Trabajo Practico3

   

Universidad  de  Chile   Facultad  de  Ciencias  Químicas  y  Farmacéuticas   Bioquímica       Trabajo  Práctico  N°  3   Análisis  de  proteínas  por  electroforesis  en  geles  denaturantes  de  poliacrilamida   Precaución:  La  acrilamida  es  neurotóxico,  como  monómero.  Utilizar  guantes.   Antecedentes:     La   electroforesis   es   el   proceso   por   el   cual   moléculas   cargadas   en   solución   se   mueven   por   efecto  de  la  aplicación  de  un  campo  eléctrico.  La  velocidad  a  la  cual  las  moléculas  se  desplazan   en   un   campo   eléctrico   varía   con   la   carga,   forma   y   tamaño   de   la   molécula,   así   como   también   con   el   voltaje   aplicado.   Por   esta   razón,   las   técnicas   electroforéticas   han   sido   extensamente   desarrolladas  para  la  separación  de  moléculas  como  proteínas  o  ácidos  nucleicos.       SDS-­‐  PAGE,  electroforesis  en  geles  de  poliacrilamida  con  SDS:   Corresponde   a   un   tipo   particular   de   electroforesis   muy   utilizado   para   la   separación   de   proteínas  en  una  mezcla,  así  como  para  la  estimación  de  pesos  moleculares  de  proteínas  (1,2).       Entre  las  características  relevantes  de  esta  metodología,  se  pueden  destacar:     1.  Este  tipo  de  electroforesis  se  realiza  en  geles  de  poliacrilamida  (2).  La  poliacrilamida  es  un   polímero   que   se   forma   a   partir   de   monómeros   de   acrilamida   que   se   entrecruzan   con   N,   N´,   metilen-­‐bis-­‐acrilamida,   en   presencia   de   persulfato   de   amonio   (APS)   y   TEMED   como   catalizadores   redox   (importante   destacar   que   la   reacción   de   polimerización   es   fuertemente   inhibida  por  oxígeno).  Este  polímero  forma  una  red  porosa,  a  través  de  la  cual  se  desplazan  las   proteínas,  a  una  velocidad  diferente  según  su  longitud.     El   tamaño   del   poro   depende,   entre   otros   factores,   de   los   porcentajes   de   acrilamida   y   bisacrilamida.  En  general,  un  aumento  en  la  concentración  de  acrilamida  determina  un  menor   tamaño  del  poro.       Preguntas:     -­‐   ¿Cómo   influye   el   porcentaje   de   acrilamida   (y   el   tamaño   del   poro)   en   la   separación   electroforética  de  las  proteínas?   -­‐   Para   separar   proteínas   de   alto   peso   molecular,   ¿es   conveniente   aumentar   o   disminuir   la   concentración  de  poliacrilamida?   -­‐  En  el  caso  inverso,  para  separar  proteínas  de  bajo  peso  molecular,  ¿es  conveniente  aumentar   o  disminuir  la  concentración  de  poliacrilamida?  

  2.   Corresponde   a   un   tipo   de   electroforesis   en   condiciones   denaturantes,   es   decir,   donde   las   proteínas  pierden  su  conformación  nativa  y  se  encuentran  desplegadas.    

La  denaturación  de  las  proteínas  se  logra  a  través  de   su   preparación   con   SDS,   dodecil   sulfato   de     sodio,   calor  y  β-­‐Mercaptoetanol  (β-­‐ME)  o  Ditiotreitol  (DTT).   El   tratamiento   con   exceso   de   SDS   y   calor   despliega   las  proteínas  al  afectar  las  interacciones  débiles  que   sustentan   las   estructuras   terciaria   y   cuaternaria,   mientras   que   β-­‐ME/DTT   reducen   los   puentes   disulfuro,  intra  e  intercatenarios  (3).  

Figura  1   Estructura  del  SDS   Regiones  hidrofílica  (carga  negativa  dada  por  el  sulfato)   e  hidrofóbica,  características  de  los  detergentes  

