Trabajo Practico2

   

Universidad  de  Chile   Facultad  de  Ciencias  Químicas  y  Farmacéuticas   Bioquímica  I       Trabajo  Práctico  N°  2   Cuantificación  de  la  concentración  de  proteínas     Objetivos:     -­‐   Determinar   la   concentración   de   proteínas   en     muestras   problema   utilizando   los   métodos   de   Bradford  (Bradford  y  cols,  1976)  y  Biuret  (Riegler  y  cols,  1914).   -­‐  Discutir  las  ventajas  y  desventajas  de  cada  método.   -­‐  Aplicar  los  conceptos  y  metodologías  relacionados  con  la  elaboración  de  soluciones  y  realización   de  curvas  de  calibración.       Antecedentes:   Existen   diversos   métodos   para   la   cuantificación   de   proteínas,   siendo   los   basados   en   técnicas   espectrofotométricas   lo   más   conocidos.   Estos   métodos   se   basan   en   la   formación   de   complejos   contienen   las   proteínas,   la   capacidad   de   estos   de   absorber   luz   en   alguna   longitud   de   onda,   y   la   relación   lineal   entre   la   absorbancia   y   la   concentración   del   complejo   formado.   La   capacidad   intrínseca   de   las   proteínas   de   absorber   luz,   también   permite   su   cuantificación   bajo   los   mismos   principios  descritos.   Entre  los  métodos  espectrofotométricos  podemos  mencionar,       -­‐  Métodos  basados  en  la  formación  de  complejos  con  colorantes,   -­‐  Método  de  Bradford   -­‐  Métodos  basados  en  la  formación  de  complejos  de  cobre,   -­‐  Reacción  del  Biuret   -­‐  Método  del  Ácido  Bicinconínico   -­‐  Método  de  Lowry   -­‐  Métodos  basados  en  la  absorbancia  natural  de  los  aminoácidos  con  cadenas  aromáticas:   -­‐  Medición  de  la  absorbancia  a  280  nm  en  muestras  puras  de  proteínas   -­‐  Método  de  Warburg-­‐Christian     Al  usar  cualquier  método  espectrofotométrico  es  indispensable  conocer  su  sensibilidad,  intervalo   de  concentración  de  respuesta  lineal  y  el  coeficiente  de  extinción  o  factor  de  calibración.  Como   se  determinó  en  el  trabajo  práctico  anterior,  esta  información  se  obtiene  mediante  una  curva  de   calibración.   En   general,   no   existe   un   método   completamente   satisfactorio   para   medir   la   concentración   de   proteínas  de  una  muestra.  La  elección  de  un  método  dependerá  de;    

-­‐    La  naturaleza  de  la  muestra  (pura  o  mezcla  de  proteínas),     -­‐    La  presencia  de  compuestos  interferentes,   -­‐    La  rapidez  y  sensibilidad  requerida,   -­‐    Factores  como  la  complejidad  del  ensayo  y  los  costos,     1.  Cuantificación  de  proteínas  por  métodos  colorimétricos  basados  en  su  unión  a  colorantes:     1.1.  Método  de  Bradford  (Bradford  y  cols,  1976):   Figura  1     Estructura  química  del  Azul  de  Coomassie  G-­‐250   El   reactivo   de   Bradford   contiene   un   compuesto     denominado   azul   de   Coomassie   G-­‐250,   el   cual   se   encuentra   disuelto   en   ácido   fosfórico,   H3PO4.   En   este   ambiente   ácido,   el     colorante   azul   de   Coomassie   presenta   un   color   café   rojizo,   con   un     máximo   de   absorbancia  a  los  465  nm.     Este   compuesto   puede   formar   complejos   con   proteínas,   lo   que   determina   un   cambio   de   color,   al   azul,  y  un  cambio  del  máximo  de  absorbancia  a  los    595  nm.     La   formación   de   complejos   entre   azul   de   Coomassie   y   proteínas   se   debe   al   establecimiento   de   interacciones   no   covalentes,   particularmente   a   través   de   residuos   de   aminoácidos   básicos   (especialmente  arginina,  histidina  y  lisina)  y  aromáticos.   Debido  a  que  la  cantidad  de  proteínas  determina  la  cantidad  de  complejo  formado  con  azul  de   Coomassie,  la  medición  de  absorbancia  a  595  nm  permite  evaluar  la  concentración  de  proteínas.   Este  método  permite  la  determinación  de  proteínas  en  un  intervalo  de  concentraciones  de  1  a  10   µg/ml.   Figura  2   MÉTODO  DE  BRADFORD   A.  Formación  del  complejo  entre  el  colorante  Azul  de  Coomassie  y  las  proteínas,  B.  Espectro  de  absorción  del  colorante  Azul  de   Coomassie  en    presencia  (máximo  de  absorbancia  a  los  595  nm)  y  ausencia  de  proteínas  (máximo  de  absorbancia  a  los  465  nm)      

