Tlc Parte3

**#ñ-*ffñ-

PARTICION

ADSORCION activa

polar

lipófila

apolar

ripotiru J

ripóf¡ta Yhidrófitu

Fr"#""*[*l

niorotira

fs*a"."b"*l,-|

de las condicionesapropiadasde separación(extraídode Fig.13: Esquemaparaladeterminación

n8D. a

-

Tetracloruro de carbono

o

rs @

o

2.5 c m

Hexano

Poder de elución crec¡ente del eluyente

- Benceno

-

Clorurode metileno

-

Cloroformo (+ 1 % etanol)

Fig. 14: Pruebade la manchapara la determinación del eluyente adecuado (extraído de

tlel).

ajuste.Graciasa los esquemascitadosno hacefalta probara ciegas.¿Quéeluyentedebe elegirse? la sencilla"pruebade la mancha"(Fig.14)[19].Seaplicavarias Unagranayudala proporciona de lassustancias la disolución de pocoscentímetros, veces,de manerapuntualy a distancias a separarsobre el sorbentedeseado.Trasdejar evaporarel disolvente,se apoya sobre el centrode cada manchaun capilardelgadollenode eluyente.El podercapilardel sorbente las sustanciasen haceque el fluídose extiendaen formacircular,separandoeventualmente pruebas rápidas pueden forma de cromatogramacircular.Por comparaciónde estas en la Fig. 14 el mostrado estimarseel eluyentey el sorbentemás favorables.En el ejemplo puede la cubeta utilizarse benceno*es el más apropiado.Paraotrastareasde optimización Vario-KS(verFig. 35 en el Capítulo3). El CapÍtulo3, a continuación,nos va a presentarlas etapasdel trabajopráctico.

* por razonesde seguridad,el benceno deberíareemplazareactualmentepor tolueno.

25

3 Parte práctica El desarrollopráctico de la cromatografía de capa fina consta esencialmente de un procedimientoprincipal,un procedimiento facultativoy medidascomplementarias (Fig. t5l.

Las etapasdel procedimiento principal- aplicaciónde la muestra,desarrollo, deteccióny - son componentes evaluación irrenunciables de toda cromatografía. Las medidasfacultativas(prelavado de la capa,derivatización pre-y postcromatográfica, preacondicionamiento) permiten,en muchoscasos,influireficazy favorablemente la en sensibilidad, selectividad, y su reproducibilidad. separación Lasmedidascomplementarias incluyenla preparación de la muestraantesde su aplicación, de maneraadecuadaa laseparación,y laelecciónde lacapay el eluyente. A menudo,tambiénse incluyenen estasmedidascomplementarias el examende la separaciónpor luz UV y la documentación del cromatogramal2O). 3.1 Fabricaciónde las capas El usuariotiene hoy en día a su disposiciónuna multitudde sorbentesy tipos de capas preparadaspara cromatografíade capa fina. La oferla es por lo generalsuficientemente completa,por lo que la mayoríade las vecesno es necesarioque el usuariofabriquesus propiascapas. Sóloconvieneefectuarel revestimiento de lasplacasde CCFcuandolasquese precisenno estén disponiblesen el mercado.Como ejemplospuedenconsiderarselas capas que contienensustancias tampón,reactivosespeciales u otrosligantes,o biencapasformadas por mezclasde sorbentes. En generalel revestimientose efectúasobre placasde vidrio(detamaño5 x 20 cm, 10x 20 cm o 20 x 20 cm). Las placasse limpian previamentea conciencia(con polvos de fregar o detergente)y se aclarancon agua destilada. A continuación se introducen enfila en una plantillay se revistenmedianteun extendedor(Fig.16).Este procedimiento se puede automatizar(extendedorautomático de capas CAMAG).El espesor de la capa puedeser fijadoarbitrariamente entre0.1 y 2 mm [21].

Fig. 16: Revestimiento medianteuna plantilla.

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de capa fina. Fig. 15: Procedimiento de trabajoen cromatogr.afía 27

Indicacionesy sugerencias: - La superficie de lasplacasde vidriodebeestarlimpiade grasaparaque la capase adhiera correctamente. manejarlas sólo con guanteslimpios). flras desengrasar, - El revestimiento debe realizarse rápidamente. En caso contrariono quedarÍauna capa homogénea, debidoalarapidezcon quese endurece(p.ej.,pocosminutosen el casode las placas"G"). - La aplicacióndebe realizarse a velocidadconstante. - Debenevitarselascorrientesde aireduranteel procesode secado,puespodrÍanprovocar la apariciónde grietas. - Debenseguirsemuycuidadosamente lasindicaciones de losfabricantes, ya quecualquier errorrepercutirá en peorescapacidadde separación y reproducibilidad. - La calidady reproducibilidad de las capasfabricadaspor el usuarioson generalmente peoresque la de las preparadas. La adherencia de las capases peory su grosormenos constante.

