivitas antimikroba dan metode evaluasi. Beberapa bioassay seperti difusi-cakram, yah difusi dan kaldu atau pengenceran agar dikenal dan umum digunakan, tetapi yang lain seperti aliran cyto florometrics dan metode bioluminescent tidak banyak digunakan karena mereka membutuhkan peralatan khusus dan evaluasi lebih lanjut untuk reproduktifitas dan standardisasi, bahkan jika mereka dapat memberikan hasil yang cepat efek agen antimikroba dan pemahaman yang lebih baik tentang dampaknya terhadap kelangsungan hidup dan Kerusakan sel dipengaruhi oleh mikroorganisme yang diuji. Dalam artikel ulasan ini, daftar lengkap in vitro metode pengujian kerentanan antimikroba dan informasi terperinci tentang kelebihan dan keterbatasannya dilaporkan.

ulasan ini, berfokus pada penggunaan metode tes antimikroba untuk penyelidikan in vitro dari ekstrak alami dan obat murni sebagai agen antimikroba potensial. Setelah revolusi di "era emas", ketika hampir semua kelompok antibiotik penting (tetrasiklin, sefalosporin, aminoglikosida dan makrolida) ditemukan dan masalah utama dari kemoterapi diselesaikan pada 1960-an, sejarah berulang kembali saat ini dan senyawa yang menarik ini dalam bahaya kehilangan kemanjurannya karena peningkatan resistensi mikroba

[1]. Saat ini, dampaknya cukup besar dengan kegagalan pengobatan terkait dengan bakteri yang resistan terhadap beberapa obat dan telah menjadi kepedulian global terhadap kesehatan masyarakat [2,3].

Untuk alasan ini, penemuan antibiotik baru adalah tujuan penting. Produk alami masih merupakan salah satu sumber utama molekul obat baru hari ini yang berasal dari bakteri prokariotik, mikroorganisme eukariotik, tanaman dan berbagai organisme hewan. Mikroba dan produk tanaman menempati bagian utama dari senyawa antimikroba yang ditemukan sampai sekarang [4].

Tumbuhan dan sumber alami lainnya dapat menyediakan sejumlah besar senyawa yang kompleks dan beragam secara struktural. Baru-baru ini, banyak peneliti telah ber fokus pada investigasi tanaman dan ekstrak mikroba , minyak esensial, metabolit sekunder murni dan disintesis molekul baru sebagai agen antimikroba potensial [5-7].

Berbagai metode laboratorium dapat digunakan untuk mengevaluasi atau Menskrining aktivitas antimikroba secara in vitro dari ekstrak atau murni senyawa. Metode dasar yang paling dikenal adalah difusi-cakram dan metode kaldu atau agar-agar. Metode lainnya adalah digunakan terutama untuk pengujian antijamur, seperti teknik makanan beracun . Untuk mempelajari lebih lanjut efek antimikroba dari suatu agen di Direkomendasikan untuk menguji kedalaman, waktu-matikan dan metode cyto florometrik,

yang memberikan informasi tentang efek sifat penghambatan (bakterisida atau bakteriostatik) (tergantung waktu atau tergantung konsentrasi) dan kerusakan sel yang mempengaruhi uji mikroorganisme. Karena daya tarik baru dengan sifat produk antimikroba baru seperti memerangi bakteri yang resistan terhadap beberapa obat, hal itu Penting untuk mengembangkan pemahaman yang lebih baik tentang arus metode yang tersedia untuk skrining dan / atau mengukur antimikroba efek dari ekstrak atau senyawa murni untuk aplikasinya dalam kesehatan manusia, pertanian dan lingkungan. Karenanya, dalam Ulasan ini, teknik untuk mengevaluasi antimikroba in vitro kegiatan dibahas secara rinci.

2. Metode difusi 2.1. Agar-difusi metode disk Pengujian difusi agar disk adalah metode yang dikembangkan pada tahun 1940 Dan resmi digunakan di banyak laboratorium mikrobiologi klinis untuk uji kepekaan antimikroba secara rutin. Saat ini, banyak diterima dan disetujui sebagai standar yang diterbitkan oleh Klinik dan Laboratorium Lembaga Standar (CLSI) untuk pengujian bakteri dan ragi []. Meskipun tidak semua bakteri dapat diuji secara akurat dengan metode ini, standardisasi telah dibuat untuk menguji patogen bakteri nakal seperti streptokokus, Haemophilus in fluenzae, Haemophilus parain fluenzae, Neisseria gonorrhoeae dan

