Tesis Microalgas 1.pdf

UNIVERSIDAD POLITÉCNICA DE CHIAPAS

PROGRAMA ACADÉMICO DE MAESTRÍA EN ENERGÍAS RENOVABLES

“EVALUACIÓN DEL POTENCIAL DE PRODUCCIÓN DE BIODIESEL A PARTIR DE MICROALGAS USANDO AGUA RESIDUAL COMO MEDIO DE CULTIVO”.

TESIS QUE PARA OBTENER EL GRADO DE

MAESTRO EN ENERGÍAS RENOVABLES

PRESENTA

PAULA DEYANIRA ORANTES CALLEJA

DIRECTOR: DRA. MINERVA GAMBOA SÁNCHEZ CODIRECTOR: DR. SERGIO ALBERTO GAMBOA SÁNCHEZ

Tuxtla Gutiérrez, Chiapas, Enero de 2018.

AGRADECIMIENTOS Al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT), por el apoyo financiero brindado durante la estancia en la institución, cursando la maestría, el cual fue primordial para lograr esta meta. Gracias de corazón a mi directora de tesis a la Dra. Minerva Gamboa Sánchez, así como a mis asesores, el Dr. Sergio Alberto Gamboa Sánchez y a la Mtra. Yazmín Sánchez Roque, por su dedicación, apoyo, paciencia y tiempo brindado. Ha sido un privilegio poder contar con su guía y ayuda. Al Dr. Sergio Saldaña Trinidad, por su amabilidad y atinadas recomendaciones y ayuda con la revisión de la tesis. A todo el personal administrativo en la UP que dedicó su tiempo en atenderme amablemente en lo relativo a la escuela. A los maestros que se encargaron de mi formación y la de mis compañeros durante la maestría. Gracias a la carrera de Ingeniería en Tecnología Ambiental por permitirme usar las instalaciones, los equipos y reactivos de los laboratorios de la misma, al Dr. Josué Chanona, Coordinador. A los laboratorios de Ingeniería Agroindustrial e Ingeniería en Energías por el uso de sus instalaciones, equipos y reactivos. A la Mtra. Edith Ponce, por su apoyo y atención. Al TSU Roosvelt Toledo, por su amable ayuda en diversas técnicas e información, muchas gracias!. A los coordinadores de dichas carreras, Dr. Roger Castillo Palomera, Dr. Sergio Saldaña Trinidad. Agradezco ampliamente al Dr. Emilio Arenas Guerrero, quien me brindó su apoyo durante toda mi estancia en la maestría, con consejos, revisiones e información, además de facilitar las algas usadas durante esta investigación. Gracias por tu buen criterio, enseñanzas y simpatía. Agradezco a mis compañeros y amigos, José Carlos, Jero, Valente, Scarlett, Rocío, Gera, Ing. Gilberto, Karina y aquellos que hayan estado ahí, por su valiosa ayuda y compañía cuando los días eran largos y cansados en el laboratorio. Sin ustedes esto no sería posible. Finalmente, agradezco a dios y a mi familia por su apoyo y amor.

DEDICATORIA La tesis la dedico con todo mi amor y cariño a mi familia. A mi hijo al que adoro, mi motor en la vida para seguir adelante. A mi mamá y a mis hermanos, por su gran apoyo no solo durante esta etapa sino toda mi vida. Se la dedico especialmente a mi abuelita que está en el cielo, pero que me dejó grandes enseñanzas y sobre todo un gran ejemplo y amor. Te extrañaremos siempre.

Índice Resumen ................................................................................................................. 1 Glosario ................................................................................................................... 3 Capítulo 1 Introducción ........................................................................................... 5 1.1 Planteamiento del Problema .......................................................................... 5 1.2 Justificación ................................................................................................... 6 1.3 Antecedentes ................................................................................................. 8 1.4 Objetivos ...................................................................................................... 12 Objetivo general. ............................................................................................. 12 Objetivos específicos ...................................................................................... 12 1.5 Hipótesis ...................................................................................................... 12 Capítulo 2 Marco Teórico ...................................................................................... 13 2.1 Producción de biodiesel a partir de microalgas ............................................ 13 2.1.1 Biodiesel ................................................................................................ 13 2.1.2 Biodiesel a partir de microalgas ............................................................. 14 2.1.3 Síntesis de lípidos .................................................................................. 16 2.1.4 Factores que afectan la acumulación de triacilglicerol y la composición de ácidos grasos.................................................................................................. 17 2.1.4.1 Nutrientes ........................................................................................ 18 2.1.4.2 Temperatura .................................................................................... 19 2.1.4.3 Luz ................................................................................................... 19 2.1.4.4 Fases de crecimiento y estatus fisiológico ....................................... 20 2.1.4.5 Otros ................................................................................................ 20 2.2 Producción de microalgas ............................................................................ 21 2.2.1 Selección de la especie ......................................................................... 21 2.2.2 Cultivo .................................................................................................... 22 2.2.3 Cosecha de biomasa celular .................................................................. 23 2.2.4 Extracción de lípidos .............................................................................. 24 2.3 Producción de biodiesel por microalgas en aguas residuales ...................... 26 2.3.1 Eficiencia del crecimiento de microalgas en aguas residuales .............. 29

2.3.1.1 Ciclo del nitrógeno ........................................................................... 30 2.3.1.2 Ciclo del fósforo ............................................................................... 32 Capítulo 3 Metodología ......................................................................................... 34 3.1 Caracterización fisicoquímica del agua residual .......................................... 34 3.2 Especie Verrucodesmus verrucosus ............................................................ 34 3.3 Cultivo de microorganismos y diseño experimental ..................................... 35 3.4 Coliformes fecales........................................................................................ 38 3.5 Eficiencia de remoción de nutrientes ........................................................... 41 3.5.1 Amonio (𝑁𝐻4+ ) ........................................................................................ 41 3.5.2 Fosfatos (𝑃𝑂43− ) ..................................................................................... 43 3.5.3 Nitratos (𝑁𝑂3− ) ........................................................................................ 45 3.6. Concentración celular ................................................................................. 48 3.7. Separación de la biomasa del medio de cultivo .......................................... 51 3.8. Extracción de lípidos totales ....................................................................... 52 3.9. Cuantificación de lípidos ............................................................................. 53 Capítulo 4 Discusión de Resultados...................................................................... 55 4.1 Caracterización fisicoquímica del agua residual cruda y tratada ................. 55 4.2 Cinéticas de crecimiento .............................................................................. 58 4.2.1 Primer escalado de 250 ml .................................................................... 58 4.2.2 Segundo escalado de 1 L ...................................................................... 62 4.2.3 Tercer escalado de 18 L ........................................................................ 65 4.3 Rendimientos de producción de biomasa .................................................... 68 4.4 Remoción de nutrientes y coliformes fecales ............................................... 70 4.4.1 Caracterización Inicial ............................................................................ 70 4.4.2 Primer escalado de 250 ml .................................................................... 71 4.4.3 Segundo escalamiento de 1 L ............................................................... 73 4.4.4 Tercer escalamiento de 18 L ................................................................. 74 4.5 Comportamiento del pH ............................................................................... 78 4.5.1 Primer escalamiento de 250 ml ............................................................. 79 4.5.2 Segundo escalamiento de 1 L ............................................................... 80

4.5.3 Tercer escalamiento de 1 L ................................................................... 81 4.6 Evaluación del rendimiento de lípidos .......................................................... 82 Capítulo 5 Conclusiones ....................................................................................... 86 Capítulo 6 Recomendaciones ............................................................................... 88 Referencias Bibliográficas ..................................................................................... 89 ANEXOS

Índice de tablas Tabla 2.1. Biomasa y productividades de lípidos de microalgas crecidas en varios tipos de agua residual [26]. ............................................................................................ 28 Tabla 3.1. Parámetros físico-químicos a medir en la caracterización del agua residual. .............................................................................................................................. 34 Tabla 3.2: Medios de cultivo usados para el crecimiento de Verrucodesmus verrucosus .............................................................................................................................. 35 Tabla 4.1. Caracterización de los parámetros fisicoquímicos al agua residual cruda y tratada. .................................................................................................................. 56 Tabla 4.2. Contenido típico de nutrientes en agua residual municipal cruda en mg/L [51]. ....................................................................................................................... 57 Tabla 4.3. Concentraciones celulares (cel/ml) iniciales y finales de las etapas exponenciales en cada medio. Parámetros poblacionales: tasa de crecimiento específico (µmáx/día); tiempo de duplicación, tg (días) y divisiones por día, k. Primer escalado de 250 ml. .............................................................................................. 61 Tabla 4.4. Concentraciones celulares (cel/ml) iniciales y finales de las etapas exponenciales en cada medio. Parámetros poblacionales: tasa de crecimiento específico (µmáx/día); tiempo de duplicación, tg (días) y divisiones por día, k. Segundo escalado de 1 L. .................................................................................................... 65 Tabla 4.5. Concentraciones celulares (cel/ml) iniciales y finales de las etapas exponenciales en cada medio. Parámetros poblacionales: (µmáx/día); tiempo de duplicación, tg (días) y divisiones por día, k. Tercer escalado de 18 L. ................ 67 Tabla 4.6. Rendimiento máximo de la especie Verrucodesmus verrucosus (mg/L) correspondiente al tercer escalamiento en fotobiorreactor de 20 L de capacidad. 69 Tabla 4.7. Caracterización de los diferentes medios de cultivo. Amonio (𝑁𝐻4+ ), Fosfatos (𝑃𝑂43− ) y Coliformes Fecales (NMP/ml). ................................................................ 70 Tabla 4.8. Concentración inicial de Amonio (𝑁𝐻4+ ), Fosfatos (𝑃𝑂43− ) y Coliformes Fecales (NMP/ml) para los diferentes medios de cultivo durante el primer escalamiento. ........................................................................................................ 72

Tabla 4.9. Concentración final de Amonio (𝑁𝐻4+ ), Fosfatos (𝑃𝑂43− ) y Coliformes Fecales (NMP/ml) para los diferentes medios de cultivo durante el primer escalamiento. . 73 Tabla 4.10. Concentración inicial de Amonio (𝑁𝐻4+ ) y Fosfatos (𝑃𝑂43− ) para los medios de cultivo durante el segundo escalamiento. ........................................................ 74 Tabla 4.11. Concentración final de Amonio (𝑁𝐻4+ ) y Fosfatos (𝑃𝑂43− ) para los medios de cultivo durante el segundo escalamiento. ........................................................ 74 Tabla 4.11. Concentración inicial y final de (𝑁𝑂3− ) y porcentaje de remoción de los medios de cultivo durante el tercer escalamiento.................................................. 77 Tabla 4.12. Rendimiento máximo de lípidos en % y en mg/L, en los tratamientos con ARC-E y AF. .......................................................................................................... 83

Índice de figuras Figura 2.1. Transesterificación de aceite para biodiesel (R1–3 son grupos de hidrocarburos) [21]. ............................................................................................... 14 Figura 2.2. Productividad de aceite de las microalgas en comparación con los cultivos convencionales [3]. ................................................................................................ 15 Figura 3.1. Cultivo de algas en matraces de 500 ml con 250 ml de medio inoculado. .............................................................................................................................. 36 Figura 3.2. Cultivo de microalgas en reactores de 20 L con 18 L de medio inoculado. .............................................................................................................................. 37 Figura 3.3. Prueba presuntiva de coliformes fecales. ............................................ 39 Figura 3.4. Análisis de concentración de amonio .................................................. 41 Figura 3.5. Curva de calibración de amonio (𝑁𝐻4+ ). .............................................. 43 Figura 3.6. Análisis de la concentración de fosfatos. ............................................ 44 Figura 3.7. Curva de calibración de fosfatos ( 𝑃𝑂43− )............................................. 45 Figura 3.8. Análisis de la concentración de nitratos .............................................. 46 Figura 3.9. Curva de calibración de nitratos (𝑁𝑂3− ) ............................................... 47 Figura 3.10. Reglilla de Neubauer de 9 mm2......................................................... 48 Figura 3.11. a) Vista al microscopio de la microalga con el objetivo 40X. b) Vista en el microscopio de barrido electrónico. ....................................................................... 49 Figura 3.12.Sedimentación de algas durante 24 hrs. ............................................ 51 Figura 3.13. Cosecha de microalgas después de la centrifugación ...................... 51 Figura 3.14. Extracción de lípidos en aparato Soxhlet. ......................................... 52 Figura 3.15. Destilación de lípidos suspendidos en hexano por medio de Rotavapor. .............................................................................................................................. 53 Figura 3.16. Lípidos extraídos después de la destilación con rotavapor. .............. 54 Figura 4.1. Duplicaciones acumuladas de Verrucodesmus verrucosus en los diferentes medios de cultivo durante el primer escalado. ...................................... 59 Figura 4.2. Cinéticas de crecimiento del primer escalado en las diferentes calidades de agua ................................................................................................................. 59

Figura 4.3. Duplicaciones acumuladas de Verrucodesmus verrucosus en los diferentes medios de cultivo durante el segundo escalado. .................................. 63 Figura 4.4. Cinéticas de crecimiento del segundo escalado en las diferentes calidades de agua ................................................................................................. 64 Figura 4.5. Duplicaciones acumuladas de Verrucodesmus verrucosus en los diferentes medios de cultivo durante el tercer escalado. ....................................... 66 Figura 4.6. Cinéticas de crecimiento del tercer escalado en las diferentes calidades de agua ................................................................................................................. 67 Figura 4.7. Remoción de amonio 𝑁𝐻4+ de los medio de cultivo durante el tercer escalado. Superíndice común difieren significativamente a P <0.05. Se realizó un análisis de varianza (ANOVA). .............................................................................. 75 Figura 4.8. Remoción de fosfatos (𝑃𝑂43− ) de los medio de cultivo durante el tercer escalado. Superíndice común difieren significativamente a P <0.05. Se realizó un análisis de varianza (ANOVA). .............................................................................. 76 Figura 4.9. Comportamiento del pH durante el primer escalamiento de 250 ml durante 10 días. Superíndice común difieren significativamente a P <0.05. Se realizó un análisis de varianza (ANOVA). .............................................................................. 79 Figura 4.10. Comportamiento del pH durante el segundo escalamiento de 1 L durante 10 días. Superíndice común difieren significativamente a P <0.05. Se realizó un análisis de varianza (ANOVA). .............................................................................. 80 Figura 4.11. Comportamiento del pH durante el tercer escalamiento de 18 L durante 44 días. Superíndice común difieren significativamente a P <0.05. Se realizó un análisis de varianza (ANOVA). .............................................................................. 81 Figura 4.12. Gráfica comparativa de la concentración inicial de amonio (𝑁𝐻4+ ) y la concentración final de lípidos. ............................................................................... 84

Resumen Actualmente, entre los principales problemas que enfrenta la humanidad, destacan el deterioro ambiental y la crisis energética, por lo que es primordial la sustitución de los combustibles denominados fósiles o tradicionales, derivados del petróleo, por otros, de origen biológico; por lo que se piensa que una alternativa factible para reemplazar los derivados del petróleo es la producción de biocombustibles. Los biocombustibles son principalmente alcoholes, éteres, ésteres y otros productos químicos que provienen de compuestos orgánicos de base celulósica (biomasa), pueden ser sólidos, gaseosos o líquidos y se necesita que tengan características equivalentes a los de procedencia fósil. El uso de microalgas para la producción de biodiesel, son una buena alternativa para obtener biocombustibles ya que son especies con elevada eficiencia fotosintética, tienen alta capacidad de crecer, tanto en aguas marinas, dulces, residuales y salobres, además, su velocidad de crecimiento es relativamente alta.

