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Endocitosis mediada por receptores: información sobre el sistema receptor de lipoproteínas El sistema coordina el metabolismo del colesterol, un componente esencial de la membrana plasmática de todas las células de los mamíferos. El estudio de este sistema ha conducido a una mejor comprensión de la base celular de la homeostasis del colesterol. También ha puesto de relieve un importante mecanismo de regulación metabólica en el proceso de endocitosis mediada por receptores. En este artículo, describimos primero la endocitosis mediada por receptores de LDL, una secuencia de eventos en los que la unión y la internalización del receptor se acoplan en regiones especializadas de la membrana plasmática llamadas fosas recubiertas. En segundo lugar, analice las funciones celulares del colesterol derivado de las LDL internalizadas. En tercer lugar, se presenta evidencia genética para indicar que tanto la unión como la internalización de la LDL están mediadas por una única molécula receptora que contiene dos sitios activos, uno que media la unión y la otra internalización. Finalmente, las características del sistema receptor de LDL se utilizan para sugerir modelos para sistemas receptores en general. Comprensión del mecanismo por el cual las macromoléculas extracelulares interactúan con los receptores de superficie para regular los eventos metabólicos intracelulares. Los recientes avances en el campo de la biología celular han hecho posible que se presenten eventos mediados por receptores directamente en células de mamíferos vivos. Ahora nos hemos dado cuenta de que los receptores de la superficie celular operan a través de una red de orgánulos subcelulares. Los receptores en la membrana plasmática se comunican con las proteínas en el núcleo, el retículo endoplasmático, los lisosomas, las mitocondrias y otras estructuras. ¿Cómo se articula esta comunicación en toda la célula? ¿Cómo regula una célula una ruta metabólica cuyos componentes activos residen en diferentes compartimentos subcelulares? Las respuestas a algunas de estas preguntas fundamentales han estado disponibles recientemente a través de estudios del sistema receptor de lipoproteínas (1, 2). Este sistema regulador de toda la célula coordina el metabolismo del colesterol, un componente esencial de la membrana plasmática de todas las células de los mamíferos. Pero más allá de su importancia en la homeostasis del colesterol, el sistema receptor de lipoproteínas ha sido reconocido como un prototipo para un mecanismo de regulación metabólica: el proceso de endocitosis mediada por receptores. A nivel celular, algunos comentarios preliminares sobre el metabolismo del colesterol parecen apropiados. Todas las células animales requieren colesterol para sus membranas plasmáticas, sin embargo, el cuerpo no puede tolerar el exceso de colesterol en la sangre debido a que el esterol insoluble se deposita en las paredes de las arterias, lo que produce aterosclerosis. De este modo, los animales han desarrollado un mecanismo para transportar el colesterol a través de la sangre y suministrarlo a las células, mientras que al mismo tiempo evitan su acumulación excesiva. Para este propósito, el colesterol se empaqueta en partículas de lipoproteínas en el hígado y el intestino, y las lipoproteínas solubles se secretan en plasma y se transportan a los tejidos objetivo. En el hombre, la más abundante de estas partículas es la lipoproteína de baja densidad (LDL). Dos tercios del colesterol en el plasma humano está contenido dentro de las LDL. La mayor parte del colesterol reside dentro de LDL. La mayor parte del colesterol reside en un apolar.

Núcleo en el que cada molécula de esterol está esterificada con un ácido graso de cadena larga. Este núcleo de ésteres de colesterilo está rodeado por una capa polar que contiene fosfolípidos, pequeñas cantidades de colesterol no esterificado y una proteína llamada apoproteína B (3). Al sintetizar sus membranas, las células requieren colesterol no esterificado. Para usar el colesterol de las LDL, las células deben poder desarmar la lipoproteína e hidrolizar los ésteres de colesterilo. Aquí es donde entra en juego la necesidad de múltiples orgánulos subcelulares. La clave del proceso es un receptor de la superficie celular que se une a la LDL y facilita su entrada en las células. La secuencia de reacciones por la cual las células usan el receptor para obtener colesterol se llama la vía del receptor de LDL.