Neisseria meningitidis, menggunakan media kultur spesifik, berbagai kondisi inkubasi dan kriteria interpretatif untuk zona hambatan [9]. Dalam prosedur ini agar piring diinokulasi dengan standar inokulum dari mikroorganisme uji. Lalu, saring cakram kertas dengan diameter sekitar 6 mm, mengandung senyawa uji pada konsentrasi yang diinginkan, ditempatkan pada permukaan agar. Cawan Petri diinkubasi dalam kondisi yang sesuai. Umumnya, agen antimikroba berdifusi ke dalam agar dan menghambat perkecambahan dan pertumbuhan mikroorganisme uji dan kemudian diameter zona pertumbuhan penghambatan diukur (Gbr. 1A). tabel 1 menunjukkan media pertumbuhan, suhu, periode inkubasi dan ukuran inokulum yang dibutuhkan oleh standar CLSI. Antibiogram memberikan hasil kualitatif dengan mengkategorikan bakteri sebagai rentan, menengah atau resisten [11]. Karena itu, ini adalah alat mengetik berdasarkan fenotip resistensi mikroba Ketegangan diuji, hasilnya juga memandu dokter dalam yang sesuai pemilihan perawatan empiris awal, dan antibiotik yang digunakan untuk pasien individu dalam situasi tertentu [12]. Namun penghambatan pertumbuhan bakteri tidak berarti kematian bakteri, metode ini tidak dapat membedakan efek bakterisida dan bakteriostatik. Selain itu, metode difusi agar disk tidak sesuai Untuk menentukan konsentrasi hambat minimum (MIC), sebagaimana adanya mustahil untuk mengukur jumlah agen antimikroba menyebar ke dalam media agar. Namun demikian, perkiraan MIC

dapat dihitung untuk beberapa mikroorganisme dan antibiotik oleh membandingkan zona hambatan dengan algoritma yang tersimpan [13]. Namun demikian, uji difusi cakram menawarkan banyak keunggulan metode lain: kesederhanaan, biaya rendah, kemampuan luar biasa untuk menguji jumlah mikroorganisme dan agen antimikroba, dan kemudahan menafsirkan hasil yang diberikan. Apalagi beberapa penelitian sudah menunjukkan minat besar pada pasien yang menderita bakteri infeksi antibiotik yang didasarkan pada antibiogram dari agen penyebab [14]. Fakta ini disebabkan oleh korelasi yang baik antara data in vitro dan evolusi in vivo [12]. Sebelum standarisasi, metode difusi disk sudah dilakukan yang digunakan untuk menguji posaconazole terhadap jamur berfilamen [15], micafungin melawan Aspergillus [16], dan caspofungin melawan Aspergillus dan Fusarium [17]. Saat ini, antijamur standar pendekatan disk-difusi digunakan untuk menguji filamen non-dermatofit jamur [18]. Media kultur, ukuran inokulum dan inkubasi kondisi disebutkan dalam Tabel 1 [19]. Keuntungan metode ini yang disebutkan di atas, terutama Kesederhanaan dan biaya rendah, telah berkontribusi pada penggunaan umum untuk skrining antimikroba dari ekstrak tumbuhan, minyak atsiri dan obat-obatan lainnya [20-23].

2.2. Metode gradien antimikroba (Etest) Metode gradien antimikroba menggabungkan prinsip

metode pengenceran dengan metode difusi untuk menentukan nilai MIC. Hal ini didasarkan pada kemungkinan menciptakan gradien konsentrasi agen antimikroba yang diuji dalam media agar. The Etest (BioMérieux) adalah versi komersial dari teknik ini. Dalam prosedur, strip diresapi dengan ins peningkatan gradien konsentrasi agen antimikroba dari satu ujung ke ujung lainnya diendapkan pada permukaan agar, sebelumnya diinokulasi dengan mikroorganisme yang diuji. Metode ini digunakan untuk penentuan antibiotik MIC, antijamur dan antimikobakteri [24]. Nilai MIC ditentukan di persimpangan strip dan elips hambatan pertumbuhan. Saya t sederhana untuk diterapkan; oleh karena itu, secara rutin digunakan untuk memenuhi mands dari dokter. Namun, Etest s strip harganya sekitar $ 2–3 masing-masing.