Este trabajo incluye los procesos de cultivo, cosecha y secado de la microalga Verrucodesmus verrucosus usando agua residual cruda y tratada como medio de cultivo, así como la extracción de lípidos con potencial para generar biodiesel. En el presente trabajo de investigación caracterizó el agua residual y se evaluó la eficiencia de remoción de nitrógeno (N) y fósforo (P), se cuantificó la producción de biomasa y lípidos, además se cuantificó y evaluó la producción de biomasa microalgal.

La Productividad de Biomasa para la especie cultivada en agua con fertilizante fue de 600 mg/L*día y 4 % de contenido de lípido y para la cultivada en agua residual cruda estéril fue de 383.3 mg/L*día y 2.5% respectivamente.

El agua residual cruda y tratada fue obtenida de la planta de tratamiento de aguas residuales (PTAR) Tuchtlán en Tuxtla Gutiérrez, Chiapas, la cual funciona por medio de un tratamiento típico de lodos activados, de cada una de las muestras se obtuvo los siguientes resultados: Amonio 57.49 mg/L y 0.10 mg/L Fosfatos 5.10 mg/L y 1.21

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mg/L, SST(g/L): 0.184, 0. 046, SSV (g/L): 0.13 y 0.034, SDT (g/L): 0.799, 0.745, SVT (g/L): 0.276, 0.128, ST(g/L) 0.938, 0.791, Coliformes Fecales (NMP/ml) 1,100 y 4.

Los Medios de cultivo usados para el crecimiento de Verrucodesmus verrucosus, fueron con agua residual cruda, agua residual tratada en un sistema de lodos activados convencional y con agua destilada enriquecida con nutrientes (fertilizante bayfoland forte) a una concentración 1:1000. El inóculo inicial se mantuvo en matraces de 250 ml con 100 ml de medio de cultivo, la cepa se dejó crecer hasta notar un color verde uniforme, siendo esta la fase exponencial. Se realizó un conteo mediante cámara de Neubauer, con el fin de conocer la concentración del inóculo. Se llevaron a cabo escalados a 250 ml, 1L y 10 L. En el escalado de 18 L con agua residual cruda estéril la concentración celular inicial (cel/ml) fue de 118,333.33 y la final de 1,283,333 y con agua destilada con fertilizante la concentración celular inicial (cel/ml) fue de 133,333.33 y la final de 1,575,000. Obteniendo remociones de amonio de 80.35% para AF y de 78.91% para ARC-E, de fosfatos de 83.44% para ARC-E y de 32.71 para AF y de nitratos de 98.82% ARC-E y un 83.86% para AF, con un rendimiento promedio de lípidos no polares de 23.70 mg/L para AF y de 9.31 para ARC-E.

La especie algal Verrucodesmus verrucosus fue capaz de crecer en el agua residual consumiendo 𝑁𝐻4+ , 𝑁𝑂3− , 𝑃𝑂43− y se logró determinar que genera lípidos útiles para la producción de biodiesel.

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Glosario •

Biocombustibles son principalmente alcoholes, éteres, ésteres y otros productos químicos que provienen de compuestos orgánicos de base celulósica (biomasa).

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Bioetanol: Etanol generado a partir de la biomasa o de una fracción biodegradable de residuos.

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Biodiesel: éster metílico generado a partir de un aceite vegetal, algas o animal de calidad similar al gasóleo.

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Biogás: combustible gaseoso generado a partir de la biomasa de vegetales y/o a partir de la fracción biodegradable de los residuos.

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Biometanol: metanol generado a partir de la biomasa de vegetales.

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Biodimetiléter: dimetiléter generado a partir de la biomasa de vegetales.

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BioMTBE (metil ter-butil éter): combustible generado a partir del biometanol.

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Biocarburantes sintéticos: hidrocarburos sintéticos o sus mezclas, generados a partir de la biomasa vegetal.

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Aceite vegetal puro: obtenido a partir de plantas oleaginosas mediante presión, extracción u otros procedimientos comparables, crudos o refinados, pero sin modificación química.

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Microalgas: son organismos unicelulares eucariotas fotosintéticos capaces de transformar la energía luminosa en energía química con una eficiencia cuatro veces superior a la de las plantas. 3

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Lípidos: son un grupo de compuestos químicamente diversos, solubles en solventes orgánicos (como cloroformo, metanol o benceno) e insolubles en agua. La mayoría de los organismos, los utilizan como reservorios de moléculas fácilmente utilizables para producir energía (aceites y grasas).

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Fotobiorreactores: equipos que permiten cultivos libres de contaminación y con la capacidad de proveer las condiciones básicas ideales para microorganismos fotótrofos como microalgas.

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Capítulo 1 Introducción 1.1 Planteamiento del Problema A partir de la crisis de 1973, los combustibles fósiles, mismos que se han usado como principal fuente para la producción de energía, han incrementado sus precios y reducido sus reservas, además, de provocar efectos ambientales adversos. Entre estos efectos se encuentran, principalmente, un incremento en la producción de gases de efecto invernadero (GEI) [1], mismos que derivan en otras problemáticas como son el calentamiento global y el cambio climático, los cuales ya están teniendo impactos negativos sobre la biosfera [2]. En México, la combustión de este tipo de energéticos es responsable de poco más del 61% de las emisiones de CO2 y del 46% de los GEI. Por otro lado, las reservas de petróleo estimadas para el 2009, incluyendo el petróleo que podrían obtenerse de depósitos ya descubiertos, aquél que puede ser obtenido con la tecnología y condiciones económicas actuales, así como del que no pueden ser recuperado con la tecnología común, es de alrededor de 1,376 billones de barriles, lo cual corresponde a reservas que durarán cerca de 35 años [3].

Esta problemática ha ocasionado la búsqueda de fuentes alternas de energía que sean de preferencia renovables, limpias y económicas, tales es el caso de los biocombustibles [3]. La primera generación de biocombustibles, como el etanol de almidón y melaza o algún cultivo de aceite, se usaron en un principio para combatir ésta problemática, sin embargo, han provocado algunos debates con respecto a la verdadera sustentabilidad de sus procesos, ya que, dependen de la producción de monocultivos, el cambio de uso de suelo y no eliminan por completo el uso de combustibles fósiles [4]. Por lo anterior es de suma importancia disponer de alternativas bioenergéticas que supusieran menores impactos negativos al ambiente y a la sociedad. [5].

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1.2 Justificación Los biocombustibles contienen energía que se deriva directa o indirectamente de la fijación de carbono (geológicamente reciente) en organismos vivos, condición que los hace casi carbono neutros. Además, estos tienen impactos ambientales y perfiles de emisión bajos en comparación con los combustibles fósiles [6].

Debido a las problemáticas suscitadas con los primeros tipos de biocombustibles, surgieron los de segunda y tercera generación. Los biocombustibles de segunda generación son bioproductos que vienen de materia prima no alimentaria es decir, biomasa lignocelulósica e incluyen residuos producidos por sistemas agrícolas y de procesamiento de alimentos [7]. Las microalgas, se consideran biocombustibles de tercera generación, debido a su rápida tasa de crecimiento, su habilidad para fijar gases de efecto invernadero, su alta producción de lípidos y que su producción depende de un cultivo en medio acuático [7] [8] [9]. La tecnología de microalgas es una alternativa prometedora, ya que para satisfacer el 100% de la demanda actual de diésel de petróleo en México, sería necesario emplear sólo 1% de la extensión total del país, considerando el rendimiento lipídico y la independencia a la calidad de los suelos [10].

Muchos estudios se han enfocado en la identificación de condiciones que inducen a la acumulación de lípidos neutrales en las células de las microalgas, tal es el caso del estrés por nutrientes, como la limitación de nitrógeno y fósforo. Sin embargo, una limitante de este enfoque es que a pesar de inducir a un alto rendimiento de lípidos, la productividad de la biomasa puede ser bastante baja, por lo que la productividad de lípidos generalmente no es alta. Las condiciones de cultivo de alta biomasa, en aguas residuales, podrían ser más benéficas y más eficientes puesto que se ha demostrado su capacidad para producir altas concentraciones de lípidos mediante el uso de sus nutrientes [11].

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Por otro lado, para el año 2014, en México, se estimaba que el agua residual generada era de 228.7 m3/s (7.21 miles de hm3/año), de la cual, 211.0 m3/s (6.65 miles de hm3/año) fue recolectada a través de los sistemas de alcantarillado, y de esta, el 52.8%, es decir 111.3 m3/s (3,51 miles de hm3/año) fue tratada a través de las 2,337 plantas de tratamiento de aguas residuales en operación a lo largo del país, además, se espera que estas cifras vayan en aumento. Muchos de estas plantas no llegan a tener tratamientos terciarios, por lo que es posible que contengan aún contaminantes en concentraciones que podrían llegar a dañar el ambiente [12]. Los nutrientes en el agua residual, como el amonio, nitratos, fosfatos y materia orgánica pueden contribuir a la eutrofización de los cuerpos de agua, por lo que el agua residual no puede ser descargada directamente en los cuerpos de agua naturales antes de algún tratamiento especializado [13]. Las microalgas son usadas como tratamiento terciario, aunque, generalmente también crecen de manera adecuada en aguas residuales sin tratamiento alguno [3].

Así también, las Naciones Unidas reportaron un incremento aproximado del 55% de la demanda de agua para el año 2050, la cual incluye 800 km3 solo para el uso doméstico. El mismo reporte indica que en un futuro cercano, mayores esfuerzos podrían ser dirigidos en lograr tratamientos de agua residual doméstica adecuados y accesibles económicamente [13].

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1.3 Antecedentes Después de la Segunda Guerra Mundial, se iniciaron investigaciones en Estados Unidos, Alemania, Japón e Inglaterra sobre técnicas de cultivo y sistemas de ingeniería para el cultivo de microalgas a mayores escalas. Dado que la necesidad de combustible alternativo de transporte había disminuido, la investigación en ese momento se centró en el cultivo de algas como una fuente de alimento o, en algunos casos, para el tratamiento de aguas residuales. El interés en la aplicación de algas para biocombustibles se reavivó durante el embargo petrolero y las subidas de los precios del petróleo de 1970, lo que llevó a iniciar el Programa de Especies Acuáticas en 1978. Dicho programa gastó $ 25 millones en 18 años con el objetivo de desarrollar combustibles líquidos de transporte a partir de algas que serían competitivos con los precios de los combustibles derivados del petróleo. La investigación del programa se centró en el cultivo de microalgas en estanques abiertos, los cuales son sistemas de bajo costo pero vulnerables a perturbaciones ambientales como cambios de temperatura o invasiones biológicas. Entre los hallazgos más significativos del programa se encontraba que el crecimiento rápido y la alta producción de lípidos eran "mutuamente excluyentes", ya que los primeros requerían altos nutrientes y los últimos bajos. El informe final sugirió que la ingeniería genética puede ser necesaria para poder superar esta y otras limitaciones naturales de las cepas de algas, y que las especies ideales podrían variar con el lugar y la estación. Aunque se demostró con éxito que la producción a gran escala de algas para combustible en los estanques al aire libre era factible, el programa no lo hizo a un costo competitivo con el petróleo, especialmente a medida que los precios del petróleo se hundían en 1990. Otras contribuciones a la investigación de los biocombustibles de algas han venido indirectamente de proyectos centrados en diferentes aplicaciones de cultivos de algas. Trabajos centrados en la recolección de gas hidrógeno, metano o etanol a partir de algas, así como suplementos nutricionales y compuestos farmacéuticos, han ayudado a informar la investigación sobre la producción de biocombustibles a partir de algas [14].

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Por otro lado, la Unión Europea, con una producción de 8,812 millones de litros (ML) en 2008, es el líder mundial en la industria del biodiesel en la actualidad, y se estima que lo seguirá siendo durante la década próxima. Alemania, por su parte, encabeza la lista de países productores (3,203 ML), seguido por EUA (3,182 ML), Francia (2,063 ML) e Italia (676 ML); además, países en desarrollo tales como Malasia, China, Brasil, Colombia, Argentina e Indonesia, son prometedores en la industria del biodiesel. Además, se estima un mercado mundial de biodiesel de 168,206 ML para el 2016 [6] [10].

Los estudios realizados en relación con las microalgas para la producción de biodiesel, nos proporcionan un panorama mucho más amplio con respecto a sus propiedades y capacidades, así como los retos a superar para lograr producciones suficientes de esta clase de biocombustibles.

En Colombia, una investigación realizada en 2010, se orientó en crear, montar, validar y ajustar la tecnología necesaria para llevar a cabo el proceso de obtención de biodiesel a partir de microalgas en sistemas cerrados, el cual responde al establecimiento y diseño de un proceso productivo, que, a la vez se trata de una oportunidad sostenible en regiones alejadas con dificultades sociales, ambientales y energéticas [15].

En 2013, se realizó un estudio con la microalga Kirchneriella sp. aislada de aguas residuales, la cual fue probada por su habilidad para ser cultivada en masa, utilizar nutrientes de medios definidos y aguas residuales y producir bioproductos de interés comercial, dando resultados favorecedores, puesto que se logró generar productos como biomasa rica en carbohidratos, biodiesel y los pigmentos β,β- caroteno y luteína [16].

En Perú, un estudio realizado en 2014, indica que microalgas oleaginosas fueron aisladas de un río con el fin de evaluar su potencial para la producción sustentable

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de biodiesel, encontrando una especie en particular, Ankystrodesmus sp., con alto contenido de lípidos totales con más del 40% con predominancia de triglicéridos [5].

En una investigación realizada por Sacristán et al (2014) se evaluó el potencial de dos especies de microalgas, Chlorella vulgaris y Scenedesmus acutus, y de una cianobacteria, Arthrospira maxima, para remover nutrientes y acumular lípidos, útiles para producir biodiesel, al cultivarse en dos calidades de agua residual, cruda (ARC) y tratada (ART), comparadas con un medio enriquecido (AE) con fertilizante comercial. Los cultivos se realizaron obteniéndose buenas productividades de biomasa para S. acutus y C. vulgaris, los tres microorganismos, por otro lado, tuvieron una buena eficiencia de remoción de nutrientes y una acumulación de lípidos mayor en S. acutus, así como, una alta producción de biodiesel para los tres microorganismos [17].