A                                                                                                                                                                                                                                              B        

   

  Desventajas:     -­‐  Debido  a  que  la  formación  del  complejo  proteína-­‐Coomassie  está  determinada  por  la  presencia   de  aminoácidos  particulares,  la  cantidad  de  estos  puede  influenciar  la  determinación.   -­‐  Incompatible  con  detergentes  en  concentraciones  que  se  utilizan  normalmente  en  el  laboratorio.   -­‐  Algunas  sustancias  particulares,  incompatibles  con  este  método,  son;     Buffer  Systems   ACES,  pH  7.8  100  mM   N-­‐Acetylglucosamine  in  PBS,  pH  7.2,  100  mM   Bicine,  pH  8.4  100  mM   Bis-­‐Tris,  pH  6.5  100  mM   Calcium  chloride  in  TBS,  pH  7.2  10  mM   CelLytic  B  Reagent  undiluted,  no  interference   CHES,  pH  9.0  100  mM   Cobalt  chloride  in  TBS,  pH  7.2  10  mM   EPPS,  pH  8.0  100  mM   Ferric  chloride  in  TBS,  pH  7.2  10  mM   Glycine  100  mM   HEPES,  pH  7.5  100  mM   Imidazole,  pH  7.0  200  mM   MES  (0.1  M),  NaCl  (0.9%),  pH  4.7  undiluted   MES,  pH  6.1  100  mM   MOPS,  pH  7.2  100  mM   Nickel  chloride  in  TBS,  pH  7.2  10  mM   PBS;  Phosphate  (0.1  M),  NaCl  (0.15  M),  pH  7.2,  undiluted   PIPES,  pH  6.8  100  mM   Sodium  acetate,  pH  4.8  180  mM   Sodium  bicarbonate  0.1  M   Sodium  citrate,  pH  4.8  or  pH  6.4  200  mM   Sodium  Citrate  (0.6  M),  MOPS  (0.1  M),  pH  7.5,  undiluted   Sodium  phosphate  0.1  M   TBS;  Tris  (25  mM),  NaCl  (0.15  M),  pH  7.6,  undiluted   Tricine,  pH  8.0  100  mM   Triethanolamine,  pH  7.8  100  mM   Tris  2.0  M   Tris  (25  mM),  Glycine  (192  mM),  pH  8.0,  undiluted   Tris  (25  mM),  Glycine  (192  mM),  SDS  (0.1%),  pH  8.3,  1:2  dilution   Zinc  chloride  in  TBS,  pH  7.2  10  mM  

 

Buffer  Additives   Ammonium  sulfate  1.0  M   Aprotinin  10  mg/L   Asparagine  10  mM   Cesium  bicarbonate  0.1  M   Glucose  1.0  M   Glycerol  10%   Guanidine•HCl  3.5  M   Hydrochloric  Acid  0.1  M   Imidazole,  pH  7.0  200  mM   Leupeptin  10  mg/L   Phenol  Red  0.5  mg/ml   PMSF  1  mM   Sodium  azide  0.5%   Sodium  chloride  5.0  M   Sodium  Hydroxide  0.1  M            

  2.  Cuantificación  de  proteínas  por  métodos  colorimétricos  basados  en  la  formación  de  complejos   de  cobre:     2.1.  Método  de  Biuret  (Riegler  y  cols,  1914):     El  reactivo  de  Biuret  está  constituido  de  una  mezcla  de,  KOH,  Cu+2  y  tartrato  de  sodio  ((2R,3R)-­‐2,3-­‐ dihydroxybutanedioate,  que  permite  estabilizar  los  iones  Cu+2  en  solución).     Los   iones   Cu+2   del   reactivo   pueden   formar   complejos   con   péptidos   (de   3   o   más   aminoácidos),   a   través   de   su   interacción   con   los   nitrógenos   del   enlace   amida.   El   complejo   de   cobre   formado   presenta  un  color  azul,  con  absorbancia  a  540  nm.   En  condiciones  alcalinas,  posteriormente,  se  produce  la  reducción  de  Cu+2  a  Cu+1.    

