Trabalho De Concluso De Curso Carlos Alexandre Breyer 2009

UNIVERSIDADE DO OESTE DE SANTA CATARINA ÁREA DE CIÊNCIAS EXATAS E DA TERRA CURSO DE BIOTECNOLOGIA INDUSTRIAL

CARLOS ALEXANDRE BREYER

UTILIZAÇÃO DE TÉCICAS MOLECULARES PARA CARACTERIZAÇÃO DE SOROTIPOS DE SALMOELLA ORIGIÁRIOS DE ABATEDOUROS E DA CADEIA PRODUTIVA DE AVES DA REGIÃO DE VIDEIRA/SC

Videira - SC 2009

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CARLOS ALEXANDRE BREYER

UTILIZAÇÃO DE TÉCICAS MOLECULARES PARA CARACTERIZAÇÃO DE SOROTIPOS DE SALMOELLA ORIGIÁRIOS DE ABATEDOUROS E DA CADEIA PRODUTIVA DE AVES DA REGIÃO DE VIDEIRA/SC

Trabalho de Conclusão de Curso apresentado ao curso de Biotecnologia Industrial da Universidade do Oeste de Santa Catarina como requisito parcial à obtenção do grau de Bacharel em Biotecnologia Industrial

Orientador: Prof. Dr. César Milton Baratto

Videira – SC 2009

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BREYER, CARLOS ALEXANDRE

UTILIZAÇÃO DE TÉCICAS MOLECULARES PARA CARACTERIZAÇÃO DE SOROTIPOS DE SALMOELLA ORIGIÁRIOS DE ABATEDOUROS E DA CADEIA PRODUTIVA DE AVES DA REGIÃO DE VIDEIRA/SC

Trabalho de Conclusão de Curso apresentado ao curso de Biotecnologia Industrial da Universidade do Oeste de Santa Catarina como requisito parcial à obtenção do grau de Bacharel em Biotecnologia Industrial

Aprovado em: _____/_____/_____

BANCA EXAMINADORA

____________________________________ Prof. Dr. César Milton Baratto (Orientador) Universidade do Oeste de Santa Catarina Nota atribuída .......

________________________________________ Prof. Dra. Jane Mary Lafayette Neves Gelinski Universidade do Oeste de Santa Catarina Nota atribuída ...

____________________________ Prof. Dr. Marco Antônio Balbó Universidade do Oeste de Santa Catarina Nota atribuída

Profº. Msc. Rodrigo G. Nogueira. (Coordenador do Curso de Biotecnologia Industrial)

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“A todos que estiveram presentes durante esses anos de graduação”.

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AGRADECIMETOS

Agradeço primeiramente a Deus, por ter iluminado meu caminho durante, esses anos de graduação; A minha família pelo apoio financeiro e pela força nos momentos difíceis; Ao Dr. Márcio Voss, por ter acreditado em mim, e possibilitado meu primeiro estágio na Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária (Embrapa); Aos pesquisadores da Embrapa que me orientaram em meus estágios Dr. Ana Cristina Sagebin Albuquerque (Embrapa Trigo, Passo Fundo/RS), Dr. Andréa Penãloza (Embrapa – Centro Nacional de Recursos Genéticos e Biotecnologia, Brasília/DF), Dr. João Batista Ribeiro (Embrapa Suínos e Aves, Concórdia/SC); Ao professor Dr. Marcelo Fossa da Paz, por ter me orientado em trabalhos de iniciação cientifica, nos projetos de cultivo e análise bromatólogica de cogumelos; Ao professor Dr. Marcos Dalbó, por ter me dado a oportunidade de realizar estágio na Epagri; Ao professor Dr. César Milton Baratto pela orientação e amizade durante realização deste trabalho; Aos técnicos de laboratório Clairton, Isabel, Denise, Fernanda e Rosane, que foram fundamentais para realização destes trabalhos durante esses anos de estágio na Unoesc; Ao professor da Universidade Estadual Paulista, Dr. Marcos Antonio de Oliveira, por ter doado a enzima Taq polimerase utilizada neste trabalho;

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“Bom mesmo é ir à luta com determinação abraçar a vida e viver com paixão perder com classe e vencer com ousadia porque o MUNDO pertence a que se atreve e A VIDA É MUITO para ser insignificante” Charles Chaplin

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RESUMO

Salmonella é um micro-organismo amplamente difundido na natureza, é encontrado no solo, águas residuais, equipamentos, seu habitat natural é o trato intestinal do ser humano e animais. Este trabalho objetivou-se na caracterização molecular de diferentes sorotipos de Salmonella. Os microorganismos analisadas pertencem ao banco de cepas da UNOESC e são originários de abatedouros de aves e suínos e da cadeia produtiva de aves da região de Videira/SC. Para a caracterização molecular foram utilizadas as técnicas de PCR-RFLP (ARDRA), baseadas nos polimorfimos da região do rDNA 16S e da região intergênica entre o rDNA 16S e rDNA 23S , também foram testados os iniciadores de RAPD : H15, H16, H17, H18, H19 e H20. Dentre as técnicas utilizadas a baseada no polimorfismo da região intergênica entre o rDNA 16S e rDNA 23S apresentou um resultado mais relevante mostrando-se mais discriminatória se comparada a outras técnicas. Dos iniciadores de RAPD, apenas H15, H17 e H18 apresentaram-se promissores para caracterização e diferenciação de Salmonella. Palavras-chave: Salmonella. Técnicas Moleculares. Caracterização.

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ABSTRACT

Salmonella is thoroughly a microorganism diffused in the nature, it is found in the soil, residual waters, equipments, its natural habitat is the human being intestinal treatment and you encourage. This work was objectified in the molecular characterization of different serotypes of Salmonella. The analyzed microorganisms belong to the bank of stumps of UNOESC and they are original of frigorific of birds and pigs and of the productive chain of birds of the area of Videira/SC. For the molecular characterization the techniques of PCRRFLP were used (ARDRA), based on the polymorphism of the area of the rDNA 16S and of the area intergenic between the rDNA 16S and rDNA 23S, the initiators of RAPD were also tested: H15, H16, H17, H18, H19 and H20. Among the used techniques the set in the polimorfismo of the area intergenic between the rDNA 16S and rDNA 23S presented a more important result being shown more discriminatory if compared the other techniques. Of the initiators of RAPD, just H15, H17 and H18 came promising for characterization and differentiation of Salmonella.

Keywords: Salmonella. Molecular. Techniques. Characterization.

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LISTA DE ILUSTRAÇÕES

Figura 1: Funcionalidade da PCR - ciclos de uma reação ...................................................

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Figura 2: Regiões do rDA amplificadas. .........................................................................

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Fotografia 1: Fotografia - Extração de DA Genômico. .......................................................

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Fotografia 2: Amplificação da região rDA16S .....................................................................

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Fotografia 3: Reação de PCR-RFLP região 16S Enzima Alu1..............................................

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Fotografia 4: Reação de PCR-RFLP região 16S rDA Enzima Hinf I...................................

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Fotografia 5: Amplificação da região intergênica 16S-23S. ....................................................

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Fotografia 6: Reação de PCR-RFLP região 16S-23S DA enzima Alu I ...........................

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Fotografia 7: Reação de PCR-RFLP região 16S-23S DA enzima Hinf I.............................

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Fotografia 8: PCR – RAPD Iniciador H15 ..........................................................................

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Fotografia 9: PCR – RAPD Iniciador H17 .............................................................................

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Fotografia 10: PCR – RAPD Iniciador H18 .............................................................................

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LISTA DE QUADROS

Quadro 1: Espécies de Salmonella, subsespécies. .......................................................

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Quadro2: Principais vantagens e desvantagens de métodos de detecção de Salmonella ... 19 Quadro 3: Componentes das reações de amplificação de DA por PCR-RFLP. Indicação dos componentes e quantidades utilizadas na reação .......................................... 29 Quadro 4: Componentes das reações de amplificação de DA por PCR-RAPD. Indicação dos componentes e quantidades utilizadas na reação .......................................... 29

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SUMÁRIO

1ITRODUÇÃO ............................................................................................................. 12 1.1 OBJETIVOS ...............................................................................................................