Por otro lado, un consorcio de microalgas extraído de aguas residuales de una granja lechera en Malasia, fue evaluado para conocer su capacidad de producción de biodiesel, en donde se encontró que el 72.70% del lípido obtenido de las algas podría ser convertido en biodiesel [18].

En China, 2015, se realizó una revisión de las microalgas como recursos en el país y su potencial en la producción de biocombustible líquido y productos de alto valor en una refinería con un enfoque integrado, con el fin de tener una visión más clara de una producción económicamente factible con el uso de microalgas [6].

Un estudio en india, realizado en 2017 con el alga Euglena sanguinea, una de las especies más robustas en el agua dulce con altas productividades de lípidos, fue explorada tanto a escala laboratorio, así como en masa mediante canales. La transesterificación se llevó a cabo usando mejillón blanco, el cual es tanto recuperable como ecológico. Los resultados demuestran que el biodiesel generado tiene un nivel apropiado para proveer una mejor estabilidad a la oxidación y propiedades de combustión para su uso en aplicaciones automotrices [19].

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Finalmente, en el año 2017, un estudio realizado con agua de mar y agua residual tratada, las cuales se utilizaron y se combinaron para ser usadas como medio de crecimiento para Nannochloropsis oculata y Tetraselmis suecica bajo las mismas condiciones de cultivo. Fueron investigados los efectos de estos tipos de agua sobre la proliferación celular y la cinética de crecimiento. Se encontró que diferentes concentraciones de agua residual muestran diferentes resultados de crecimiento de las especies, por lo que, tanto N. oculata como T. suecica pueden tolerar y utilizar las aguas residuales, esto es debido al efecto de mayores concentraciones de las fuentes fundamentales en la etapa de crecimiento y cambio de la composición iónica del medio de cultivo. Además se evaluó el rendimiento de producción de bioetanol de estas dos cepas. Los resultados mostraron que T. suecica es muy adecuado para la producción de etanol utilizando aguas residuales municipales como medio de cultivo [20].

Los estudios con microalgas son bastante extensos, sin embargo, aún hacen falta mayores esfuerzos para lograr que este tipo de sistemas sean viables a mayores escalas, por lo que es de suma importancia continuar con las investigaciones en este tema para así lograr mayores eficiencias en su producción y procesamiento.

11

1.4 Objetivos Objetivo general. Evaluar la producción de lípidos de la microalga Verrucodesmus verrucosus usando agua residual cruda y tratada como medio de cultivo, con el fin de conocer su potencial para generar biodiesel.

Objetivos específicos 1.- Caracterizar parámetros fisicoquímicos del agua residual.

2.- Cultivar la especie de microalga en el agua residual.

3.- Evaluar la eficiencia de remoción de N y P y la cinética de crecimiento de la especie de microalga.

4.- Cuantificar la producción de biomasa y lípidos.

1.5 Hipótesis La especie algal Verrucodesmus verrucosus será capaz de crecer en el agua residual 3− consumiendo NH4+ , NO− 3 y PO4 y de esta manera generar altas concentraciones de

biomasa y lípidos con potencial para producir biodiesel, que en conjunto representen una cantidad viable para su producción en comparación con otros métodos de cultivo.

12

Capítulo 2 Marco Teórico 2.1 Producción de biodiesel a partir de microalgas 2.1.1 Biodiesel El biodiesel es un biocombustible que está constituido por ésteres de metilo de ácidos grasos de cadena larga derivado de diversos tipos de aceite de origen animal, vegetal e incluso de microalgas, el cual debe cumplir con ciertas especificaciones técnicas para ser usado en motores [5]. Los lípidos que se usan para su producción son los triacilglicéridos, en los que tres moléculas de ácidos grasos son esterificadas con una molécula de glicerol [21]. Comúnmente, la materia prima usada para los biocombustibles son cultivos convencionales, como la soya, la palma, el trigo, la cebada y el maíz, los cuales, en algunos casos, son utilizados para alimentación humana y requieren de tierras agrícolas para su producción [22] [23].

Para la producción de biodiesel existen diversas metodologías, de las cuales cuatro han sido las más estudiadas: el uso directo de aceites o mezclas de estos con diesel fósil, microemulsiones, pirólisis y transesterificación [10]. Esta última es la más recomendada en la producción de biodiesel [3]. Se trata de una reacción de los triacilglicéridos con metanol, para la cual estos son convertidos a diglicéridos, luego a monoglicéridos y finalmente a glicerol [23]. Para poder realizarse se requieren de 3 moles de alcohol por cada mol de triacilglicérido, para producir 1 mol de glicerol y 3 moles de metil ésteres (ver fig. 2.1) [21]. La transtesterificación es el método más económico y ofrece ventajas como: elevada conversión (98%) con pocas reacciones secundarias, reducido tiempo de reacción y conversión directa a éster sin pasos intermedios [3].

13

Figura 2.1. Transesterificación de aceite para biodiesel (R1–3 son grupos de hidrocarburos) [21].

2.1.2 Biodiesel a partir de microalgas Las microalgas están consideradas dentro de la tercera generación de biocombustibles [22] [24], y pueden producir varios tipos de biocombustibles renovables, que incluye al metano por digestión anaeróbica, al biodiesel derivado del aceite microalgal y la producción fotobiológica de hidrógeno [21].

Las microalgas son microorganismos microscópicos eucariotas o procariotas fotosintéticos, que pueden ser desde unicelulares hasta multicelulares. Las microalgas eucariotas consisten en diatomeas y algas verdes, mientras que las microalgas procariotas incluyen cianobacterias (algas verde-azuladas). Las microalgas tienen una buena capacidad para utilizar agua, CO2 y luz solar para sintetizar biomasa a través de la fotosíntesis, transformando así la energía solar en energía química orgánica almacenada en las células de microalgas. Aparte del agua, el CO2 y la luz solar, el fósforo y el nitrógeno se presentan como dos insumos nutritivos principales para el crecimiento de microalgas. Así como, los macro elementos como N, P, Na, Mg, K y Ca y micro elementos como Mn, B, Mo, Zn, Co y Fe también son necesarios [25].

La producción de biomasa microalgal es generalmente más cara que la de los cultivos convencionales, debido a los requerimientos de luz, CO2, agua, sales inorgánicas y rangos de temperatura de entre 20°C y 30°C, así como a los requerimientos del medio de crecimiento, el cual, debe proveer los elementos inorgánicos que constituyen a las células algales, que incluye nitrógeno (N), fósforo (P), hierro (Fe) y en algunos casos silicio (Si). Las necesidades nutricionales mínimas pueden ser estimadas usando la fórmula molecular aproximada CO0.48H1.83N0.11P0.01 [21] [22]. 14

Las ventajas del uso de microalgas para la producción de biodiesel, sobre otros tipos de biomasa, son: su cultivo se puede realizar usando CO2, lo que ayuda a la mitigación de GEI [21] [24]; el ciclo de cosecha de las microalgas es bastante corto y su tasa de crecimiento es alta [22], de 1-3 duplicaciones por día, lo cual es al menos de 5 a 10 veces mayor que la tasa de crecimiento de las plantas [24]; las algas son capaces de usar nutrientes libremente disponibles en aguas residuales, como nitrógeno y fósforo [24] [26] [3] lo que disminuye los costos de su producción [26]; tienen un rendimiento de aceite mucho mayor que cualquier cultivo convencional [3] (ver figura 2.2); sintetizan y acumulan grandes cantidades de lípidos neutrales/ aceites (20-50% con base en peso seco) [27]; crecen adecuadamente en fotobiorreactores, superando la productividad de las plantas terrestres en aproximadamente diez veces; pueden ser cultivadas sobre tierras no productivas, como son los desiertos o las costas [3] [24] [21], y usando agua de mar, salobre o residual, con lo cual se disminuye la presión sobre el agua dulce requerida para la producción de alimento [3].

Representación de la Productividad de Aceite (L/Ha) Microalgas (2) Microalgas (1) Palma de Aceite Coco Jatrofa Canola Cacahuate Girasol Grasa Amarilla Mostaza Soya Algodón Maíz

136,900 58,700 5,950 2,689 1,892 1,190 1,059 952 907 572 446 325 172

0

20000

40000

60000

80000

100000

120000

140000

Figura 2.2. Productividad de aceite de las microalgas en comparación con los cultivos convencionales [3]. (1) 30% de aceite en biomasa (con base en peso seco); (2) 70% de aceite en biomasa (con base en peso seco)

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Por otro lado, los retos a los que se enfrenta este enfoque son: la selección de cepas con alto contenido lipídico, alta productividad, mejor perfil de lípidos y adaptabilidad al tipo de agua a usar y a las condiciones ambientales; el establecimiento de estrategias de cultivo adecuadas, que permitan lograr una alta productividad de lípidos y de biomasa; el uso de aguas residuales, evitando contaminaciones; la selección del tipo de reactor más adecuado, o una combinación de ellos, para lograr la máxima productividad de biomasa al mínimo costo y la disminución de los costos de cosecha, extracción de lípidos y conversión a biodiesel [28] [3].

2.1.3 Síntesis de lípidos Las microalgas sintetizan ácidos grasos para dar lugar a varios tipos de lípidos que varían dependiendo de la especie, estos son: lípidos polares, lípidos neutrales, ceras, esteroles, fosfolípidos, glicolípidos, carotenoides, terpenos, tocoferoles y quinonas. De estos, los lípidos neutrales (triacilglicéridos) son los más indicados para la producción de biodiesel [3].

La habilidad de las algas para sobrevivir y proliferar en un amplio rango de condiciones ambientales, es reflejada en gran medida, en la diversidad y en el patrón inusual de lípidos celulares, así como en su habilidad para modificar eficientemente el metabolismo lipídico, en respuesta a los cambios en dichas condiciones [27].

Los ácidos grasos que componen a las microalgas, incluyen generalmente, moléculas lineales de 12 a 22 átomos de carbono en número par, saturadas e insaturadas, donde la posición y el número de enlaces dobles (1 a 6) es variable, observándose por lo general una configuración cis. Los ácidos grasos más frecuentes son los de 16C a 18C, sin embargo, en algunas especies predominan moléculas de cadena media (10C, 12C, 14C) o demasiado larga (> 20C). Por lo general, en las microalgas dulceacuícolas prevalecen los ácidos grasos saturados y mono-insaturados, mientras que los compuestos poli-insaturados (PUFAs, Polyunsaturated Fatty Acids) constituyen, ocasionalmente, la mayor fracción de ácidos grasos en especies marinas. Esta

16

variación en el perfil de ácidos grasos entre grupos algales, puede también observarse bajo distintas condiciones de cultivo [10].

El metabolismo lipídico de las algas se realiza en el cloroplasto mediante la síntesis de novo de ácidos grasos, los cuales son luego usados como los precursores para la síntesis de cloroplastos y otras membranas celulares, así como para la síntesis de reservas de lípidos neutrales, en su mayoría TAGs, que pueden acumularse en condiciones ambientales adversas o subóptimas. El paso inicial en la síntesis de ácidos grasos, consiste en la carboxilación de acetil-CoA dependiente de ATP para su conversión en malonil-CoA. Esta reacción es catalizada por la enzima acetil-CoA carboxilasa y se considera el paso limitante del proceso, ya que compromete el flujo de acetil-CoA hacia la biosíntesis de lípidos, donde las unidades de este acetil probablemente derivan del piruvato proveniente de la glucólisis. La reacción anterior es seguida por ciclos de adición descarboxilativa de malonil-CoA a unidades acilo y βreducción, catalizados por el sistema ácido graso sintetasa, hasta producir moléculas de 16C y 18C saturadas. Las moléculas poliinsaturadas, producidas mediante mecanismos de desaturación aerobia y elongación, son precedidas por los ácidos palmítico (16:0) y oleico (18:1ω9). Por su parte, se sugiere que la biosíntesis de triglicéridos sucede en el citosol y en el retículo endoplásmico esencialmente a través de la catálisis por acil-transferasas del traslado secuencial de ácidos grasos a las posiciones 1, 2 y 3 del glicerol-3-fosfato, donde antes de la última transferencia, se requiere de la defosforilación del ácido fosfatídico previamente formado [27] [10].

2.1.4 Factores que afectan la acumulación de triacilglicerol y la composición de ácidos grasos Aunque la aparición y la medida en que se produce TAG parecen ser especıficas de especies / cepas, y son controladas en última instancia por la composición genética de organismos individuales, las algas oleaginosas producen solo pequeñas cantidades de TAG bajo un crecimiento óptimo o condiciones ambientales favorables. La síntesis y la acumulación de grandes cantidades de TAG se acompañan de importantes alteraciones en la composición de lípidos y ácidos grasos en la célula cuando las algas 17

oleaginosas se colocan bajo condiciones de estrés impuestas por estímulos ambientales químicos o físicos, ya sea actuando individualmente o en combinación. Los principales estímulos químicos son la inanición de nutrientes, la salinidad y el pH del medio de crecimiento. El mayor estímulo físico es la temperatura ambiente y la intensidad luminosa. Además de los factores químicos y físicos, la fase de crecimiento y / o el crecimiento de la cultura afecta el contenido de TAG y la composición de ácidos grasos [27].

2.1.4.1 Nutrientes La aclimatación de las microalgas a la restricción de nutrientes se caracteriza por la manifestación de respuestas específicas para el elemento limitado (inducción de sistemas de transporte de alta afinidad y de la síntesis de enzimas hidrolíticas para la liberación intra o extracelular del nutriente), además de respuestas generales tales como cambios morfológicos, cese de la división celular, alteraciones en la permeabilidad de las membranas, acumulación de lípidos y/o polisacáridos, reducción de la actividad fotosintética y modificación de procesos metabólicos [10]. La producción de biocombustibles a escala industrial a través del cultivo de microalgas, requiere grandes cantidades de nutrientes, típicamente de nitrógeno (generalmente en forma de nitrato) y fosforo (en forma de ortofosfatos) [29]. De todos los nutrientes evaluados, la limitación de nitrógeno es el nutriente más importante que afecta el metabolismo de los lípidos en las algas. Se ha observado una tendencia general hacia la acumulación de lípidos, en particular TAG, en respuesta a la deficiencia de nitrógeno en numerosas especies o cepas de diversos taxones de algas [27]. Respuestas similares son inducidas por la deficiencia de fósforo, azufre y silicio, siendo el efecto de este último específico para las diatomeas. Asimismo, la disponibilidad de Hierro (+3) influye en el contenido oleaginoso, aunque el mecanismo se desconoce. Sin embargo, el comportamiento

de

las

microalgas

ante

la

restricción

de

nutrientes

es

considerablemente variable y por tanto, no es posible establecer una tendencia generalizada entre las especies microalgales. La acumulación de lípidos en especies oleaginosas, a pesar de la atenuación de la división celular, es consecuencia de la asimilación continua de carbono y su orientación hacia la síntesis activa de ácidos 18

grasos. Los lípidos bajo tales circunstancias, fungen como una reserva de carbono y energía, además de proteger al organismo contra el estrés fotooxidativo [10].

