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pequeña charla celular. Las células vecinas intercambian información molecular a través de canales que las conectan directamente. la interrupción de este sistema de señalización puede conducir a trastornos que van desde la pérdida de audición hasta la enfermedad cardíaca. PERSONAS QUE COMPRENDEN NOTICIAS A TRAVÉS DE TWITTER, FACEBOOK Y LINKEDIN, las células también utilizan múltiples modos de intercambio de información. Algunos envían hormonas, que viajan a lo largo y ancho del torrente sanguíneo; otros emiten neurotransmisores, que transmiten señales entre una neurona y otra. Sin embargo, resulta que prácticamente todas las celdas se conectan en red con sus vecinos a través de amplias colecciones de canales que conectan directamente el interior de una celda con el interior de la siguiente. Los investigadores lograron vislumbrar esta forma de comunicación célula-célula a mediados de la década de 1960, cuando inyectaron moléculas de tinte fluorescente en una célula individual en medio de un mar de células muy compactas. Mirando a través de un microscopio, vieron que la fluorescencia se propagaba rápidamente de una célula a otra hasta que a veces centelleaban las células en el tejido.Estudios anteriores habían sugerido que los iones podían transmitir señales eléctricas entre las células vecinas. Pero al observar la propagación de las moléculas de colorante, que son pequeñas pero más grandes que los iones, se confirmó sin lugar a dudas que las células albergan canales a través de los cuales las moléculas pasan en abundancia entre las células adyacentes. Los biólogos ahora saben que estos canales están en todas partes. Las colecciones de ellos se producen en los tejidos de todos los animales, incluidos los humanos, donde participan en una extraordinaria variedad de funciones. Las colecciones, llamadas brechas, ayudan a sincronizar el latido de las células musculares en el corazón y la contracción del útero durante el parto. Las uniones comunicantes permiten que el ojo para ajustar a niveles di ff Erent de luz. Incluso desempeñan un papel en la formación de órganos durante el desarrollo embrionario. Durante los últimos 20 años, los científicos han descubierto que los defectos en el ensamblaje o la actividad de las brechas contribuyen a una variedad de enfermedades humanas, como pérdida de la audición, cataratas, afecciones de la piel, trastornos neurológicos, enfermedades del corazón e incluso ciertos tipos de cáncer. Una sola mutación un ff eja una proteína constituyente de una brecha de la salida en las cuentas del oído interno para la pérdida de audición en hasta un 40 por ciento de las personas con sordera hereditaria. Y las nuevas enfermedades vinculadas a las uniones se descubren todo el tiempo, varias en los últimos años, incluyendo un tipo de epilepsia que afecta a los niños.Ahora, los estudios proporcionan información interesante sobre cómo se construyen las brechas, y están comenzando a revelar cómo la interrupción de la actividad y el ensamblaje de la brecha precipita la enfermedad. Los hallazgos deberían conducir a nuevas

terapias para muchos trastornos que se producen cuando las células ya no pueden compartir información "interna". CONSTRUYENDO PUENTES Los investigadores no pensaban en términos de relevancia médica atrás cuando los primeros experimentos de inyección de tinte se realizaron por primera vez. En los años sesenta y setenta, se centraron en descubrir más pruebas de este misterioso vecino a vecino.Comunicación entre células y sobre el aprendizaje de sus propiedades. Antes de identificar y nombrar las uniones, los fisiólogos encontraron que esta información molecular se comparte en una variedad de órganos y organismos, desde embriones de calamar y peces eléctricos hasta una variedad de células de mamíferos. Y confirmaron que las moléculas se mueven directamente entre las células en los puntos donde sus membranas entran en contacto físico cercano. A fines de la década de los sesenta, los científicos decidieron cómo se verían los canales y cómo se formarían. Los estudios microscópicos anteriores habían revelado la presencia de parches grandes y planos donde las membranas de dos células vecinas yacen cerca. En estas uniones, las células parecían estar separadas por una brecha muy delgada, de unos pocos nanómetros de ancho, lo