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1.1.1 Objetivo geral ........................................................................................................

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1.1.2 Objetivos específicos ..............................................................................................

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2 REVISÃO .....................................................................................................................

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2.1 O GÊNERO SALMOELLA.....................................................................................

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2.1.1 Taxonomia do gênero Salmonella ......................................................................... 16 2.1.2 Identificação de sorotipos .....................................................................................

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2.2 INFECÇOES CAUSADAS POR SALMOELLA...................................................

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2.3 DIAGNÓSTICO ........................................................................................................

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2.3.1 Diagnósticos baseados em PCR (Polimerase Chain Reaction) .........................

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2.3.1.1 PCR-RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphisms) ………………….

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2.3.1.2 PCR – RAPD (amplificação ao acaso de DNA polimórfico) ..............................

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3 METODOLOGIA .......................................................................................................

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3.1 ISOLADOS BACTERIANOS ...................................................................................

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3.2 CONDIÇÕES DE CULTIVO E MEIOS DE CULTURA PARA SALMOELLA ....

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3.3 EXTRAÇÃO DE DNA BACTERIANO .................................................................... 26 3.4 INICIADORES DE PCR PARA A AMPLIFICAÇÃO DO rDNA 16S E INTERGÊNICA ENTRE OS RDNAS 16S e 23S .......................................................... 27 3.5 INICIADORES E PCR-RAPD ..................................................................................

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3.6 CLIVAGEM DOS PRODUTOS DE AMPLIFICAÇÃO DE DNA BACTERIANO

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3.6.1 Eletroforese em Gel de Agarose ...........................................................................

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4 RESULTADOS E DISCUSSÃO ................................................................................

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4.1 CARACTERIZAÇÃO DE SALMOELLA BASEADA NA TÉCNICA DE PCRRFLP ................................................................................................................................. 33 4.2 CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DE SOROTIPOS DE SALMOELLA ATRAVÉS DA TÉCNICA DE PCR-RAPD .................................................................. 38 5 COCLUSÕES ........................................................................................................... 40 REFERÊCIAS ............................................................................................................

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LISTA DE ABREVIATURAS

ARDRA

Análise da Restrição do DNA Ribossomal Amplificado

BHI

Infusão Cérebro e Coração

CDC

Center for Disease Control

DA

Ácido Desoxirribonucleico

EDTA

Ácido Etilenodiaminotetracético

ERIC

Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus (Seqüências de consenso repetitivas intergênicas de enterobactérias)

FRLP

Restriction Fragment Length Polymorphisms (Polimorfismo por Cumprimento de Fragmentos de Restrição)

LB

Luria Betrani

OMS

Organização Mundial de Saúde

PCR

Polimerase Chain Reaction (Reação em cadeia da Polimerase)

RAPD

Random Amplified Polymorphic DNA (Polimorfismo da Amplificação do DNA

ao Acaso) RA

Ácido Ribonucléico

SDS

Dodecil Sulfato de Sódio

TE

Tris EDTA

UFC

Unidade Formadora de Colônias

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1ITRODUÇÃO

O Meio Oeste do Estado de Santa Catarina tem sua econômica basicamente voltada para agroindústria, uma forte aptidão para o setor primário de produção de alimentos e na sua industrialização. Entre os tipos alimentícios que se destacam estão os produtos cárneos, onde todas as etapas da produção são alvos de possíveis fontes de contaminação, dentre os quais e com maior importância, está o microrganismo identificado como Salmonella, que se apresenta como um dos principais entraves para a boa qualidade dos alimentos, sendo portanto, um fator de risco econômico-social e de saúde pública. Sua transmissão aos humanos ocorre através da ingestão de água ou alimentos de origem animal, crus ou mal cozidos, como carne de frango e ovos contaminados. As bactérias entéricas classificadas como Salmonella tem sido isoladas em todos os setores de abatedouro de aves e suínos incluindo os manipuladores, carcaças, equipamentos e ambiente. Este patógeno constitui-se em um dos principais microrganismos associados às enfermidades causadas por alimentos contaminados durante o processamento da matéria prima, potencializados pelas más condições de higienização do ambiente relacionado (SILVA, 2002). Diversos estudos têm priorizado a análise de sorotipos específicos de Salmonella isolados de fontes variadas. Particularmente os sorototipos Salmonella enterica subsp. enterica Enteritidis e S. enterica Typhimurium, uma vez que estes se constituem nos principais patógenos associados a infecções humanas. Neste sentido, o conhecimento da diversidade fenotípica e genotípica de sorotipos de Salmonella de ocorrência em ambientes específicos pode se constituir em dados essenciais em estudos epidemiológicos e de rastreabilidade da origem dos patógenos, de tal forma, que se possa determinar a trajetória de contaminação em etapas da industrialização ou preparo da matéria prima, além de propiciar a diferenciação entre linhagens, fazer relações filogenéticas e diagnóstico precoce e rápido (GROISMAN e cols.,, 1993; SILVA, 2002). Para tal, métodos moleculares baseados em análise de amplificação e/ou restrição de ácido desoxiribonucléico (DNA) são utilizados para discriminar as linhagens envolvidas em infecções humanas com melhor precisão que os métodos fenotípicos (QUINTAES, e cols., 2002; FARBER, 1996). Visto que, para a sorotipagem fenotípica da Salmonella, fazem-se necessários vários testes metabólicos e biológicos de triagem para a posterior definição de sua estrutura antigênica. Embora esses métodos sejam valiosos para a caracterização de isolados eles apresentam alguns problemas como o custo e o tempo (FARBER, 1996; BOPP, e cols., 1999).

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Com a disseminação dos métodos para análise de DNA, técnicas genotípicas têm sido aplicadas à tipagem ou subtipagem de isolados bacterianos (ARBEIT, 1999; TOZETTO, 2006). Esses métodos moleculares apresentam muitas vantagens sobre as técnicas convencionais. Uma das mais importantes é que como o DNA sempre pode ser extraído das bactérias, todas são tipáveis pelo método; outra é que o poder discriminatório dos métodos baseados em análise de DNA é maior que o dos procedimentos fenotípicos (FARBER, 1996). Entretanto nenhuma abordagem molecular combina reprodutibilidade e poder discriminatório com rapidez e simplicidade, principalmente sem um estudo básico e extenuante para a otimização dos processos (FARBER, 1996; ARBEIT, 1999). O estudo parte da necessidade de saber a real dimensão da diversidade e distribuição dos sorotipos de Salmonella predominantes no ambiente de abatedouros de suínos e aves, permitindo contribuir para estudos epidemiológicos e genéticos deste patógeno, o principal causador de toxinfecções alimentares.

1.1 OBJETIVOS

1.1.1 Objetivo geral

Utilizar técnicas moleculares de PCR-RFLP e PCR-RAPD para análise dos sorotipos de Salmonella mais encontrados em alimentos, especialmente oriundo da cadeia produtiva de aves de corte e abatedouros de suínos, a partir de padrões obtidos para diferenciação genotípica entre os sorotipos.

1.1.2 Objetivos específicos

• Utilizar técnicas moleculares baseadas na amplificação e clivagem da região do rDNA 16S e da região intergênica (ITS) entre os genes rDNAs 16S e 23S para identificação dos diferentes sorotipos de Salmonella;

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• Identificar novos iniciadores para a técnica de PCR-RAPD úteis para diferenciação de sorotipos; • Utilizar a técnica de PCR-RAPD para identificação de padrões moleculares dos sorotipos analisados; • Analisar o polimorfismo genético de sorotipos de Salmonellas a partir dos padrões de fragmentos específicos obtidos pelas técnicas moleculares.