2.1.4.2 Temperatura El efecto de la temperatura sobre la composición bioquímica se realiza principalmente a través de dos mecanismos distintos: (1) por la velocidad de las reacciones químicas y bioquímicas y (2) por la división del carbono fijado fotosintéticamente en varios tipos de macromoléculas (por ejemplo, proteínas, carbohidratos y lípidos). Un tema bien estudiado es el efecto de la temperatura sobre la composición y contenido de lípidos de la membrana. Una disminución de la temperatura de crecimiento por debajo de un nivel óptimo generalmente disminuye los lípidos totales, pero aumenta el grado de insaturación de los lípidos en los sistemas de membrana. La mejora en la estabilidad y la fluidez de las membranas celulares, en particular las membranas tilacoides (a través de niveles aumentados de ácidos grasos insaturados en los lípidos de membrana) protegen a la maquinaria fotosintética de la fotoinhibición o fotooxidación a bajas temperaturas. En contraste, el contenido de PUFAs disminuye con el aumento de la temperatura. El mayor contenido lipídico puede ocurrir a la temperatura óptima, por encima de la cual el contenido de lípidos podría disminuir. [30]. La temperatura óptima para los cultivos de microalgas se encuentra entre los 20 y los 24 °C, sin embargo, algunas cepas de microalgas pueden adaptarse a un amplio rango de temperatura, entre los 25 y 50 °C [14].

2.1.4.3 Luz Efecto de la luz sobre la composición bioquímica de las algas fotosintéticas es en gran medida controlado por el proceso de fotoaclimación. En este proceso, las células de algas experimentan cambios dinámicos en la composición de la célula, junto con alteraciones en las propiedades estructurales, biofísicas y fisiológicas para la fotosíntesis y el crecimiento de las algas [30]. Debido a que las microalgas crecen fotosintéticamente, la luz es uno de los factores limitantes más importantes. Los sistemas algales pueden ser iluminados mediante luz artificial, luz solar o ambos [14]. 19

Las altas intensidades luminosas disminuyen el contenido de lípidos polares, con un aumento en la cantidad de lípidos neutrales almacenados, en su mayoría triglicéridos, mientras que intensidades bajas, a su vez, promueven la síntesis de lípidos polares altamente insaturados, estructural y funcionalmente asociados con las membranas [10] [27].

2.1.4.4 Fases de crecimiento y estatus fisiológico El contenido de lípidos y la composición de ácidos grasos también están sujetos a variabilidad durante el ciclo de crecimiento. En muchas especies de algas examinadas, a menudo se observa un aumento en los triglicéridos durante la fase estacionaria. El envejecimiento del cultivo también afecta el contenido de lípidos y ácidos grasos y su composición. El contenido total de lípidos de las células aumenta con la edad en algunas algas, habiendo algunas excepciones a esto, donde la edad del cultivo no tiene casi ninguna influencia en el contenido total de ácidos grasos. La mayoría de los estudios sobre el metabolismo de lípidos de algas se han llevado a cabo en un modo de cultivo por lotes. Por lo tanto, la edad de un cultivo dado puede estar o no asociada con el agotamiento de los nutrientes, lo que dificulta la separación de los efectos del envejecimiento verdadero de los efectos inducidos por la deficiencia de nutrientes en el metabolismo de los lípidos [27].

2.1.4.5 Otros El pH y la salinidad son otros factores que modifican la síntesis de lípidos de diversas microalgas, sin embargo el tipo y cantidad de lípidos producidos también dependen de la especie y de la magnitud del cambio de éstas variables [10]. El rango de pH para el cultivo de la mayoría de las especies se encuentra entre los 7 y 9, con un rango óptimo de entre 8.2 a 8.7 [14].

El tipo de carbono usado para la fotosíntesis es CO 2, dado que las algas viven con altas concentraciones de CO2, los gases de efecto invernadero (GHG), el dióxido de 20

nitrógeno (NO2) y los contaminantes en la atmósfera de diversas fuentes serán nutrientes para las algas. [13]

2.2 Producción de microalgas 2.2.1 Selección de la especie De acuerdo a la especie de microalga, se pueden producir diferentes tipos de lípidos, hidrocarburos y aceites complejos. No todos los aceites de las algas son adecuados para hacer biodiesel, sin embargo, casi siempre se producen los indicados para este fin [21].

La microalga debe tener ciertas características, con el fin de que estas generen los lípidos adecuados, entre las principales se encuentran: rápido crecimiento; gran contenido de productos de alto valor agregado; capacidad para desarrollarse en ambientes extremos; células grandes en colonias o filamentos; tolerancia a condiciones ambientales diversas, a niveles altos de CO2 (15% o más), a contaminantes, al efecto físico de la agitación o turbulencia y, finalmente, las excretas de la microalga deben estar libres de autohinibidores [10].

De las cepas de algas oleaginosas, las algas verdes representan el mayor grupo taxonómico que ha sido identificado. Esto puede ser debido a que están presentes en diversos hábitats naturales, por lo que pueden aislarse fácilmente, además de que generalmente crecen más rápido en condiciones de laboratorio que las especies de otros grupos taxonómicos. Las algas verdes oleaginosas, reportadas en la literatura, muestran un contenido promedio de lípidos totales de 25.5% (con base en peso seco). Dicho contenido aumenta considerablemente (al doble o triple) cuando las células se someten a condiciones de cultivo desfavorables, tales como el estrés foto-oxidativo o la inanición de nutrientes. En promedio, hay un aumento en los lípidos totales a un 45,7% (con base en peso seco) a partir de algas verdes oleaginosas cultivadas bajo condiciones de estrés. Por otro lado, las algas verdes en el nivel del género no presentan diferentes capacidades para sintetizar y acumular lípidos. La capacidad 21

intrínseca de producir grandes cantidades de lípidos y aceites es específica de la especie o cepa [27].

2.2.2 Cultivo El contenido de lípidos en las microalgas puede exceder el 80% del peso seco de la biomasa, aunque los niveles del 20% al 50% son bastante comunes. La productividad de lípidos, que es la masa del aceite producido por unidad de volumen del caldo de microalgas por día, depende de la tasa de crecimiento algal y el contenido de la biomasa [21]. El contenido de lípidos aumenta considerablemente (al doble o triple) cuando las células son sometidas a condiciones de cultivo desfavorables, tales como estrés foto-oxidativo o deficiencia de nutrientes [27].

Se pueden encontrar tres tipos principales de condiciones de crecimiento: el cultivo fotoautótrofo, heterotrófico y mixotrófico. El cultivo fotoautótrofo es el método de cultivo más utilizado, al igual que otras plantas fotosintéticas, las algas fotoautótrofas utilizan el CO2 y la luz solar como fuente de carbono y energía, respectivamente. En cambio, las microalgas heterotróficas utilizan materiales de carbono orgánico como fuente de carbono y energía, en lugar de CO2 y luz solar, para acumular biomasa. En cuanto al cultivo heterotrófico, los productos inducidos por la luz, incluyendo arotenoides, clorofilas y otros pigmentos como las ficobilinas, se reducen significativamente. A través del cambio de las condiciones de cultivo y la aplicación de la ingeniería genética, se ha encontrado que cientos de algas autotróficas tienen la capacidad de convertirse en algas heterotróficas. Las microalgas mixotróficas pueden ser autotróficas y heterotróficas. En el cultivo mixotrófico, los nutrientes orgánicos y sustratos disponibles junto con la intensidad de la luz influyen en el estado trófico [25].

Existen dos sistemas de cultivo para la producción de biodiesel por medio de microalgas: los cultivos abiertos, donde la biomasa está expuesta a las condiciones medioambientales; y los cultivos cerrados, denominados fotobiorreactores (PBR), con poco o ningún contacto con el medio externo [31].

22

De estos, algunos de los, sistemas de cultivo que han sido ampliamente utilizados, son: los cultivos en suspensión, incluyendo estanques abiertos y reactores cerrados y cultivos inmovilizados, incluyendo sistemas matrix-inmovilizados y biopelículas. Los sistemas de cultivo abierto a gran escala más comunes en la práctica, son los estanques de carrusel o canales (raceway ponds), estos son estanques abiertos y poco profundos, con ruedas de paletas para proporcionar la circulación de las algas y nutrientes, son también relativamente baratos de construir y operar, pero a menudo sufren baja productividad. Los fotobiorreactores tubulares son el único tipo de sistemas cerrados utilizados en la producción a gran escala de algas [8].

Los fotobiorreactores pueden ser subclasificados como: fotorreactor vertical, fotorreactor plano u horizontal, y fotorreactor helicoidal. El fotorreactor helicoidal es considerado el más fácil de ampliar la producción. En comparación con los estanques abiertos, los fotobiorreactores tubulares pueden proporcionar un mejor control del pH y de la temperatura, mayor protección contra la contaminación del cultivo, mezclas más homogéneas, menos pérdida por evaporación y mayores densidades celulares. Uno de los desafíos significativos del uso de estanques de carrusel y fotobiorreactores tubulares, es la recuperación de biomasa. Este desafío ha sido mitigado en cierta medida por los cultivos inmovilizados o los procesos ligados a las algas. Las biopelículas de algas podrían desempeñar un papel importante en la superación de los principales desafíos a la producción y recolección de microalgas. Si se proporciona suficiente área superficial, el crecimiento de la biopelícula de las algas puede ser más que crecimiento suspendido [8].

2.2.3 Cosecha de biomasa celular La cosecha de la biomasa celular contribuye del 20 al 30% del costo total de producción [24]. Para esto, los métodos comúnmente utilizados son la sedimentación, floculación, filtración y centrifugación [28]. La aplicación de estos métodos depende de las características de la especie, la densidad celular y las condiciones de cultivo, ya que algunas de estas propiedades facilitan su recolección [10]. 23

La floculación es usada muchas veces como un primer paso en los procesos de cosecha, con el fin de agregar las células, y de esa forma incrementar su tamaño de partícula y así, facilitar la subsecuente centrifugación, filtración o sedimentación. Las células algales están cargadas negativamente, lo cual previene su agregación en suspensiones celulares, sin embargo la adición de sales minerales, pueden reducir o eliminar esta carga.

La biomasa puede ser cosechada después de la floculación u omitiendo este paso, mediante centrifugación o sedimentación. La sedimentación, es la técnica más usada en los tratamientos de agua residual, debido a los grandes volúmenes tratados y al bajo valor de la biomasa generada. Sin embargo, debido al pequeño tamaño de las microalgas y su baja gravedad específica, que provoca una baja tasa de asentamiento para la cosecha rutinaria de algas, el método mayormente usado para la recolección de células algales, es la centrifugación, puesto que es rápido, sirve para una amplia gama de diferentes microalgas y tiene una alta eficiencia de células cosechadas (>95%). Sin embargo, la centrifugación supone un proceso intensivo de energía [26].

Otro método usado es la filtración, para la cual se usa presión de vacío junto con el uso de filtros, los cuales son adecuados para recolectar algas grandes (>70m) pero no para pequeñas microalgas, para las cuales se puede usar membranas de microfiltración o ultrafiltración, sin embargo, la necesidad de reemplazo constante de estas membranas y el costo de bombeo lo vuelve un proceso caro. En general, la centrifugación sigue siendo el método más confiable y preferido y es solo ligeramente más caro que los métodos alternativos. [26]

2.2.4 Extracción de lípidos A diferencia de los cultivos terrestres, la extracción de lípidos de una microalga es relativamente difícil de realizarse, debido a la presencia de una pared celular gruesa

24

que impide parcialmente la liberación del lípido de su interior, por lo que los procesos mecánicos no son usados para extraer los lípidos de las microalgas [29].

Los solventes químicos son el método más comúnmente usado para la extracción. Esto se debe a su alta selectividad y solubilidad con los lípidos, de esta forma, los lípidos dentro de la microalga pueden ser extraídos a través de su pared celular mediante difusión [29]. Los métodos de extracción con disolventes se realizan de la manera siguiente: los disolventes orgánicos polares, como el etanol, pueden romper el enlace de hidrógeno entre los lípidos polares; y los disolventes orgánicos no polares son capaces de romper las interacciones hidrofóbicas entre los lípidos no polares/neutrales. Es posible usar varios disolventes orgánicos para la extracción de lípidos, por ejemplo, hexano, etanol, cloroformo o sus mezclas, con lo que puede extraerse hasta un 98% de lípidos de la biomasa seca [25]. Sin embargo, algunas de las desventajas de estas técnicas, son los costos y la energía adicionales necesarios para la recuperación del solvente, así como, la contaminación de la biomasa libre de lípidos, restringiendo las posibilidades para el posterior aprovechamiento de este coproducto, además de la alta toxicidad hacia el ser humano y el ambiente circundante [10].

En años recientes, las investigaciones en el campo de extracción y reacción, han ingresado en una nueva era dinámica con la introducción de la tecnología de fluido supercrítico. El principio básico de esta tecnología es lograr una cierta fase que está más allá del punto crítico de un fluido, en el que desaparece el menisco que separa la fase líquida y vapor, dejando así solo una fase homogénea. En la fase supercrítica, las propiedades termofísicas como son, la densidad, viscosidad, difusividad y constante dieléctrica de un fluido cambiará drásticamente dependiendo de la temperatura y la presión. Consecuentemente, los cambios en las propiedades termofísicas transforman al fluido en un súper solvente y así, mejora la extracción y eficiencia de reacción. Varios fluidos supercríticos que están siendo explorados en la actualidad son el etileno, etano, metanol, etanol, CO2, benceno, tolueno y agua [29]. La ventaja de este método radica en la falta de contaminación de los compuestos algales, por lo que la biomasa residual 25

puede ser utilizada directamente como alimento para animales, fertilizantes o como sustratos para la digestión anaerobia. Sin embargo, la inversión de capital es alta, además de la alta presión requerida durante el proceso, limitando la aplicación práctica [25].

2.3 Producción de biodiesel por microalgas en aguas residuales El tratamiento de aguas residuales acoplado con la producción de biocombustibles a través del cultivo de microalgas es una alternativa que está recibiendo atención considerable. Este tipo de aguas, tienen altas concentraciones de nutrientes, en particular de N y P, lo que requiere de tratamientos químicos costosos para su remoción [32]. Las microalgas, por su parte, tienen la habilidad para crecer en ambientes ricos en nutrientes y consumirlos de manera eficiente, así como de acumular metales del agua, características que las hacen un medio atractivo para un tratamiento sustentable y de bajo costo de aguas residuales.

El crecimiento de microalgas bajo condiciones de cultivo de alta biomasa, tiene un gran potencial en la generación de biocombustibles, puesto que se ha demostrado su capacidad para producir altas concentraciones de lípidos mediante el uso de los nutrientes en aguas residuales. Las microalgas reproducidas en este tipo de medio, tiene una acumulación de lípidos que va desde el rango bajo (<10% DW) a moderado (25-30% DW), aunque, en algunos estudios se ha observado una relativa alta productividad [26]. En la tabla 2.1 se pueden observar la cantidad de biomasa y lípidos obtenidos por las microalgas probadas en diversos tipos de agua residual.