que hace que la estructura se llame unión de brecha. El nombre se atascó incluso después de que los investigadores descubrieron que este espacio estrecho no está vacío, pero está lleno de las partes de los canales que conectan una célula con otra. Para explorar el papel que desempeñan estos parches de membrana plana en la "conectividad celular" observada en el tinte y los experimentos eléctricos, uno de nosotros (Johnson) comenzó a estudiar qué sucede cuando se ensamblan estas uniones. Junto con sus colegas de la Universidad de Minnesota, Johnson separó suavemente las células cultivadas derivadas de un tumor hepático y luego las volvió a mezclar. En cuestión de minutos, surgieron parches aplanados en las membranas celulares, pero solo donde las dos células hicieron contacto. Esta observación confirmó la sospecha de que el ensamblaje de uniones de separación es un proyecto conjunto que requiere la colaboración de células adyacentes.A medida que estos parches aplanados se expandían y maduraban, también aumentaba la corriente eléctrica que pasaba entre las células. Estas uniones, al parecer, podrían facilitar el intercambio de iones. Pelando las membranas de las células conectadas para observar más de cerca, Johnson y su equipo vieron lo que parecían ser partículas grandes que se habían acumulado dentro de los parches aplanados. Más tarde, se descubrió que estas partículas eran los canales que son los bloques de construcción de las uniones de brecha [ver cuadro en la página siguiente]. Cada canal se forma a partir de moléculas llamadas conexinas, que pertenecen a una familia de proteínas identificadas a fines de los años ochenta. Seis proteínas conexina se unen para formar un donut - estructura en forma de una llamada hemicanal.Este hemicanal se inserta en la membrana externa de la

célula, donde puede interactuar con un hemicanal en una célula vecina. Cuando las conexinas en estos hemicanales coinciden, forman un poro continuo que conecta las células de una manera que pone el citoplasma de una célula en comunicación directa con el citoplasma de otra. Este poro es, en efecto, un canal de unión de separación única, cientos o miles de los cuales se agregan para formar cada unión de separación. La construcción de estos enormes conglomerados de comunicaciones es una tarea masiva para las células. Una única brecha puede contener 10.000 canales. Debido a que cada canal de unión de separación involucra dos hemicanales, esto haría un total de 120,000 conexiones por conexión. El corazón solo contiene miles de millones de células, cada una de las cuales interactúa con varios de sus vecinos a través de uniones. El ensamblaje de estas estructuras colosales, en otras palabras, es una maravilla de la ingeniería molecular. Aún más notable es que las uniones no son permanentes o incluso de larga duración, sino que se desarman y reconstruyen continuamente. Se ha demostrado que la mitad de las conexiones en una unión de brecha cardíaca se reemplazan cada dos horas. En el transcurso de un día, cada brecha en el corazón humano es probablemente derribada y reemplazada por canales recién ensamblados. Dada la complejidad de estas estructuras extraordinarias, parece probable que los sistemas deban existir para garantizar que su construcción funcione sin problemas para que las comunicaciones de célula a célula no se pierdan. Para controlar estos mecanismos regulatorios, los tres, que todos estudiábamos brechas, optamos por combinar nuestra experiencia; en particular, queríamos explorar cómo se controla el ensamblaje y la eliminación de estos extensos canales de comunicación. VINCULANDO JUNTAMOS Nuestro plan para colaborar tomando café en una conferencia sobre empalmes en el Centro de Conferencias de Asilomar en Pacific Grove, California. Era 1991, y uno de nosotros (Lampe) era un becario postdoctoral en el laboratorio de Johnson en la Universidad de Minnesota. , donde el foco se había dirigido a la regulación del ensamble de unión de brecha. El último miembro de nuestro trío (Laird), entonces un postdoctorado en el laboratorio de Jean-Paul Revel en el Instituto de Tecnología de California, acababa de desarrollar un conjunto de moléculas de anticuerpos que se unían específicamente a las proteínas conexas. Estos anticuerpos nos permitirían interactuar con las conexinas y ver qué partes de las moléculas son críticas para