2 REVISÃO

Nos últimos anos houve o envolvimento da indústria e dos governos na produção de alimentos de origem animal, garantindo sua qualidade e segurança para consumo humano. A qualidade e segurança dos alimentos tornaram-se essenciais aos processos de produção para diminuir as fortes reações negativas dos consumidores e de organizações nas crises recentes do setor de alimentos de origem animal. Programas que visam à segurança alimentar vêm proporcionando um controle efetivo em toda a cadeia produtiva, desde a produção primária até o consumo do alimento in natura ou processado. Sendo que estes programas têm como objetivo aumentar a segurança e qualidade dos alimentos produzidos, levando a um crescimento nas exportações, através da preparação do setor produtivo brasileiro para atender às exigências dos exportadores (CARDOSO; TESSARI, 2008). As toxinfecções são um grave problema enfrentado pela indústria de alimentos, dentre estas, as causadas por Salmonella é considerada uma das mais freqüentes. Segundo Cardoso e Tessari (2008) a salmonelose é um desafio para a saúde publica, no Brasil e no mundo, pois a partir da década de 70 tem ocorrido um aumento acentuado e continuo no número de casos vinculados a determinados sorotipos, os quais variam geograficamente. São vários os relatos da presença de salmonelose veiculada a ovos e carne de aves, em países como Brasil, Estados Unidos e países europeus. Levantamentos têm mostrado que cerca de 30 a 50% das carcaças de frango congeladas ou resfriadas estão contaminadas por Salmonella. No Brasil a relatos de carcaças de frango com contaminações variando entre 9,15 e 86,7% (CARDOSO; TESSARI, 2008).

2.1 O GÊNERO SALMONELLA

Bactérias do gênero Salmonella, pertencem à família das Enterobacteriacea, foram primeiramente descritas por Eberth em 1880 e cultivadas por Gaffkey em 1884. São Bastonetes Gram-negativos, não formadores de esporos, anaeróbios facultativos, fermentam glicose e reduzem nitratos a nitritos, sua temperatura ótima de crescimento é entre 35-37oC e pH 6,5-7,5 (PELCZAR e cols., 1996). Atualmente são descritos mais de 2500 sorotipos de Salmonella (CDC,2006). A

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Salmonella é classificada em espécies sendo que a classificação antigênica determina os diferentes sorovares. A classificação antigênica dos sorotipos de Salmonella é definida e mantida pela Organização Mundial de Saúde (OMS), em colaboração com o Centro de Referência e Pesquisa em Salmonella, localizado junto ao instituto Pasteur, em Paris na França. Anualmente a lista de sorotipos é atualizada e publicada (BREMMER e cols., 2000). A nomenclatura da Salmonella é considerada complexa e cientistas usam diferentes sistemas para se referir e classificar este gênero. Porém é necessária uma uniformidade da nomenclatura para uma melhor comunicação entre cientistas, funcionários de saúde e o público (BREMMER e cols., 2000).

2.1.1 Taxonomia do gênero Salmonella

De acordo com o sistema da CDC (Center of Disease Control na Prevention) o gênero Salmonella contém duas espécies, S. enterica e S. bongori. A espécie S. enterica é subdividida em seis subespécies que são designadas por nomes ou números romanos (quadro 1). A designação taxomica por nomes é considerada a mais correta, mas a com números romanos é mais simples e mais comumente utilizadas para a designação dos sorotipos. Salmonella bongori, foi originalmente designada como S. enterica subespécie enterica V, mas posteriormente passou a ser considerada uma espécie separada. Porém, para simplicidade e conveniência, a espécie Salmonella bongori, às vezes é ainda e designada “subespécie V” com finalidade de designação de sorotipo (BREMMER e cols., 2000; CDC, 2006). Quadro 1: Espécies de Salmonella, subsespécies. Salmonella enterica subspecies I Salmonella enterica subsp. enterica II Salmonella enterica subsp. salamae IIIa Salmonella enterica subsp. arizonae IIIb Salmonella enterica subsp. diarizonae IV Salmonella enterica subsp. houtenae VI Salmonella enterica subsp. indica Fonte: CDC, 2006

Assim, a nomenclatura do sorotipo Enteritidis é descrita como, Salmonella enterica subspécie enterica sorovar Enteritidis, sendo abreviada como Salmonella Enteritidis (BREMMER e cols., 2000).

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2.1.2 Identificação de sorotipos

Os sorotipos de Salmonella são identificados por uma variedade de testes. Primeiramente um isolado é identificado e a subespécie é determinada, na maioria das vezes através de testes bioquímicos. A classificação em diferentes sorovares é realizada através da determinação dos antígenos somáticos ou de parede celular (O), flagelares (H) e o antígeno de virulência (Vi). Os antígenos O e H são identificados através de ensaios de aglutinação independentes que utilizam antisoros, que reagem com um grupo de antígenos relacionados ou com um único antígeno. Em culturas mais velhas ou isolados antigos podem ser detectados mais o antígeno H. Quando apenas o antígeno H é detectado, o isolado é inoculado em meio que contém antisoro para o antígeno H, que já foi identificado. Os organismos que expressam o antígeno H, previamente descoberto são imobilizados pelo antisoro e crescem perto do ponto de inoculação. Já os organismos que expressam o segundo antígeno de H podem se mover para longe do ponto de inoculação (BREMMER, 2000; CDC, 2006).

2.2 INFECÇOES CAUSADAS POR SALMONELLA

Atualmente a Salmonelose é considerada uma das principais zoonoses para a saúde pública em todo o mundo, principalmente pela dificuldade de adoção de medidas de controle. O controle da ocorrência de infecções causadas por Salmonella não e considerado apenas um problema de saúde pública, mas também um problema econômico. Nos últimos anos os Estados Unidos obtiveram um gasto estimado entre 1,3 e 4 bilhões de dólares em decorrência de despesas médicas, faltas no trabalho e quebras de produtividade. O Brasil vem atribuindo inúmeras medidas de controle sanitário, por ser um dos maiores produtores mundiais de carne de aves e bovinos, evitando assim grandes perdas econômicas (SHINOHARA, e cols., 2008). O microrganismo Salmonella está amplamente difundido na natureza, podendo estar presente no solo, no ar, nas águas residuais, nos equipamentos, mas seu habitat natural é o trato intestinal dos seres humanos e animais. Este patógeno está envolvido em diversos casos de surtos e contaminações de origem alimentar em diversos países. As bactérias do gênero Salmonella estão entre as principais causadoras de enfermidades em humanos vinculadas a alimentos. A sua transmissão ocorre através da

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ingestão de carnes mal cozidas, leite, ovos e outros alimentos que sofreram contaminação cruzada. Os produtos de origem animal são os principais responsáveis pelas ocorrências de salmoneloses em todo o mundo (CONCEIÇÃO e cols., 2007). A salmonelose é uma infecção autolimitante, que na maioria das vezes não exige tratamento. Mas infecções invasivas ocorrem entre 5 e 10% dos casos podendo resultar em septicemia e meningite, principalmente entre crianças, idosos e pacientes com sistema imune comprometido (CONCEIÇÃO e cols., 2007). A patogenia das infecções causadas por Salmonella é considerada complexa, sendo o primeiro passo no processo da doença, a transmissão da bactéria para um hospedeiro susceptível. Para haver uma infecção são necessários 105 a 1010 UFC, variando conforme a cepa e o estado do hospedeiro. Essa quantidade de inoculo é necessária para que os microorganismos possam superar a barreira da acidez do estômago e também competir com a microbiota intestinal. Mas essa dose pode ser reduzida quando a bactéria é ingerida com alimentos que atravessam rapidamente o estomago, ou também com líquido ou alimentos que neutralizam a acidez do estômago (DARWIN; MILLER, 1999 apud ZUNCAN, 2008 p.23). Em países em desenvolvimento, como é o caso do Brasil, as doenças como a diarréia assumem maior importância devido a fatores como o consumo de água não tratada, falta de saneamento básico, desnutrição e falta de diagnóstico, o sistema de notificação de doenças transmitidas por alimentos é precária e os números de infecções por Salmonella são desconhecidos. Cerca de apenas 10% dos casos de infecções causada por alimentos são notificados no Brasil, devido principalmente a falta de fiscalização das autoridades (SHINOHARA e cols., 2008). A maioria dos sorotipos de Salmonella apresenta-se patogênicos para o homem, sendo que seus sintomas clínicos podem ser divididos em: febre tifóide, febre entérica e infecções entéricas causadas por outros tipos de Salmonella (SHINOHARA e cols., 2008). A febre tifóide só ocorre no ser humano e é causada pela S. Thyphi. Sua forma de contaminação ocorre de forma interpessoal através da ingestão de alimentos contaminados por fases humanas. Os indivíduos podem desenvolver a doença ou se tornar portador por meses ou até mesmo anos. Apresenta sintomas graves, como febre alta, diarréia e vômitos. O período de incubação dura normalmente de 7 a 21 dias e doença pode durar ate oito semanas. Em alguns casos a febre tifóide pode levar a morte, sendo caracterizada por septicemia, febre contínua, cefaléia e diarréia (SHINOHARA e cols., 2008). Quando o agente etiológico é a Salmonella Paratyphi A, B, e C, ocorre a febre entérica. Seus sintomas são mais leves, se comparados febre tifóide, podendo ocorrer