3.2 Preparaciónde las capas 3.2.1 Activación Enla superficie de un sorbentese encuentra un elevadonúmerode centrosactivosen losque puedenadsorbersesustancias.La cantidadde sustanciaadsorbiday la estabilidadde ra adsorcióndependen(siendolos demás factoresconstantes)de la fuerza de los centros activos(energía por unidadde superficie) superficial y su número(superficie por unidadde peso).Cuantomayoresseanambosparámetrosmayores la actividaddel sorbentey portanto el poder de retenciónde la fase estacionaria. Cuandola actividades alta el eouilibno adsorción-desorción se desplazahaciala adsorción, lo queen la prácticasignificarecorridos más corlos y R¡smenores. El prerecubrimiento de la capacon desactivadores (generalmente sustanciaspolares)rebala su actividad.Enla desactivación de lasplacasconvencionales de CCFinfluyeespecialmente el vaporde aguadel aire.Las moléculasde agua,muy polares,se acumulanen los centros activos,disminuyendo la superficiedel sorbente.En pocosminutos(2 a 5) se estableceun equilibrio entreel aguade la capay el aguadel aire,quedependeúnicamente de la humedad del aire. La preparación de la placay la aplicación de muestraacostumbran a durarvariosminutos,por lo que la actividaddel sorbentereflejageneralmente la humedadrelativadel aire del laboratorio. La preactivación de la capasóloseránecesaria en contadasocasiones,ya queen cualquiercaso la actividadvendrádeterminadapor la humedaddel aire de la sala o laboratorio. Paraobtenerresultadoscromatográficos reproducibles se precisancondicionesconstantesy reproducibles. Existenunas cubetasespecialesque ofrecenla posibilidadde ajustarla actividad(acondicionamiento) (p.ej.la cubetaCAMAGVarioKSo lacubeta congranprecisión de dobledeposito,Cap.3.5.3122,231). 28

Indicacionesy sugerencias: tener una actividadalta para obteneruna elevadaeficaciade - No es imorescindible separación. depende,comotodo equilibrio, la actividad) - El equilibriode adsorción(y por consiguiente de la presióny de la temperatura.Lasvariacionesde presióny de temperaturaprovocano de aguao su cesiónal ambiente. bien la acumulación - Durantela aplicaciónde la muestrael vaporde aguadel alientopuedehacerdisminuir localmentela actividad. - En generalno es necesariopreactivarla capa. - A veces,sin embargo,se debe activar.En paísestropicalespuede llegara ser incluso parapoderreproducirlas separaciones. rndispensable del equitibrio(actividadconstante)dependedel espesorde la - Eltiempode establecimiento capay aumentacon éste. - En general,el efectocatalíticode la capa aumentaal aumentarla actividad.Algunos o condensaral estar en contacto con superficies eluyentespuedendesproporcionar act¡vas(p. ej. la acetona). sobrela mismaplacaque la muestra' - Las sustanciaspatróndebenser cromatografiadas de entradamantienenla influenciade la - Las salasclimatizadascon compartimentos constante. actividadconsiderablemente 3.2.2 Conservacióny Prelavado. Los sorbentesde gransuperficieadsorbenno sólo el aguasinotambiéntodos los demás Si se utilizancapasquehanestadolargo en el airedel laboratorio. vaporesquese encuentren aparecenextensasregiones sin ningunaprotección, tiempoexpuestasal airedel laboratorio cerca del frente del eluyenteo del frente F) que impidenla de suciedad(generalmente obtenciónde resultadosreproducibles. a losgases,por lo quesólo es permeable de plásticode lasplacascomerciales Elenvoltorio en soportesde La conservación ambiente. del las influencias de límite cierto lasaíslahastaun placas(p. ej. soportede placasCAMAG)protegedel airedel laboratorioy, por tanto, de las rmpurezas. Debidoa su capacidadde adsorcióny según las condicionesde fabricación(duranteel envasadoestán en contactocon grandescantidadesde aire),los sorbentescontienen siemprepequeñascantidadesde impurezasprocedentesdel medio ambiente(p. ej. etc.). pesticidas,suavizantes, Porello,en algunoscasospuedellegara ser necesarioprelavarlas capas. para el prelavadose eluye la capa generalmenteuna vez con una mezclade cloroformoEl recorridose hace metanol(1+ 1)o biencon el eluyentequese va a utilizarposteriormente. más largoque el previstopara el frentedel eluyentedel cromatogramaulterior[24]. lndicacionesy sugerencias: debe evitarsela - Si se almacenanlas placas en recipientesde vidrio (desecadores) de grasade cierre. utilización - No sueleser necesarioalmacenarsobreagentesdesecantes' 29