  3.   La   asociación   de   SDS   con   las   proteínas   les   confiere  una  carga  negativa,  lo  que  determina  la     migración   de   las   proteínas   desde   el   cátodo     (electrodo   negativo)   hacia   el   ánodo   (electrodo   Figura  2   Denaturación  de  una  proteína  en  presencia  de  SDS,    β-­‐ME  y   positivo).   Particularmente,   el   SDS   se   une   a   las   calor   La  proteína  pierde  su  conformación  nativa  al  interrumpirse  las   proteínas   en   una   relación   aproximada   de   1   interacciones  débiles  y  puentes  disulfuro  que  la  mantienen.   Además  su  asociación  a  SDS  le  confiere  carga  negativa   molécula   de   SDS   por   cada   2   residuos   aminoacídicos,   razón   por   la   cual,   la   relación   carga/masa   es   constante   en   todas   las   proteínas.   Adicionalmente,   como   la   carga   es   proporcional  a  la  fuerza  eléctrica  (definiendo  fuerza  eléctrica  como  F  =  m  x  a),  se  obtiene  que   todas  las  proteínas  se  mueven  con  la  misma  aceleración  (a  =  F/m).     Finalmente,  la  migración  diferencial  de  las  proteínas    depende  de  factores  como  el  tamaño  del   poro   del   gel   y   la   longitud   de   la   cadena   polipeptídica   (que   tiene   relación   directa   con   el   peso   molecular  de  las  proteínas)  (4).    

  4.   SDS-­‐PAGE   permite   estimar   el   peso   molecular   de   una  proteína.  Como  se  ha  descrito,  existe  una  relación   entre   la   migración   electroforética   de   una   proteína   y   su   longitud   y   peso   molecular.   Particularmente,   se   ha   descrito   que   existe   una   relación   aproximadamente   lineal   entre   el   log   PM   y   la   movilidad   relativa   de   una   proteína,  RF  (como  se  muestra  en  la  figura  3)  (4).  

Figura  3   Relación  entre  el  peso  molecular  de  una  proteína,  PM,  y   su  movilidad  relativa,  RF  

  La  movilidad  relativa,  RF,  se  define  como:  

 

 

 

Por  lo  tanto,  el  uso  de  un  estándar  de  proteínas  (mezcla  de  proteínas  con  pesos  moleculares   conocidos)   en   un   SDS-­‐PAGE,   permite   la   estimación   de   pesos   moleculares   de   proteínas   problemas  usando  la  relación  descrita  entre  log  PM  y  RF.  ¿Cómo  se  realiza  esto?   (al  final  de  la  guía  se  muestra  un  ejemplo  de  estándar  de  proteínas).  

 

5.   Las   etapas   básicas   para   un   SDS-­‐PAGE   son:   preparación   del   gel   (consta   de   un   gel   concentrador   y   separador),   preparación   de   las   muestras,   electroforesis,   tinción   del   gel   (la  

tinción  permite  visualizar  las  proteínas  como  bandas,  cuya  intensidad  indica    la  cantidad  de  esa   proteína  en  la  muestra)  y  desteñido  del  gel.   Objetivos:   1.  Comprender  el  principio  de  separación  de  proteínas  en  un  gel  SDS-­‐PAGE.   2.  Analizar  el  patrón  de  separación  de  proteínas  de  distintas  muestras.     3.  Comprender  la  importancia  de  esta  técnica  en  casos  prácticos.   Reactivos:   -­‐  Solución  acrilamida/  bisacrilamida   -­‐  Amortiguador  gel  separador   -­‐  Amortiguador  gel  concentrador   -­‐  SDS  10%     -­‐  β-­‐mercaptoetanol   -­‐  Persulfato  de  amonio  10%  (APS)     -­‐  TEMED  (Tetrametiletilendiamina)   -­‐  Amortiguador  de  corrida   -­‐  n-­‐butanol  saturado  en  agua     -­‐  Amortiguador  de  carga   -­‐  Estándares  de  peso  molecular   -­‐  Solución  de  tinción  

→  30%  /  0.8%   →  1.5M  Tris-­‐HCl  pH  8.8   →  0.5M  Tris-­‐HCl  pH  6.8  

       

→  0.025M  Tris,  0.192M  glicina,  0.1%  SDS  pH  8.3    

 

→   0.125   M   Tris-­‐Cl,   4%   SDS,   20%   v/v   glicerol,     0.02%   azul  de  bromofenol,  pH  6.8   →  PageRuler  Prestained  Protein  Ladder,  FERMENTAS   →  0.025%  azul  de  Coomasie  R-­‐250,  7%  ácido  acético,   40%  metanol   →  7%  ác.  acético,  40%  metanol   →  7%  ác.  acético,  5%  metanol  

-­‐  Solución  de  desteñido  I     -­‐  Solución  Desteñido  II     ¿Cuál  es  la  función  del  glicerol  y  del  azul  de  bromofenol  en  el  amortiguador  de  carga?     Además  de  estos  reactivos,  usted  recibirá  1  o  más  muestras  problema.   Materiales:  