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septicemia, gastroenterite, febre e vomito. Os principais meios de contaminação são o consumo água ou alimentos como ovos, mariscos, leite e vegetais contaminados. Seu período de incubação é de 6 a 48 horas e a duração da doença é em média de três semanas (SHINOHARA e cols., 2008). Infecções entéricas causadas por outros tipos de salmonelas são também conhecidas como salmoneloses. Causam infecção gastro intestinal, ocasionando dores abdominais, diarréia, vômito e febre baixa, sendo raros casos de morte ocasionados por esse tipo infecção. Alimentos como carne bovina, aves, suínos e ovos crus são os principais meios de contaminação (SHINOHARA e cols., 2008).

2.3 DIAGNÓSTICO

Vários são os métodos utilizados para detecção de Salmonella, normalmente são utilizados testes bioquímicos, cultura fecal, sorologia por ELISA e técnicas baseadas em PCR (Reação da Polimerase em Cadeia). A quadro 2 aponta as principais vantagem e desvantagens de cada método (SMITH e cols., 2002).

Quadro2: Principais vantagens e desvantagens de métodos de detecção de Salmonella. Teste

Vantagens

Cultura fecal

Baixo custo

ELISA PCR

Desvantagens Não permite estimativa da prevalência na população, resultado demorado, flutuação da população bacteriana Alto custo Alto custo

Precisão Precisão, resultado rápido, permite identificação de sorotipos Fonte: Explorando Questões Globais em Medicina Veterinária - Brasil.

Para a sorotipagem fenotípica da Salmonella, fazem-se necessários vários testes bioquímicos para a definição de sua estrutura antigênica. Embora esses métodos sejam valiosos para a caracterização de isolados, eles apresentam vários problemas como o uso de um conjunto adequado de reagentes e procedimentos para cada organismo. A sorotipagem e a fagotipagem requerem reagentes especializados como antisoros, fagos e estirpes bacterianas para propagar os fagos, disponíveis somente em laboratórios de referência, além do sistema não estar apto a todas as espécies, pois alguns isolados não podem ser tipáveis. Outro fator

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determinante está na difícil e complexa classificação deste grupo de micro-organismo, que também dificulta a padronização inclusive de sua nomenclatura (FARBER 1996; BOPP, e cols., 1999). A identificação e subtipagem dos micro-organismos são importantes ferramentas laboratóriais, podendo auxiliar na identificação de fontes de contaminação, no controle de surtos e levar a uma redução nas taxas de transmissão. Técnicas moleculares estão sendo cada vês mais utilizadas na caracterização e identificação de sorotipos de micro-organismos, apresentando algumas vantagens sobre técnicas convencionais, como precisão e rapidez nos resultados. O micro-organismo Salmonella é amplamente difundido na natureza, e pode ser encontrado numa variedade muito grande de hospedeiros. No estudo realizado por Zuncan (2008) foram isolados sorotipos de Salmonella de carcaças de suínos, provenientes de diferentes frigoríficos, onde prevaleceu a ocorrência dos sorotipos S. Typhimurium, S.Enteritidis . Em estudo realizado por Weiss e cols., (2002) foram isolados sorotipos de Salmonella de 25 suínos através de amostras de fezes, e foram identificados os sorotipos S.Agona, S. Bredeney, S. Derbi, S. Panama e Salmonella sp. Rocha e cols., (2003) estudaram a ocorrência de Salmonella em pintos de corte de um dia e 55,6% dos lotes analisados apresentaram contaminação, sendo isolados os sorotipos S.Enteritidis e S. Heidelberg. Já um estudo realizado por Tiollie e Costa, 2005, onde foram avaliados carcaças de frango vendidas em feiras livres da cidade de Manus/AM apontou uma contaminação de 50% das amostras analisadas, sendo que o sorótipo S. Panama obteve uma ocorrência maior, estando presente em 22,4% das amostras. Os dados apresentados acima

demostram a real dimensão da ocorrência de

contaminação por Salmonella em todas as etapas da cadeia produtiva de carnes e produtos derivados. Neste contexto este trabalho procurou desenvolver metodologias simples, baratas e precisas para caracterização e diferenciação de sorotipos de Salmonella, isoladas da região de Videira/SC, sendo que os sorotipos utilizados neste estudo são os mais frequentemente isolados nos diferentes estágios da cadeia produtiva. Santos e cols., (2001) demostraram com sucesso a utilização da reação de PCR para a detecção de Salmonella atravês da amplificação do gene invA, que é responsável pela penetração deste micro-organismo no hospedeiro, mas por outro lado a amplificação deste gene, detecta a presença de Salmonella, mas não consegue distinguir um sorotipo de outro. Um ponto central para realização deste trabalho veio da necessidade do desenvolvimento de técnicas mais eficientes e de alta reprodutibilidade, que possibiltam a discriminação de

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sorotipos de Salmonella de maneira rápida e precisa. Neste contexto as técnicas baseadas na amplificação e clivagem do 16S rDNA e região intergênica 16S-23S rDNA apresentaram grande poder discriminatório, o que faz com que estas metodologias tenham um futuro promissor.

2.3.1 Diagnósticos baseados em PCR (Polimerase Chain Reaction)

A reação em cadeia da polimerase foi desenvolvida por Kary Mullis em meados da década de 80 (MULLIS e FALOONA, 1987). Essa técnica desde sua criação causou uma grande revolução na biologia, tanto na pesquisa, para o entendimento dos processos biológicos fundamentais, como nas áreas de diagnósticos, e melhoramento genético vegetal e animal. A importância da técnica desenvolvida por Mullis concedeu-lhe o prêmio Nobel de medicina no inicio dos anos 90. PCR é uma técnica que envolve a síntese in vitro de milhões de cópias de um segmento específico de DNA, na presença da enzima DNA polimerase (Figura1). A reação se baseia no anelamento e extensão enzimática de um par de oligonucleotídeos (pequenas moléculas de DNA de fita simples) utilizadas como iniciadores (primers), que delimitam a seqüência de DNA de fita dupla alvo da amplificação. Esses iniciadores são sintetizados artificialmente, de maneira que suas seqüências sejam complementares as seqüências que se deseja amplificar (MULLIS e FALOONA, 1987). Uma reação de PCR é dividida em três etapas: desnaturação, anelamento e extensão. A fita dupla de DNA é desnaturada por meio do aumento da temperatura para 92 a 95°C. Na etapa de anelamento, a temperatura é diminuída para 35 a 60°C, dependendo essencialmente do tamanho e seqüência do iniciador a ser utilizado, permitindo a hibridização DNA-DNA de cada iniciador com a seqüência que se deseja amplificar. Na terceira etapa, a temperatura é elevada para 72°C para que a enzima DNA polimerase realize a extensão da nova fita de DNA a partir de uma fita molde. Esta extensão envolve a adição de nucleotídeos, utilizando como molde a seqüência- alvo, de modo que uma cópia desta seqüência é feita no processo (MULLIS e FALOONA, 1987). Este ciclo é repetido dezenas de vezes, sendo que a quantidade de DNA dobra a cada ciclo. A amplificação segue uma progressão geométrica, de maneira que no vigésimo ciclo, é produzido mais de um milhão de cópias. Esta escala permite começarmos a reação com

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quantidades mínimas de DNA e terminá-la terminá com grandes andes quantidades de uma seqüência de DNA específica (MULLIS MULLIS e FALOONA, 1987).

Figura 1: Funcionalidade da PCR - ciclos de uma reação. Fonte: O autor (2009).