la formación y la actividad de la unión . Los anticuerpos de Laird reconocieron un tipo particular de conexina : Cx43. Los seres humanos tienen genes que codifican 21 proteínas de conexina diferentes, y cada tipo de célula produce su propio conjunto característico de conexinas. Las células de la piel, ambiciosamente, conforman hasta nueve diferentes. conexinas. Sin embargo, Cx43 es el miembro más extendido de la familia y está presente en muchos órganos, como la piel, el corazón, el cerebro, los pulmones y los huesos. Cx43, como todas las conexinas, consta de cuatro segmentos que abarcan la membrana que anclan la proteína en la membrana celular. La cola de la proteína,

que cuelga dentro de la célula, contiene una variedad de elementos que luego determinaríamos que están involucrados en la regulación de su actividad y su ensamblaje en canales y uniones. Y dos bucles hechos por la proteína a medida que se teje dentro y fuera de la membrana sobresalen en el espacio entre las células. Algunos de los anticuerpos que Laird había generado se concentraron en estos segmentos extracelulares. Debido a que los bucles sobresalen de la superficie de la célula, parecía razonable pensar que podrían funcionar como Velcro - como ganchos que permiten conexinas para adherirse a los otros. Para examinar esa suposición, nuevamente separamos las células cultivadas y luego las volvimos a mezclar, pero esta vez agregamos los anticuerpos de Laird. Ahora las brechas no se formaron en absoluto; no vimos transferencia de célula a célula de colorante inyectado ni parches aplanados característicos del desarrollo de uniones de brecha. Al adherirse a los bucles, los anticuerpos habían impedido que las conexinas de una célula se "acoplasen" a las conexiones de la célula vecina. Tales estudios de anticuerpos demostraron que las uniones de conexina son críticas para la construcción de uniones de brecha. Pero se necesitaba una técnica diferente para ver las conexiones en tiempo real a medida que avanzaban alrededor de una célula viva. SIGUE LA PROTEINA I N 1994 LOS TRES de nosotros nos encontramos juntos en otra conferencia, esta vez en la reunión de la Sociedad Americana para la Biología Celular en San Francisco. Durante los chats nocturnos sobre las presentaciones que habíamos escuchado, nos entusiasmamos cada vez más con la proteína verde fluorescente (GFP), una herramienta molecular cuya utilidad finalmente sería reconocida por un Premio Nobel. Un orador en la reunión describió cómo había vinculado este marcador fluorescente a su proteína favorita para rastrear sus viajes en células vivas. Así que nos preguntamos si nuestros grupos de investigación podrían usar GFP para monitorear los movimientos de las conexiones. Comenzamos pegando GFP a los extremos de la cola de las conexiones. Para nuestro gran placer, este enfoque funcionó bien: las conexinas etiquetadas se insertaron correctamente en la membrana celular, donde se ensamblaron en uniones funcionales que mostraban casi todas las propiedades de las construidas a partir de conexinas no modificadas. Ahora teníamos una forma poderosa de observar el comportamiento de las conexiones dentro de las células: trabajo que Laird continuó en su nuevo puesto en la Universidad de Western Ontario. Nuestras primeras observaciones fueron sorprendentes. Inicialmente tomamos imágenes de las celdas que contenían conexiones etiquetadas cada 10 minutos, pensando que podríamos unir estas imágenes fijas para hacer una película de lapso de tiempo que destaque el movimiento de conexiones. Pero las conexinas viajaban tan rápido que no podíamos decir qué proteína era cuál o dónde había ido cada una. Intentamos nuevamente cada dos minutos, pero ese período de tiempo todavía no era lo suficientemente bueno. Para ver las moléculas