Debido   a   que   la   formación   de   complejos   de   cobre   depende   de   la   cantidad   de   enlaces   peptídicos     (los  cuales  están  determinados  por  la  cantidad  de  proteínas),  la  evaluación  de  la  absorbancia  a   540  nm  permite  calcular  la  concentración  de  proteínas.   Figura  3   MÉTODO  DE  BIURET   +2 Formación  del  complejo  proteína-­‐Cu ,  el  cual  presenta  un  máximo  de  absorbancia  a  los  540  nm  

OH-­‐  

PROTEÍNAS  +  Cu+2    

Cu+2  

Cu+1  

AZUL   A  max  =  540  nm    

    El  nombre  de  este  método,  Biuret,  tiene  su  origen  en  la  siguiente  reacción;   Figura  4   REACCIÓN  DE  BIURET   Corresponde  a  la  condensación  de  dos  moléculas  de  urea  formando  un   compuesto  denominado  Biuret,  la  molécula  más  simple  capaz  de  formar  un   2   complejo  con  Cu

  En   esta   reacción,   el   denominado   compuesto   Biuret   (que   corresponde   a   la   condensación   de   2   moléculas  de  urea),  se  compleja  con  Cu+2  en  un  medio  alcalino.   La  molécula  Biuret,  es  la  forma  química  más  pequeña  capaz  de  formar  un  complejo  con  Cu+2.       Ventajas:   -­‐  Es  un  método  rápido  y  fácil  de  realizar.   -­‐  Presenta  pocas  interferencias.   -­‐  La  determinación  no  se  ve  influenciada  por  la  composición  aminoacídica  de  la  proteína.   -­‐  El  complejo  es  estable  durante  1  hora.         Desventajas:   -­‐   Baja   sensibilidad   (requiere   altas   concentraciones   de   proteínas).   El   intervalo   útil   es   desde   0,5   a   10   mg/ml  de  proteína.    

*   La   formación   de   este   complejo   de   Cu+2   y   su   posterior   reducción   a   un   ion   cuproso,   Cu+,   son   la   base  para  el  desarrollo  de  métodos  de  mayor  sensibilidad  como  el  método  de  Lowry  (Lowry  y  cols,   1951)  y  el  método  del  ácido  bicinconínico  (Smith  y  cols,  1985).       2.2.  Método  del  Ácido  Bicinconínico  BCA  (Smith  y  cols,  1985):     Este  método  se  fundamenta  en  la  determinación  de  absorbancia  a  562  nm,  longitud  de  onda  a  la   cual  absorbe  el  compuesto  formado  en  este  ensayo,  que  corresponde  a  un  complejo  de  BCA  con   iones  Cu+1.   La  formación  de  este  complejo  se  produce  en  2  etapas;     Primera  etapa:  corresponde  a  una  reacción  de  Biuret  típica,  en  la  cual  péptidos  que  contengan  3  o   más   residuos   aminoacídicos  actúan   como   quelantes   de   iones   Cu+2,   el   cual   en   condiciones   alcalinas   es  reducido  a  Cu+,  generándose  un  complejo  de  color  azul  que  absorbe  a  540  nm.     Segunda   etapa:   Los   iones   Cu+1,   generados   en   la   primera   etapa,   forman   un   complejo   con   2   moléculas  de  BCA,  el  cual  presenta  un  color  violeta  con  absorbancia  en  los  562  nm.   Figura  5   MÉTODO  DEL  Á CIDO  BICINCONÍNICO,  BCA   +2   +1 Implica  la  reducción  del  Cu a  Cu ,  y  la  posterior  formación  de  un  complejo  con  BCA,  el  cual   presenta  un  máximo  de  absorbancia  a  los  562  nm  