No início da década de 80, nos experimentos iniciais da PCR, utilizava-se utilizava a enzima DNA polimerase termo lábil extraída de E.coli,, cuja temperatura ótima de polimerização é de 37°C. Esta era adicionada manualmente a cada ciclo de amplificação, uma vez que, sendo termo lábil, era destruída toda vez que a temperatura atingisse 95°C para ocorrer à desnaturação da fita. No de 1988, Saiki e cols., (1988) isolaram uma DNA polimerase (Taq DNA polimerase) da bactéria Thermus aquaticus que vive em fontes térmicas, e a temperatura de polimerização é a 72°C, mantendo assim sua atividade a 95°C. Isso possibilitou a completa automatização do processo de PCR, através da utilização de aparelhos chamados de termocicladores (SAIKI e cols., 1988). A reação de PCR pode ser utilizada utilizada na detecção direta da presença de um agente em uma amostra clínica. Neste caso verifica-se verifica se a presença do agente através da complementaridade entre os iniciadores e o DNA presente na amostra. Mas esse método de análise pode ser de grande auxilio na identificação id do gênero Salmonella em isolados e é empregada em vários métodos de genotipagem ou caracterização molecular (SANTOS ( e cols., 2001). Varias técnicas baseadas em PCR tem sido utilizadas para a detecção e caracterização de microorganismos dentre estas estas destacamos a amplificação de elementos de DNA repetitivo altamente conservados, conhecido como rep-PCR. rep PCR. As principais seqüências repetitivas

23

incluem a seqüência REP (Repetitive Sequence Extragenic Palindromic) que possui de 3540pb, a seqüência ERIC (Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus) que possui de 124-127pb e a seqüência BOX com 154 pb (ALVES e cols., 2003). Alcocer e cols., (2006) utilizaram a técnica de REP- PCR e ERIC-PCR para diferenciação de sorotipos de Salmonella. Neste estudo a técnica de REP-PCR apresentou resultados positivos, sendo possível diferenciar os sorotipos estudos, os quais apresentando padrões diferentes de bandas, já a técnica de ERIC-PCR apresentou-se pouco discriminativa. Dentre as técnicas que apresentam grande potencial para diferenciação e caracterização de micro-organismo estão a PCR-RAPD e a PCR-RFLP, que foram utilizadas neste estudo. A descrição destas técnicas e mostrada a seguir.

2.3.1.1 PCR-RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphisms)

Grande parte dos estudos das relações filogenéticas de bactérias é baseada na analise dos genes ribossomais 16S, 5S e 23S. Dentre estes o 16S rDNA tem sido mais amplamente utilizado para delinear as relações entre famílias, gêneros e espécies (SERAFINI e cols., 2002). A análise comparativa das seqüências de nucleotídeos, de organismos próximos, mostra que estas regiões do genoma são altamente conservadas em diferentes níveis taxonômicos, mas possuem algumas regiões altamente variáveis, as quais podem ser utilizadas para fazer uma diferenciação em nível especifico e infra-específico (SERAFINI e cols., 2002). A utilização do gene 16S tem adquirido grande importância na taxonomia bacteriana, aumentando consideravelmente o número de espécies. Assim propõem que a utilização da análise da seqüência do 16S rDNA possam vir a substituir em parte a hibridização de DNA na descrição de novas espécies bacteriana (SERAFINI e cols., 2002). Além do gene 16S, a região espaçadora entre 16S e 23S vem se revelando promissora para caracterização bacteriana, por apresentar uma variação significativa para esse tipo de análise, esta região apresenta diferenças em sua seqüência e no seu tamanho (SERAFINI e cols., 2002). Para a análise das variabilidades destas seqüências são utilizadas técnicas baseadas em PCR, como é o caso do RFLP, Nesta técnica essas regiões são amplificadas por PCR e o produto da amplificação é digerido por enzimas de restrição (AMANN e cols., 1995).

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Alguns trabalhos baseiam-se apenas amplificação, clonagem e seqüenciamento desta região para a posterior comparação entre as seqüências para a obtenção dos resultados, o que, entretanto, reflete na necessidade de uma estrutura adequada e no maior gasto com a obtenção da seqüência do rDNA 16S de cada organismo. Por outro lado, apenas com a amplificação e clivagem com endonucleases de restrição também é possível obter resultados reproduzíveis e satisfatórios na sorotipagem e na caracterização dos isolados de maneira rápida e menos dispendiosa (BORZANI e cols.,, 2001; SAMBROOK E RUSSEL, 2001) Uma técnica que vem apresentando resultados satisfatórios para caracterização de micro-organismos é a análise da restrição do DNA ribossomal amplificado (ARDRA). Junior e cols., (2004) demonstraram com sucesso a utilização desta técnica na caracterização e diferenciação a de isolados Azospirillum através da amplificação e clivagem das regiões 16S rDNA, 23S rDNA e região intergênica 16S-23S rDNA. Neste estudo foi possível determinar o padrão de restrição de estipes de Azospirillum relacionadas, evidenciando seu sítio de origem e as espécies de Brachiaria que colonizam. Além dessas técnicas de identificação de polimorfismos por amplificação e clivagem de seqüência amplificada de DNA ribossômico, é necessária a utilização de técnicas para a análise de DNA tais como: eletroforese em gel de agarose; separação de fragmentos de DNA por tamanho em pares de base e estimativa do mesmo; eletroforese em gel de poliacrilamida. Além da extração de ácidos nucléicos totais e de DNA dos diferentes sorotipos e isolados, para utilização como molde na reação. Métodos estes, utilizados para a discriminação de linhagens de grupos bacterianos de diferentes origens, podem ser desenvolvidos no laboratório de genética e biologia molecular da Unoesc/Videira/SC. No presente estudo terão prioridades as técnicas de amplificação de DNA baseadas em PCR que têm sido mais freqüentemente utilizadas em estudos desta natureza (CANHOS e cols., 1999; SAMBROOK e RUSSEL, 2001; JIN e cols., 2006).

2.3.1.2 PCR – RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA)

Umas das técnicas mais utilizadas para a diferenciação de microorganismos e a técnica de RAPD. Os primeiros estudos que utilizaram esses métodos foram feitos em 1990 e a partir de então tem sido amplamente utilizados na diferenciação de micro-organismos, estudos de diversidade genética e resolução de grupos taxonômicos. Esta técnica é baseada em uma

25

reação de PCR, na qual se utiliza iniciadores de seqüências aleatórias com cerca de 10 nucleotídeos. A grande vantagem desta técnica é que ela pode ser utilizada em qualquer tipo de bactéria e não há necessidade de conhecimento prévio do genoma (SERAFINI e cols., 2002). O resultado da PCR pode então ser visualizado por eletroforese, permitindo a comparação de diferentes isolados bacterianos através da identificação do tamanho dos fragmentos. O peso molecular e o número de bandas variam de acordo com a amostra utilizada e a uniformidade de bandas em organismos relacionados. Assim, podem-se comparar os perfis obtidos para diferenciar linhagens ou espécies, sendo que há bandas presentes em uma determinada espécie ou grupo, mas está ausente em espécies relacionadas (SERAFINI e cols., 2002). Vários trabalhos têm utilizado a técnica de RAPD na diferenciação de sorotipos de Salmonella, apresentado resultados bastante significativos, quando comparados e métodos tradicionais de detecção (QUINTAES e cols., 2004; MALORNY e cols., 2000; BETANCOR e cols., 2004; QUINTAES e cols., 2002).

26

3 METODOLOGIA

Este trabalho foi realizado na forma de projeto de pesquisa visando à utilização de técnicas moleculares baseadas no polimorfismo do DNA para caracterização e diferenciação de sorotipos de Salmonella.

3.1 ISOLADOS BACTERIANOS

As cepas de Salmonella analisadas pertencem ao banco de cepas da Universidade do Oeste de Santa Catarina. A maioria cepas foram obtidas através de um projeto de pesquisa que determinou a ocorrência de enterobactérias, com ênfase em bactérias patogênicas, em abatedouros de suínos e na cadeia produtiva de aves.