Oleh karena itu, pendekatan ini menjadi mahal jika banyak obat diuji [11]. Beberapa penelitian sebelumnya telah menunjukkan korelasi yang baik antara nilai MIC ditentukan oleh Etest dan yang diperoleh oleh pengenceran kaldu atau metode pengenceran agar [25-27]. Teknik ini bisa juga dilakukan untuk menyelidiki interaksi antimikroba antara dua obat [28]. Untuk mempelajari efek gabungan dari dua

antibiotik, strip Etest, diresapi dengan antibiotik pertama, adalah ditempatkan pada permukaan pelat agar yang diinokulasi sebelumnya. Setelah satu jam, itu strip dihapus dan diganti dengan yang lain diresapi dengan a antibiotik kedua. Sinergi terdeteksi oleh penurunan MIC kombinasi dengan setidaknya dua pengenceran dibandingkan dengan dari antibiotik yang paling aktif diuji sendiri [29]. Juga untuk hal yang sama tujuan, strip Etest dapat diendapkan pada media agar dalam a formasi silang dengan sudut 90 ° di persimpangan antara sisik pada masing-masing MIC untuk mikroorganisme yang diuji [30]. Kemudian, setelah inkubasi, konsentrasi penghambatan fraksional dex (FICI) dapat dihitung dengan menggunakan rumus berikut: ∑ = () + () FICI FIC A FIC B dimana FIC A () = () () MIC A dalam kombinasi MIC A sendiri dan () = FIC B () () MIC B dalam kombinasi

MIC B sendiri Synergy didefinisikan oleh FICI r0.5 dan antagonisme oleh FICI 44. FICI antara 0,5 dan 1 ditafsirkan sebagai tambahan dan antara 1 dan 4 sebagai ketidakpedulian [31].

2.3. Metode difusi lainnya Metode difusi lebih lanjut digunakan dalam penelitian mikrobiologi laboratorium untuk menyaring ekstrak, fraksi atau zat murni untuk potensi antimikroba mereka atau untuk menyelidiki antagonisme antara mikroorganisme. Di antara metode ini, yang paling umum tercantum di bawah ini. 2.3.1. Agar metode difusi dengan baik Metode difusi agar sumur banyak digunakan untuk mengevaluasi aktivitas timicrobial dari tanaman atau ekstrak mikroba [32,33]. Demikian pula untuk prosedur yang digunakan dalam metode difusi cakram, pelat agar permukaan diinokulasi dengan menyebarkan volume inokulum mikroba di atas seluruh permukaan agar. Lalu, sebuah lubang dengan diameter dari 6 sampai 8 mm ditinju secara aseptik dengan penggerek gabus steril atau ujung, dan volume (20-100 mL) agen antimikroba atau ekstrak solusi pada konsentrasi yang diinginkan dimasukkan ke dalam sumur. Kemudian, Pelat agar diinkubasi dalam kondisi yang sesuai tergantung pada uji mikroorganisme. Agen antimikroba berdifusi dalam media agar dan menghambat pertumbuhan strain mikroba diuji (Gbr. 1B). 2.3.2. Metode difusi agar steker

Metode difusi agar steker sering digunakan untuk menyoroti tagonisme antara mikroorganisme [34,35], dan prosedurnya adalah mirip dengan yang digunakan dalam metode difusi disk. Itu melibatkan membuat kultur agar-agar dari strain yang diinginkan media kultur dengan garis-garis ketat di permukaan piring. Selama mereka pertumbuhan, sel mikroba mengeluarkan molekul yang berdifusi dalam agar medium. Setelah inkubasi, plot-agar atau silinder dipotong secara aseptik dengan penggerek gabus steril dan diendapkan pada permukaan agar piring lain yang sebelumnya diinokulasi oleh mikroorganisme uji. Zat-zat tersebut berdifusi dari colokan ke media agar. Kemudian, aktivitas antimikroba dari molekul disekresikan mikroba adalah terdeteksi oleh munculnya zona hambatan di sekitar agar-agar colokan (Gbr. 1C). 2.3.3. Metode lintas garis Metode cross streak digunakan untuk menyaring mikroorganisme dengan cepat untuk antagonisme [36]. Strain mikroba yang diminati diunggulkan oleh a goresan tunggal di tengah piring agar-agar. Setelah inkubasi periode tergantung pada strain mikroba, piring diunggulkan dengan mikroorganisme diuji dengan streak tunggal tegak lurus terhadap garis tengah. Setelah inkubasi lebih lanjut, interaksi antimikroba dianalisis dengan mengamati ukuran zona hambat. 2.3.4. Metode makanan beracun Metode makanan beracun sebagian besar digunakan untuk mengevaluasi antijamur efek terhadap cetakan [37-39]. Agen antijamur atau ekstraknya adalah dimasukkan ke dalam agar cair pada konsentrasi akhir yang diinginkan