Este enfoque, tiene beneficios comunitarios y comerciales, ya que, en el tratamiento de aguas residuales se consigue una alta degradación de los contaminantes, la tierra fértil es menos impactada en comparación con otros cultivos oleaginosos, los nutrientes están libremente disponibles en el agua y pueden ser reciclados, la biomasa o proteínas refinadas pueden ser usados como cualquier generador de energía agrícola y otros productos de valor, pueden ser también refinados. A pesar de estos 26

aspectos favorables siguen existiendo limitaciones económicas, biológicas y logísticas significativas, las cuales se deben superar si se espera realizar el proceso completo [16].

27

Tabla 2.1. Biomasa y productividades de lípidos de microalgas crecidas en varios tipos de agua residual [26]. Tipo de Agua Residual

Especie de Microalga

Productividad de Biomasa (DW) (mg/L*día)

Municipal (tratamiento primario)

nd

25

nd

Nd

Municipal (concentrado)

Chlamydomonas reinhardtii

2000

25.25

505

Scenedesmus obliquus

26

31.4

8

Botryococcus braunii

345.6

17.85

62

Mezcla de Chlorella sp., Micractinium sp., Actinastrum sp.

270.7

9

24.4

B. braunii

700

nd

69

Chlorella sp.

2.6 g m-2 día-1

9

230 mg m-2 día-1

Scenedesmus sp.

6

0.9

0.54

Mezcla de Microspora willeana, Ulothrix zonata, Ulothrix aequalis, Rhizoclonium hieroglyphicum, Oedogonium sp.

5.5 g m-2 día-1

nd

Nd

R. hieroglyphicum

10.7g m-2 día-1

0.7

72 mg m-2 día-1

R. hieroglyphicum

17.9 g m-2 día-1

1.2

Chlorella sp.

81.4g

13.6i

11i

Mezcla de Chlorella sp., Micractinium sp., Actinastrum sp.

59

29

17

B.braunii

34

13.2

4.5

Chlorella saccharophila

23

18.1

4.2

Dunaliella tertiolecta

28

15.2

4.3

Pleurochrysis carterae

33

12

4

Scenedesmus sp.

126.54

12.8

16.2

Municipal (tratamiento secundario) Municipal (tratamiento secundario) Municipal (tratamiento primario+CO2) Agrícola (estiércol de puerco alto en NO3-N) Agrícola (residuos lácteos con soporte de espuma de poliestireno) Agrícola (orina fermentada de cerdo)

Agrícola (residuos lácteos de digestión anaerobia)

Agrícola (Efluente de cerdo máxima tasa de residuos cargados) Agrícola (Efluente lácteo +CO2) Agrícola (Residuos de leche digestada 20x dilución ) Agrícola (Agua residual láctea, dilución 25%) Industrial (fábrica de alfombras sin tratamiento) Industrial (fábrica de alfombras sin tratamiento) Industrial (fábrica de alfombras sin tratamiento) Industrial (fábrica de alfombras sin tratamiento) Agua residual artificial DW= peso seco

Contenido de Lípido (%DW)

Productividad de Lípido (mg/L*día )

210 mg m-2 día1

28

2.3.1 Eficiencia del crecimiento de microalgas en aguas residuales La eficiencia del crecimiento algal depende de ciertas variables críticas, como el pH, la temperatura, la concentración de nutrientes esenciales y la disponibilidad de la luz, O2 y CO2. Hay algunos aspectos que afectan el crecimiento de la microalga en las aguas residuales, como son: la alta concentración de nutrientes, en particular, el nitrógeno en forma de amonio; la presencia de toxinas como el cadmio y el mercurio, o químicos orgánicos; factores bióticos, como bacterias patógenas o zooplancton depredador, así como, microorganismos en el agua residual que pueden llegar a competir con la microalga por nutrientes esenciales. Otro factor crítico es la densidad inicial del inóculo en el agua residual, puesto que influye en el crecimiento de la población completa. Estos aspectos, pueden diferir dependiendo del tipo de agua residual y del sitio donde esté ubicada, así como de las características y habilidades de la especie de microalga [26]. El N y el P se presentan en el agua residual en forma de 𝑁𝐻4+ (amonio), 𝑁𝑂3− (nitratos), 𝑁𝑂2− (nitritos) y 𝑃𝑂43− (fosfatos). El nitrógeno, es un constituyente clave para muchas

biomoléculas, como son los aminoácidos, ácidos nucleicos, clorofilas, entre otros; es el nutriente más importante para las microalgas (después del carbono) y se incorpora como nitrato o como amonio. Es también un factor crítico para regular el contenido de lípidos de las microalgas, ya que numerosos estudios muestran que la biosíntesis y la acumulación de lípidos se potencian en cultivos de microalgas limitados en nitrógeno [33] [34] [35].

El fósforo es otro macronutriente importante que desempeña un papel importante en los procesos metabólicos celulares mediante la formación de muchos componentes estructurales y funcionales necesarios para el crecimiento normal, el desarrollo y la reproducción de microalgas, tales como, la formación de ácidos nucleicos, transferencia de energía y el contenido de lípidos y composición de ácidos grasos [34].

29

Los nutrientes indispensables para el crecimiento de las algas, presentes en el agua residual son incorporados por medio de dos procesos vitales en la naturaleza, el ciclo del nitrógeno y el ciclo del fósforo, sin los cuales ésta no sería capaz de sobrevivir. 2.3.1.1 Ciclo del nitrógeno El nitrógeno en la materia orgánica viva y muerta se encuentra predominantemente en la forma reducida de amonio, principalmente en las proteínas y nucleótidos (ADN, ARN y ATP). En promedio, las células procariotes contienen alrededor de 55% de proteínas y 23% de polinucleótidos. Cuando estos compuestos son hidrolizados y catabolizados por los organismos heterotróficos, el nitrógeno es liberado finalmente en forma de 𝑁𝐻4+ , a este proceso se le conoce como amonificación, también llamado mineralización del nitrógeno [35].

El amonio puede ser asimilado e incorporado de vuelta a las biomoléculas por una variedad de organismos aerobios y anaerobios, o, de manera alternativa, el amonio puede ser oxidado mediante microorganismos nitrificadores bajo condiciones aerobias.

El paso límite en la mineralización del nitrógeno es la hidrólisis extracelular de macromoléculas en pequeñas unidades. La hidrólisis microbial inicial de las proteínas y polinucleótidos produce oligopéptidos, aminoácidos, oligonucleótidos, y nucleótidos, todos teniendo proporciones inferiores a 6 de C:N. Subsecuentemente, los procesos fermentativos y respiratorios desaminan estas pequeñas moléculas disueltas, liberando NH4+.

El amonio formado durante la fijación del N es incorporado al material celular por una de dos rutas metabólicas. La mayoría de los organismos fijadores de nitrógeno, como las plantas y las bacterias, producen glutamato como producto inicial de la asimilación de 𝑁𝐻4+ , en dicha ruta, el glutamato es formado de la aminación reductiva de αoxoglutarato mediante la enzima glutamato deshidrogenasa (GDH):

30

Ecuación 2.1. 𝑁𝐴𝐷(𝑃)𝐻 +

𝑁𝐻4+

+ 𝛼 − 𝑜𝑥𝑜𝑔𝑙𝑢𝑡𝑎𝑟𝑎𝑡𝑜 → 𝑁𝐴𝐷(𝑃)+ + 𝑔𝑙𝑢𝑡𝑎𝑚𝑎𝑡𝑜 + 𝐻2 𝑂

La GDH tiene solo una moderada afinidad por el 𝑁𝐻4+ , y ya que el 𝑁𝐻4+ generalmente reprime la actividad de la enzima nitrogenasa, una rápida asimilación es imperativa. Así, algunas veces es usada una alternativa para una alta afinidad en la ruta de asimilación que mantiene una baja concentración de 𝑁𝐻4+ . Inicialmente, el 𝑁𝐻4+ es agregado al glutamato por medio de un ATP con la enzima glutamina sintetasa (GS): Ecuación 2.2. 𝑔𝑙𝑢𝑡𝑎𝑚𝑎𝑡𝑜 + 𝑁𝐻4+ + 𝐴𝑇𝑃 → 𝑔𝑙𝑢𝑡𝑎𝑚𝑖𝑛𝑎 + 𝐴𝐷𝑃

La glutamina es transformada de nuevo a glutamato por medio de una segunda reacción, catalizada por la enzima glutamato sintetasa ó GOGAT (glutamina- αoxoglutarato-amino-transferasa): Ecuación 2.3. 𝑔𝑙𝑢𝑡𝑎𝑚𝑖𝑛𝑎 + 𝛼 − 𝑜𝑥𝑜𝑔𝑙𝑢𝑡𝑎𝑟𝑎𝑡𝑜 + 𝑁𝐴𝐷𝑃𝐻 → 2 𝑔𝑙𝑢𝑡𝑎𝑚𝑎𝑡𝑜 + 𝑁𝐴𝐷𝑃

El costo de la ruta GS-GOGAT es un ATP por glutamato formado, pero el beneficio al organismo es una rápida asimilación de 𝑁𝐻4+ de bajas concentraciones en el ambiente, previniendo la supresión de la actividad de la nitrogenasa. La nitrificación describe la oxidación del a 𝑁𝐻4+ a 𝑁𝑂2− y finalmente a 𝑁𝑂3− . Enlaza a la mayoría de las formas reducidas y oxidadas del ciclo del nitrógeno, lo cual ejerce influencia considerable sobre la dinámica del nitrógeno en ambientes acuáticos. En efecto, como un resultado de la nitrificación, el producto primario de la mineralización del nitrógeno, 𝑁𝐻4+ , raramente ocurre en concentraciones significativas en ambientes aerobios.

31

Finalmente, durante la desnitrificación, se convierte el 𝑁𝑂3− a N2 removiendo el nitrógeno fijado del ambiente, proceso que consiste en un número de pasos de reducción respiratoria: Ecuación 2.4 𝑁𝑂3− → 𝑁𝑂2− → 𝑁𝑂 → 𝑁2 𝑂 → 𝑁2

El proceso se cataliza mediante enzimas (reductasas).

2.3.1.2 Ciclo del fósforo El fósforo es el décimo elemento más abundante sobre la Tierra, y es encontrado dentro de la litósfera como fosfato en aproximadamente 300 minerales naturales. En la corteza terrestre, la mayoría del fósforo está contenido en sedimentos (incluido el suelo) y roca sedimentaria, de las cuales una pequeña fracción es almacenada en depósitos económicos principalmente extraídos para uso de la industria de fertilizantes. De las reservas biológicamente activas de fósforo, que contienen orgánicos vivos y muertos así como fósforo inorgánico disuelto, solo el 1% es encontrado en la biomasa viva [36].

El fósforo es usado por la mayoría de los microorganismos en la síntesis de ácidos nucleicos, nucleótidos (ATP), fosfolípidos, fosfoazúcar, polifosfatos, cofactores varios, algunas proteínas, y otros componentes celulares. Los microorganismos han desarrollado sistemas activos de trasporte por medio de membranas para la adquisición regulada de fosfato del medio ambiente.

Los enlaces de fósforo en forma orgánica generalmente no están disponibles de manera directa para los organismos vivos, aunque las moléculas orgánicas pequeñas pueden llegar a ser asimiladas. La mayoría del fósforo orgánico debe ser primero liberado del resto orgánico mediante mineralización antes de que esté disponible para la asimilación de los seres vivos. Esto es realizado a través de la acción hidrolítica mediante una variedad de enzimas especiales. 32

Los procesos microbianos en gran parte controlan la inmovilización y movilización del fósforo en ambientes acuáticos. Durante la mineralización de la materia orgánica, los enlaces orgánicos del fósforo son asimilados parcialmente y liberados parcialmente como fósforo inorgánico disuelto por la comunidad heterotrófica microbiana. La cantidad de fósforo liberado y consumido, depende principalmente de la proporción C:P de los substratos orgánicos.

La asimilación del fósforo inorgánico ocurre a través de la demanda energética en la formación del ATP. La mayoría de la síntesis del fosfato que contienen las biomoléculas, provienen generalmente de una reacción inicial entre un grupo carbinol y ATP, formando ésteres de fosfatos monoméricos en la presencia de una quinasa apropiada. La siguiente ecuación muestra un proceso catalizado mediante la enzima glucoquinasa: Ecuación 2.5. 𝑔𝑙𝑢𝑐𝑜𝑠𝑎 + 𝐴𝑇𝑃 → 𝑔𝑙𝑢𝑐𝑜𝑠𝑎 6 − 𝑓𝑜𝑠𝑓𝑎𝑡𝑜 + 𝐴𝐷𝑃

Los detalles del ciclo del fósforo pueden variar dependiendo de las condiciones locales. El fósforo es generalmente el principal nutriente limitante en el crecimiento del fitoplancton en lagos de agua dulce, mientras que el nitrógeno limita la producción en costas oceánicas y en muchas áreas del océano abierto.

33

Capítulo 3 Metodología 3.1 Caracterización fisicoquímica del agua residual Se realizaron determinaciones de parámetros físico-químicos en el agua residual sin tratar (de entrada) y tratada (después del tratamiento secundario), con el fin de conocer sus composiciones (Tabla 3.1). Tabla 3.1. Parámetros físico-químicos a medir en la caracterización del agua residual.

Parámetro Amonio Nitratos Fosfatos pH Conductividad Sólidos Suspendidos Totales Sólidos Suspendidos Volátiles Sólidos Totales Sólidos Volátiles Totales Sales Disueltas Totales

Referencia Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater [37]. NMX-AA-079-SCFI-2001 [38]. Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater [37]. NMX-AA-008-SCFI-2011 [39]. NMX-AA-008-SCFI-2011 [39]. NMX-AA-034-SCFI-2001 [40]. NMX-AA-034-SCFI-2001 [40]. NMX-AA-034-SCFI-2001 [40]. NMX-AA-034-SCFI-2001 [40]. NMX-AA-034-SCFI-2001 [40].

La composición del fertilizante Bayfoland Forte puede consultarse en el ANEXO 1.

3.2 Especie Verrucodesmus verrucosus Verrucodesmus verrucosus fue colectada en una zona de lagos temporales en Ciudad Azteca, en el Estado de México, y mantenida en el Laboratorio de Ficología Aplicada UAMI (Universidad Autónoma Metropolitana Iztapalapa). Fue aislada por la técnica de aislamiento con micropipeta de punta adelgazada. Se mantuvo en la cámara de cultivo Nuaire en medio F2 con fotoperiodo de 12:12 y fue identificada mediante microscopía electrónica de barrido (MEB) y microscopía de luz.

34

La especie fue recientemente descrita por Hegewald (2013), presenta células ovaladas y alargadas de menos de 10 micras, generalmente de entre 4 y 7 µm con granulaciones en la pared celular, forman cenobios de 4 a 8 células, las cuales están ligeramente aplanadas en los sitios donde se unen y casi siempre formados por dos hileras de células apretadas dispuestas en diferentes planos. Ha sido reportada en Brasil, Alemania y México [41] [42].