Endocitosis de LDL mediada por receptores: unión acoplada a la internalización a través de fosas recubiertas Los pasos bioquímicos en la vía del receptor de LDL se inician mediante la unión de LDL a un receptor específico en la superficie celular. El receptor de LDL se descubrió en 1973 a través de estudios de fibroblastos de piel humana en cultivo de tejidos (4-6). El trasfondo de estos estudios se encuentra en las observaciones de Bailey (7) y Rothblat (8), quienes en la década de 1960 demostraron que las células animales cultivadas no sintetizaban su propio colesterol, sino que lo extrajeron de las lipoproteínas que estaban presentes en el suero de El medio de cultivo. En 1973, nuestro laboratorio observó que aunque el suero humano contiene una mezcla de lipoproteínas que transportan colesterol, los fibroblastos podrían derivar colesterol solo de LDL (4, 9). Esta fue la primera pista de que las células podrían tener un mecanismo específico para interactuar con una lipoproteína específica. Luego, encontramos que la especificidad del efecto LDL se debía a la existencia de un receptor de superficie celular para LDL (6, 10). Para estudiar el receptor, etiquetamos LDL con 125I de modo que el yodo se uniera solo al componente de la proteína. Cuando las monocapas de fibroblastos intactos se incuban a 4VC con 125I-LDL, se produce la unión pero se evita la internalización (6, 10, 11). El 1251-LDL se une a una sola población de sitios receptores de superficie. A 370C, se logra la unión media máxima a una concentración de LDL de aproximadamente 1 nM (6, 12). Los fibroblastos humanos producen un máximo de 20,000-50,000 receptores por célula. La unión requiere un catión divalente, ya sea calcio o manganeso (13). El receptor es exquisitamente sensible a las proteasas como la pronasa, la tripsina y la quimotripsina, pero es resistente a las glicosidasas y otras enzimas hidrolíticas (10, 13). El receptor también se inactiva por reacciones de modificación de proteínas, como la acetilación y el tratamiento con glutaraldehído. Por eso creemos que el receptor es una proteína. El receptor reconoce el componente de apoproteína B de LDL; no reconoce las apoproteínas A-I y A-II, las proteínas que se encuentran en alta densidad. Lipoproteína (HDL), la otra lipoproteína principal que transporta colesterol en el plasma humano (6, 14, 15). En ciertos animales que reciben grandes cantidades de colesterol, otra lipoproteína, llamada HDLC, se acumula en el plasma (16). Aunque la HDLC no contiene apoproteína B, contiene una proteína llamada apoproteína E que comparte varias propiedades físicas y químicas con la apoproteína B. El receptor LDL de los fibroblastos reconoce la apoproteína E y, por lo tanto, se une a la HDLC así como a la LDL (16, 17) . Una propiedad importante del receptor de LDL es que las LDL pueden disociarse por exposición a heparina y otros glicosaminoglicanos sulfatados (11). La capacidad de liberar LDL del receptor con heparina ha proporcionado una herramienta poderosa con la cual diseccionar la vía del receptor. Habiendo unido LDL en la superficie celular, ¿cómo extrae la célula los ésteres de colesterilo del núcleo de la lipoproteína? La respuesta vino cuando las células se calentaron a 370ºC y se encontró que la

partícula de LDL completa estaba internalizada y degradada (10). La Fig. 1 muestra un experimento bioquímico diseñado para seguir la internalización de 125I-LDL unida al receptor. Antes del tiempo cero, los fibroblastos se incubaron con 125I-LDL a 4VC para que se produjera la unión. Las células se lavaron para eliminar la LDL no unida. Luego se expuso un grupo de células a heparina a tiempo cero. Debido a que estas células no se habían calentado, la heparina liberó casi todo el 125I-LDL unido del receptor. Solo una pequeña cantidad de 125I-LDL fue resistente a la liberación de heparina. El resto de las células se calentaron luego a 370ºC. Después de varias veces, las placas individuales de células se enfriaron a 40ºC para detener la internalización y luego se expusieron a heparina. Durante el período de calentamiento, la cantidad de LDL que estaba en la superficie y posteriormente liberable por la heparina disminuyó rápidamente, y esto fue compensado por un aumento en el LDL que había entrado en la célula y ya no era liberable por la heparina. Este 125I-LDL internalizado no permaneció en la celda. FIG. 1. Internalización y degradación a 37*C de 125I-LDL previamente unidas al receptor de LDL a 40C en fibroblastos humanos normales. Las células se incubaron en un medio de crecimiento que contenía un 10% de suero deficiente en lipoproteínas durante 48 horas antes del experimento. El día del experimento, cada plato recibió 2 ml de medio helado que contenía 10, tg de proteína por ml de 1251-LDL. Se dejó que el 125I-LDL se uniera a las células a 40ºC, después de lo cual cada monocapa se lavó exhaustivamente. Cada placa recibió luego 2 ml de medio que contenía 10 Atg de proteína por ml de LDL no marcado, y todas las placas se incubaron a 370ºC. Después del tiempo indicado a 370ºC, los grupos de alimentos se enfriaron rápidamente a 40ºC, se eliminó el medio y se midió su contenido de material soluble en ácido tricloroacético marcado con 125I (-) (10). También se determinaron las cantidades de 125I-LDL (0) unidas a la superficie (liberables con heparina) y 1251-LDL internalizadas (resistentes a la heparina) que permanecieron asociadas con las células (A) (11).

Durante un largo período Después de aproximadamente 30 minutos, el LDL dentro de la célula disminuyó. Al mismo tiempo, apareció en el medio de cultivo un material marcado con 125 lb soluble en ácido tricloroacético. Estos productos solubles en ácido consistían casi en su totalidad de mono [125I] yodotirosina, lo que indica que el componente proteico de la LDL internalizada se había digerido completamente en aminoácidos (10). Se ha demostrado que esta hidrólisis ocurre dentro de los lisosomas (18, 19). Al mismo tiempo que la proteína de LDL se hidroliza, los ésteres de colesterilo también se hidrolizan (19). El colesterol liberado dentro del lisosoma entra en el compartimento citoplásmico, donde se convierte en el regulador central del metabolismo del colesterol (descrito a continuación). Un aspecto del experimento de calentamiento en la Fig. 1 fue sorprendente. Esa fue la notable eficiencia de la internalización. Casi toda la 125I-LDL unida al receptor se internalizó en 15 minutos (20). Los fibroblastos deben tener un mecanismo eficiente para acoplar los eventos de enlace e internalización. La clave de este acoplamiento resultó ser una estructura intrigante llamada pozo recubierto. Los hoyos recubiertos en la superficie de los ovocitos de mosquito se describieron en 1964 por Roth y Porter (21), y posteriormente estas estructuras se observaron en prácticamente todas las células animales (22). Representan regiones especializadas de la superficie celular donde la membrana plasmática está sangrada y recubierta sobre su superficie citoplásmica por un material borroso. El papel del hoyo revestido en la endocitosis mediada por receptores se reconoció en estudios de captación de LDL que se llevaron a cabo en colaboración con Richard Anderson (23, 24).