dan tercampur rata. Kemudian, medium dituangkan ke dalam cawan Petri. Setelah pra-inkubasi semalam, inokulasi dapat dilakukan dengan a disc mycelia mulai dari 2 sampai 5 mm, yang disimpan di tengah piring. Setelah inkubasi lebih lanjut dalam kondisi yang sesuai untuk strain jamur yang diuji, diameter pertumbuhan jamur di piring kontrol dan sampel diukur, dan antijamur Efek diperkirakan dengan rumus berikut: () = ((-)) × Aktivitas antijamur% Dc Ds / Dc 100 Di mana Dc adalah diameter pertumbuhan di pelat kontrol dan Ds adalah diameter pertumbuhan di piring yang mengandung antijamur diuji agen. Sporulasi juga dapat dibandingkan dengan kontrol. Secara umum, ketika standardisasi metode yang digunakan gagal, Peneliti harus membawa kontrol positif dengan antimikroba yang dikenal molekul untuk membandingkan hasil yang ditemukan dan menyatakan pendekatan eksperimental yang tepat. 3. Kromatografi lapis tipis (KLT) –bioautografi Pada tahun 1946, Goodall dan Levi [40] menggabungkan kromatografi kertas metode (PC) dengan kontak bioautografi untuk mendeteksi yang berbeda penisilin untuk tekad mereka. Setelah itu, Fischer dan Lautner [41] memperkenalkan TLC di bidang yang sama. Teknik ini menggabungkan TLC dengan metode deteksi biologis dan kimia. Beberapa pekerjaan telah dilakukan pada penyaringan ekstrak organik, terutama ekstrak tumbuhan, untuk aktivitas antibakteri dan antijamur oleh TLCbioautografi [42,43]. Seperti yang ditunjukkan di bawah ini, tiga bioautografis teknik, yaitu difusi agar, bioautografi langsung, dan agaroverlay

uji, telah dijelaskan untuk penyelidikan antimikroba senyawa dengan pendekatan ini. 3.1. Agar difusi Juga dikenal sebagai metode kontak agar, ini adalah metode yang paling sedikit digunakan salah satu tekniknya. Ini melibatkan transfer dengan difusi agen antimikroba dari kromatogram (PC atau TLC) ke agar piring sebelumnya diinokulasi dengan mikroorganisme yang diuji. Setelah beberapa menit atau jam untuk memungkinkan difusi, kromatogramnya adalah dihapus dan piring agar diinkubasi. Hambatan pertumbuhan zona muncul di tempat-tempat, di mana senyawa antimikroba kontak dengan lapisan agar [44]. 3.2. Bioautografi langsung Bioautografi langsung adalah metode yang paling banyak diterapkan di antaranya tiga metode. Plat TLC yang dikembangkan dicelupkan ke dalam atau disemprotkan dengan suspensi mikroba. Kemudian, bioautogram diinkubasi di 25 ° C selama 48 jam dalam kondisi lembab [45]. Untuk visualisasi tumbuh mikroba

garam tetrazolium sering digunakan. Garam ini menjalani konversi ke formazan berwarna intens yang sesuai oleh dehydrogenases sel hidup [46,47]. p-Iodonitrotetrazolium violet adalah reagen deteksi yang paling cocok [44,48]. Garam ini disemprotkan ke bioautogram, yaitu direinkubasi pada 25 ° C selama 24 jam [49] atau pada 37 ° C selama 3-4 jam [5]. Itu Kaldu Mueller Hinton yang dilengkapi dengan agar telah direkomendasikan