3.3 Preparaciónde las muestras. En algunoscasos,p. ej. en análisisde trazaso en muestrascon matricescomplejas,no se puedenaplicarlas muestrasdirectamente sobrela placa,sino que es necesariauna etapa previade purificación y/ode enriquecimiento (clean-up). A partirde la muestraa investigar se obtieneun crudo,p. ej.medianteextracción, destilación, sublimación (sólose o precipitación citanlos procedimientos de separación más imporlantes). Estecrudopuedesersometidoa otrasetapasde clean-upantesde la separación definitivapor cromatografía. Estasetapas deberían, en la medidade lo posible,separarlalssustancia/s por a investigar específicamente gruposo tipos de sustancias[25]. La Tabla2 agrupalos procesosde clean-upmás impofiantes.

Tabla2: Pasosde clean-up. Denominación

Descripción

Disolución

Separacióndirecta por solubilizaciónde - Al finalizar debe eliminarse el disollos componentesprincipales(extracción vente simple).

Extracción líquido-líquido

La muestra se reparte entre dos disolventes no misciblesen un embudo de decantación.La malriz de la muestrase concentraen un disolventey la sustanciaa analizaren el otro.

- El método hace preciso tener buenos químrcos conoc¡mientos - Los componentesde la muestradeben ser conocidos

Extracciónen fasesólida

a) Extraccióncon columnasExtrelut[26]. (Columnasrellenasde tierra de diatomeas.) La muestra (hasta 20 ml) se ¡ntroducedirectamente en la columna. La elucióncon disolventesorgánicos provoca la separación de todas las sustanc¡as lipófilas. La fase acuosa puedefinalmenteser eiuídacon disolventespolares-

- Todos los procedimentosusuales de extracciónsontransferibles a estemétooo - Se evita la formaciónde emulsiones - Se ahorraneluyentes,materialy tiempo - Los eluatosson puros - Los factoresde recuperación,así como la sensibilidadde la detección son mejores que en la extracciónconvencional

y sugerencias Indicaciones

b) Extraccióncon columnasadsorbex(co- - lntroducciónde muestra y extracción lumnas comerciales empaquetadas con disolventeadecuadocomo en a con fases modificadasquímicamente que ret¡enenselectivamente lassustancias). Placas espec¡ales

Las placas con zona de concentración - El estrechamientotiene lugar especialprocuranconcentrarlas mezclasaplicadas mente en s¡stemasde adsorción en una banda estrecha.Ocasionalmente ejercentambiénla funciónde un clean-up, en la que se separan sustancias interferentes[271.

Derivatización

Transformaciones ouímicasadecuadasal - Es ventajosa cuando trabajar con el problemapara modificarlas propiedades derivado es más sencillo que con la cromatográficas[28,29]. oroo¡amuestra

Cromatografía oe columna

Preseparación de una muestrapor croma- - El trabajo posteriordepende del grado tografíade intercambioiónico, de adsoroe pureza ción,de particióno afinidaden columnas - Es posible el acoplamiento directo convenc¡ona¡es. HPLC/CCF segúnse requiera.

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lndicacionesy sugerencias: empíricamente. debenhallarsey optimizarse - Muchosde los procesosde preparación - Cualquiererrorcometidoen la preparación del cromatose arrastrahastala evaluación gramaterminado. - Los utensiliosy disolventesnecesariospara la preparación de la muestradebenestar absolutamente limoios. - Deberíaprepararsesuficientesustanciaparapoderefectuarmedidasde control(determtnacionesdobleso múltiples), laslábiles) deberíancromatogralasmuestras(especialmente - Despuésde la preparación, una fiarsetan ráoidocomofueraoosible.Paraalmacenar duranteunanochedebeutilizarse nevera.Paraalmacenamientos más largosdebe usarseun congelador. 3.4 Aplicación de las muestras. 3.4.1 Generalidades (verCap. En generalse aplicanmuestrasque han sido sometidasa algunapreparación J.ó1.