La visualización de los receptores de LDL se hizo posible mediante el uso de LDL que se había acoplado covalentemente a la proteína ferritina que contiene hierro para que la lipoproteína pudiera verse en el microscopio electrónico (23). Los hoyos recubiertos cubren solo el 2% de la superficie celular de los fibroblastos, pero contienen el 50-80% de los receptores de LDL (23, 25). Cuando primero se permite que los fibroblastos se unan a la ferritina-LDL a 4VC y luego se calientan a 370 ° C, en 1 minuto se puede ver la ferritina-LDL en fosas recubiertas que han invaginado en la célula y han comenzado a formar vesículas endocíticas recubiertas (Fig. 2 ). Dentro de los 3 minutos posteriores al calentamiento, estas vesículas recubiertas se desprenden de la membrana y pueden verse transportando la ferritina LDL a la célula. Dentro de 6-8 minutos después del calentamiento, la ferritina LDL se observa dentro de los lisosomas donde se está degradando la LDL (24). El curso temporal de la captación de LDL-ferritina en el microscopio electrónico es idéntico a la rápida captación de 125I-LDL observada en los estudios bioquímicos. La agrupación de receptores de LDL en pozos recubiertos explica la extraordinaria eficiencia del proceso de internalización de LDL. Las propiedades de las fosas recubiertas se enumeran en la Tabla 1. Al mismo tiempo que nosotros, junto con Richard Anderson, realizábamos estudios funcionales de las fosas recubiertas, Barbara Pearse aisló las vesículas recubiertas del cerebro de cerdo. FIG. 2. Micrografía electrónica que muestra la localización de la LDLferritina en un pozo recubierto en la superficie celular de un fibroblasto humano normal. Los puntos negros denotan las partículas de LDL-ferritina. (X115,500.)

Tabla 1. Propiedades de las fosas recubiertas 1. Las fosas recubiertas son estructuras transitorias que se forman y pellizcan continuamente para formar vesículas recubiertas. 2. La vida útil es inferior a 5 min. 3. La tasa de formación y la internalización no están influenciadas por la presencia de receptores LDL o LDL. 4. Cada fosa recubierta contiene receptores para muchas macromoléculas diferentes. 5. El revestimiento está compuesto predominantemente de una proteína de 180,000 de peso molecular, llamada clatrina. Mostró que la capa peluda está compuesta predominantemente por una proteína de 180,000 de peso molecular que ella llamó clatrina (22, 26, 27). Parecía probable que la misma proteína estuviera presente en las fosas recubiertas de los fibroblastos humanos. Por lo tanto, aislamos la clatrina de las vesículas recubiertas de cerebro bovino, preparamos un anticuerpo para la misma, y utilizamos este anticuerpo para contener las vesículas recubiertas en fibroblastos humanos (28). Por microscopía electrónica de inmunoperoxidasa indirecta, se observó que el anticuerpo anti-clatrina se unía específicamente a las fosas recubiertas en la superficie de los fibroblastos humanos y a las vesículas recubiertas dentro de la célula (28). En estudios más recientes de microscopía electrónica (29), Anderson ha demostrado que la ferritina y la clatrina LDL están localizadas en las mismas fosas y vesículas recubiertas. Estos hallazgos plantean una pregunta crucial: ¿Cómo encuentran los receptores de LDL su camino a las fosas recubiertas? La respuesta ha sido sugerida por estudios genéticos que se discuten más

adelante en el artículo. La Fig. 3 muestra una representación esquemática de los pasos secuenciales en la vía del receptor de LDL a medida que emergen de los estudios bioquímicos y ultraestructurales. Los receptores de LDL se encuentran en pozos recubiertos. La unión de las LDL es seguida por la internalización dentro de las vesículas recubiertas, que se fusionan rápidamente con los lisosomas. La proteína de LDL se hidroliza a aminoácidos, y los ésteres de colesterilo se hidrolizan por una lipasa ácida lisosomal. El colesterol no esterificado resultante cruza la membrana lisosomal y entra en el compartimento citoplásmico, donde cumple sus funciones celulares.

Funciones del colesterol derivado de las LDL internalizadas: funciones reguladoras y estructurales El colesterol derivado de las LDL internalizadas es el agente central que media un sistema complejo de control de retroalimentación que estabiliza la concentración de colesterol celular. Esta estabilización se logra mediante las tres reacciones reguladoras ilustradas en la Fig. 3. Primero, el colesterol entrante suprime la enzima microsomal 3hidroxi-3-metilglutaril-coenzima A reductasa (HMG-CoA reductasa), la enzima que controla la velocidad en la biosíntesis del colesterol. , desactivando así la síntesis de colesterol en la célula (4, 9). En segundo lugar, el colesterol entrante activa una enzima esterificante de colesterol microsomal llamada FIG. 3. Pasos secuenciales en la ruta de LDL en células de mamíferos cultivadas. HMG-CoA reductasa denota 3-hidroxi-3-metilglutaril-coenzima A reductasa; ACAT denota acil-CoA: colesterol aciltransferasa; Las flechas verticales sugieren efectos reguladores.

