Tlc Parte2

Se describe por el número de platos teóricos,N, o la altura de plato, H. N:

,u(r*)

\A12

H:

" 16X

dondeX expresala distanciaentreuna manchade sustanciay el puntode paftiday W el de 10cm,N alcanzavaloresde hasta5000en placas diámetrode la mancha.Paraun recorrido (comparando, al de unacolumna estevalorde N corresponde de CCFde altaeficacia(HPTLC) de CG empacadade 2 m de longitud;unacolumnade HPLCde 25 cm y diámetrointeriorde 4.6 mm alcanzalos 10 - 15.000platosteóricos).Más claroes compararla alturade un plato teórico:losvalorestípicosson 6 a 10 p en columnasde HPLCy 12 V en placasde HPTLC.A menoralturadel platoteórico,másetapasde separacióntienenlugarparaun mismorecorrido y mayores la eficaciade separación. Hay que distinguirla selectividadde la eficacia de separación.Mientrasla eficaciade del pico (verarriba),la selectividadexpresala separaciónhacereferenciaal ensanchamiento diferenciaentre los R1sde las sustanciasseparadas. La Fig. 7 aclaraesta relación. Parala aplicaciónpráctica,lo decisivoes la calidadde la separaciónde dos sustancias Éstadependetanto de la distintasen un sistemade CCFdado (eluyente+ faseestacionaria). Fig. 7: Diferenciaentreeficaciade separacióny selectividad de una separación cromatográfica.

cromatode la resolución Fig.8: Determinación gráfica R".

Alta eficaciade separación (: picos estrechos) pero baja --t selectividad (sustancias separadasde forma incompleta)

rl

+I Baja eficacia de separación(= picos anchos) pero buena selectividad(R1sclaramentedistintos).

lYry¿rJllrwrJ

17

eficaciade separacióncomo de la selectividaddel sistemade separación.El parámetro es la resolución,R" (verFig. 8). correspondiente R":

1 /2 W 1 + 1/2 W 2

AsíW expresael diámetrode lasmanchasde dossustancias 1 y 2,y d es la distanciaentrelos centrosde las manchas.Es evidenteque cuanto mayor es la distanciay menoreslos diámetrosmediosde lasmanchasde lassustancias, mejores la resolución. Cuando1/2W1 1/2 W2: d, entoncesR. : 1 y lassustancias por líneade base",es decir,la están"separadas respuestacromatográficavuelveentreellasa la líneade base (verFig. 8).Kaiserintrodujoun parámetroadicionalde gran utilidad,el númerode separación,SA/[14]. Este parámetroexpresael máximonúmerode sustanciasque un sistemade CCF puede separaridealmente de maneracompletaen un determinado recorrido.En este caso ideal, todos los pares de sustanciasvecinas estaríanseparadoscon una resolución1 (ver arriba). La determinación experimental de este parámetroSN (Separation Number)es realmente sencilla: - Se cromatografía una mezclade sustanciascuyos Rrsson distintosy se encuentran por todo el cromatograma. distribuídas - Conun densitómetro (verFig.43)se registra y se representa un densitograma en unaescala ampliadael anchode la mancha,medidaa la mitadde la alturadel pico,frenteal recorrido respectivoZ¡ (verFig. 9). - Lospuntosobtenidosse unenpor unarectay se extrapolan losanchosde manchaboy br a Z¡ = 0 Y Zt : 1 respectivamente. - Se calculaSN (magnitudadimensional) segúnla relaciónsimplificada:

sN: __zr _t dondeZ¡ es el recorridohastael frente. Fig. 9: Determinación del númerode separaciónSN [14].