Cu+1  +    2   BCA  

Complejo  BCA  –  Cu+1  

VIOLETA   A  max  =  562  nm    

  Por   lo   tanto,   debido   a   que   el   número   de   enlaces   peptídicos   determina   la   cantidad   de   Cu+1   producido,  la  determinación  de  absorbancia  a  562  nm,  dada  por  el  complejo  BCA-­‐Cu+1,   permite   estimar  la  concentración  de  proteínas.     Ventajas:   -­‐  Compatible  con  surfactantes  y  denaturantes  (es  el  método  que  presenta  menos  interferencias).   -­‐  Muy  sensible.   -­‐  La  determinación  presenta  escasa  variación  entre  proteínas  (similar  al  método  de  Lowry  y  menor   a  los  métodos  basados  en  Azul  de  Coomassie).   -­‐  Fácil  y  rápido  de  realizar.    

Desventajas:   -­‐  Incompatible  con  agentes  reductores  y  sustancias  que  puedan  quelar  Cu.  ¿Por  qué?   -­‐  Aminoácidos  libres  reductores  (triptófano,  tirosina  y  cisteína)  pueden  afectar  la  determinación.   -­‐   La   determinación   es   dependiente   de   la   composición   aminoácidica   de   la   proteína,   siendo   influenciada  por  el  contenido  de  residuos  de  triptófano,  tirosina  y  cisteína.     2.3.  Método  de  Lowry  (Lowry  y  cols,  1951):     Este  método  se  basa  en  la  detección  de  la  forma  reducida  del  reactivo  de  Folin-­‐Ciocalteu,  la  cual   presenta  un  color  azul  intenso  que  absorbe  a  los  750  nm.   Reactivo  de  Folin-­‐Ciocalteu:  Na2MoO4  +  Na2WoO4  +  H3PO4.     La  formación  del  compuesto  coloreado  requiere  de  2  etapas.   Primera   etapa:   corresponde   a   una   reacción   de   Biuret   típica   (la   cual   también   está   presente   el   método  del  BCA).  Recordemos  que  en  esta  etapa  se  produce  Cu+.   Segunda   etapa:   se   incorpora   el   reactivo   de   Folin-­‐Ciocalteu,   el   cual   es   reducido   por   el   Cu+   (esto   también   puede   ser   influenciado   por   residuos   de   aminoácidos   reductores.   La   forma   reducida   del   reactivo  es  azul  intenso,  y  absorbe  a  los  750  nm.   Debido   a   que   el   número   de   enlaces   peptídicos   determina   la   cantidad   de   Cu+1   producido,   la   magnitud  de  la  forma  reducida  del  reactivo  de  Folin-­‐Ciocalteu   es  proporcional  a  la  cantidad  de   proteínas.     Figura  6   MÉTODO  DE  LOWRY   +1 Implica  la  reducción  del  reactivo  de  Folin-­‐Ciocalteu  acoplada  a  la  oxidación  del  Cu .  L a  forma  reducida  del   reactivo  presenta  un  máximo  de  absorbancia  a  los  750  nm   Forma  oxidada   Forma  reducida  

Reactivo  de  Folin-­‐Ciocalteu  

AZUL   A  max  =  750  nm    

Reactivo  de  Folin-­‐Ciocalteu  

+1  

Cu  -­‐ PROTEÍNAS  

OH

-­‐  

Cu+2  -­‐  PROTEÍNAS  

  Ventajas:   -­‐  Buena  sensibilidad  y  precisión.     Desventajas:   -­‐  Incompatible  con  agentes  reductores,  sustancias  que  puedan  quelar  el  Cu  y  detergentes.   -­‐  Aminoácidos  libres  reductores  pueden  influenciar  la  determinación.   -­‐   La   determinación   es   dependiente   de   la   composición   aminoácidica   de   la   proteína,   siendo   influenciada  por  el  contenido  de  residuos  de  triptófano,  tirosina  y  cisteína.   -­‐  Requiere  mayor  tiempo.  