acil-CoA: colesterol aciltransferasa (ACAT) para que el exceso de colesterol pueda reesterificarse y almacenarse como ésteres de colesterilo (30, 31). Y, lo que es más sorprendente de todo, el colesterol entrante desactiva la síntesis del receptor de LDL, evitando una mayor entrada de LDL y protegiendo las células contra una acumulación excesiva de colesterol (32). El efecto general de este sistema es coordinar las fuentes intracelulares y extracelulares de colesterol para mantener un nivel constante de colesterol no esterificado dentro de la célula frente a las fluctuaciones en el suministro externo de lipoproteínas. Los fibroblastos humanos crecen en ausencia de lipoproteínas porque pueden sintetizar colesterol a partir de acetil-CoA. Por otro lado, cuando la LDL está disponible, las células usan preferentemente el receptor para captar la LDL y mantener su propia síntesis de colesterol suprimida. Además de sus funciones reguladoras, el colesterol derivado de LDL cumple otras dos funciones en células cultivadas: es un componente esencial de las membranas celulares (33, 34) y es un sustrato para la síntesis de hormonas esteroides (35, 36). La Tabla 2 enumera los tipos de células cultivadas en las que se ha demostrado la vía del receptor de LDL. Estas células provienen de humanos, perros, cerdos, ratones, hámsters y vacas. En cada tipo de célula, el colesterol derivado de LDL se utiliza para la síntesis de membrana y para la regulación de la homeostasis del colesterol. Las células suprarrenales del ratón y la vaca tienen un número especialmente alto de receptores LDL (35, 36). En estas células suprarrenales, el colesterol LDL se transfiere del lisosoma a otro compartimiento, las mitocondrias, donde la cadena lateral se rompe y el colesterol se convierte en hormonas esteroides. Como se esperaba de su aparición generalizada en células cultivadas, el receptor de LDL desempeña un papel en una amplia variedad de células en el cuerpo. Ho et al. (37, 38) encontraron que la ruta completa de las LDL funciona en los linfocitos humanos inmediatamente después de su aislamiento de la sangre. Nuestros colegas Basu et al. (13) y Kovanen et al. (39) recientemente desarrolló un ensayo de unión que mide la actividad del receptor de LDL en membranas preparadas a partir de homogeneizados

de tejidos frescos. Han utilizado este ensayo para medir la actividad del receptor en 16 tejidos de la vaca. Como se predijo a partir de los estudios de cultivo celular, el número de sitios de unión a LDL de alta afinidad fue mayor en las membranas de la corteza suprarrenal y el cuerpo lúteo ovárico, los dos tejidos que sintetizan hormonas esteroides y tienen los requisitos más altos para el colesterol. En contraste, la médula suprarrenal y el intersticio ovárico, que no producen grandes cantidades de esteroides, mostraron una actividad de unión a LDL mucho menor. La unión de alta afinidad también se detectó en muchos otros tejidos, incluido el tejido adiposo, el miocardio, el músculo esquelético, etc. No se detectó una unión significativa de LDL de alta afinidad en los eritrocitos maduros (39). Las funciones reguladoras y estructurales del receptor de LDL en células cultivadas y su distribución generalizada en tejidos animales han sugerido un modelo para la función de LDL en el cuerpo.

Tabla 2. Células cultivadas que obtienen colesterol a través de la vía del Humanos Ratones Fibroblastos Células suprarrenales (clon Y-1) Fibroblastos transformados por simio Teratocarcinoma células virus 40. Células leucémicas 1210 Células endoteliales Ovario de hámster chino Células del músculo liso Células adrenocorticales Linfoblastos

receptor de LDL La característica más destacada de este modelo es que las LDL transportan el colesterol desde sus sitios de síntesis y absorción en el hígado y el intestino hasta sus sitios de utilización en células extrahepáticas. A medida que entrega colesterol a las células, la partícula de LDL se degrada. Por lo tanto, el receptor de LDL cumple una doble función: permite que las células obtengan colesterol y al mismo tiempo elimina LDL del plasma (40).

Disección genética del receptor de LDL: una proteína única que media la unión y la internalización. Los experimentos bioquímicos y morfológicos muestran que la unión y la internalización de las LDL son eventos acoplados que están mediados por el pozo recubierto. La comprensión de las bases moleculares de este acoplamiento se ha facilitado por la existencia de mutaciones humanas que ocurren naturalmente en el gen del receptor de LDL. Estas mutaciones se encuentran en pacientes que tienen una enfermedad común llamada hipercolesterolemia familiar (HF) (41). La HF es una enfermedad autosómica dominante que muestra un efecto de dosificación génica. Los individuos afectados muestran uno de dos fenotipos clínicos: heterocigotos u homocigotos (41). Los heterocigotos se producen en la población con una frecuencia de 1 de cada 500 personas, lo que coloca a la HF entre las enfermedades hereditarias más comunes en el hombre. Los heterocigotos tienen una elevación de 2 a 3 veces en el nivel plasmático de LDL y con frecuencia desarrollan infartos de miocardio desde los 35 hasta los 45 años de edad. En raras ocasiones, dos heterocigotos se casan y producen un homocigoto que hereda dos dosis del gen mutante. Los homocigotos se ven afectados en la infancia con hipercolesterolemia grave con niveles plasmáticos de LDL 6 veces por encima de lo normal. Por lo general, sufren infartos de miocardio antes de los 15 años. Aunque los homocigotos son raros, sus fibroblastos hicieron posible el análisis genético del receptor de LDL. Ahora hemos estudiado los fibroblastos de un gran número de pacientes con el diagnóstico clínico de FH "homocigotos". En cada caso, las