3.2 CONDIÇÕES DE CULTIVO E MEIOS DE CULTURA PARA SALMOELLA

Os isolados de Salmonella foram previamente cultivados em meio de Infusão Cérebro e Coração (BHI), incubados 35-370C/24h. Posteriormente as células foram repicadas em placas com Luria Betrani (LB) sólido; compondo-se basicamente de: cloreto de sódio, triptona e extrato de levedura; e incubadas a 35-37oC/ 24 h para isolamento. As colônias isoladas foram replicadas em meio LB liquido e incubadas a 35-37oC/ 24h.

3.3 EXTRAÇÃO DE DNA BACTERIANO

A extração do DNA foi realizada seguindo-se o método descrito por Sambrok e cols., (2001). Culturas bacterianas foram transferidas para um microtubo de centrifuga, e centrifugada a 10000rpm durante 2 minutos. O sobrenadante foi descartado e as bactérias foram ressuspendidas em 1000uL de solução salina-EDTA. A solução foi centrifugada a 10000rpm durante 2 minutos, o sobrenadante foi desprezado e as células foram ressuspensas

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em 450ul de solução salina-EDTA. Foram adicionados 5uL de lisozima (20mg/mL) e a suspensão foi incubada a temperatura ambiente por 10 minutos. Transcorrido esse período foram adicionados 10uL de proteinase K (60mg/mL), mistura foi então incubada a 370C por 12 horas. Foram então adicionados 100uL de fenol-clorofórmio-álcool isoamilíco (25:24:1), as amostras foram homogeneizadas suavemente por inversão e centrifugados a 1000rpm por 20 minutos. O sobrenadante foi recolhido em um novo tubo, foram adicionados 100uL de clorofórmio-álcool isoamílico (24:1) e novamente centrifugados a 10000rpm por 20 minutos. O sobrenadante foi recolhido em um novo tubo, foram adicionados 5uL de RNase (20mg/dL) e a mistura foi incubada por 1 hora a 37oC. O DNA foi precipitado com 1,5V de isopropanol e centrifugado a 10000rpm por 20 minutos. O sobrenadante foi desprezado, e foram adicionado 1mL de etanol 80% e centrifugado a 10000rpm por 20 minutos. O sobrenadante foi desprezado, o precipitado foi seco a temperatura ambiente e ressuspenso em 50uL de solução salina-EDTA.O DNA foi então quantificado em gel de agarose 2% e a visualização do DNA extraído foi realizada sob iluminação ultra violeta em sistema de foto documentação Vilber Lourmat. O material foi então armazenado a -20oC para a utilização no decorrer dos experimentos.

3.4 INICIADORES DE PCR PARA A AMPLIFICAÇÃO DO rDNA 16S E INTERGÊNICA ENTRE OS RDNAS 16S e 23S

Os iniciadores para a amplificação do rDNA 16S anelarão em seqüências conservadas nas regiões flanqueadoras do gene sendo a seqüência dos iniciadores: FD1 (5’ – AGAGTTTGATCCTGGGTCAG – 3’) e RP2 (5’ –GGCTACCTTGTTACGACTT -3’), previamente descritos por Woo e colaboradores (2001). E para a amplificação da região intergênica

entre

os

rDNAs

16S

e 23S

foram

os

iniciadores:

16-1A

(5’ -

GTCGGAATCGCTAGTAATCG -3’) e 23-1B (5’ – GGGTTCCCCCATTCGGA – 3’), previamente descrita por Baudart e colaboradores (2000). Os iniciadores foram sintetizados pela empresa especializada K & M QUÍMICA LTDA. A figura 2 demonstra as regiões do DNA que foram amplificadas. Indicando o local de anelamento dos iniciadores.

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Figura 2: Regiões do rDA amplificadas. amplificadas. Representação das regiões 16S rDNA rD e intergênica 16S23S rDNA. Regiões em preto representam tRNAs expressos na região intergênicas da maioria das bactérias Gram-negativas. Fonte: Copilado lado de Serafini e cols, cols 2002.

A reação de PCR foi realizada em termociclador marca Thermo Eletron modelo mod HBSP02110. Os componentes da reação podem ser observados no quadro 3. O programa utilizado para a reação de amplificação de DNA (PCR) com os oligonucleotídeos (iniciadores) da região 16S rDNA e a região intergênica 16S-23S 16S 23S rDNA teve as seguintes condições: 960C por 5 minutos , 940C por 40 s, 500C por 1 minutos, 720C durante 1: 30 minutos , repetindo a partir do passo dois 30 vezes, 720C por 10 minutos e 40C por 10 minutos, de acordo com a metodologia previamente publicada (BAUDART (BAUDART e cols., 2000; WOO e cols., 2000).

29

Quadro 3: Componentes das reações de amplificação de DA por PCR-RFLP. Indicação dos componentes e quantidades utilizadas na reação. Componentes Concentração Volume/µl Tampão de reação 2,5 10x DNTPs 2,0 1Mm DNA molde 3,0 100 ng/µl # Direto 1,0 50 pmol # Reverso 1,0 50 pmol Taq DNA-polimerase 0,5 2,5 U/µl H2O Mili-Q (pura) 13,5 Final 25 Fonte: O autor (2009)

3.5 INICIADORES E PCR-RAPD

Foram também utilizados no estudo iniciadores RAPD: H15, H16, H17, H18, H19 e H20, gentilmente cedidos pelo pesquisador da Epagri, Dr. Marco Antonio Dalbó. Os componentes da reação de PCR-RAPD podem ser visualizados no quadro 4. Quadro 4: Componentes das reações de amplificação de DA por PCR-RAPD. Indicação dos componentes e quantidades utilizadas na reação Componentes Concentração Volume/µ µl Tampão de reação 2,5 10x MgCl2 1,5 50mM DNTPs 2,0 1mM DNA molde 2,0 100 ng/µl Iniciador 1,0 50 pmol Taq DNA-polimerase 0,5 2,5 U/µl H2O Mili-Q (pura) 15,5 Final 25 Fonte: O autor (2009)

O programa utilizado para reação de PCR-RAD teve as seguintes condições: 94°C por 5 minutos, 37°C por 1 minutos, 72°C por 1:30 minutos, repetindo a partir do passo 2 por 35 vezes, 72 °C por 10:00 minutos e 4°C por 10 minutos (PAGNO, 2008).

3.6 CLIVAGEM DOS PRODUTOS DE AMPLIFICAÇÃO DE DNA BACTERIANO

A clivagem dos produtos de amplificação da região 16S rDNA e da região intergênica

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16S rDNA e 23S rDNa foram realizadas com as seguintes endonucleases de restrição: Alu I (AGCT); Hinf I (GANT) segundo procedimento sugerido pelos fabricantes (Jena Bioscience). O produto final foi analisado em gel de agarose 3%.

3.6.1 Eletroforese em Gel de Agarose

A agarose, na concentração de 1,0 a 3,0%, foi fundida em TAE 1x (tampão), adicionando brometo de etídio, para a concentração final de 0,5 µg/ml. A eletroforese foi realizada em tampão TAE 1x. Sendo adicionado ao DNA, a ser analisado, tampão de amostra numa concentração final de 1x. Após a eletroforese, o DNA foi visualizado em transiluminador de UV com comprimento de onda curto. O tamanho dos fragmentos de DNA foi estimado com base nos padrões do marcador Ladder 100pb (SAMBROOK e RUSSEL, 2001). A comparação dos padrões de bandas obtidos entre os diversos sorotipos e isolados para as diferentes técnicas foi realizada sob iluminação ultravioleta em sistema de foto documentação Vilber Lourmat, as fotografias obtidas foram analisadas no programa Microsoft Office Picture Manager.

31

4 RESULTADOS E DISCUSSÃO

Um ponto fundamental na análise nas técnicas moleculares para identificação e caracterização de micro-organismos é o DNA molde utilizado na reação de PCR. Em nosso trabalho encontramos muitas dificuldades para obter um DNA limpo e em quantidade suficiente para gerar uma amplificação de qualidade. As metodologias testadas para extração de DNA foram todas variações da metodologia descrita por Sambrock, 2001. A metodologia que obteve melhores resultados está descrita no item metodologia e o resultado pode ser observado na fotografia 1.