o en formade banda(Fig.17).En general,la La aplicaciónpuedehacersepuntualmente de la manchaen la dirección aplicación en formade bandaproduceun menoralargamiento procedimiento se eliminanen gran del flujo,comparadocon la aplicaciónpuntual.Poreste de colas (tailing). pueden formación que a la parte las sobrecargas conducir de la capa y evalúan con mayor mejor se separan se Ademáslas mezclasaplicadasen formade banda por pocas capa pueden bandas que aplicar se resideen exactitud.La desventaja [30]. parael tamañode la manchade La eleccióndel disolventede la muestraes determinante en formacircularsobreel mismo lassustancias partida.Algunosdisolventes cromatografían puntode partida,mientrasque otrosno (Fig.18).

n-Hexano 9*

o

Toluono

o

Cloroformo

o puntualy entreaplicación Fig.17: Comparación en forma de banda.

áE -^

oo. o-c

a

Acetona

del disolventesobreel tamaFig.18: Influencia ño de la manchade partida. JI

La muestray la sustanciapatróndeberíandisolverseen el mismodisolventeo mezclade disolventes. Despuésde la aplicaciónse eliminacompletamente este disolvente o mezcta, pudiéndose aumentarla velocidadde evaporación con un ventilador. En estecasohay que tener en cuenta que puede alterarselocalmentela concentraciónen la mancha por evaporación asimétricadel disolvente. puntualesel volumende muestraaplicadoes, por lo general,de 1 a 5 ul en En aplicaciones cromatografÍa de capafinay de 100a 500nl en cromatografía de capafinade altaresolución (HPTLC). La concentración de la muestrasueleoscilarentre0.01 o/oy 1.OOo/o. Eldiámetrode lasmanchasde partidano deberíasersuperiora unos5 mm en CCFy 1-2mm en HPTLC.Hayque evitaren lo posiblela aplicaciónen variasfracciones, dadoque en cada aplicación sucesivase cromatografíala (loque se reconoce manchaaplicadaanteriormente por la formade huesoen el cromatograma final).Pesea todo,si es necesario aplicaren veces sucesivas, se evaporará el disolventeentrecada aplicación. Las disoluciones de muestray patrónempleadasen estudioscuantitativos deben,en ro posible,contenerla mismamalriz.Eventualmente se debeañadirlamalrizde la muestraa las patrónen proporciones disoluciones quela presencia comparables,ya de otroscomponentes puedealterarlos R1sde las sustanciasde referencia. 3.4.2 Preparaciónde las placas Normalmente, en primerlugarse marcala líneade comienzoa 1.5cm del bordeinferioren CCF(aprox.1 cm en HPTLC). A una distanciade 10 a 15 cm (aprox.5-7 cm en HPTLC)se acota el recorridoprevistodel frentedel eluyente.Las marcasdeben hacersecon un lápiz blandoy en los bordesexterioresde la placaparaevitard añarla capa.Los puntosde partida se marcancuidadosamente separados entresí por unadistanciadel a2 cm (aprox.5 mm en HPTLC)y, empezando desdeel bordede la placa,siguiendola líneade partidaimaginada (Fig. 19).Las plantillasde aplicaciónhacenmás sencillaestatarea(Fig.20). La regióncomprendida entrela marcadelfrentey el bordesuperiorde la placapuedeutilizarse para escribirotros datos adicionalescomo la fecha,las condicionesexoerimentales o la (Fig.19). descripciónde las disoluciones aplicadas(características de la aplicación) En análisiscuantitativos se aplicanpatronesde comparación de concentración conocidaal lado de las franjas de análisis.La aplicaciónse realizasegún distintos esquemas, dependiendo de quesetrabajeconel métodode un patrónde variospatroneso con latécnica del data-pair[32]. preparativas Las cromatografías se realizanla mayoríade las vecessobreplacasde 20 x20 cm con capasde unos2 mm de espesor.La líneade partidase marcaa 2 o 3 cm por encima delbordeinferiorde la placa.Sobreestalíneade partidase aplicanhasta200mg de sustancia disueltosayudándose de unareglay medianteun capilaro unajeringa.También en estecaso debeevitarseen lo posibleaplicaren vecessucesivas. Elúnicoprocedimiento adecuadopara (CAMAGLinomatlV). aplicaciones múltipleses el de pulverización 3.4.3 Métodos de aplicacióny aparatos. Paraaplicarse utilizangeneralmente capilareso jeringas[34].Cuandose aplicamediante capilares bastael podercapilarde la capaparahacerfluirla solucióna ensayar. La aplicación por jeringaes una aplicaciónforzada:la muestrase expulsaal ejerceruna fuerzasobre la 32