Puntode

- Esta imagen no es de todo correcta 1B

2.3 Empirismoilustradoo ¿qué influyeen una separacióny de qué manera? en ordendecrecientede importancia,25parámetrosque F. GEISS[15] cita, clasificados influyenen la separaciónpor CCF: 1. Faseestacionaria. 2. Fasemóvil. 3. Tioo de cubeta. (acondicionamiento). 4. Adsorciónpreviade una mezclade disolventes 5. Humedadrelativa, 6. Actividadde la fase estacionaria. 7. Saturaciónde la cubetay la fase estacionariacon vaporesdel eluyente. 8. Tamañode granode las partículasen la fase estacionaria. 9. Tamañode las manchasaplicadas. 10. Distanciaentrela posicióninicialde la sustanciay el niveldel eluyenteen la cubetade separación. irregulara lo largodel recorridode los distintos 11. Gradientesde eluyente(distribución del eluyente). componentes 12. Alteraciones en la calidadde la faseestacionaria. 13. Velocidadde flujode la fase móvil. 14. Magnituddel Rr. 15. Temperatura. 16. Volumende la muestra. 17. Aglomerante en la faseestacionaria. 18. Espesorirregularde capa en la fase estacionaria. 19. Fabricación de la faseestacionaria. 20. Espesorde capa de la fase estacionaria. 21. Convecciones en la fasegaseosade la cubetade separación, de la fase móvil). 22. Tipo de desarrollo(flujoascendente/descendente/horizontal 23. lmourezasen el eluvente. 24. Recorrido. 25. pH. de capafina,porqué influyen enlacromatografía cuántosparámetros Estalistamuestra claramente el empirismoprecedea la teoríay porquése requiereun grancuidadoparaobtenerresultados En el marcode esta introduccióndirigiremosnuestraatenciónsólo a la fase reproducibles. la de la cubeta.Al finalde estecapÍtulose encuentra a la fasemóvily a la saturación estacionaria, de separación. adecuadas de lascondiciones determinación 2.3.1 La faseestacionaria(el sorbente) fueunacondiciónprevia y calidadconstantes de naturaleza de sorbentes Lacomercialización rutina. de propagación método para la CCF como de la esencial Las característicasprincipalesy los parámetrosde los sorbentesse resumenen los tres apartadossiguientes, (1)Composiciónquímicay estructura. en dos tipos: Los numerosossorbentesse clasificanbásicamente tambiénllamadasstraightphaseso fasesnormales. - Fasespolares(hidrófilas), - Fasesapolares(lipófilas), tambiénllamadasreversedphaseso fasesreversas(abreviadas RP). 19

Enmedioseencuentran polares.Ensu mayoría lasfasesmedianamente setratade sorbentes modificados comoporejemplolasfasesnitriladas, dioladaso aminadas. Suspropiedades se asemejana las de las fasesnormalo reversadependiendo del eluyente. Lasfasespolaresse combinanen generalcon eluyentesno polarescomo cloroformo/metanol.Porel contrario,lasfasesreversasse combinancon eluyentescon alto contenidoen agua.Naturalmente, al cambiarde fasedirectaa fasereversase invierleel ordende elución. Lossorbentes de mayorsignificación prácticasonel gelde sílice,el gelde sílicemodificado, et óxidode aluminio y la celulosa. Cercade un 90 % de las separaciones se realizansobregel de sílice,un polvoporosoy amodo.Contieneen su superficiegruposSi-OHque puedenformarenlacespor puentede hidrógenoentre ellos o con sustanciaspolares.La cantidadmáximade grupos S|-OH y por lo tantola máximaactividad,la presentael gel de síliceactivadoa '150oC. disponibles, Estetratamiento le haceperderel aguaadsorbiday tenerde 4 a 6 gruposSi-OHpor cada10 nm2. Los gelesde sílicemodificadosse obtienenpor reacciónmediantesilanosapropiados.Los gruposfuncionalescomo -NHr, DIOL o -CN quedanasí fijadosquímicamente sobre ra superficie delsorbente.Losgelesde sílicehidrofobizados (silanizados) con alquilclorosilanos son de especialinterésen cromatografía. Paftiendode gel de sílice(faseestacionaria polar)se obtienenfasesapolaresllamadasfases reversas. Se comercializan sistemasRP con 1, B o 18 átomosde carbonoen la cadena hidrófoba:las fasesRP-2,RP-8y RP-18. Por últimoexistentambiéngeles de sílicecon gruposfuncionalesquirales(ópticamente activos).Estasfasespermitensepararsustancias ópticamente activasen susenantiómeros por interacciónde diastereómeros. En la actualidad,la síntesisde productosnaturalesy fármacoses impensable sin un controlrigurosode la purezadel enantiómero: los distintos puedentenerdistintaspropiedades enantiÓmeros y, por lo tanto,debenser farmacológicas investigados separadamente. El uso de celulosacomo sorbenteparasepararsustanciashidrófilascomo aminoácidos v azúcaresproduceresultadosparecidosa los obtenidospor cromatografía de papel. Se vendentambiénplacasde poliamiday de silicatode magnesio(Florisil) en cuyosdetalles no se entraaquí. (2)Características de granoy de poro. La eficaciade separaciónde un adsorbente(verCap.2.2)estádeterminadapor su estructura geométrica. Tambiénforman parte de ella el tamaño de parlículay su distribución.La selectividadde un adsorbente(ver Cap. 2.2) depende,por el contrario,de la estructura químicadel material. - Diámetrode partícula. En principiose cumpleque cuantomenoresson las partículas y cuántomás estrechaes la distribución de tamañosde granotantomejores la eficaciade separación. Losdiámetrosde las partÍculasdeberíanser ademáslo más uniformesposible(distribución de tamañode partícula estrecha). Eldiámetrode partícula de losgelesde sílicecomerciales oscilaentrelos5 y los 40 gm. En la Figura10 se muestrandistribuciones típicasde tamañode grano. 20