 

-­‐  Unidad  de  electroforesis   -­‐  Fuente  de  poder     -­‐  Baño  de  agua   -­‐  Mechero,  rejilla,  trípode,  Vaso  pp  1000  cc   -­‐  Fuentes  plásticas  con  tapas  para  teñir  y  desteñir   -­‐  Agitador  rotatorio     Procedimiento:   a.  Preparación  de  muestras:     -­‐  Considerando  la  concentración  de  las  muestras,  calcular  el  volumen  necesario  para  obtener   30  μg  de  proteína  total.     -­‐   Mezcle   las   muestras   con   amortiguador   de   carga   4X.   El   volumen   de   Amortiguador   de   carga   agregado  debe  ser  suficiente  para  que  la  solución  final  quede  a  1X.   Puede  usar  la  Tabla  N°  1  para  ordenar  estos  datos.    

-­‐   Coloque   sus   muestras   por   5   minutos   en   baño   de   agua   hirviendo.   Sacar   y   colocar   en   hielo,   hasta  cargarlas  en  el  gel.  ¿Cuál  es  la  importancia  de  esta  etapa?   Muestra          

Tabla  N°  1   Volumen  para  obtener  30   μg  de  proteínas  

Concentración  de  la   muestra          

       

Volumen  de   amortiguador  de  carga          

  b.  Preparación  de  geles:     Usted  deberá  preparar  2  geles,  los  llamados  geles  concentrador  y  separador.     ¿Cuál  es  la  función  de  cada  uno  de  ellos?     b.1.  Preparación  gel  separador:   Preparar  la  solución  según  lo  indicado  en  la  tabla  N°  2.   Estos  volúmenes  están  dados  para  obtener  un  gel  al  12%  de  acrilamida.       Precaución:  La  acrilamida  es  neurotóxico,  como  monómero.  Utilizar  guantes.   Tabla  N°2  -­‐  Gel  Separador         Volumen     Solución  Acril  /  bisacril   2,000  ml     Amortiguador  gel  separador   1,300  ml     ddH2O     1,600  ml     SDS  10%   50  μL     TEMED     5  μL     APS  10%     50  μL     Volumen  total   5  ml     -­‐  Para  la  preparación  de  un  gel  es  suficiente  preparar  5  ml.    

Volumen   4,000  ml   2,600  ml   3,200  ml   100  μL   10    μL   100   10  ml  

-­‐   Una   vez   agregado   el   APS   comienza   la   reacción   de   polimerización.   Incorpórelo   al   final   en   la   solución.     -­‐   Agregar   esta   solución   con   una   pipeta   Pasteur   (o   una   micropipeta   p1000)   entre   los   vidrios   (ver   Figura   5)   con   el   cuidado   de   no   formar   burbujas,   ya   que   estas   pueden   interferir  con  la  gelificación  de  la  acrilamida   y  posterior  corrida  de  las  proteínas.       -­‐   Llenar   hasta   0,5-­‐1,0   cm   bajo   la   ubicación   que  tendrían  los  bolsillos  (espacios  en  el  gel   concentrador   donde   se   colocan   las   muestras).   Calcular   esta   distancia,   Figura  4   utilizando  la  peineta  (pieza  de  plástico  que   Detalle  del  área  que  debe    ser  llenada  con  solución  para  el  gel   da   el   molde   de   los   bolsillos).   Observar   separador   Figura  4.    

-­‐  A  continuación  agregar  lentamente  entre  500  y  1000  uL  de  n-­‐butanol  saturado  en  agua,  sobre   la   solución   del   gel   separador   (como   se   muestra   en   la   figura   4,   el   gel   consta   del   gel   separador   y   concentrador,  los  cuales  se  ubican  en  la  zona  inferior  y  superior  respectivamente).   Esperar   que   gelifique   (se   puede   ver   que   ha   gelificado,   con   lo   que   queda   de   solución  en   el   tubo   donde  esta  se  preparó).     Una  vez  que  ha  gelificado,  elimine  el  n-­‐butanol  y  lave  con  agua  destilada.     b.2.  Preparación  gel  concentrador:   Preparar  la  solución  según  lo  indicado  en  la  tabla  N°  3.   Tabla  N°  3   Gel  concentrador  

 

Solución  Acril  /  bisacril     Amortiguador  gel  concentrador   ddH2O     SDS  10%   TEMED     APS  10%     Volumen  total  

    -­‐  Colocar  la  solución  del  gel  concentrador  sobre  el  gel   separador,   hasta   el   borde.   Colocar   la   peineta,   introduciéndola   en   la   solución   sin   formar   burbujas.   Dejar  gelificar.     Una   vez   gelificado,   sacar   la   peineta   cuidando   la   integridad  de  los  bolsillos.