células mostraron evidencia de una anomalía primaria en el gen para el receptor de LDL (42, 43). Se han identificado tres clases de alelos mutantes. Uno de estos, Rb0, especifica. Un receptor que no tiene actividad de unión. La segunda clase de alelos, Rb-, especifica un receptor que tiene una actividad de unión reducida pero detectable. El tercer alelo mutante, Rb +, i, especifica un receptor fascinante que puede unirse a la LDL normalmente pero que no puede transportar la LDL a la célula. La tabla 3 muestra la distribución de estos alelos en fibroblastos de 50 pacientes con HF homocigótica. En cada caso, se encontró que las células muestran evidencia de dos alelos mutantes en el locus del receptor. Veintinueve de los sujetos no muestran actividad de unión y se presume que son homocigotos para el alelo Rbo (genotipo Rbo / Rbo). Veinte de los sujetos muestran una actividad de unión detectable pero marcadamente reducida. Se postula que cada uno de estos sujetos tiene un alelo Rb- y un alelo Rbo o un segundo Rb- (genotipo Rb- / Rb0 o Rb- / Rb-). Las células de un paciente tienen un defecto de internalización. Sus células conservan la capacidad de unirse a las LDL, pero son incapaces de internalizar la lipoproteína unida al receptor (ver más abajo). Los fibroblastos de un gran número de heterocigotos FH también se han estudiado. En cada caso, las células muestran evidencia de un alelo normal y uno de los tres alelos mutantes en el locus del receptor (42, 43). Por lo tanto, FH, como la mayoría de los errores innatos del metabolismo, parece ser genéticamente heterogéneo en el sentido de que varias mutaciones diferentes en un solo locus producen un síndrome clínico similar. La figura 4 ilustra las consecuencias bioquímicas del defecto del receptor de LDL en los fibroblastos de uno de los pacientes que es homocigoto para el alelo Rb0 y cuyas células muestran el defecto de unión completa. En cada panel, las acciones de LDL son

trazado en función de la concentración de la lipoproteína en el medio de cultivo. En células normales a medida que aumenta la concentración de 1251-LDL en el medio, la cantidad de LDL unida al receptor aumenta hasta que todos los sitios se vuelven ocupados. La tasa de captación de LDL es proporcional a la unión a la superficie. En las células normales, las tasas de hidrólisis tanto de la apoproteína como de los ésteres de cIolesterilo son proporcionales a la unión a la superficie y la captación celular de la lipoproteína. En las células normales, la captación de LDL suprime la síntesis de colesterol y estimula la esterificación del colesterol. Los resultados en células del homocigoto de FH con receptor negativo están en un contraste sorprendente. No se detecta unión a la superficie de 125I-LDL en las células mutantes. Como resultado, no se produce una captación de alta afinidad de LDL (6, 11), y los componentes de la apoproteína y el éster de colesterilo no se hidrolizan a velocidades normales (10, 44). Debido a que no puede ingresar a la célula, las LDL no suprimen la síntesis de colesterol (5, 9) y no estimulan la esterificación del colesterol (30).

El mensajero intracelular en la ruta de las LDL es el colesterol derivado de la hidrólisis lisosomal de las LDL (1, 19). Para confirmar la especificidad del defecto de unión de LDL en estas células homocigotas de FH, incubamos las células con colesterol no esterificado disuelto en etanol. Este colesterol ingresa a las células mediante la difusión a través de la membrana sin un requisito para el receptor de LDL. Cuando se agregó colesterol de esta forma a las células homocigotas de FH, evitó el defecto del receptor y suprimió la síntesis de colesterol y estimuló la esterificación del colesterol normalmente (9, 31, 33). La principal conclusión de los experimentos anteriores es que las células homocigotas de FH tienen un defecto primario en el receptor de LDL que evita que degraden la LDL y utilicen su colesterol. Como resultado, las células homocigotas FH deben sintetizar su propio colesterol para crecer. Los estudios de las células homocigotas de FH con receptor negativo confirmaron que la unión de los receptores teroespecíficos de LDL es esencial para la acción celular de LDL. Pero ¿qué pasa con la internalización? ¿Se requiere alguna acción separada del receptor, o la internalización es simplemente el destino inevitable de cualquier molécula que se une a la superficie celular? Los estudios iniciales no proporcionaron evidencia de un papel para el receptor aparte de la unión. En todos los sujetos normales, la internalización siguió inevitablemente la unión, y en todos Los pacientes con internalización de defectos de unión se redujeron en proporción a la disminución de la unión (42, 45). Pero luego encontramos un tipo de mutación que desafía esta noción simple. Esta mutación se observó en los fibroblastos del paciente único con el defecto de internalización (iniciales JD). J.D. es un niño de 14 años que tiene una elevación de 6 veces en su nivel de LDL en plasma y todas las otras características clínicas de la HF homocigótica (20). Fig. 5: compara el metabolismo de las LDL en los fibroblastos de J.D. con los de un sujeto normal en función de la concentración de LDL en el medio. En las células J.D., la unión superficial de LDL es solo ligeramente menor que en las células normales. Sin embargo, las células J.D. no pueden internalizar el LDL unido. Como resultado de este defecto de captación, las células J.D. no hidrolizan los componentes de la proteína y el éster de colesterilo de las LDL unidas al receptor. La síntesis de colesterol sigue siendo alta y la esterificación del colesterol no está activada. El fracaso de las células J.D. para internalizar LDL es altamente específico. Estas células muestran endocitosis normal de moléculas inertes como la globulina sucrosean y gamma (20), y también tienen una capacidad normal para captar y degradar el factor de crecimiento epidérmico marcado con 125I, una molécula que se une a los receptores de superficie, se internaliza y se degrada. una manera similar a LDL (2). El mecanismo para el defecto de internalización fue revelado por el microscopio electrónico. Cuando se examinaron los fibroblastos de J.D. mediante microscopía electrónica, se observó que contenían el mismo número de fosas y vesículas recubiertas que las células normales y que el aspecto de las fosas recubiertas era normal. Sin embargo, a diferencia de los fibroblastos normales en los que el 50-80% de los receptores de LDL se localizan en las fosas recubiertas, virtualmente ninguna LDLferritina se unió a las fosas recubiertas de las células J.D. (46). En lugar de unirse a los hoyos recubiertos en las células J.D., la LDLferritina se une a los receptores de LDL que se dispersan a lo largo de segmentos de membrana no recubiertos (46). Las propiedades de unión de estos receptores son las mismas que las de las células normales (20); simplemente están en el lugar equivocado. Los hallazgos del