Capaspreparadas HPTLC CCF Gelesde sílicede CCF

Gelesde sílicede CCFclásicos

comerciales. de tamañosde granode sorbentes Fig.10: Distribución - Super-ficie. entremuestray Seexpresaen m2/ g. A mayorsuperficie,másintensasson lasinteracciones El poderde adsorciónes mayor,es decir,la retenciónes másfuerte.Las faseestacionaria. superficiesde los geles de sílicecomercialesestán comprendidasentre 400 y 600 m'/9. - Volumende poro y su distribución. Se expresaen ml/g (unvalortípicoes 0.8 ml/g).Unavariablerelacionadaes el diámetrode poro, expresadoen nm (unvalortípicoes 6 nm). (3)Parámetrosde capa. entre100 y 250 pm, se sitúatípicamente analíticas El espesorde las capasde separación y el de las los 250 ¡-rm, de nqrmalesestáalrededor mientrasqueel de lascapasde separación Para separaciones 200 ¡rm. capas de CCF de alta eficacia(HPTLC)alrededorde los preparativas existenptacascon espesoresentre0.5 y 2 mm. Raspandodeterminadaszonas adheridas, posteriormente lassustancias y solubilizando de la placadespuésde laseparación es oosibleaislarestassustancias. Tambiéninfluyenen las propiedadesde las capas los aglomerantesempleados,que orgánicos). y fijación(p. ej.,el yesoo aglomerantes aumentansu estabilidad placasconzonasde concentracón.ldealmente,en estaszonasde Tambiénse comercializan concentrándoseen una concentraciónlas sustanciasavanzancon el frente del eluy"ente, banda estrecha(p. ej., procesosde separaciónadsortivos).Al alcanzarsela capa de separaciónempieza la cromatografíapropiamentedicha. La línea de partida de la 21

cromatografíase encuentraen la fronteraentre la zona de concentracióny la capa de se mantieneasi El tamañode la manchaen la direcciónde la cromatografía cromatografía. pequeñoy se mejorala resolución. 2.3.2 La fasemóvil. su actividad,la eleccióndel eluyente Ademásdel sorbentey (parasorbenteshidrófilos) también influyedecisivamente en la separación.El eluyentedisuelvedel sorbentelas Tabla1: Serieeluotrópica segúnHALPAAP[17]. Serie eluotrópica