-­‐   Algunos   interferentes   específicos   son;   urea,   guanidina·∙HCl,   sacarosa,   sulfato   de   amonio,   Tris·∙HCl   >  0.1M,  acetato  de  sodio  >1M  o  fosfato  de  sodio,  EDTA.     3.  Cuantificación  de  proteínas  por  métodos  basados  en  su  absorbancia  natural:     3.1.  Cuantificación  de  proteínas  por  medición  de  absorbancia  a  280  nm:   Las   proteínas   presentan   un   máximo   de   absorbancia   a   los   280   nm   como   consecuencia   de   la   presencia   de   los   aminoácidos   aromáticos   triptófano   y   tirosina   (también   contribuyen,   aunque   en   menor  grado,  fenilalanina  y  los  puentes  disulfuro).  Por  lo  tanto,  es  posible  cuantificar  proteínas  a   través   de   la   medición   directa   de   la   absorbancia   a   280   nm,   esto   es,   sin   un   tratamiento   previo,   aunque  como  en  todas  las  metodologías  se  requiere  la  realización  de  una  curva  de  calibración.       Ventajas:   -­‐  Fácil  y  rápido  de  realizar.   -­‐  Es  un  método  de  determinación  directa,  ya  que  no  involucra  una  reacción.   -­‐  Bajo  costo.   -­‐  Requiere  pequeñas  cantidades  de  muestra.   -­‐  La  muestra  puede  ser  recuperada.     Desventajas:   -­‐   Debe   utilizarse   en   muestras   puras   de   proteínas   que   no   presenten   contenido   de   ácidos   nucleicos,   ya  que  estos  últimos  presentan  un  máximo  de  absorbancia  a  260  nm  (cercano  a  los  280  nm  a  los   cuales   se   ubica   en   máximo   de   absorbancia   de   las   proteínas),   lo   cual   puede   afectar   la   determinación.       -­‐  Elevada  variabilidad.  Debido  a  que  la  absorbancia  a  280  nm  depende  del  contenido  de  tirosina  y   triptófano,  existe  diferencia  en  la  absorbancia  a  280  nm  entre  diferentes  proteínas.       -­‐  Incompatible  con  detergentes  y  agentes  denaturantes.     3.2.   Cuantificación   de   proteínas   por   medición   de   absorbancia   a   280   y   260   nm,   Método   de   Warburg-­‐Christian  (Warburg  y  Christian,  1941):     Este   ensayo   se   realiza   en   las   mismas   condiciones   que   el   anterior,   y   tiene   como   objetivo   establecer   la  concentración  de  proteínas  excluyendo  la  interferencia  de  los  ácidos  nucleicos.   Consiste   en   medir   la   absorbancia   a   260   y   280   nm,   longitudes   de   onda   a   las   cuales   presentan   un   máximo   de   absorbancia   ácidos   nucleicos   y   proteínas   respectivamente.   El   cociente   de   estas   absorbancias   permite   establecer   el   porcentaje   de   ácidos   nucleicos   en   la   muestra,   y   un   factor   de   corrección  que  posibilita  determinar  la  concentración  de  proteínas  excluyendo  la  interferencia  de   los  ácidos  nucleicos.    

Conociendo   el   factor   de   corrección   previamente   mencionado,   se   puede   determinar   la   concentración  de  proteínas  de  la  siguiente  manera;     𝒎𝒈  𝑷𝒓𝒐𝒕𝒆í𝒏𝒂   = 𝑨𝟐𝟖𝟎   ×𝑭𝒂𝒄𝒕𝒐𝒓  𝒅𝒆  𝒄𝒐𝒓𝒓𝒆𝒄𝒄𝒊ó𝒏   𝒎𝒍

 

A  continuación  se  muestra  el  porcentaje  de  ácidos  nucleicos  y  factor  de  corrección  en  función  de   la  relación  A280/A260;   Razón   A280/A260   1.75   1.60   1.50   1.40   1.30   1.25   1.20   1.15   1.10   1.05   1.00   0.96   0.92   0.88   0.86  

%  Ácidos   Nucleicos   0   0.25   0.50   0.75   1.00   1.25   1.50   2.00   2.50   3.00   3.50   3.75   4.25   5.00   5.25  

Factor  de  corrección  para  una   celda  de  1  cm   1.105   1.075   1.05   1.025   0.995   0.975   0.95   0.91   0.87   0.835   0.80   0.785   0.755   0.715   0.705  

Razón   A280/A260   0.84   0.82   0.80   0.78   0.76   0.74   0.72   0.70   0.68   0.66   0.65   0.64   0.62   0.60   0.49  