microscópico electroneumático en las células J.D. han sido confirmados por Carpentier et al. (47), quienes utilizaron la técnica de autorradiografía cuantitativa con microscopio electrónico de 125I-LDL. Está claro que las células J.D. no logran internalizar las LDL porque sus receptores de LDL no pueden incorporarse en las fosas recubiertas.

Una explicación para el defecto genético en la J.D. las células han avanzado en base a estudios de fibroblastos de los padres de J.D. (2, 43). Ambos padres presentan hipercolesterolemia y otras características clínicas típicas de la FH heterocigótica. Sin embargo, los dos padres exhiben diferentes mutaciones en el locus del receptor. Cuando los fibroblastos de la madre se incubaron con 125I-LDL, se unieron a la mitad de la cantidad normal de lipoproteínas (43). Los estudios con ferritina LDL mostraron que una proporción normal de sus receptores estaban en pozos recubiertos (46). Cuando sus células se calentaron a 370ºC, todas las 125I-LDL unidas al receptor entraron en la célula dentro de los 10 minutos (43). Por lo tanto, las células de la madre fueron bioquímicamente idénticas a las del heterocigoto habitual para el alelo receptor negativo (genotipo + / RbO). Una situación genética diferente fue evidente en las células del padre de J.D. (42). Aunque tenía el fenotipo clínico de HF heterocigota, sus células se unían aproximadamente 1,5 veces más que 125I-LDL que las células normales (43). La mitad del 125I-LDL unido al receptor se internalizó en 10 minutos y la otra mitad permaneció en la superficie durante más de 30 minutos (43). Estudios con ferritina LDL confirmaron que las células del padre tenían dos poblaciones de receptores LDL. Una de estas poblaciones estaba ubicada en fosas recubiertas y la otra población estaba ubicada a lo largo de segmentos de membrana no recubiertos (46). Ambas poblaciones de receptores se unieron a la LDL-ferritina, pero cuando las células se calentaron, solo la LDL-ferritina que estaba unida a los receptores en las fosas recubiertas entró en la célula. La LDL-ferritina unida a receptores en la membrana no recubierta permaneció en la superficie celular. El hallazgo de dos poblaciones de receptores en las células del padre sugirió que él también tenía un alelo normal y un alelo mutante en el locus del receptor. Los receptores producidos por el alelo normal se ubicaron en fosas recubiertas y llevaron su LDL unido a la célula. Los receptores especificados por el alelo mutante fueron capaces de unirse a LDL, pero no pudieron incorporarse en las fosas recubiertas. Como resultado, el LDL unido a estos receptores no fue internalizado por las células. Este alelo se denominó Rb +, j (unión positiva, internalización negativa) y el genotipo del padre se designó + / Rb + iO (43). El pedigrí de la familia J.D. se muestra en la Fig. 6. El estudio de la descendencia de este matrimonio apoya la idea de que la mutación Rb0 en la madre y la mutación Rb +, io en el padre son alélicas (2, 43). El caso índice, J.D., tiene hipercolesterolemia grave y el fenotipo homocigoto como se discutió anteriormente. La hermana de J.D. es clínicamente normal. Sus fibroblastos tenían una cantidad normal de receptores de LDL e internalizó el LDL unido normalmente. Presumiblemente ella heredó un alelo normal de cada padre. El hermano de J.D. tiene un nivel de colesterol en plasma moderadamente elevado y clínicamente parece ser un heterocigoto. Sus fibroblastos se comportaron de manera idéntica a la del padre. Se unieron a una cantidad de LDL algo superior a la normal, pero solo se internalizó la mitad de la lipoproteína unida. Además, mediante microscopía electrónica, sus células, como la del padre, tenían solo la mitad de la cantidad normal de receptores en pozos recubiertos. Así, el hermano de J.D. parece haber heredado el alelo normal de la madre y el alelo Rb + io del padre (Fig. 6). Como se describió anteriormente, las células de J.D. se