Fotografia 1: - Extração de DA Genômico. Eletroforese em gel de agarose 1,5%, amostras de DNA genômico. Fonte: O Autor (2009)

Segundo Quintaes e cols., (2004), a qualidade do DNA é um fator determinante o sucesso da reação de amplificação. No estudo realizado por estes os autores observou-se que em reações de RAPD, a concentração de DNA utilizado influencia concideravelemente o resultado da reação, quando foram utilizados 20ng/uL de DNA obteve-se um perfil de amplificação considerálvel, mas quando a concentração de DNA foi aumentada para 40ng/uL, algumas bandas não amplificaram, já quando foi aumentado a concentração dos iniciadores de 20ng/uL para 40ng/uL as amplificações foram idênticas. Já Tyler e cols., (1997) demostraram que são inúmeros os fatores que afetam a reprodutividade da técnica de PCR para detecção de mico-organismos, dificultando a interpretação dos resultados por diferentes laboratórios. Segundo estes mesmos autores existem vários fatores que efetam a reprodutividade destas técnicas, como a concentração de MgCl2, o fornecedor e a concentração de Taq polimerase, o lote dos iniciadores, o método de extração do DNA e até mesmo o modelo do termociclador

32

utilizado.

4.1 CARACTERIZAÇÃO DE SALMOELLA BASEADA NA TÉCNICA DE PCR-RFLP

Vários trabalhos de caracterização bacteriana tem utilizado como base o gene ribossomal 16S e a região espassadora entre 16S e 23S também conhecida como ITS (CHANG e cols., 1997; CHRISTENSEN e cols., 2000; LUZ e cols., 1998; LAGATOLLA, e cols., 1996; CHRISTENSEN, e cols., 2000 ). Essas regiões do genoma bacteriano apresentam além de partes conservadas que são importantes para investigações taxonomicas alguns fragamentos altamente variáveis que podem ser utilizados para caracterização e distinção de sorotipos de microorganismos (SERAFINI e cols., 2002) . A técnica de PCR-RFLP é amplamente utilizada na caracterização e diferenciação molecular de várias especies. Uma etapa fundamental para o sucesso de uma desta técnica, é a amplificação da sequência que será clivada pelas enzimas de restrição. A região 16S rDNA contém aproximandamente 1550pb, sendo compostas por regiões altamente conservadas e regiões polimorficas, sendo que essas podem ser utilizadas para promover a caracterização de micro-organismos (CLARRIDGE, 2004). Geralmente o gene 16S rDNA é universal em bacterias e pode ser utilizado para medir relações entre esses micro-organismos, a comparação desta sequencia permite a diferenciação a nível de gênero, espécies e até mesmo em nível de sub-espécies (CLARRIDGE, 2004). A fotografia 2, demonstra amplificação da região 16S rDNA realizada neste estudo. 1 2

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9

Fotografia 4: Amplificação. da região rDA16S . 1. S. Typhi, 2. S. Typhimurium, 3. S. Enteritidis , 4. S. Arizonae, 5. Salmonella sp., 6. S. Panama, 7. S. Moraelia, 8. S. Heidelberg, 9. S. Derby. Fonte: O Autor (2009).

A análise de restrição da região do 16S rDNA com a enzima de restrição Alu I

33

(fotografia 3) apresentou a formação de quatro diferentes perfis. O perfil A, foi encontardo para os sorotipos de S. Typhi, S. Typhimurium, S. Enteritidis e Salmonella sp. com a formação de fragmentos com 250 pb, 350pb , 380pb e 600pb. O perfil B foi encontrado apenas para S. Arizonae com 200pb e 250 pb. O percil C foi encontrado apenas para Salmonella sp. com a formação de fragmentos de aproximadamente 350pb, 500pb e 600pb. E o perfil D foi encontrado para os sorotipos S. Panama, . S. Moraelia, S. Heidelberg. S. Derby. M

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3

4

A

A

A

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D

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1500pb 1000pb 900pb 800pb 700pb 600pb 500pb 400pb 300pb

200pb

100pb

A

D

Fotografia 3 : Reação de PCR-RFLP região 16S Enzima Alu I. Eletroforese em gel de agarose 2%. M. marcador Ladder 100pb., 1. S. Typhi, 2. S. Typhimurium, 3. S. Enteritidis , 4. S. Arizonae, 5. Salmonella sp., 6. S. Panama, 7. S. Moraelia, 8. S. Heidelberg, 9. S. Derby. Fonte: O Autor (2009).

Atravês da análise de restrição da região 16S DNA de Salmonella com a enzima Hinf1 (fotografia 4) foram encontrado 8 perfis distintos dentre os nove analisados. A S. Typhi apresentou 6 perfis com 350pb, 700pb, 900pb, 1000pb, 1400pb e 1550pb. S. Typhimurium e S. Enteritidis apresentaram apenas duas bandas com 350 e 700pb. S. Arizonae apresentou umm perfil diferentes dos outros sorotipos analisados com bandas de aproximadamente 110pb, 200pb, 280pb, 320pb.

34

M

1

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3

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6

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1500pb 1000pb 900pb 800pb 700pb 600pb 500pb 400pb 300pb

200pb

100pb

A

B

B

C

D

E

F

G

H

Fotografia 4: Reação de PCR-RFLP região 16S rDA Enzima Hinf I. Eletroforese em gel de agarose 2%. M. marcador Ladder 100pb. 1. S. Typhi, 2. S. Typhimurium, 3. S. Enteritidis , 4. S. Arizonae, 5. Salmonella sp., 6. S. Panama, 7. S. Moraelia, 8. S. Heidelberg, 9. S. Derby. Fonte: O Autor (2009).

Outra

importante

região

utilizada

na

caracterização

e

diferenciação

de

microorganismos está baseada na amplificação da região intergênica entre o DNA 16S e 23S. Alguns trabalhos já se basearam nesta técnica para diferenciação de Salmonella a nível de sorotipo e até mesmo para determinar diferenças dentro de um mesmo sorotipo (Lagattola, e cols., 1996). A região intergênica 16S-23S é uma região altamente polimórfica e pode ser encontrada mais de uma cópia no cromossomo bacteriano (LAGATOLLA, e cols., 1996; CHRISTENSEN, e cols., 2000). A fotografia 5 representa a amplificação da região 16S-23S , podem ser observados diferentes perfis de amplificação, sendo que para alguns dos sorotipos analisados foram observados mais de um produto de amplificação. Outros trabalhos relatam a formação de mais de um produto de amplificação (LAGATOLLA, e cols., 1996; CHRISTENSEN, e cols., 2000). No trabalho realizado por Lagotta e cols., (1996) foram estudados 218 isolados pertencentes a 10 sorotipos. Neste estudo os sorotipos S. enteretide, S. Panama, S. Goldcoast, S. London e S. Heidelberg

apresentaram perfis idênticos e mais de um produto de

amplificação. Isso é explicado pelo alto grau de polimorfismos desta região e pela alta quantidade de cópias dos genes que codificam para o rRNA 16S e rRNA 23S.

35

Em nosso estudo S. Tyhi, S. Typhimurium, S. Enteritidis , apresentaram perfil identico, com a formção de duas bandas com cerca de 700pb e 750pb. Os sorotipos S. Moraelia e S. Derby também apresentaram padrões de bandas idênticos, com cerca de 500pb, 600pb e 650pb. Já os sorotipos S. Arizonae (700pb) , S. Panama (650pb) e Salmonella sp.( 650pb, 700pb e 750pb) apresentaram padrões únicos de amplificação.

M

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587pb 458pb 260pb 100pb

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Fotografia 5: Amplificação da região intergênica 16S-23S . 1. S. Typhi, 2. S. Typhimurium, 3. S. Enteritidis , 4. S. Arizonae, 5. Salmonella sp., 6. S. Panama, 7. S. Moraelia, 8. S. Salmonella sp, 8. S. Derby. Fonte: O Autor (2009).