3.3 Cultivo de microorganismos y diseño experimental Se realizó, como primera fase, una comparación entre tres medios de cultivos (M1, M2 y M3), con el fin de evaluar el crecimiento del alga en los mismos (Tabla 3.2) [17]. Tabla 3.2: Medios de cultivo usados para el crecimiento de Verrucodesmus verrucosus

Medios M1 M2 M3

Características Descarga de agua residual cruda. Agua residual tratada en un sistema de lodos activados convencional. Agua destilada enriquecida con nutrientes (fertilizante Bayfoland forte) a una concentración 1:1000

El agua residual cruda y tratada fue tomada de la planta de tratamiento de aguas residuales (PTAR) Tuchtlán en Tuxtla Gutiérrez, Chiapas, la cual funciona por medio de un tratamiento típico de lodos activados. El agua residual cruda se recolectó después del cribado inicial y el agua residual tratada, después del tratamiento secundario, antes de la desinfección final con cloro.

El agua residual fue filtrada con el fin de eliminar los sólidos presentes en esta, ya que los nutrientes esenciales para el alga se encuentran disueltos en el agua residual como nitrógeno y fósforo inorgánico. Al mismo tiempo este proceso facilita el manejo de las algas y permite una mejor distribución de la luz.

El inóculo inicial se mantuvo en matraces de 250 ml con 100 ml de medio de cultivo, la cepa se dejó crecer hasta notar un color verde uniforme, siendo esta la fase 35

exponencial. Para conocer la concentración del inóculo, se realizó un conteo mediante cámara de Neubauer y se obtuvo una cantidad de 658,333.33 ± 236,290.78 cel/ml. Se inocularon 6,583,333.33 cel/ml (10 ml) de dichos tubos a matraces Erlenmeyer de 500 ml, con 240 ml de los tres medios de cultivo indicados, estériles y sin esterilizar, cada uno con tres réplicas, con excepción de M3, que tuvo dos réplicas y fue usado como blanco. Los tratamientos se agitaron manualmente todos los días para adicionar CO 2 atmosférico y se dejaron crecer durante 10 días (ver figura 3.1). Estudios indican que la concentración del inóculo, no influye significativamente sobre las tasas de crecimiento y la remoción de nutrientes [11].

Figura 3.1. Cultivo de algas en matraces de 500 ml con 250 ml de medio inoculado.

AF y ARC-E, presentaron altas concentraciones de nutrientes esenciales para el crecimiento del alga y una baja contaminación del medio, tanto por factores externos como por su propia naturaleza, dando como resultado un crecimiento adecuado, por lo que fueron escalados (por duplicado) a matraces de 1 L de capacidad con 900 ml de medio y 100 ml de inóculo, con una aireación constante de 0.5 L/min y dejando crecer durante otros 10 días. Finalmente los matraces se escalaron a reactores cilíndricos de vidrio de 20 L de capacidad (ver figura 3.2) y diámetro 30.20 cm, con 17.3 L de medio y 700 ml del inóculo, con una aireación por medio de una bomba de 36

aire de 2L/min, permitiendo que se realizara el proceso durante 44 días más, hasta llegar a la fase estacionaria, ya que en esta etapa se presenta en las microalgas una mayor acumulación de lípidos [16] [43].

Figura 3.2. Cultivo de microalgas en reactores de 20 L con 18 L de medio inoculado.

Todos los tratamientos se mantuvieron bajo fotoperiodos de luz- oscuridad 12:12, con una lámpara de luz fluorescente de 25 watts y 1,650 lúmenes, colocada a 25 cm de distancia, temperatura de 25°C ± 5 y agitaciones manuales diarias para la adición de CO2 ambiental en la fase inicial, y, con bombeo de aire durante el segundo y tercer escalamiento [31].

Para el análisis estadístico se usó una regresión lineal con el modelo sigmoidal de Gompertz (ANEXO 2) a cada una de las cinéticas de crecimiento durante los escalamientos, para la evaluación de correlación entre puntos (R2 y Valor de P en tabla 4.3). Mientras que para evaluar las diferencias entre los grupos probados se llevó a cabo un análisis de varianza (ANOVA).

37

3.4 Coliformes fecales Se determinó la cantidad de microorganismos del grupo coliforme, para el primer escalado, realizando una prueba inicial y una final para cada muestra, con el fin de tener conocimiento de la cantidad aproximada de microorganismos coliformes existentes en el agua residual y la cantidad de estos que podrían sobrevivir a las condiciones ambientales propuestas para el alga, ya que diversos estudios han observado que los factores ambientales que son favorables para el crecimiento de las algas son poco favorables para la sobrevivencia de estos microorganismos [33].

Generalmente las pruebas para determinar coliformes fecales, se emplean para estimar el grado de contaminación fecal. Esta prueba se realizó mediante el cultivo en un medio líquido en tubos múltiples y el cálculo de sus números más probables (NMP) en la muestra [44].

Para la prueba presuntiva se tomó una alícuota de 1 ml de muestra homogeneizada y se agregó a 9 ml de agua peptona da, para posteriormente agregar 1 ml de esta muestra a otro tubo con 9 ml y de esta a un último tubo con la misma cantidad, haciendo tres diluciones: 1:10, 1:100 y 1:1000.

Cada dilución de muestra de agua peptonada se inoculó por triplicado con 1 ml en tubos con 9 ml de caldo lactosado. Los tubos se examinaron a las 24 y 48 horas de incubación a 35°C y se tomaron como positivos aquellos tubos que presentaron turbidez y producción de gas en el interior de la campana Durham (ver fig. 3.3).

38

Figura 3.3. Prueba presuntiva de coliformes fecales.

Las pruebas confirmativas se realizaron resembrando 1 ml de los tubos positivos de muestra de caldo lactosado en medio EC, el cual es más selectivo ya que el contenido de lactosa en este medio, favorece el crecimiento de bacterias lactosa positivas, mientras que las sales biliares inhiben el crecimiento de gran parte de la flora acompañante. Los tubos de incubaron a 35°C y se examinaron a las 24 y 48 horas, tomándose como positivos aquellos tubos que presentaron turbidez con producción de gas.

Mediante tablas estadísticas (ver ANEXO 3) se llevó a cabo el cálculo del número más probable (NMP) de organismos coliformes que puedan estar presentes en la muestra, a partir de los números de los tubos que dan resultados confirmativos positivos.

Los reactivos se prepararon de la siguiente manera:

39

Contenido de caldo lactosado: Componentes

Cantidad (g) Medio comercial (g)

Triptosa

6

Lactosa

2

Cloruro de sodio (NaCl)

2

Fosfato monobásico (NH2PO4)

1.25

Fosfato dibásico de potasio (K2HPO4)

1.25

Lauril sulfato de sodio

0.5

13

Esta cantidad se diluyó en 1 L de agua, se calentó con agitación constante para que el medio estuviera completamente mezclado, después de esto se distribuyeron 9 ml en los tubos de ensayo necesarios para las pruebas, a cada tubo se le colocaron campanas Durham, y finalmente se esterilizaron en autoclave a 121°C y 15 libras de presión durante 15 minutos.

Contenido de la solución salina de peptona (agua peptonada): Componentes

Cantidad (g)

Peptona

1.0

Cloruro de sodio 8.5

Esta cantidad se diluyó en 1 L de agua, se calentó con agitación constante para que la mezcla se encontrara completamente mezclada, y finalmente se esterilizó en autoclave a 121°C y 15 libras de presión durante 15 minutos.

Medio EC: Componentes

Cantidad (g) Medio comercial (g)

Triptosa

20.0

Lactosa

5.0

Mezcla de sales biliares

1.5

Fosfato monobásico de potasio (KH2PO4)

1.5

Fosfato dibásico de potasio (K2HPO4)

4.0

Cloruro de sodio (NaCl)

5.0

13

40

Se diluyó en 1 L de agua hirviendo, se distribuyeron 9 ml en los tubos de ensayo necesarios para las pruebas y finalmente, a cada tubo se le colocaron campanas Durham, para después llevar a esterilización en autoclave a una temperatura de 121°C durante 15 minutos.

3.5 Eficiencia de remoción de nutrientes Para determinar la calidad del agua y evaluar la remoción de nutrientes antes y después del período de cultivo, para cada escalamiento, se analizó al principio y al final de los primeros dos escalamientos, y cada cuatro días para el tercer escalamiento, el contenido de fosforo en forma de ortofosfatos y de nitrógeno en forma de nitratos y amoniacal, siguiendo la metodología empleada durante la caracterización de aguas residuales [45]. 3.5.1 Amonio (𝐍𝐇𝟒+ ) Para las pruebas de amonio (fig. 3.4) se usaron 10 ml muestra filtrada, a la cual se agregó 0.2 ml de reactivo R1, 0.2 ml de reactivo R2 y 0.2 ml de reactivo R3 y se esperó durante 10 minutos, para finalmente medir la absorbancia a 630 nm.

Figura 3.4. Análisis de concentración de amonio

Los reactivos se prepararon de la siguiente manera: 41

R1: Se disolvieron 2 g de EDTA disódico 2H2O en 70 ml de agua destilada calentando, para después adicionar 25 g de citrato sódico tribásico.2H2O y 1 g de nitroprusiato sódico y finalmente completar hasta 100 ml con agua destilada.

R2: Se disolvieron 2.75 g de NaOH en 50 ml de agua destilada, se dejó enfriar y se añadieron 8 ml de fenol líquido, para finalmente completar hasta 100 ml con agua destilada.

R3: Se disolvieron 4 g NaOH en 30 ml de agua y se agregaron 50 ml de hipoclorito, 7% Cl2, para finalmente completar hasta 100 ml con agua destilada.

La curva de calibración (fig. 3.5) se llevó a cabo usando una disolución madre de 1000 ppm, a la cual se le agregó 4.714 g de amonio sulfato anhidro aforado a 1 L con agua destilada y se le agregó 0.3 ml de cloroformo. De la disolución madre se realizó la dilución 1:100, para la disolución estándar intermedia de amonio de 10 ppm, de esta, se agregaron 0.5, 1.0, 1.5 y 2.0 ml en tubos de reacción y se completaron a 10 ml con agua destilada, al mismo tiempo que se preparó un blanco con 10 ml de solo agua destilada. Finalmente se procedió con la adición de los reactivos indicados.

42

Figura 3.5. Curva de calibración de amonio (𝑁𝐻4+ ).

Los datos obtenidos de la regresión de la gráfica fueron: Ecuación 3.1. Modelo de la regresión lineal: 𝑦 = 0.6668𝑥 + 0.024

R2=0.9902

3.5.2 Fosfatos (𝐏𝐎𝟑− 𝟒 ) A 5 ml muestra filtrada se agregaron 0.4 ml reactivo R1 y 0.4 ml de reactivo R2, las muestras se midieron por espectrofotometría UV-VIS a una absorbancia de 880 nm (ver fig. 3.6).

43

Figura 3.6. Análisis de la concentración de fosfatos.

Los reactivos se prepararon de la siguiente manera:

R1 COLORANTE: Se adicionaron 4.3 g de Amonio heptamolibdato decahidratado, 0.12 g de Antimonio potasio tartrato y 27 ml de ác. sulfúrico concentrado en 250 ml de agua destilada.

R2 REDUCTOR: Se agregaron 25 g de ácido. ascórbico, 2.5 ml de ácido. fórmico en 250 ml agua.

La curva de calibración se llevó a cabo usando una disolución madre a 1000 ppm a la que se le agregaron 4.394 g de potasio fosfato monobásico anhidro KH2PO4 aforado a 1000 ml con agua destilada, finalmente se le adicionaron 0.3 ml de cloroformo. De la disolución madre se realizó la dilución 1:100, para hacer la disolución estándar intermedia de fosfatos de 10 ppm.

Para la curva patrón (fig. 3.7), se tomaron 0.5, 1.0, 1.5 y 2.0 ml de la disolución estándar intermedia y se agregaron en tubos de ensayo los cuales se completaron a 10 ml con agua destilada. De estos tubos se tomaron 5 ml y se agregaron a tubos de reacción, al mismo tiempo se preparó un blanco con 5 ml de solo agua destilada y finalmente se procedió con la adición de los reactivos indicados.

44

Figura 3.7. Curva de calibración de fosfatos ( 𝑃𝑂43− )

Los datos obtenidos de la regresión de la gráfica fueron: Ecuación 3.2. Modelo de la regresión lineal: 𝑦 = 0.6566𝑥 + 0.0398

R2=0.9973 3.5.3 Nitratos (𝐍𝐎− 𝟑) Los nitratos se determinaron usando el método de sulfato de brucina [46], en donde la brucina reacciona con los nitratos bajo condiciones ácidas y altas temperaturas para producir un complejo de color amarillo.

Para realizar el análisis de nitratos fue necesario filtrar la muestra, con el fin de remover turbiedad. Se midieron 10 ml de muestra con o sin dilución y se transfirieron a tubos de ensayo, mismos que se sumergieron en un baño de agua fría, para después añadirles 2 ml de disolución de cloruro de sodio y mezclarlos. El siguiente paso fue agregarles 10 ml de disolución de ácido sulfúrico, procediendo a mezclarlos y 45

enfriarlos. En seguida, se agregaron 0.5 ml del reactivo brucina-ácido sulfanílico, mezclando y enfriando los tubos después. Los tubos se colocaron en un baño de agua en ebullición durante 20 minutos, al concluir el tiempo estos se sacaron y se sumergieron en agua fría. Los patrones y muestras se leyeron a 410 nm (ver fig. 3.8).

Figura 3.8. Análisis de la concentración de nitratos

Los reactivos para la determinación de nitratos se prepararon de la manera siguiente:

Disolución de ácido sulfúrico: Se añadieron 500 ml de ácido sulfúrico concentrado a 125 ml de agua, dejando enfriar a temperatura ambiente.

Disolución de cloruro de sodio: Se pesaron aproximadamente pero con precisión 300 g de cloruro de sodio, se disolvió en agua destilada y se aforó a 1 L.

Disolución de brucina-ácido sulfanílico: Se disolvió 1,0 g de sulfato de brucina y 0,1 g de ácido sulfanílico en aproximadamente 70 ml de agua destilada caliente. Se añadieron 3,0 ml de ácido clorhídrico concentrado, para después enfriar y aforar a 100 ml.

46

La curva de calibración se realizó a partir de una disolución madre de nitratos de 100 ppm, para la cual se secó aproximadamente 1g de nitrato de potasio a 105°C por 24 h, después se pesaron 0.7218 g, los cuales se diluyeron en agua y se aforaron a 1000 ml. Esta disolución se preservó con 2 ml de cloroformo por no más de 6 meses.

De la disolución madre de nitratos, se tomó una alícuota de 10 ml y se aforó a 1 L con agua para hacer la disolución estándar intermedia de nitratos de 1 ppm. Esta disolución se preservó con 2 ml de cloroformo por no más de 6 meses.