unieron un poco menos de LDL que lo normal. Ninguno de los receptores de J.D se ubicó en pozos recubiertos y ninguno de los LDL unidos se internalizó. Este patrón se explicaría si J.D. fuera un compuesto genético (genotipo Rb / 1Rb +, iO). De su madre, heredó el alelo silencioso, Rbu. De su padre, heredó el alelo defectuoso de internalización, Rb +, io. Todos los receptores que pueden enlazar LDL son del tipo Rb +, 0 y, por lo tanto, ninguno de los LDL enlazados está internalizado. El mecanismo anterior implica que la mutación de unión y la mutación de internalización son alelos alternativos en un solo lugar que especifica el receptor de LDL. Se podrían invocar otros mecanismos más complejos para explicar los hallazgos en este pedigrí. Por ejemplo, el receptor de LDL podría tener múltiples subunidades codificadas por genes independientes. La madre puede ser heterocigótica para una mutación en el gen para la subunidad de unión y el padre puede ser heterocigoto para una mutación en otro gen que especifica la subunidad de internalización. En este caso, J.D. sería un doble heterocigoto; es decir, él llevaría alelos mutantes únicos en dos loci genéticos. Si cada receptor estuviera compuesto por una única subunidad de unión y una única subunidad de internalización, un heterocigoto doble de este tipo debería tener un número medio normal de sitios de unión, pero la mitad de estos deberían estar asociados con las subunidades de internalización normales. Como resultado, la mitad del LDL enlazado debe internalizarse normalmente. Por lo tanto, la tasa global de internalización de 125ILDL en estas células debe ser un cuarto de la normal (unión media normal X interiorización mitad normal). Sin embargo, las mediciones directas muestran que la internalización de 125I-LDL en las células de J.D. es menos del 5% de la tasa normal (20, 43). Este hallazgo tiende a excluir la posibilidad de que las dos mutaciones involucren genes para diferentes subunidades. Una segunda hipótesis alternativa es que el defecto de internalización no se debe a un defecto en el receptor en sí, sino a un defecto en una proteína que funciona catalíticamente para incorporar receptores de LDL en las fosas recubiertas. Según esta hipótesis, el padre heterocigoto tendría la mitad de la cantidad normal de esta enzima de internalización. Si este fuera el caso, las células del padre deberían internalizar todo el LDL unido, pero la tasa de internalización debería ser la mitad de la normal. Sin embargo, como se resumió anteriormente, las células del padre se comportaron de una manera diferente; internalizaron la mitad del LDL unido a una tasa normal y no pudieron internalizar la otra mitad (43). Tal descubrimiento sugiere un defecto estequiométrico en el receptor y no una cantidad medio normal de una proteína catalítica. Sobre la base de las consideraciones anteriores, creemos que la hipótesis de un solo locus genético con dos alelos es más probable. Su prueba requerirá el aislamiento de la proteína receptora de las células de J.D. y la demostración de que su secuencia primaria de aminoácidos se altera como resultado de ambas mutaciones. En vista del pequeño número de receptores por célula, tal prueba definitiva puede estar muy lejos. Sin embargo, la hipótesis de un solo locus es útil porque permite construir un modelo comprobable para el mecanismo mediante el cual los receptores de LDL se incorporan a las fosas recubiertas. Nuestro modelo de trabajo se muestra en la Fig. 7. Por analogía con otras proteínas de membrana, es probable que el receptor de LDL se sintetice Biología celular: marrón y goldstein 36 Biología celular: marrón y goldstein En polirribosomas unidos a membrana y glicosilados en el aparato de Golgi. El receptor se inserta inicialmente en la membrana plasmática en sitios aleatorios. Los datos genéticos sobre el defecto de internalización sugieren que el receptor tiene dos sitios activos. Uno de estos, el sitio de unión para LDL, debe estar en la superficie externa de la membrana. El segundo sitio, el sitio de internalización, permite que el receptor sea

reconocido como un componente de las fosas recubiertas. Prevemos que este sitio de internalización está en la superficie citoplásmica de la membrana. Los receptores que contienen un sitio de internalización funcional migran lateralmente en el plano de la membrana y se agrupan en pozos recubiertos. Nuestra hipótesis es que este agrupamiento ocurre en la superficie citoplásmica de la membrana como resultado de una interacción específica del sitio de internalización del receptor con la proteína de la capa clatrina o con alguna otra proteína que está unida a la clatrina (46). El agrupamiento de receptores no parece ser inducido por la unión de LDL. Todos los datos indican que la secuencia completa de la inserción del receptor en la membrana plasmática, la agrupación en las fosas recubiertas, y la internalización continúa de manera continua en los fibroblastos, ya sea que haya LDL presente (23, 46). Aunque es probable que los receptores de LDL se internalicen cuando los pozos recubiertos se pellizcan para formar vesículas recubiertas, parecen escapar de la degradación en el lisosoma (11). Cuando la síntesis de nuevos receptores está bloqueada por la cicloheximida, los fibroblastos continúan uniéndose e internalizando las LDL a velocidades máximas durante horas. Este hallazgo sugiere que los receptores son reciclados; es decir, después de que depositan su LDL en los lisosomas, los receptores regresan a la superficie celular, donde nuevamente se agrupan en pozos recubiertos. El modelo en la Fig. 7 puede ser importante por varias razones. Primero, explica el defecto de internalización en J.D. Debido a que sus receptores anormales carecen de sitios de internalización funcionales, no son reconocidos por las proteínas citoplásmicas que forman pozos recubiertos y, por lo tanto, permanecen donde se insertaron inicialmente, dispersas al azar en la superficie celular. Segundo, el modelo puede tener implicaciones para la estructura y función de otros receptores de la superficie celular que transportan ligandos de proteínas a las células. FIG. 7. Mecanismo propuesto por el cual los receptores de LDL se localizan en las fosas recubiertas de la membrana plasmática de los fibroblastos humanos. Los pasos secuenciales son los siguientes: 1, síntesis de receptores de LDL en polirribosomas; 2, inserción de receptores LDL en sitios aleatorios a lo largo de segmentos no recubiertos de membrana plasmática; 3, agrupamiento de receptores de LDL en pozos recubiertos; 4, la internalización de los receptores de LDL como picaduras recubiertas se invaginan para formar vesículas endocíticas recubiertas; y 5, el reciclaje de los receptores LDL internalizados de vuelta a la membrana plasmática. Reimpreso de la ref. 46 con permiso.