etiquetadas individuales mientras se transportaban en camiones alrededor de la célula, terminamos teniendo que recopilar imágenes cada pocos segundos. Las películas resultantes nos permitieron no solo seguir las conexiones, sino también ver los hemicanales a medida que se transportaban dentro de las células a lo largo de pistas moleculares hechas de estructuras llamadas microtúbulos. Nosotros y otros vimos que las uniones más pequeñas pueden se combinan para formar otros más grandes, algo de lo que hemos recogido pistas en nuestros estudios de microscopía electrónica. También demostramos que las uniones de brecha más grandes se pueden romper para formar las más pequeñas, una especie de remodelación de la brecha de unión que tiene lugar a medida que las células crecen, se mueven, se flexionan y se dividen. Nuestros colegas idearon más métodos para etiquetar las conexinas y descubrieron que las uniones de brotes crecen agregando hemicanales a su perímetro, de modo que la parte central de la unión de una brecha representa la sección "más antigua" de la placa. Estos componentes más antiguos parecen eliminarse a medida que las uniones en brecha envejecen, una observación que podría explicar cómo las uniones en brecha permanecen establecidas incluso cuando se pierden las conexiones dentro de ellas; Los canales más nuevos se agolpan hacia adentro para reemplazar los canales que son más antiguos. Tal vez el hallazgo más sorprendente de nuestros estudios de células vivas fue que las uniones también pueden ser reclamadas por la célula en grandes porciones, cuando una de las células participantes esencialmente quita un bocado a su vecino, un mecanismo que otros habían propuesto basado en algunos estudios anteriores. Imágenes de microscopía electrónica. Esta maniobra radical ingiere los componentes de unión aportados por ambas celdas cayeron de un solo golpe, un proceso que puede proporcionar una manera segura de interrumpir rápidamente la comunicación entre dos celdas cuando ya no es deseable. Dicha eliminación a gran escala de las brechas se produce en el útero después del parto, lo que deshabilita las redes de comunicación que se han formado para coordinar las contracciones. TOMANDO EL CONTROL Sabiendo que las uniones de brecha se renuevan constantemente, a continuación, nos proponemos explorar cómo las células podrían supervisar esta masiva recaptación molecular . Los primeros estudios apuntaron a las proteínas llamadas quinasas como los reguladores. Con el simple paso de agregar grupos de fosfato a una proteína diana, las quinasas pueden alterar la actividad o ubicación de esa proteína dentro de la célula. Nuestro desafío fue determinar si las proteínas quinasas también regulan el comportamiento de las conexinas y, en caso afirmativo, qué hace exactamente esta fosforilación. Lampe tomó la iniciativa en este conjunto de estudios cuando estableció su laboratorio en el Centro de Investigación del Cáncer Fred Hutchinson en Seattle en 1994. Al desarmar Cx43 y examinar la proteína una pequeña porción a la vez, Lampe y sus colegas descubrieron que, más de su vida útil, esta

conexión se fosforila en hasta 15 lugares diferentes a lo largo de su cola. Esta información nos permitió elaborar algunos de los códigos regulatorios que controlan la formación de uniones de brecha que contienen Cx43. Cuando las quinasas específicas actúan sobre ciertas partes de la cola de la proteína, la modificación mejora el ensamblaje de las uniones que contienen Cx43; otras quinasas que actúan sobre diferentes partes de la cola inhiben la formación, la actividad o el tamaño de la unión. La información sobre el código reglamentario ahora nos permite examinar muestras de tejido humano en busca de pistas sobre cómo los cambios en la fosforilación podrían alterar la forma en que se ensamblan las uniones y funcionan en respuesta a una lesión o durante la enfermedad. Nosotros y otros hemos comenzado a determinar, por ejemplo, cómo cambia la comunicación a través de lasuniones entre las células cardíacas. están tratando de recuperarse de la falta de oxígeno después de un ataque al corazón o cuando las células de la piel se movilizan para curar un corte o un rasguño. En ambos casos, el equipo de Lampe encontró que la fosforilación aumenta en un sitio en particular en la cola de Cx43. Esta fosforilación aumenta brevemente el tamaño de las uniones de brecha en estos tejidos al evitar que Cx43 interactúe con una proteína (estudiada por otros grupos) que restringe la capacidad de las nuevas conexinas para integrarse en las uniones existentes. El aumento resultante en el tamaño de la unión de la brecha sirve para aumentar la comunicación, lo cual es crítico en los primeros minutos después de la lesión, y ayuda a preservar la función en el tejido cardíaco y facilita la migración de las células de la piel necesarias para cerrar una herida abierta. Saber cómo la fosforilación afecta el ensamblaje y la función de