Os estudos relatados na literatura baseam-se somente na amplificação da região 16S23S. Em nosso trabalho os produtos da amplificação também foram clivados com enzimas de restrição para aumentar a capacidade descriminatória do método. O produto da reação de clivagem com a enzima Alu I pode ser visualizado na fotografia 6. Foram obtidos atráves da clivagem com esta enzima quatro diferentes perfis. S. Typhi, S. Arizonae e Salmonella sp. obtiveram o mesmo padrão de bandas com 100pb, 230pb, 250pb e 380pb. S. Typhimurium e S. Enteritidis apresentaram bandas de 100pb, 180pb, 250pb, 300pb, 380pb. S. Moraelia e S. Derby apresentaram bandas de 250pb, 300pb e 500pb. S. Heidelberg apresentou bandas de 130pb, 200pb, 250pb, 380pb e 450pb.

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100pb

A

B

B

A

A

C

D

C

Fotografia 6: Reação de PCR-RFLP região 16S-23S DA enzima Alu I Eletroforese em gel de agarose 3%. M. marcador Ladder 100pb. 1. S. Typhi, 2. S. Typhimurium, 3. S. Enteritidis , 4. S. Arizonae, 5. Salmonella sp., 6. S. Moraelia, 7. S. Heidelberg, 8. S. Derby. Fonte: O Autor (2009).

A fotografia 7 representa a clivagem do produto de amplificação da região 16S-23S pela enzima Hinf I. Todos os sorotipos análisados, exceto S. Moraelia e S. Derby apresentaram perfis diferentes para essa enzima de restrição. S. Typhi apresentou bandas com 100pb, 500pb, 600pb, 750pb e 800pb. S. Typhimurium apresentou bandas com 100pb, 300pb, 400pb, 550pb, 600pb, 750pb e 800pb. S. Enteritidis apresentou bandas com 100pb, 250pb, 300pb, 400pb e 600pb. S. Arizonae apresentou bandas 580pb, 600pb,700pb. Salmonella sp. apresentou bandas de 100pb, 250pb, 350pb e 500pb. S. Panama 100pb, 300pb, 350pb, 480pb, 550pb. S. Moraelia e S. Derby apresentaram bandas de 350pb e 450pb. S. Heidelberg apresentou bandas com 100pb, 400pb, 450pb, 600pb, 650pb.

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G

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Fotografia 7: Reação de PCR-RFLP região 16S-23S DA enzima Hinf 1. Eletroforese em gel de agarose 2%. M. Marcador E 840. 1. S. Typhi, 2. S. Typhimurium, 3. S. Enteritidis , 4. S. Arizonae, 5. Salmonella sp., 6. S. Panama, 7. S. Moraelia, 8. S. Heidelberg, 9. S. Derby. Fonte: O Autor (2009).

4.2 CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DE SOROTIPOS DE SALMOELLA ATRAVÉS DA TÉCNICA DE PCR-RAPD

A técnica de PCR–RAPD, tem sido amplamente utilizada em estudos de caracterização e diferenciação molecular de Salmonella (SANTOS, 2003; JIN e cols., 2006; MALORNY e cols., 2000; BETANCOR e cols., 2003; QUINTAES e cols., 2002; ZUCON, 2008; TOZZETO, 2006). Neste trabalho foram testados 6 iniciadores de RAPD, não descritos na literatura para identificação e caracterização de Salmonella. Sendo estes H15, H16, H17, H18, H19 e H20. Os iniciadores H16, H19 e H20 não apresentaram resultados significativos, para estudos de caracterização de Salmonella. Entretando os iniciadores H15, H17 e H18 apresentaram resultados bastante significativos para estudos futuros. Para os iniciadores H17 e H18, serão necessários mais testes para determinar a melhor temperatura de anelamento, pois utilizando-se da temperatura de 37oC verificou-se diferença nos padrões de amplificação formados, mas não foi possivel determinar a real dimensão da diferença entre os sorotipos analisados. Já iniciador H15 apresentou resultado significativo há uma temperatura de anelamento 37oC. Com a utilização do iniciador H15, foram obtidos quatro diferentes perfis entre os

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sorotipos utilizados neste estudo, variando de 200pb a 700pb (fotografia 8).O perfil A apresentou a formação de três fragmentos com 250pb, 300pb e 600pb, para S. Typhi, S. Enteritidis . O perfil B foi encontrado para S. Typhimurium e S. Enteritidis , com fragmentos de 200pb, 300pb e 450pb. O perfil C foi encontrado para Salmonella sp. e S. Panama, apresentando a formação de três fragmentos com 230pb, 300pb e 550pb. O perfil D, foi encontrado para os S. Moraelia, S. Heidelberg e S. Derbi, apresentando fragmentos de 230pb, 300pb e 400 pb. Todos os sorotipos de Salmonella utilizados neste estudo apresentaram com iniciador H15 uma banda com aproximadamente 300pb. M

1

2

3

4

5

B

B

A

C

6

7

8

9

1500 pb 1000 pb 900 pb 800 bp 700 pb 600 pb 500 pb 400 pb 300 pb 200 pb

100 pb

A

C

D

D

D

Fotografia 8: PCR – RAPD Iniciador H15. Eletroforese em gel de agarose 2%. M. marcador Ladder 100pb.1. S. Typhi, 2. S. Typhimurium, 3. S. Enteritidis , 4. S. Arizonae, 5. Salmonella sp., 6. S. Panama, 7. S. Moraelia, 8. S. Heidelberg, 9. S. Derby.

Fonte: O Autor (2009).

Para o iniciador para PCR-RAPD H17 serão necessários mais testes, pois até o momento não se conseguiu uma qualidade de amplificação satisfatória, para determinar um perfil molecular. Mas apesar da baixa qualidade da amplificação podem ser observadas (fotografia 9) diferenças entre os sorotipos utilizados neste estudo, o que indica que este iniciador pode ser utilizado em estudos futuros para determinação de sorotipos de Salmonella. Para se obter um melhor resultado pode-se aumentar a concentração de MgCl2 para que o iniciador se anele em regiões menos específicas, ocasionando assim uma maior quantidade e qualidade de amplificações.

39 M

1

2

3

4

5

6

7

8

9

1500 pb 1000 pb 900 pb 800 pb 700 bp 600 bp 500 bp 400 bp 300 pb 200 pb

100 pb

Fotografia 9: PCR – RAPD Iniciador H17. Eletroforese em gel de agarose 2%. M. marcador Ladder 100pb, 1. S. Typhi, 2. S. Typhimurium, 3. S. Enteritidis , 4. S. Arizonae, 5. Salmonella sp., 6. S. Panama, 7. S. Moraelia, 8. S. Heidelberg, 9. S. Derby. Fonte: O Autor (2009)

Para o iniciador de RAPD H18 (fotografia 10) serão necessários mais testes de amplificação, mas notam-se diferenças significativas entre os padrões de bandas formados. M

1

2

3

4

5

6

7

8

587pb 458pb

260pb

100pb 20pb

Fotografia 10 : PCR – RAPD Iniciador H18. Eletroforese em gel de agarose 2%. M. marcador Ladder 100pb. 1. S. Typhi, 2. S. Enteritidis , 3. S. Arizonae, 4. Salmonella sp., 5. S. Panama, 6. S. Moraelia, 7. S. Heidelberg, 8. S. Derby. Fonte: O Autor (2009).

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5 COCLUSÕES

• Através da amplificação e clivagem da região rDNA 16S foi possível diferenciar os sorotipos de Salmonella estudos. • Através da amplificação e clivagem da região integênica entre o rDNA 16S e rDNA 23S foi possível diferenciar os sorotipos de Salmonella estudados. Sendo que esta técnica é altamente promissora e ainda pouco explorada na caracterização de diferenciação de Salmonella. • Os iniciadores de RAPD H15, H17 e H18, apresentam-se com potencial para estudos de diferenciação molecular de Salmonella, entretanto serão necessários mais alguns testes para os iniciadores H17 e H18 melhorando assim a qualidade das amplificações. • Os resultados obtidos trazem a perspectiva da utilização das técnicas baseadas na amplificação e clivagem da região rDNA 16S e região intergênica entre rDNA 16S e rDNA 23S em novos estudos de caracterização de Salmonella polimorfismos dentro de um mesmo sorotipo.

e também para detectar

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