untuk memberikan cairan yang cukup untuk memungkinkan kepatuhan yang terbaik ke pelat TLC dan menjaga kelembaban yang sesuai untuk pertumbuhan bakteri [50]. Bioautografi langsung dapat digunakan dengan jamur atau bakteri. Ini adalah teknik termudah untuk mendeteksi antijamur zat, dan juga memberikan hasil yang konsisten untuk memproduksi spora jamur seperti Aspergillus, Penicillium dan Cladosporium [51,52] .For bakteri, Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus dan Escherichia coli strain sering digunakan untuk mengidentifikasi senyawa antibakteri [42] , 53]. 3.3. Agar overlay bioassay Juga dikenal sebagai bioautografi imersi, itu adalah hibrida dari kedua metode sebelumnya. Piring TLC ditutup dengan biji yang dicairkan media agar. Untuk memungkinkan difusi yang baik dari yang diuji senyawa ke dalam media agar, piring dapat ditempatkan pada rendah suhu selama beberapa jam sebelum inkubasi. Setelah inkubasi dalam kondisi yang sesuai tergantung pada mikroorganisme uji, pewarnaan dapat dibuat dengan pewarna tetrazolium. Seperti bioautografi langsung, metode ini dapat diterapkan untuk semua mikroorganisme seperti Candida albicans [54] dan cetakan [43]. Ini memberikan definisi yang baik zona hambatan pertumbuhan dan tidak sensitif terhadap kontaminasi [44]. Secara keseluruhan, TLC-bioautografi sederhana, efektif dan murah teknik untuk pemisahan campuran kompleks, dan

pada saat yang sama, ini melokalisasi konstituen aktif pada TLC piring. Karena itu, dapat dilakukan keduanya di laboratorium yang canggih dan laboratorium kecil yang hanya memiliki akses ke a minimum peralatan [44]. Meski memiliki online canggih kromatografi cair kinerja tinggi digabungkan bioassay, yang menjadi semakin populer sebagai metode pilihan untuk pembersihan akhir dari fraksi ekstraktif untuk mendapatkan senyawa murni, TLC - bioautografi menawarkan teknik cepat untuk penyaringan sejumlah besar sampel untuk bioaktivitas dan dalam fraksionasi terbimbing bioaktif [45]. Dapat digunakan untuk deteksi antimikroba dalam sampel lingkungan dan makanan serta untuk mencari obat antimikroba baru. 4. Metode pengenceran Metode pengenceran adalah yang paling tepat untuk penentuan nilai MIC, karena mereka menawarkan kemungkinan untuk memperkirakan konsentrasi zat antimikroba yang diuji dalam agar (agar pengenceran) atau media kaldu (macrodilution atau microdilution). Baik metode kaldu atau pengenceran agar dapat digunakan untuk itu secara kuantitatif mengukur aktivitas antimikroba in vitro terhadap bakteri dan jamur. Nilai MIC yang direkam didefinisikan sebagai yang terendah konsentrasi zat antimikroba yang diuji yang menghambat pertumbuhan yang terlihat dari mikroorganisme yang diuji, dan biasanya dinyatakan dalam mg / mL atau mg / L. Ada banyak pedoman yang disetujui untuk pengenceran uji kepekaan antimikroba yang rewel atau tidak cepat saji bakteri, ragi dan jamur berfilamen. Yang paling dikenal

standar disediakan oleh CLSI dan Eropa Komite Pengujian Kerentanan Antimikroba (EUCAST). Sebagai disarankan, pedoman ini memberikan prosedur yang seragam untuk pengujian yang praktis dilakukan di sebagian besar laboratorium mikrobiologi klinis. Pengembangan standar metodologi seperti itu tidak menjamin relevansi klinis dari pengujian tersebut. Namun demikian, itu memang memungkinkan bioassay dilakukan dalam pendekatan standar untuk mengevaluasi relevansi klinis hasil [55]. 4.1. Metode pengenceran kaldu Kaldu mikro atau pengenceran makro adalah salah satu antimikroba paling dasar metode pengujian kerentanan. Prosedurnya melibatkan menyiapkan pengenceran dua kali lipat dari agen antimikroba (mis. 1, 2, 4, 8, 16 dan 32 mg / mL) dalam medium pertumbuhan cair yang dikeluarkan dalam tabung mengandung volume minimum 2 mL (macrodilution) atau dengan volume yang lebih kecil menggunakan pelat mikrotitrasi 96-sumur (mikrodilusi) (Gbr. 2). Kemudian, setiap tabung atau sumur diinokulasi dengan mikroba inokulum disiapkan dalam media yang sama setelah pengenceran standar suspensi mikroba disesuaikan dengan skala 0,5 McFarland (Gbr. 3). Setelah pencampuran dengan baik, tabung diinokulasi atau 96-sumur piring mikrotitrasi diinkubasi (kebanyakan tanpa agitasi) di bawah kondisi yang cocok tergantung pada mikroorganisme uji (Tabel 1). Metodologi eksperimental untuk melakukan secara akurat mikrodilusi adalah skema pada Gambar. 4. MIC adalah konsentrasi terendah agen antimikroba itu sepenuhnya menghambat pertumbuhan organisme dalam tabung atau mikrodilusi