Fórmula

Indicede polaridad segun Snyder-)

Masa Consmotar tante dieléctrica

Punto oe ebullición

Presión de vapor

Valor MAK 1983

rcl

(20"c)

[mbar]

Iml/m3] o [ppm]

(20o 25"C)

Ig/mol]

1.9

'100.21

98.4

48

500

n-heptano

u7n 16

n-hexano

C o H,¿

0 .0

1.9

8 6 . 1B

68.9

160

100

ciclohexano

C o H,e

0.0

2.0

8 4 . 16

80.7

104

300

¡sooctano

C a H,u

0.4

1.9

114.23

99.2

CI

500

2.4

'187.38

47"7

368

1000

153.82

76.5

120

10

11 0 . 6

29

200

210

10

87

20

1,1,2-tricloro- ctrFccctF2 trifluoroetano tetraclorurode carbono

cc14

1 .7

tolueno

c6H5cH3

2 .3

2.4

92.14

cloroformo

cHC13

4.4

4.8

11 9 . 3 8

dicloroetano

ctcHrcH2cl

3 .7

10.6

98.97

83.4

diclorometano

cH2cl2

AA

9.1

84.93

40.0

'1-butanol

cH3(cHr)3oH

3 .9

17.8

74.12

117.2

acetonitrilo

cH3cN

6-2

41.05

8 1. 6

07

40

2-propanol

cH3cH(oH)cH3

4.3

18.3

6 0 . 10

82.4

4J

400

+.ó

6.0

88.10

77.1

acetato de etilo cH3cooc2Hs

ot./

100 6.7

.100

400 233

1000

acetona

cH3cocH3

5.4

20.7

58.08

56.2

etanol

crH50H

5.2

24.3

46.07

78.5

1,4-dioxano

c4H8o2

4.8

2.2

88,.11

101.0

41

50

7.4

72.11

66.0

200

200 200

tetfahidrofurano c4H80

1000

metanol

cH30H

6.6

32.6

32.O4

65.0

128

agua

HrO

9. 0

80.2

18.01

100.0

23

.) L. R. Snyder:J. Chromatogr.92,223-230 (1974)

¿¿

__.>

Precarga -_+

Capa seca Capa seca

--->

Papel de filtro saturado por capilaridad

--¡>

-"+

,/

Saturación capilar

--

+ I

tt Cubeta saturada

Cubeta no saturada

del cromatograma. de la cubetasobreel desarrollo de la atmósfera Fig.11: Influencia sustanciasa separar,haciéndolasavanzar.Cuanto más eluyente se adsorbe sobre el Si la sustancia sorbente,mayores el poderde eluciónde éste (poderde desplazamiento). próxima al frente. más se eluye que por sorbente, el tienemayorafinidadpor el eluyente de en estemomentoadvediracercade unaconfusiónde concepto:la composiciÓn Conviene necesarlamente no puede, aunque móvil) fase (comunmente llamada la mezclaeluyente porqueel eluyentetambién debe,ser idénticaa la fase móvilefectivacromatográficamente pone de relievecuandose se fenómeno Este proceso cromatográfico. está sometidoal de los llamados la aparición lugar a dando componente, de un más de utilizaneluyentes "frentes8", especialmenteen cubetas"sandwich"(verCap. 3). sobreunacapade gel de sílice Un ejemplonosva a dejarestomásclaro:cromatografiamos polar, retrasacromatográficamente, se y El éter, éter. ciclohexano empleandocomo eluyente cieftadistanciadel mismo A una ciclohexano. de únicamente que se compone el frente conlo punto hay un salto en la y En este éter. ciclohexano de mezcla una aparecer emptezaa pocopolares,que lo quese conocecomo"frente8".Lassustancias polaridaden el eluyente, sólo,seagrupanenestaposición.Lo mismolesocurrea menudo conciclohexano no avanzan a las impurezasde la propiacapa.Al fenómenodescritose le superponenademásotros efectoscomo la evaporacióny la condensación(versaturaciónde la cubeta). en unasucesiónde poderde elución Se ha comorobadola utilidadde ordenarlos eluyentes con la ordenaciónde los esencialmente "serie corresponde se eluotrópica" creciente.Esta hablando,unaserie Estrictamente dieléctrica. polaridad o su constante su según eluyentes parael gel de las series todo, Con para determinado. un sorbente sólo válida es etuótrópica sílicey el óxidode aluminioson casiiguales,mientrasque la serieparaunafaseRPtieneun aspectototalmentedistinto. del de la serieeluotrópica másimporlantes LaTabla1 muestraunaselecciónde loseluyentes gel de sílice. 23