%  Ácidos   Nucleicos   5.50   6.00   6.50   7.25   8.00   8.75   9.50   10.75   12.00   13.50   14.50   15.25   17.5   20.00   100.0  

Factor  de  corrección  para  una   celda  de  1  cm   0.69   0.67   0.645   0.615   0.59   0.565   0.54   0.51   0.48   0.45   0.43   0.415   0.38   0.35    

3.3.  Otras  metodologías  de  cuantificación  basadas  en  la  absorbancia  natural  de  las  proteínas:     También  es  posible  cuantificar  proteínas  a  través  de  la  determinación  de  absorbancia  a  entre  220   y   240   nm,   donde   presentan   un   máximo   de   absorbancia   los   enlaces   peptídicos   y   los   grupos   carboxílicos.   Sin   embargo,   esto   es   útil   solo   para   muestras   puras   de   proteínas,   ya   que   muchas   sustancias  presentan  absorbancia  en  este  intervalo  de  longitud  de  onda.     Actividad  N°  1,  Determinación  de  la  concentración  de  proteínas  en  muestra  problema  mediante   el  método  de  Bradford     a)  Reactivos:  Reactivo  de  Bradford,  solución  patrón  de  BSA,  muestra  problema.     b)  Procedimiento:     1.   Preparación   de   las   soluciones   patrón:   El   método   mide   adecuadamente   concentraciones   de   proteína   entre   1   y   10   µg/ml.   En   consecuencia,   genere   una   tabla   para   preparar   5   soluciones   dentro   de  ese  intervalo  de  concentraciones.  Considere  que  cada  solución  de  proteína  debe  contener  200   µl   del   reactivo   Bradford   y   el   volumen   de   la   alícuota   de   la   solución   patrón.   El   volumen   final   de   cada  solución  debe  ser  de  1  ml.     Utilice  la  siguiente  tabla  como  referencia  para  realizar  la  curva  de  calibración.  

    2.   Medición   de   absorbancia   de   las   soluciones   patrón.   Una   vez   preparadas   las   soluciones   patón   proceda  a  medir  la  absorbancia  a  595  nm.     Consideraciones:   -­‐  Recuerde  realizar  el  blanco  correspondiente.   -­‐  El  reactivo  de  Bradford  debe  ser  el  último  componente  en  ser  agregado,  ¿Por  qué?   -­‐  El  reactivo  de  Bradford  es  bastante  viscoso  por  lo  que  es  imprescindible  agitar  vigorosamente  las   soluciones  una  vez  agregado  el  reactivo.     -­‐  Mezcle  bien,  espere  5  min  antes  de  realizar  la  medición  de  absorbancia.     -­‐  Para  obtener  el  error  del  método  realice  las  mediciones  en  triplicado.     Registre  sus  datos  en  la  siguiente  tabla.  

    3.  Medición  de  la  absorbancia  de  las  muestras  problema.  Prepare  las  muestras  problema  según  lo   que   se   indica   en   la   siguiente   tabla     y   realice   la   medición   de   absorbancia   como   lo   hizo   anteriormente.     Mida   la   absorbancia   de   la   muestra   problema   más   de   una   vez,   con   ello   podrá   obtener   la   concentración  de  la  muestra  con  el  error  de  la  determinación.    

   

Actividad  N°  2,  Determinación  de  la  concentración  de  proteínas  en  muestras  problema  mediante   el  método  de  Biuret     a)  Reactivos:  Reactivo  de  Biuret,  solución  patrón  de  BSA,  muestra  problema.     b)  Procedimiento:     1.   Preparación   de   las   soluciones   patrón:   Siguiendo   la   misma   lógica   que   en   caso   del   método   de   Bradford,  prepare  5  soluciones  entre  0,5  a  5  mg/ml  de  proteína.   Considere   que   debe   agregar  500   µL  de  reactivo  de  Biuret  a  cada  solución,  y  obtener  un  volumen  final  de  1ml.   Utilice  la  siguiente  tabla  como  referencia  para  realizar  la  curva  de  calibración.    

 

  2.   Medición   de   absorbancia   de   las   soluciones   patrón:   Agregue   finalmente   el   reactivo   de   Biuret,   mezclar  y  luego  de  20  minutos  medir  la  absorbancia  a  540  nm.   Para  obtener  el  error  del  método  realice  las  mediciones  en  triplicado.  Recuerde  realizar  el  blanco   correspondiente.   Registre  sus  mediciones  en  la  siguiente  Tabla.  