la conexina, y cómo la comunicación de la unión de la brecha cambia en respuesta a una lesión o enfermedad, ha abierto una puerta al desarrollo de terapias que pueden promover o inhibir la actividad de las proteínas quinasas relevantes.Sin embargo, tales estrategias de tratamiento deben seguirse con cautela, ya que un aumento de las uniones en una etapa de la enfermedad puede resultar perjudicial. más adelante. Por ejemplo, aunque las uniones se agrandan brevemente inmediatamente después de una lesión, luego se degradan rápidamente para promover una curación adecuada. En las personas que tienen diabetes, el cierre de la herida se retrasa por una sobreproducción continua de Cx43. Y cuando se rasca la córnea, las conexinas pueden promover la inflamación y la cicatrización en lugar de curar. En estos casos, la limitación de la producción o función de Cx43 en las células que rodean una lesión promueve la reparación rápida de heridas sin cicatrices, un enfoque que varias compañías de biotecnología están siguiendo. Sin embargo, para aprovechar al máximo nuestro conocimiento de la biología de la brecha para diseñar terapias efectivas, los investigadores necesitan una comprensión más profunda de cómo se conectan las conexinas en diferentes tejidos en diferentes condiciones, y cómo su agregación y actividad van mal ante la enfermedad. El estudio de las mutaciones causantes de enfermedades en los

genes que codifican para las proteínas conexinas está comenzando a ofrecer algunas ideas útiles. INTERRUPCION DE COMUNICACIONES Los investigadores descubrieron la primera evidencia genética sólida de que las conexinas pueden participar en la enfermedad a mediados de los años noventa. Se descubrió que las mutaciones en el gen que codifica Cx32 causan una forma de una afección neurológica llamada enfermedad de Charcot-MarieTooth. En este trastorno, las uniones de brecha desaparecen en la vaina de mielina que aísla los nervios, lo que hace que la mielina se degrade y conduzca a la degeneración nerviosa; esa pérdida, a su vez, precipita la atrofia muscular y la debilidad, particularmente en las extremidades. Con el descubrimiento de que las mutaciones en los genes de la conexina tienen serias consecuencias fisiológicas, el campo de la unión de brecha fue testigo de una explosión de interés por parte de investigadores y clínicos que intentaron determinar la base genética de estas enfermedades. Estudios adicionales revelaron nuevas mutaciones de la conexina, y hoy se sabe que 14 trastornos diferentes se derivan de defectos en las conexiones de la brecha. Lo más sorprendente de esta colección de condiciones es lo diferentes que son unas de otras. Además de la enfermedad neurodegenerativa de Charcot-Marie-Tooth, las mutaciones en las conexinas pueden ser la causa de la pérdida de audición, la epilepsia, la enfermedad cardíaca, las afecciones de la piel, las cataratas y una variedad de trastornos que surgen durante el desarrollo embrionario. Como podría esperarse, las mutaciones en diferentes conexiones contribuyen a diferentes enfermedades. Pero en un hallazgo más sorprendente, resulta que las conexinas mutantes no afectan necesariamente a todos los tejidos u órganos por igual;Si un mutante en particular se produce en dos órganos, podría afectar la función en uno pero no en el otro. Muchos grupos de investigación están trabajando para entender este fenómeno. Una explicación podría ser que en ciertos tejidos, otras conexiones sanas pueden compensar una variante defectuosa, lo que permite que la comunicación de la brecha se mantenga en un nivel adecuado. Tal mecanismo de compensación puede ocurrir en algunos tejidos pero no en otros. O tal vez una conexión en particular desempeña un papel en un tejido pero diferentes funciones en otros, dependiendo de qué otras conexiones estén presentes. Los diversos miembros de la familia de las conexinas también se pueden mezclar, produciendo canales híbridos que podrían facilitar el paso de diferentes señales moleculares, algunas de las cuales son más importantes en un tejido que en otro . Para algunas conexiones, sin embargo, los defectos comprometen múltiples tejidos. Tomemos un trastorno que estudiamos, llamado displasia oculodentodigital (ODDD). Las personas con esta afección, causadas por mutaciones en el gen Cx43, muestran una variedad de síntomas, que incluyen ojos pequeños, dientes poco desarrollados, deformidades esqueléticas en la cara y la cabeza y correas entre los dedos de las manos o los pies. Como si eso no fuera suficiente, algunas personas afectadas desarrollan una afección de la piel