Volumen     830  μL   630  μL   3,400  ml   50  μL   5  μL   50  μL   5  ml  

Figura  5   Montaje  de  los  vidrios  antes  de  preparar  el  gel  

c.  Preparación  de  la  unidad  de  electroforesis:     -­‐   Limpiar   y   ensamblar   los   vidrios   en   la   unidad   diseñada   para   la   elaboración   de   los   geles.   Observe   que   se   dispone   de   2   vidrios   de   diferente   tamaño.   Observar  la  Figura  5  a  continuación.   -­‐   Una   vez   preparados   los   geles   (revisar   la   sección   b.1  y  b.2  de  la  guía),  ajustar  los  vidrios  en  la  unidad   que   se   depositará   en   la   cámara   electroforética   (ver   figura  6).     Figura  6   Montaje  de  la  cámara  de  electroforesis    

  -­‐   Agregar   el   amortiguador   de   corrida,   cargar   las   muestras,   tapar   la   cámara   (ver   figura   7)   y   conectarla  a  la  fuente  de  poder.     c.  Electroforesis:  

-­‐   Una   vez   instalados   los   vidrios   en   la   cámara   de   electroforesis   (figura   6),   llene   la   cámara   con   amortiguador  de  corrida.  Cuidar  que  los  pocillos  queden  en  contacto  con  el  amortiguador.  

 

-­‐   Con   una   micropipeta,   tomar   la   muestra   que   está   preparada   con   amortiguador   de   carga.   Muy   lentamente  colocarla  en  el  pocillo  que  se  le  indicará.  Esto  debe  ser  muy  cuidadoso,  para  que   no   se   pierdan   proteínas   (sobre   todo   si   se   quiere   hacer   un   análisis   y   comparación   entre   las   muestras).   Además   de   las   muestras,   deberá   cargar   un   estándar   de   proteínas,   que   posteriormente   le   permitirá  estimar  pesos  moleculares.  

 

-­‐  Conectar  la  cámara  de  electroforesis  a  la  fuente  de  poder.     Asegúrese  que  las  conexiones  de  la  cámara  con  su  tapa  y  de  la  cámara  con  la  fuente  de  poder   sean  correctas  (figura  7).  

    -­‐  Encienda  la  fuente  de  poder  y  ajuste  el  voltaje  al  cual  realizará  la  electroforesis  (se  le  indicará   el   voltaje   a   utilizar).   Normalmente   se   utiliza   un   mayor   voltaje   cuando   las   proteínas   se   encuentran  en  el  gel  separador.     -­‐   El   progreso   de   la   electroforesis   se   realiza   observando   la   ubicación   del   azul   de   bromofenol   (frente   de   avance),   así   como   la   localización   del   estándar   de   peso   molecular   (proteínas   de   peso   molecular  conocido  que  se  observan  coloreadas).     -­‐   La   electroforesis   puede   considerarse   concluida   cuando   el   frente   de   avance   se   ubica   en   el   extremo  inferior  de  los  vidrios.     -­‐  Una  vez  terminada  la  corrida,  apagar  la  fuente  de  poder  y  desconectar  la  cámara.    

 

d.  Tinción  y  desteñido  del  gel:  

 

-­‐  Se  desarma  la  cámara  y  se  saca  el  gel  desde  los  vidrios.     -­‐  Este  gel  se  coloca  en  una  primera  fuente,  que  contiene  suficiente  solución  de  tinción,  como   para  que  el  gel  flote  y  quede  bien  cubierto.       -­‐  Dejar  por  al  menos  4  horas  en  agitación,  o  toda  la  noche.  En  el  caso  del  práctico  se  va  a  dejar   por  4  a  5  horas.    

 

-­‐   El   profesor   y   los   ayudantes   desteñirán   el   gel   con   el   siguiente   protocolo.   Se   coloca   el   gel   en   la   solución   de   desteñido   I   por   30   min,   en   agitación.   Se   remueve   esta   solución,   y   se   agrega   la   solución   de   desteñido   II,   hasta   que   las   bandas   se   vean   claramente   sin   un   exceso   de  

tinción  en  el  gel.    