La saturaciónde la cubetainfluyede maneraimportanteen el resultadode la separación.La Fig.11 muestraesquemáticamente lo que sucedeen una cubetano saturada.La placade capa fina se ha introducidoinmediatamente despuésde verterel eluyente.Durantela separaciónse evaporaeluyentede la placa,predominantemente en la zona del frente.Se requieremás eluyentepara un mismo recorridodel frente y los Rls aumentan.Si por el contrariose revistela cubetacon papelde filtro empapadocon el eluyente,sus vaporesse distribuyen en pocotiempoportodo el volumende la cubeta,con lo queéstase satura.Si se introduceuna placade separaciónen unacubetapreparadade esta manera,la capasecase impregnade eluyente.Se requiereentoncesmenoseluyenteparaun mismoavancedelfrente y los R1sson menores. La diferenciaentrelos R¡sde cubetasno saturadasy saturadases sin embargosóloaparente. En el primercasoha fluídopor la placamáseluyentedel que correspondería al recorridodel frente.En el segundo,el vapordel eluyentecondensapor delantedelfrente,aparentando un mayorrecorridodel mismo. Por último,y como ejemplo,vamosa mostrarla influencia de variosdisolventes sobreuna separación. La Fig. 12 muestracómo una mezclaproblemade colorantesse eluyemás al utilizareluyentesde poder de elución creciente.Mientrasque el n-hexano,apolar,deja inmóviles lassustancias adsorbidas enel puntode partida,laacetona,máspolar(situada más abajo en la serie eluotrópica)arrastralas sustanciasun largo trecho. En ambos casos la separaciónes nula.Los eluyenteso mezclasque se encuentranentreestos dos disolventes en la serieeluotrópica consiguen,algunosmejorque otros,separarla mezcla. En la secciónsiguienteveremoslas indicaciones prácticasparaoptimizaruna separación determinada. 2.3.3 Determinaciónde las condicionesadecuadasde separación. En la práctica diaria se puede recurrir,para numerososproblemasde separación,a la propiao ajenay consultarla abundantebibliografía. experiencia Presentamos a continuación algunasreglasgenerales y experiencias que facilitanla determinación de lascondiciones de separaciónen el sentido del "ilustrado". Una aclaraciónen primerlugar:al considerarlógicamentelas interrelaciones de los factores fasemóvil,faseestacionaria y sustanciaaanalizarse obtieneel esquemageneralde la Fig.13. Cuandosedirigeunvérticedeltriángulo haciaunapropiedad dadade unode lostresfactores, las de los otros dos quedanmás o menos"automáticamente" determinadas. Este recursoproporcionasólamenteun punto de referencia.En la mayoríade situaciones prácticasdebe intervenirel empirismopara resolverel problema.Hablandoclaro:pruebay

':i

j ,.

. .:. l

ir je

:=_=a

j"'it f.,,,,.,"'"' ;,,--. 24

r

a ¿ I

' :I ü * ü

rú. .l

: .

Fig. 12: Influenciade varios eluyentesen la separacióncromatográficade una mezcla pro" blema de colorantes.De izouierdaa derecha: j-'jj:'.:É= n-hexano, benceno, benceno-cloroformo(1 + ::i ::''.i:r 1), cloroformoy acerona.