que produce callos engrosados y escamosos en las palmas de las manos y las plantas de los pies. Estudios recientes sobre el ciclo de vida de las conexinas han ofrecido algunas pistas sobre por qué algunas personas tienen una forma más grave de la enfermedad que otras. Se han encontrado más de 70 mutaciones en Cx43 en personas con ODDD, y comenzamos por explorar qué hacen estas mutaciones a la proteína y cómo afectan la construcción de uniones de brecha. Laird y sus colegas han encontrado que muchas de las mutaciones en el gen Cx43 dan como resultado una conexina que llega a la membrana celular pero no forma una unión de brecha funcional;los tintes no fluyen a través de estas uniones de celda a celda, lo que indica que los canales de unión de brecha no están correctamente ensamblados o no permiten que las señales moleculares pasen. Ya sea camino , estos mutaciones disminuir célula-célula la comunicación. Otras mutaciones de ODDD evitan que las conexinas lleguen a la membrana celular. Los pacientes que albergan estas mutaciones generalmente tienen la forma más grave de la enfermedad, incluida la condición de la piel, junto con otros defectos. Este hallazgo sugiere que los hemicanales de conexina podrían tener un trabajo más allá de su función en la construcción de uniones y que cuando este trabajo se deshace, como sucede cuando las conexinas nunca llegan a la membrana celular, surgen problemas más graves. Quizás, por ejemplo, en lugar de asociarse para formar canales, algunos hemicanales permanecen desacoplados, lo que permite a las células liberar señales o captar moléculas de su entorno. Estas moléculas pueden ser diferentes de las que normalmente pasan a través de los canales de unión brecha. Tal La actividad de hemichannel se ha demostrado experimentalmente, agregando una nueva dimensión a nuestra comprensión del papel que desempeñan las conexinas en la comunicación celular. Otros estudios de hemicanales mutantes podrían revelar nuevos objetivos, incluidas moléculas aún no identificadas que pasan a través de hemicanales no acoplados, para el tratamiento de ODDD u otros trastornos relacionados con la conexina. Contando secretos El estudio de cómo las mutaciones afectan la construcción y el comportamiento de las uniones de brecha también podría conducir a terapias altamente específicas que contrarrestan los efectos de una mutación sin provocar efectos secundarios graves e indeseados. Saber, por ejemplo, que una mutación particular altera el ensamblaje de una unión de brecha, pero no el transporte de conexinas a la superficie celular, podría señalar el camino hacia un medicamento que podría restaurar la capacidad de la conexina para formar un canal funcional. Tales terapias dirigidas podrían proporcionar una manera de restablecer la comunicación célula-célula sin tener que reemplazar la conexina mutante por completo, un proceso que involucraría la terapia génica, un enfoque que aún es riesgoso y experimental. El descubrimiento de mutaciones causantes de enfermedades en las conexinas hace más que proporcionar objetivos terapéuticos prometedores. Proporciona a

los investigadores un conjunto novedoso de herramientas para estudiar la biología básica de las uniones de brechas. Todavía no tenemos una comprensión completa de las moléculas específicas que pasan entre las células a través de uniones de brecha, por ejemplo. En el caso de las células del corazón, sabemos que los iones que fluyen a través de las uniones llevan una señal eléctrica de una célula a otra. Pero tenemos poca idea de lo que pasa entre las células para apoyar la función de, digamos, el aparato auditivo en el oído o la respuesta de curación de la herida en la piel. Al ver cómo los canales de conexión se comportan en diferentes células y cómo los cambios en su ensamblaje y actividad pueden invocar enfermedades, finalmente podremos abordar las preguntas más fundamentales sobre esta forma íntima de comunicación celular: ¿Qué son exactamente las células que se susurran unas a otras? y ¿cómo gobiernan estos secretos moleculares el ensamblaje y el funcionamiento de criaturas complejas, incluidos nosotros mismos?