sumur yang terdeteksi oleh mata tanpa bantuan [56]. Berbeda dengan mikrodilusi metode, kerugian utama macrodilution metode yang membosankan, usaha manual, risiko kesalahan dalam persiapan solusi antimikroba untuk setiap tes, dan jumlah reagen dan ruang yang dibutuhkan relatif besar [11]. Dengan demikian, reproduksibilitas dan ekonomi reagen dan ruang yang terjadi karena miniaturisasi tes adalah yang utama keuntungan dari metode mikrodilusi. Namun demikian, yang terakhir hasilnya secara signifikan dipengaruhi oleh pendekatan, yang harus dikontrol dengan cermat jika hasil yang dapat direproduksi (intralaboratory dan interlaboratory) harus dicapai [56]. Untuk penentuan MIC endpoint, perangkat tampilan dapat memfasilitasi membaca mikrodilusi menguji dan mencatat hasil dengan kemampuan tinggi untuk membedakan pertumbuhan di sumur. Selain itu, beberapa metode kolorimetri berdasarkan penggunaan reagen pewarna telah dikembangkan. Garam tetrazolium, 3- (4,5dimethylthiazol-2-yl) -2,5diphenyltetrazolium bromida (MTT) dan 2,3-bis {2-metoksi-4-nitro-5 - [(sulfenylamino) karbonil] -2Htetrazolium-hidroksida} (XTT), sering digunakan di titik akhir MIC penentuan untuk mikrodilusi antijamur dan antibakteri tes [57-60]. Pewarna biru Alamar (resazurin), efektif indikator pertumbuhan, juga dapat digunakan untuk tujuan ini [61-64]. Diketahui bahwa ukuran inokulum [65] adalah tipe pertumbuhan sedang [66], waktu inkubasi dan persiapan inokulum metode dapat memengaruhi nilai MIC [67, 68]. Oleh karena itu, dilusi kaldu

telah distandarisasi oleh CLSI untuk menguji bakteri yang tumbuh aerobik [56], ragi [69] dan jamur berfilamen [70]. EUCAST Metode pengenceran kaldu pada prinsipnya mirip dengan metode CLSI dengan modifikasi biasanya menyangkut beberapa parameter uji seperti itu sebagai persiapan inokulum, ukuran inokulum, dan pembacaan MIC

metode yang visual dalam uji CLSI dan spektrofotometri di Pedoman EUCAST [71]. Mengenai conidium dan spora yang membentuk jamur, mikrodilusi standar oleh CLSI melibatkan inokulum spora disesuaikan secara spektrofotometri menjadi 0,4? 10 4 –5? 10 Namun, dalam uji EUCAST, inokulum dapat disesuaikan (2–5)? 10 5 CFU / mL dengan penghitungan hemositometer [72]. Banyak sekali penelitian menunjukkan pentingnya persiapan inokulum dengan hemositometer menghitung untuk persiapan yang dapat direproduksi dan sesuai terlepas dari warna dan ukuran konidia [68,73,74]. Penentuan konsentrasi bakterisida minimum (MBC) atau konsentrasi fungisidal minimum (MFC), juga dikenal sebagai konsentrasi mematikan minimum (MLC), adalah yang paling umum estimasi aktivitas bakterisida atau fungisida. MBC didefinisikan sebagai konsentrasi terendah agen antimikroba yang diperlukan untuk membunuh

99,9% dari inokulum akhir setelah inkubasi selama 24 jam di bawah a seperangkat kondisi standar yang dijelaskan dalam dokumen M26-A [75], di mana MBC dapat ditentukan setelah kaldu macrodilution atau mikrodilusi dengan mensubkultur sampel dari sumur atau tabung, menghasilkan pertumbuhan mikroba negatif setelah inkubasi di permukaan piring agar non-selektif untuk menentukan jumlah yang bertahan sel (CFU / mL) setelah 24 jam inkubasi. Bakterisida endpoint (MBC) telah didefinisikan secara subyektif sebagai konsentrasi terendah, di mana 99,9% dari inokulum akhir terbunuh [75]. MFC juga didefinisikan sebagai konsentrasi terendah dari obat yang menghasilkan 4 CFU / mL. Efek membunuh 98% -99,9% dibandingkan dengan inokulum awal [71]. Beberapa penelitian telah dilakukan untuk evaluasi yang berbeda parameter uji untuk penentuan MFC berbagai obat terhadap Isolat Candida [76], Aspergillus [77] dan cetakan lainnya [78]. 4.2. Metode pengenceran agar Metode pengenceran agar melibatkan penggabungan yang bervariasi konsentrasi yang diinginkan dari zat antimikroba ke dalam agar-agar media (media agar cair), biasanya menggunakan serial dua kali lipat pengenceran, diikuti oleh inokulasi dari inokulum mikroba yang ditentukan ke permukaan pelat agar. Titik akhir MIC direkam sebagai konsentrasi terendah agen antimikroba yang sepenuhnya menghambat pertumbuhan dalam kondisi inkubasi yang sesuai (Tabel 1). Teknik ini cocok untuk antibakteri dan antijamur