Modelos para otros sistemas receptores de superficie celular. En organismos multicelulares, las señales se transmiten de una célula a otra en forma de proteínas hormonas. Al igual que las LDL y otras proteínas transportadoras de plasma, las hormonas proteicas se unen a los receptores en la superficie de las células diana y provocan respuestas reguladoras. Un hallazgo reciente y sorprendente en la investigación de receptores es que algunas de las hormonas proteicas que antes se pensaba que actuaban solo en la superficie de las células diana, de hecho, se internalizan y degradan, al igual que las proteínas de transporte. Los ejemplos más llamativos incluyen la insulina (48), el factor de crecimiento epidérmico (49) y la gonadotropina coriónica (50). En cada caso, la captación y degradación de la hormona en las células diana está mediada por el mismo receptor que media la acción de la hormona. En cada caso la degradación se produce dentro de los lisosomas. En el caso del factor de crecimiento epidérmico, la captación se produce a través de fosas recubiertas que son las mismas que las que llevan la LDL a las células (51, 52). Estos hallazgos aumentan la posibilidad de que algunos receptores hormonales * tengan sitios de internalización que les permitan incorporarse a las fosas recubiertas para llevar sus

ligandos a las células. Entonces surge la pregunta: ¿cuál es la relación entre la internalización y degradación de una hormona y su acción reguladora? La Fig. 8 muestra dos modelos que se pueden avanzar para explicar la relación entre la acción hormonal y la degradación hormonal. El primer modelo secuencial se ejemplifica mediante LDL. La unión conduce a la internalización, que a su vez conduce a la degradación. Los productos de la degradación median la acción reguladora. En el segundo modelo, la unión al receptor es suficiente para producir la acción reguladora. Pero en una acción paralela, el receptor también media la internalización y la degradación lisosomal de la hormona. El segundo modelo difiere del primero en que la degradación no es necesaria para la acción reguladora de la hormona. Sin embargo, la degradación cumple una función fisiológica al destruir la hormona para que cada molécula de hormona pueda actuar solo una vez. En algunos casos, el receptor también puede ser destruido. Para la mayoría de las hormonas proteicas, todavía no es posible elegir entre estos dos modelos. Hasta la fecha, no se ha demostrado que la acción reguladora de una hormona proteica requiera la degradación hormonal. Sin embargo, solo unos pocos estudios han abordado específicamente este punto. Es posible que una hormona con múltiples acciones pueda actuar a través de los dos mecanismos que se muestran en la Fig. 8, algunas acciones reguladoras que requieren la degradación de la hormona y otras que sean independientes. En el sistema receptor de LDL, el primer modelo en la Fig. 8 se documentó mediante el uso de varias herramientas experimentales. Primero, había un sistema, el fibroblasto humano cultivado, en el que la unión inicial del evento y la regulación final de la enzima del evento podían estudiarse simultáneamente en células enteras. En segundo lugar, había mutantes con bloques en cada paso de la ruta y estaba claro que un bloque en cualquiera de estos pasos causaba un fallo de la regulación. Aunque solo la vinculación y la internalización se han discutido las mutaciones, también se estudiaron los fibroblastos de pacientes que tienen un bloqueo genético en la degradación de las LDL. Estas células mutantes carecen de la lipasa ácida lisosomal y, por lo tanto, no pueden responder a la LDL aunque pueden unirse e interiorizarse normalmente (19). Finalmente, una vez que quedó claro que el colesterol no esterificado era el mensajero intracelular, se pudo agregar colesterol exógeno a las células mutantes para reproducir las acciones de las LDL y, por lo tanto, para evitar los bloqueos metabólicos, confirmando su especificidad. Todas estas herramientas aún no están disponibles para ningún sistema hormonal de proteína única. Sin embargo, se están llevando a cabo estudios imaginativos en muchos laboratorios para ver si alguno de estos modelos se aplica o no a cualquiera de las hormonas proteicas. En un sentido más amplio, la observación de que algunas hormonas proteicas son internalizadas por endocitosis mediada por receptores y degradadas dentro de los lisosomas nos remite a nuestro tema inicial, a saber, que la regulación metabólica ahora debe considerarse un problema en la biología celular y en la bioquímica clásica. . El trabajo resumido aquí no podría haberse llevado a cabo sin la ayuda de varios colegas capaces y dedicados. Estamos especialmente agradecidos con el Dr. Richard G. W. Anderson, quien ha sido un colaborador invaluable en muchos aspectos de estos estudios. Este trabajo fue apoyado por una beca de investigación de los Institutos Nacionales de Salud (HL 20948).