Para la curva patrón (ver fig. 3.9) se midieron 1,0, 2,0, 4,0, 7,0 y 10,0 ml de la disolución estándar intermedia de nitratos y se llevaron a 10 ml cada uno, usando al mismo tiempo 10 ml de agua destilada como referencia. Obteniendo disoluciones de 0, 0.1, 0.2, 0.4, 0.7 y 1 ml de nitratos. Finalmente con los tubos se siguió el procedimiento explicado anteriormente.

Figura 3.9. Curva de calibración de nitratos (𝑁𝑂3− )

Los datos obtenidos de la regresión de la gráfica fueron: Ecuación 3.3.

47

Modelo de la regresión lineal: 𝑦 = 0.292𝑥 + 0.2196

R2=0.9924

3.6. Concentración celular El recuento celular es el más utilizado por ser un método sencillo y poco costoso, el cual permite además un mejor seguimiento del cultivo mediante su inspección visual [47].

Debido a esto, la concentración celular se realizó mediante conteo celular por medio de un hematocitómetro de 0.1 mm de profundidad con reglilla de Neubauer. Al tratarse de células grandes (mayores de 6 µm), el recuento se llevó a cabo usando los cuatro cuadros marcados en la figura 3.10 como A, B, C y D, lo cuales tienen 1 mm en cada uno de sus lados y un volumen correspondiente a 0.1 µL. Finalmente se realizó un promedio del conteo hecho en los cuatro cuadros.

Figura 3.10. Reglilla de Neubauer de 9 mm 2.

Para hacer el conteo celular, se agitaron los cultivos en cada uno de los reactores para permitir una distribución uniforme de las células y se tomaron muestras de 1 ml, las cuales se colocaron en tubos previamente lavados y secos, agregando una gota de lugol a cada tubo con el fin de fijar las células. Cada tubo se agitó y se succionó cada 48

muestra con una pipeta Pasteur, para posteriormente llenar la cámara y ver al microscopio. La cámara se enfocó con el objetivo de 40X, con el fin de facilitar la identificación de las células y discriminar los residuos y demás partículas con tamaño similar a la especie algal cultivada (ver figura 3.11 y .

b a

Figura 3.11. a) Vista al microscopio de la microalga con el objetivo 40X. b) Vista en el microscopio de barrido electrónico (imagen extraída de [48]).

Con el fin de tener un recuento más preciso, se usaron tres submuestras de cada muestra y con éstas se calculó la concentración media.

La concentración celular (cel/mL) se calculó utilizando la siguiente fórmula: Ecuación 3.4 𝐶 = 𝑁 ∗ 104 ∗ 𝑑𝑖𝑙

En donde: C= concentración celular (cel/mL). N= promedio de células presentes en 1mm2 (0.1µL) dil= factor de dilución 104= factor de conversión de 0.1µL a 1mL

La precisión del número de células contadas se calcula de acuerdo con la fórmula:

49

Ecuación 3.5 µ = 𝑥 ± 2√𝑥

En donde: µ= es la media poblacional x= es el promedio de células contadas en 1 mm2

A partir de estos datos se determinó la tasa de crecimiento específica, la cual fue calculada con la siguiente ecuación exponencial [49]: Ecuación 3.6 𝜇𝑒 = (𝑙𝑛𝑁𝑡 − 𝑙𝑛𝑁0 )/(𝑡2 − 𝑡1 )

Donde: µ= tasa de crecimiento específica en (días). ln= es el logaritmo natural. N0= corresponde a la concentración de la población inicial (cel/ml). Nt= concentración después del tiempo final de crecimiento (cel/ml). t1= tiempo inicial para el intervalo de crecimiento de interés en (días). t2= tiempo final de crecimiento del intervalo en (días).

Las divisiones celulares diarias se calcularon de acuerdo a la siguiente ecuación: Ecuación 3.7 𝑘 = 𝜇𝑒 / 𝑙𝑛 2

Y, finalmente, el tiempo de generación se calculó de la siguiente forma: Ecuación 3.8 tg = ln 2 /µe

50

Para cada réplica se consideraron los días de cultivo, correspondientes a la fase exponencial de crecimiento de acuerdo con las tasas de crecimiento acumuladas (Σµe) generadas [50].

3.7. Separación de la biomasa del medio de cultivo La cosecha se realizó terminando los 44 días de tratamiento, al alcanzarse la fase estacionaria de crecimiento. La biomasa se sedimentó durante 24 horas, tal como se muestra en la figura 3.12 con el fin de eliminar el sobrenadante y después se utilizó la centrífuga a 3000 rpm a 9°C por 10 minutos con el fin de acelerar la sedimentación del alga, la biomasa se colocó en cajas petri (ver figura 3.13) [51].

Figura 3.12.Sedimentación de algas durante 24 hrs.

Figura 3.13. Cosecha de microalgas después de la centrifugación

51

3.8. Extracción de lípidos totales El alga cosechada fue secada a 60°C por 24 horas para la extracción del análisis de lípidos. Los lípidos fueron extraídos en el aparato Soxhlet (ver fig. 3.14) operado a aproximadamente 80°C por 8 horas, para lo que se añadieron 150 ml de hexano en matraces bola de 250 ml, la biomasa seca de cada muestra se introdujo en un cartucho de celulosa cubierto con algodón para protegerla de posibles derrames.

Después de la extracción Soxhlet el hexano fue evaporado a 80°C usando un rotavapor (ver fig. 3.15), la muestra con restos de hexano se colocó en crisoles y se evaporó en un horno de secado. El lípido crudo fue luego redisuelto en hexano y conservado en viales de vidrio sellados en la oscuridad a 5 °C [18].

Figura 3.14. Extracción de lípidos en aparato Soxhlet.

52

Figura 3.15. Destilación de lípidos suspendidos en hexano por medio de Rotavapor.

3.9. Cuantificación de lípidos El extracto lipídico se recuperó en crisoles (fig. 3.16) previamente pesados y a peso constante; posteriormente se secó en el horno de secado a 80°C durante 20 minutos y se colocó en un desecador durante 15 minutos hasta lograr peso constante, y por diferencia de pesos se cuantifica el porcentaje de lípidos [52]: Ecuación 3.9. 𝑃𝐿 𝐶𝑜𝑛𝑡𝑒𝑛𝑖𝑑𝑜 𝑑𝑒 𝑙í𝑝𝑖𝑑𝑜𝑠 (%) = ( ) 𝑥100 𝑃𝑀

Donde: PL= peso seco de los lípidos totales PM= es el peso seco de las microalgas.

53

Figura 3.16. Lípidos extraídos después de la destilación con rotavapor.

54

Capítulo 4 Discusión de Resultados 4.1 Caracterización fisicoquímica del agua residual cruda y tratada El agua residual usada provino de una PTAR municipal, que trata el agua por medio de un proceso de lodos activados convencional. En el agua residual el nitrógeno se encuentra en su mayoría como NH4+ o NH3, dependiendo del pH, ya que el NH4+ tiene mayor presencia en el agua a un pH menor de 9, mientras que a un pH de 9 los dos compuestos se encuentran en equilibrio; para lograr su remoción, es necesario cumplir con los procesos de amonificación, nitrificación y desnitrificación, los primeros dos pasos con presencia de oxígeno y el último sin ella [53] [54]. La desnitrificación es difícil de lograr, ya que generalmente, hay presencia de oxígeno en la zona anóxica del reactor, debido sobre todo a la recirculación constante del sistema, por lo que al − final del tratamiento de lodos activados hay altas concentraciones de NO− 3 y NO2 ,

productos de la nitrificación [54]. Por lo tanto, se puede observar en la caracterización (Tabla 4.1), altas concentraciones de NH4+ en ARC, una disminución notable en ART y un aumento considerable de NO− 3 en ART lo que indica un proceso incompleto de remoción del nitrógeno. El pH de la muestra de ARC está por debajo de 9, lo que explica las altas cantidades de NH4+ en el afluente. El fósforo en el agua residual puede estar presente en tres formas, ortofosfatos, polifosfatos y fósforo ligado a cadenas orgánicas [54], por lo que su remoción se ve limitada por la baja eficiencia del proceso y de los microorganismos en la zona anaeróbica [54] [55], por lo que se puede observar una remoción de fosfatos del 76.27% durante el proceso de lodos activados para la muestra de agua tomada.

55

Tabla 4.1. Caracterización de los parámetros fisicoquímicos al agua residual cruda y tratada.

Parámetro

ARC1

ART2

ST (mg/L)

982.66 ± 45.49*

790.66 ± 24.44

SVT (mg/L)

308.00 ± 16.97

154.00 ± 25.46

SST (mg/L)

184.00 ± 16.97

46.00 ± 19.80

SSV (mg/L)

130.00 ± 8.49

34.00 ± 14.14

SDT (mg/L)

798.66 ± 28.52

744.67 ± 4.64

𝐍 − 𝐍𝐇𝟒+ (mg/L)

57.49 ± 1.26

0.10 ± 0.01

𝐏 − 𝐏𝐎𝟑− 𝟒 (mg/L)

5.10 ± 0.31

1.21 ± 0.03

Coliformes Fecales (NMP/ml)

1,100 ± 0.00

3.66 ± 0.57

𝐍 − 𝐍𝐎− 𝟑 (mg/L)

0.65 ± 0.04

57.16 ± 2.18

pH

6.90 ± 0.00

6.90 ± 0.00

Conductividad (µs)

1672 ± 2.65

1160 ± 5.00

* Media de tres repeticiones. 1

Agua Residual Cruda. Agua Residual Tratada. ST: Sólidos Totales; SVT: Sólidos Volátiles Totales; SST: Sólidos Suspendidos Totales; SSV: Sólidos Suspendidos Volátiles; 2

Los constituyentes típicos para el agua residual municipal cruda se muestran en la tabla 4.2, en donde se puede observar que los valores encontrados se encuentran dentro del rango esperado, con excepción de los SST y los SSV los cuales están por debajo. Los SST son un factor que en grandes cantidades se considera un inhibidor del crecimiento de las algas, ya que agotan el oxígeno disuelto (OD) y limitan la disponibilidad de la luz en el agua [56] [57]. A pesar de encontrarse en menor concentración que el agua residual típica, la cantidad que contiene el agua cruda usada, podría influir en el crecimiento del alga.

56

Tabla 4.2. Contenido típico de nutrientes en agua residual municipal cruda en mg/L [57].

Parámetro 𝐍 − 𝐍𝐇𝟒+ (mg/L) − 𝑵 − 𝐍𝐎− 𝟑 + 𝐍𝐎𝟐 (mg/L) 𝟑− 𝐏 − 𝐏𝐎𝟒 (mg/L) SST (mg/L) SSV (mg/L) pH

Rango de valores en el agua residual 20-75 0.1-0.5 4-15 250-600 200-480 7-8

Otros estudios con microalgas usando agua residual como medio de cultivo, muestran comportamientos similares a los mencionados anteriormente, Komolafe et al [58], utilizan agua residual de entrada (cruda) y muestran en su caracterización concentraciones altas de NH4+ , aunque menores a las reportadas en este estudio con 29.12 ± 0.0 mg/L y de PO3− 4 , en este caso mayores a las reportadas, con 35.4 ± 0.1 mg/L, así como de 23.1 ± 0.6 mg/L para los NO− 3 , una cantidad alta en comparación con la cantidad encontrada en el afluente analizado. Francesca [13] presenta resultados para agua residual de entrada, después de un tratamiento físico de cribado y para el agua residual descargada de tanques de aireación, los cuales son menores en comparación con la cantidad de nutrientes reportados en este estudio, las concentraciones para agua residual cruda y tratada respectivamente son de 22.87 ± 0.02 y 7.85 ± 0.03 para NH4+ , de 10.20 ± 0.01 y 1.89 ± 0.01 para PO3− 4 , y de 2.09 ± 0.01 y 2.50 ± 0.03 para NO3− , se puede observar que las concentraciones de NH4+ y PO3− 4 , disminuyen al finalizar el tratamiento y las de NO− 3 tienen un ligero aumento, aunque no tan notorio como el que presenta este estudio, seguramente debido a variaciones en el tratamiento del agua residual; los valores de pH y SST, se asemejan a los presentados, con pH de 6.5 ± 0.0 y 6.4 ± 0.0 y SST de 250.00 ± 0.05 y 10.00 ± 0.0 mg/L para el afluente y el efluente respectivamente.

Por otro lado Fernández et al [59], realizaron un estudio con agua residual tratada, después de un reactor biológico, en donde la concentración de NH4+ fue bastante baja, con 0.56 ± 0.02 mg/L, coincidiendo con lo reportado en este estudio, al igual que Arias et al [60], los cuales usaron agua residual tomada al finalizar un tratamiento de lodos activados, y exponen concentraciones bajas para NH4+ de 0.21 ± 0.84 mg/L y PO3− 4 de 57

2.18 ± 0.87 mg/L, así como mayores cantidades de NO− 3 con 15.94 ± 4.94 mg/L tal como se esperaría para este tipo de tratamiento, así también los SST y SVT fueron menores a 30 mg/L, cantidad mucho menor en comparación con el agua usada.

Los coliformes fecales fueron más abundantes en ARC, debido a la cantidad de contaminación fecal presente en el agua residual. En ART, la concentración disminuyó ya que casi toda la materia orgánica presente en el agua había sido metabolizada durante el proceso.

4.2 Cinéticas de crecimiento 4.2.1 Primer escalado de 250 ml

Para el primer escalado se cultivó Verrucodesmus verrucosus en las diferentes calidades de agua, y, con el fin de conocer su máximo crecimiento, así como, las fases del mismo, se realizaron cinéticas para cada uno de los medios. Una manera sencilla de conocer la etapa de crecimiento en la que se encuentra el alga, es hacer una curva con la suma progresiva de las tasas de crecimiento diario o divisiones por día, tal como se muestra en la fig.4.1. En la gráfica se puede observar que la fase exponencial inicia a partir del día dos, lo que indica una buena adaptación de la especie a los medios utilizados, y se prolonga hasta el día diez para ARC, ART, ARC-E y ART-E, permitiéndose los siguientes escalados a partir de esta etapa, con el fin de prolongar la fase logarítmica de la biomasa microalgal. La etapa exponencial de AF termina en el día 6 de crecimiento, aunque no es posible asegurar esto, ya que se necesitan más puntos, puesto que podría tratarse de una etapa temprana de crecimiento del alga.

58

Figura 4.1. Duplicaciones acumuladas de Verrucodesmus verrucosus en los diferentes medios de cultivo durante el primer escalado.

Figura 4.2. Cinéticas de crecimiento del primer escalado en las diferentes calidades de agua

La fig. 4.2 muestra las cinéticas de crecimiento del alga para cada medio de cultivo. Se puede observar, que al inicio de la fase exponencial, el medio que presentó un mejor crecimiento fue AF con 1.32 x 105 cel/ml, debido a que este medio se usó como 59

inóculo inical por lo que supone una adaptación previa de la microalga, los siguientes medios fueron ART-E con 7.17 x 104 ± 3.00 x 103, ART 6.03 x 104 ± 7.47 x 103, los cuales no tuvieron diferencia significativa entre ellos, ARC-E con 6.00 x 104 ± 1.18 x 104 y finalmente ARC con 4.18 x 104 ± 1.03 x 104 con el menor crecimiento, estos últimos sin diferencia significativa.