pengujian kerentanan. Jika beberapa isolat sedang diuji terhadap a senyawa tunggal, atau jika senyawa (atau ekstrak) yang diuji menutupi deteksi pertumbuhan mikroba dalam medium cair dengan pewarnaan, metode pengenceran agar sering lebih disukai daripada pengenceran kaldu untuk penentuan MIC. Saat ini, diproduksi secara komersial replikator inokulum tersedia dan dapat mentransfer antara 32 dan 60 inokula bakteri berbeda untuk setiap lempeng agar. Agar dilusi sering direkomendasikan sebagai metode standar untuk rewel organisme [79] seperti anaerob dan spesies Helicobacter. Memiliki telah juga digunakan untuk kombinasi obat-agen antijamur melawan

Candida sp., Aspergillus, Fusarium dan dermatophytes [80-83]. Metode ini menyajikan korelasi yang baik dengan Etest terutama untuk pengujian antibakteri terhadap Gram-positif dan Gram-negatif bakteri. Selain itu, perbandingan kategori pengenceran agar, metode mikrodilusi disk-difusi dan kaldu memberikan keunggulan hasil [25]. 5. Uji Time-kill (kurva time-kill) Tes Time-kill adalah metode yang paling tepat untuk menentukan efek bakterisida atau fungisida. Ini adalah alat yang kuat untuk memperoleh informasi tentang interaksi dinamis antara antimikroba agen dan strain mikroba. Tes pembunuhan-waktu mengungkapkan antimikroba yang tergantung waktu atau tergantung konsentrasi efek [55].

Untuk bakteri, tes ini telah terstandarisasi dan dideskripsikan dengan baik dalam M26-A dokumen CLSI [75]. Ini dilakukan dalam budaya kaldu sedang menggunakan tiga tabung yang mengandung suspensi bakteri 5? 10 5 CFU / mL. Tabung pertama dan kedua berisi molekul atau ekstrak yang diuji biasanya pada konsentrasi akhir 0,25? MIC dan 1? MIC, dan yang ketiga dianggap sebagai kontrol pertumbuhan. Inkubasi dilakukan dalam kondisi yang sesuai untuk interval waktu yang bervariasi (0, 4, 6, 8, 10, 12 dan 24 jam) [21,55]. Kemudian, persentase sel mati dihitung relatif terhadap pertumbuhan kontrol dengan menentukan jumlah sel hidup (CFU / mL) masing-masing tabung menggunakan metode penghitungan agar piring. Umumnya bakterisida Efek diperoleh dengan persentase kematian 90% selama 6 jam, yang setara dengan 99,9% dari kematian selama 24 jam [21]. Selain itu, ini Metode dapat digunakan untuk menentukan sinergisme atau antagonisme antara obat-obatan (dua atau lebih) dalam kombinasi [28,55]. Demikian pula, beberapa zat antijamur dipelajari dengan metode ini [84,85]. 6. Uji bioluminesensi ATP Uji bioluminesensi ATP didasarkan pada kapasitas untuk mengukur adenosine triphosphate (ATP) yang diproduksi oleh bakteri atau jamur. Sebagai ATP adalah bentuk kimia energi semua sel hidup, hadir dalam kurang lebih jumlah yang konstan dalam sel. Oleh karena itu, kuantifikasi digunakan untuk memperkirakan populasi mikroba dalam sampel. Dluciferin di hadapan ATP mengalami konversi oleh luciferase