    3.  Medición  de  la  absorbancia  de  las  muestras  problema.  Prepare  las  muestras  problema  según  lo   que   se   indica   en   la   siguiente   tabla   y   realice   la   medición   de   absorbancia   como   lo   hizo   anteriormente.     Realice  3  veces  la  medición  de  la  muestra  para  obtener  el  error  de  la  determinación.    

 

  Preguntas:      

-­‐  ¿Qué  información  se  debe  conocer  antes  de  medir  la  concentración  de  proteínas  de  una  muestra?   -­‐   ¿Por   qué   cree   Ud.   que   es   conveniente   determinar   la   concentración   de   proteínas   utilizando   más   de   un   método?   -­‐  Tratamiento  estadístico.  ¿Cómo  expresará  el  error  en  las  mediciones?,  ¿Cómo  determinará  el  número  de   cifras  significativas  y  el  error  asociado  al  reportar  la  concentración  de  la  muestra  problema?     -­‐  Observe  la  ecuación  que  define  la  ley  de  Lamber  y  Beer  y  explique  por  qué  algunos  métodos  para  medir   proteínas  son  más  sensibles  que  otros?  

  Referencias:   -­‐  Aitken,  A.,  Learmonth,  M.  (1996).  P rotein   D etermination   b y   U V   A bsorption.  The  Protein  Protocols  Handbook.  3-­‐6.   -­‐  Bradford,  M.  M.  (1976).  A  rapid  and  sensitive  method  for  the  quantitation  of  microgram  quantities  of  protein  utilizing   the  principle  of  protein-­‐dye  binding.  Analytical  biochemistry  72,  248-­‐254.   -­‐   Lowry,   O.   H.,   Rosebrough,   N.   J.,   Farr,   A.   L.,   and   Randall,   R.   J.   (1951).   Protein   measurement   with   the   Folin   phenol   reagent.  The  Journal  of  Biological  Chemistry  193,  265-­‐275.   -­‐   Riegler,   E.,   A   (1914).   Colorimetric   Method   for   the   Determination   of   Plasma   Albumin,   Z.   Analytical   biochemistry   53,   242.   -­‐  Smith,  P.  K.,  Krohn,  R.  I.,  Hermanson,  G.  T.,  Mallia,  A.  K.,  Gartner,  F.  H.,  Provenzano,  M.  D.,  Fujimoto,  E.  K.,  Goeke,  N.  M.,   Olson,  B.  J.,  and  Klenk,  D.  C.  (1985).  Measurement  of  protein  using  bicinchoninic  acid.  Analytical  biochemistry  150,  76-­‐ 85.  Anexo.   -­‐  Thermo  Scientific  Pierce  Protein  Assay  Technical  Handbook.  Versión  2.  15-­‐30.   -­‐  Warburg,  O.  and  Christian,  W  (1941).  Biochemistry.  Z.  310,  384-­‐421.    

                               

Trabajo  Práctico  N°  2   Cuantificación  de  la  concentración  de  proteínas     Nombre  _____________________________________  Grupo_________  Fecha________________     1.   Datos   actividad   1,   determinación   de   la   concentración   de   proteínas   mediante   el   método   de   Bradford.   1.1.  Datos  curva  de  calibración:   Solución   Concentración   Absorbancia   de  BSA   1era  Medición   1       2       3       4       5         1.2.  Datos  muestra:   Medición   Volumen  de  muestra  utilizado  en  1  ml  de   solución   1     2     3      

Absorbancia   2da  Medición            

Absorbancia   3era  Medición            

Factor  de   dilución  

Absorbancia  

     

     

2.   Datos   actividad   2,   determinación   de   la   concentración   de   proteínas   mediante   el   método   de   Biuret.   2.1.  Datos  curva  de  calibración:   Solución   Concentración   Absorbancia   de  BSA   1era  Medición   1       2       3       4       5         2.2.  Datos  muestra:   Medición   Volumen  de  muestra  utilizado  en  1  ml  de   solución   1     2     3      

Absorbancia   2da  Medición            

Absorbancia   3era  Medición            

Factor  de   dilución        

Absorbancia