-­‐  El  gel  se  puede  guardar  en  la  misma  solución  II  con  un  1%  de  glicerol.     Para  la  discusión  y  análisis  recibirán  una  fotografía  de  su  gel  teñido.     Resultados  que  debe  considerar  para  el  informe:  

 

1. Construya   una   curva   Log   MM   vs.   movilidad   relativa   (Rf)   utilizando   los   valores   de   masa   molecular   reportados   para   cada   proteína   en   el   estándar   PageRuler   y   los   valores   de   Rf   obtenidos  en  el  gel  realizado.     2. Informe  el  valor  de  Rf  obtenido  para  la/s  proteína/s  en  su  muestra  problema.     3. Informe   la   masa   molecular   estimada   para   la/s   proteína/s   en   su   muestra   problema,   interpolando  el  valor  de  Rf  obtenido  en  la  curva  estándar.       4. Discuta  las  preguntas  que  se  han  presentado  en  esta  guía.         Referencias     1.  Laemmli,  U.K.,  Nature,  227:  680  -­‐  685,  1970.   2.  Baruch,  J.  Davis.,  Annals  New  York  Academy  of  Sciences,  121:  404  -­‐  427,  1964.   3.  Grabski  A  and    Burgess  R.,  Innovations,  10-­‐12,  2001.   4.  Svasti  J.    and  Panijpan  B.,  Journal  of  Chemical  Education,  54:  560  -­‐  562,  1977.                                          

    PageRuler™  Prestained  Protein  Ladder  (FERMENTAS)       Description   PageRuler™  Prestained  Protein  Ladder  is  a  mixture  of  10  recombinant,   highly  purified  colored  proteins  with  apparent  molecular  weights  of  10   kDa   to   170   kDa.   Ladder   proteins   are   covalently   coupled   with   a   blue   dye   except   for   two   reference   bands   prestained   with   different   colors.   The   72   kDa  reference  band  is  orange  and  10  kDa  reference  band  is  green.  The   ladder   is   supplied   in   gel   loading   amortiguador   and   is   ready-­‐to-­‐use:   no   heating,  further  dilution  or  addition  of  a  reducing  agent  is  required.     Contents   Approximately   0.1-­‐0.2   mg/ml   of   each   protein   in   the   storage   amortiguador   [62.5   mM   Tris-­‐H3PO4   (pH   7.5   at   25°C),1   mM   EDTA,   2%   (w/v)  SDS,  10  mM  DTT,  1  mM  NaN3  and  33%  (v/v)  glycerol].     Applications   •  Monitoring  of  protein  separation  during  SDS-­‐PAGE.   •  Verifying  Western  transfer  efficiency.   •   Approximate   sizing   of   proteins   on   SDS-­‐polyacrylamide   gels   and   Western  blots.     Instruction  for  Use   1. Thaw  the  ladder  at  room  temperature  for  a  few  minutes  to  dissolve  precipitated  solids.  DO   NOT  BOIL!   2. Mix  gently,  but  thoroughly,  to  ensure  the  solution  is  homogeneous.   3. Load  the  following  volumes  of  the  ladder  on  an   4. SDS-­‐polyacrylamide   gel   (5   μl   per   well   for   mini   gel,   10   μl   per   well   for   large   gel).   Use   the   same  volumes  for  Western  blotting.   5. After  the  run  is  complete,  stain  the  gel  or  perform  Western  transfer  procedure  as  desired.     Note   •  Each  lot  of  the  PageRuler™  Prestained  Protein  Ladder  is  calibrated  against  a  precisely  sized,   PageRuler™  Unstained  Protein  Ladder  and  calculated  apparent  molecular  weights  are  reported   in  the  picture.   •   For   precise   molecular   weight   determinations   use   PageRuler™   Unstained   Protein   Ladder,   #SM0661,  see  www.fermentas.com.   •  In  8  or  10%  gels  low  molecular  weight  proteins  may  migrate  with  the  dye  front.   •  Loading  volumes  are  intended  for  use  in  gels  with  a  thickness  of  0.75  mm.  For  thicker  gels,   the  recommended  loading  volume  should  be  increased.   •   PageRuler™   Prestained   Protein   Ladder   could   be   used   in   Western   blotting   with   all   common   membranes:  PVDF,  nylon  and  nitrocellulose.   •   Longer   transfer   times   or   higher   transfer   voltages   may   be   required   for   Western   blotting   of   large  (>100  kDa)  proteins.