untuk oxyluciferin yang menghasilkan cahaya. Kuantitas dari cahaya yang dipancarkan diukur dengan luminometer dan dinyatakan sebagai unit cahaya relatif (RLU) yang dapat dikonversi menjadi RLU / mol ATP. Dengan demikian, ada hubungan linier antara viabilitas sel dan luminesensi diukur. Uji Bioluminescence memiliki berbagai aplikasi, seperti sebagai uji sitotoksisitas [86], evaluasi in situ dampak biofilm in situ [87], dan skrining obat pada Leishmania [88]. Apalagi itu telah digunakan oleh beberapa penulis untuk pengujian antibakteri [89], pengujian antimycobacterial [90,91], antijamur terhadap ragi [92] dan cetakan [93]. Kecepatan adalah keunggulan utama dari teknik ini yang memberikan hasil kuantitatif. Memang sudah dibuktikan bahwa teknik ini dapat memberikan hasil dalam 3-5 hari untuk tes antimycobacterial [90,91] dibandingkan dengan konvensional teknik pengenceran, yang membutuhkan 3-4 minggu inkubasi [90,91]. Uji Bioluminescence juga memiliki keuntungan menjadi digunakan untuk pengujian antimikroba in vivo atau in situ [94]. 7. Alirkan metode cyoroforometrik Beberapa tahun yang lalu, kegunaan aliran cytometry untuk kerentanan pengujian mikroorganisme disarankan. Demikian banyak penulis menyelidiki aktivitas antibakteri dan antijamur

banyak obat yang menggunakan metodologi ini [95-98]. Deteksi cepat sel yang rusak dengan pendekatan ini tergantung pada penggunaan yang tepat pewarnaan pewarna [96,99]. Karena itu, propidium iodide (PI), a

Agen fluoresen dan interkalasi, banyak digunakan sebagai pewarna DNA [96]. Beberapa penelitian dilaporkan pada keefektifan aliran sitometer sebagai alat pengujian antibakteri terhadap minyak atsiri Listeria monocytogenes, menggunakan pewarnaan gabungan dengan PI untuk evaluasi kerusakan membran dan fluor karboksi fluor dalamin (cFDA) untuk deteksi aktivitas esterase [95]. Akibatnya, sebagai tambahan ke sel yang dilisiskan, tiga subpopulasi (mati, hidup dan terluka) sel) dapat dengan jelas dibedakan dengan metode ini. Yang terluka Sel-sel digambarkan sebagai sel-sel tertekan yang menunjukkan komponen seluler kerusakan dan kerusakan reproduksi selanjutnya pertumbuhan [100]. Kuantifikasi sel yang terluka memiliki hal yang menarik hasil dalam mikrobiologi makanan, seperti subpopulasi ini kritis jika pemulihan sel menjadi mungkin, seperti pada suhu kondisi penyalahgunaan selama penyimpanan makanan [95]. Memang, mengalir cyto florometric metode memungkinkan deteksi resistensi antimikroba dan memperkirakan dampak molekul yang diuji pada viabilitas dan kerusakan sel dari mikroorganisme yang diuji [101]. Selain itu, ini memberikan hasil yang dapat direproduksi dengan cepat (2-6 jam dibandingkan dengan 24–72 jam untuk metode mikrodilusi) [96]. Namun demikian, sebarkan penggunaan metodologi ini untuk kerentanan antimikroba pengujian saat ini muncul tidak mungkin karena tidak dapat diaksesnya diperlukan peralatan aliran cytometry di berbagai laboratorium. 8. Kesimpulan Saat ini, infeksi mikroba sudah menjadi hal yang penting ancaman klinis, dengan morbiditas dan mortalitas terkait yang signifikan

yang terutama disebabkan oleh perkembangan resistensi mikroba terhadap agen antimikroba yang ada. Oleh karena itu, metode untuk antimikroba pengujian kerentanan dan menemukan antimikroba baru agen telah banyak digunakan dan terus menjadi dikembangkan. Beberapa teknik menjadi sasaran standardisasi oleh CLSI dan EUCAST, menandai langkah besar yang luar biasa dalam hal ini lapangan. Namun, ketika menguji produk alami, beberapa modifikasi protokol standar sering diminta. Jadi, ini sangat penting untuk berhati-hati agar tidak mengubah dasar-dasar mikrobiologi oleh mengencerkan media kultur dan menggunakan yang sangat terkonsentrasi inokulum. Apalagi jika kita mempertimbangkan penggunaan pelarut yang mungkin mempengaruhi pertumbuhan mikroorganisme yang diuji, dapat kita katakan itu membuat adaptasi metodologis kecil untuk protokol standar dapat menjadi solusi untuk memastikan pendekatan eksperimental yang akurat dan memungkinkan peneliti lain untuk membandingkan hasil.