En el día diez, de crecimiento, se observan mayores variaciones en las cinéticas, ART alcanza una mayor concentración de células, incluso mayor que la del medio control, con 1.26 x 106± 1.08 x 105, el agua residual tratada, es uno de los medios más usados para el crecimiento de las algas, debido a la baja cantidad de compuestos tóxicos y de microorganismos que puedan competir con estas [57], además, el medio presenta fosfatos y altas concentraciones de nitratos, considerados nutrientes esenciales para las microalgas [33] lo que explica el buen crecimiento de Verrucodesmus verrucosus en este medio. El agua residual tratada estéril (ART-E) tuvo un buen crecimiento celular, con 5.72 x 105± 1.08 x 105 cel/ml, sin diferencia significativa con el medio control (con 5.17 x 105 cel/ml), aunque menor al de ART. Estudios demuestran la capacidad de las algas para generar una relación simbiótica con ciertas bacterias, de manera que la población algal logra una mayor reproducción [61], lo que podría explicar el mayor crecimiento en el agua tratada no estéril. El agua residual cruda (ARC) tuvo muy poco crecimiento algal, con 2.08 x 105 ± 5.36 x 104 cel/ml, debido probablemente a la gran cantidad de inhibidores que contiene, como son los sólidos suspendidos totales (SST), presentes en la muestra [56]. Otro problema es la disponibilidad de la luz y las altas cargas bacterianas que compiten con el alga por nutrientes o limitan su crecimiento ya sea a través de ataques por contacto entre células o indirectamente a través de compuestos extracelulares [57]. El agua residual cruda estéril (ARC-E) tuvo entonces un mejor crecimiento en comparación con ARC, con 5.67 x 105± 1.35 x 105 cel/ml (sin diferencia significativa con el medio control) debido probablemente a este último problema, ya que al estar estéril, no hubo competencia con otros microorganismos o fue menor.

60

Tabla 4.3. Concentraciones celulares (cel/ml) iniciales y finales de las etapas exponenciales en cada medio. Parámetros poblacionales: tasa de crecimiento específico (µmáx/día); tiempo de duplicación, tg (días) y divisiones por día, k. Primer escalado de 250 ml.

Medio de Cultivo

Concentración celular inicial (cel/ml)

Concentración celular final (cel/ml)

R2

Valor de P

Tasa de crecimiento específico, µmáx/día

Tiempo de duplicación, tg (días)

Divisiones por día, k

ARC1

4.18 x 104* ± 1.03 x 104** e

2.08 x 105 ± 5.36 x 104 c

0.98

0.02

0.39a

1.80

0.56

ART2

6.03 x 104 ± 7.47 x 103 ac

1.26 x 106± 1.08 x 105 a

0.99

0.01

0.58a

1.19

0.84

ARCE3

6.00 x 104 ± 1.18 x 104 a

5.67 x 105± 1.35 x 105 b

0.99

0.01

0.60a

1.21

0.86

ART-E4

7.17 x 104 ± 3.00 x 103 bc

5.72 x 105± 1.08 x 105 b

0.99

0.00

0.52a

1.35

0.75

AF5

1.32 x 105 d

5.17 x 105 b

0.98

0.03

0.63a

1.10

0.91

* Media de tres repeticiones. ** Los promedios (± error estándar) dentro de cada columna sin superíndice común difieren significativamente a P <0.05. Se realizó un análisis de varianza (ANOVA). 1

Agua Residual Cruda.

2

Agua Residual Tratada.

3

Agua Residual Cruda Estéril.

4

Agua Residual Tratada Estéril.

5

Agua con Fertilizante.

La tasa de crecimiento máxima fue diferente para la especie en cada medio de cultivo (tabla 4.3). Los valores más altos se observaron en el medio control con 0.63, en ARCE con 0.60 y en ART con 0.58, mientras que ART-E y ARC tuvieron valores más bajos con 0.52 y 0.39 respectivamente. En un estudio similar Sacristán et al [17], obtiene tasas de crecimiento menores de entre 0.06 y 0.14 para Scenedesmus acutus en agua residual cruda y tratada, sin embargo, el medio control obtuvo una mayor tasa de crecimiento, seguido por el agua residual tratada y finalmente el agua residual cruda, 61

comportamiento parecido al encontrado en este estudio. Otro estudio con Scenedesmus obliquus en agua residual cruda pretratada sin filtrar, mostró una tasa de crecimiento de 0.28, menor a la mostrada por ARC [51]. Por otro lado, en pruebas hechas con agua residual tratada usando Scenedesmus sp., la tasa de crecimiento máxima de dos estudios fueron de 1.65, en agua esterilizada con autoclave [62] y de 1.39, en agua filtrada y esterilizada con luz UV [63], siendo estos datos mayores a los arrojados por ART y ART-E, cabe mencionar que en dichos reportes, extendieron el crecimiento de la cepa hasta su fase estacionaria, por lo que las altas tasas de crecimiento podrían ser debido a esa diferencia de tiempos de cultivo con respecto a este estudio.

Para el análisis estadístico se usó una regresión lineal con el modelo sigmoidal de Gompertz, para la evaluación de correlación entre puntos (R2 y Valor de P en tabla 4.3). Mientras que para evaluar las diferencias entre los grupos probados se llevó a cabo un análisis de varianza (ANOVA).

Para seleccionar los medios para los siguientes escalados, se tomaron en cuenta las tasas de crecimiento específico, los tiempos de duplicación y las divisiones diarias, así como la cantidad de nutrientes esenciales para el crecimiento del alga presentes en el medio, siendo el tratamiento más adecuado ARC-E.

4.2.2 Segundo escalado de 1 L

En la figura 4.3 se observa las duplicaciones acumuladas para Verrucodesmus verrucosus tanto para agua con fertilizante (AF) y agua residual cruda estéril (ARC-E), se puede observar que al igual que en la etapa anterior, la fase exponencial inicia a los dos días de tratamiento, sin embargo, AF parece haber finalizado esta etapa el día 6, aunque como se mencionó antes los puntos son pocos para asegurar esto, mientras que ARC-E parece seguir en esta etapa hasta el día 10, antes del siguiente escalado.

62

Figura 4.3. Duplicaciones acumuladas de Verrucodesmus verrucosus en los diferentes medios de cultivo durante el segundo escalado.

Si comparamos las cinéticas de crecimiento de la figura 4.4 del primer escalado con el segundo, se pueden observar menores variaciones en el crecimiento, así como concentraciones celulares mayores, lo que podría ser debido a la adición de CO2 atmosférico durante esta etapa, ya que se ha demostrado que esta puede aumentar la productividad algal a más del doble debido a un aumento en la actividad fotosintética [64] [65] [66].

63

Figura 4.4. Cinéticas de crecimiento del segundo escalado en las diferentes calidades de agua

El crecimiento de Verrucodesmus verrucosus en los dos medios no tuvo diferencias significativas en el día diez, sin embargo se observa un rápido crecimiento para el medio control desde el principio del tratamiento. La menor concentración de células en ARC-E puede ser debido a diferentes compuestos inhibidores del crecimiento del alga presentes en el agua residual y que no se encuentran en el medio control, como son, altas cargas orgánicas, la cantidad de SST mismos que tienen influencia en la dispersión y penetración de la luz, así como la posible presencia de metales pesados [57].

64

Tabla 4.4. Concentraciones celulares (cel/ml) iniciales y finales de las etapas exponenciales en cada medio. Parámetros poblacionales: tasa de crecimiento específico (µmáx/día); tiempo de duplicación, tg (días) y divisiones por día, k. Segundo escalado de 1 L.

Medio de Cultivo

Concentración celular inicial (cel/ml)

Concentración celular final (cel/ml)

R2

Valor de P

Tasa de crecimiento específico, µmáx/día

Tiempo de duplicación, tg (días)

Divisiones por día, k

ARCE1

9.14 x 104* ± 3.38 x 104** a

9.25 x 105 ± 1.30 x 105 a

0.48

0.17

0.50 a

1.38

0.73

AF2

1.83 x 105 a

1.54 x 106 a

0.99

0.00

0.92 a

1.46

0.68

* Media de tres repeticiones. ** Los promedios (± error estándar) dentro de cada columna sin superíndice común difieren significativamente a P <0.05. Se realizó un análisis de varianza (ANOVA). 1

Agua Residual Cruda Estéril.

2

Agua con Fertilizante.

Las tasas de crecimiento (tabla 4.4) de la especie fueron similares a las presentadas por Martínez [67], el cual reporta tasas de crecimiento diarias de entre 0.45 y 1.05 para Scenedesmus obliquus cultivada en agua residual cruda. Mientras que Ruíz [45] obtuvo una mayor concentración celular para Scenedesmus obliquus, con 5.8 x 106 cel/ml en agua residual urbana, pero una menor tasa de crecimiento diario, con 0.15.

ARC-E no logra una buena correlación con el modelo asignado, esto puede ser debido a que los diez días no son suficientes para lograr terminar la fase logarítmica del tratamiento y empezar con la estacionaria, momentos necesarios para lograr el ajuste.

4.2.3 Tercer escalado de 18 L

Las duplicaciones acumuladas (fig. 4.5) para ambos medios muestran el inicio de la etapa exponencial a partir del día dos, al igual que en los escalamientos anteriores. La tasa de crecimiento diaria fue mayor para AF que para ARC (tabla 4.5), por lo que la 65

fase exponencial termina para AF el día 28, mientras que para ARC-E el día 34, aunque las concentraciones celulares finales no tienen diferencias significativas, por lo que la diferencia de tiempos podría deberse a los obstáculos que encuentra el alga para lograr un crecimiento adecuado en el agua residual, provocando un retraso en su crecimiento.

Las concentraciones celulares logradas a finales del tercer escalado, no son significativamente diferentes de las concentraciones de los tratamientos en el escalamiento anterior, lo que indica que el aumento en el flujo del aire adicionado al reactor no influyó en este factor.

Figura 4.5. Duplicaciones acumuladas de Verrucodesmus verrucosus en los diferentes medios de cultivo durante el tercer escalado.

Los puntos iniciales y finales de la cinética de crecimiento (fig. 4.6) en los dos medios no tuvieron diferencia significativa, lo que indica que a pesar de que AF crece de manera más acelerada y la concentración es ligeramente superior, ARC-E podría ser usada en la producción de biomasa algal ya que genera altas concentraciones de la misma en un tiempo no muy diferente al del medio control, con una diferencia de 6 días antes de llegar a la fase estacionaria. 66

Figura 4.6. Cinéticas de crecimiento del tercer escalado en las diferentes calidades de agua

Tabla 4.5. Concentraciones celulares (cel/ml) iniciales y finales de las etapas exponenciales en cada medio. Parámetros poblacionales: (µmáx/día); tiempo de duplicación, tg (días) y divisiones por día, k. Tercer escalado de 18 L.

Medio de Cultivo

Concentración celular inicial (cel/ml)

Concentración celular final (cel/ml)

R2

Valor de P

Tasa de crecimiento específico, µmáx/día

Tiempo de duplicación, tg (días)

Divisiones por día, k

ARCE1

1.18 x 105* ± 7.19 x 104** a

1.28 x 106 ± 2.36 x 105 a

0.99

0.00

0.23 a

2.97

0.34

AF2

1.33 x 105 a

1.57 x 106 a

0.99

0.00

0.41 a

1.71

0.58

* Media de tres repeticiones. ** Los promedios (± error estándar) dentro de cada columna sin superíndice común difieren significativamente a P <0.05. Se realizó un análisis de varianza (ANOVA). 1

Agua Residual Cruda Estéril.

2

Agua con Fertilizante.

67

Xiong et al [68], realizó estudios con Scenedesmus obliquus expuesta a 0, 1, 20, 50 y 100 mg/L de Levofloxacingo para evaluar su ecotoxicidad en agua residual salina sintética esterilizada y obtiene tasas de crecimiento específico diario de entre 0.64 a 0.22, las cuales son cercanas a las obtenidas en este estudio. De la misma forma, Song et al [69], hizo pruebas con agua residual artificial con el género Scenedesmus, con diferentes concentraciones de fósforo y amonio, para conocer el efecto de estos nutrientes en las algas, obteniendo tasas de crecimiento de entre 0.28 a 0.42, mientras que en el medio control de 0.27. Labbé et al [70], también realizó un estudio, en donde utilizó cultivos mezclados de Scenedesmus en agua residual de una granja lechera y obtuvo un crecimiento celular máximo de 5.6 x 10 7 cel/ml, así como una tasa de crecimiento máxima por día de entre 0.156 ± 0.002 y 0.239 ± 0.026. Wu et al [71], realiza

una

investigación

con

Scenedesmus

obliquus,

usando

diferentes

concentraciones de nitratos (de 0.3, 0.6, 0.9, 1.5 g/L) en medio BG11, obteniendo una tasa máxima de crecimiento diario de 0.54, con una concentración de 0.9 g/L de nitratos. Y, finalmente, en un estudio realizado por Arenas [48], con Verrucodesmus verrucosus en agua residual cruda, presenta crecimientos máximos para la fase estacionaria de 3 x 106 cel/ml, con una tasa de crecimiento de 0.08, mientras que el medio control con Bayfoland forte, obtuvo un crecimiento de 9 x 106 cel/ml y una tasa de crecimiento de 0.23. Se puede observar que los valores en general, tienen ligeras variaciones, sin embargo, no se alejan mucho del rango de 0.23 a 0.41 obtenido para Verrucodesmus verrucosus en este estudio (tabla 4.5), sin embargo, los valores cambian dependiendo del tipo y estado del alga, así como las condiciones a las que se sometan los tratamientos.

4.3 Rendimientos de producción de biomasa Con el cultivo de algas con altas concentraciones de nutrientes, se esperan altas productividades de biomasa, para de esta forma obtener altas concentraciones de lípidos, ya que bajo este enfoque la cantidad de lípidos es menor lo contrario a lo que ocurre mediante otros procesos, como el estrés por nutrientes, lo que sucede comúnmente es una alta acumulación de estos, mientras que con altas cantidades de 68

biomasa la acumulación es poca. Con el fin de conocer el rendimiento de biomasa algal, se realizó una relación entre el peso del alga y volumen del medio, obteniéndose para AF, un rendimiento, de 600.00 mg/L de biomasa, mientras que para ARC-E, 383.33* ± 23.57 mg/L (tabla 4.6). Tabla 4.6. Rendimiento máximo de la especie Verrucodesmus verrucosus (mg/L) correspondiente al tercer escalamiento en fotobiorreactor de 20 L de capacidad. Medios de Cantidad de muestra Cantidad de algas Rendimiento máx cultivo (ml) (g) (mg/L) AF1 3 0.0018 600.00 a 0.00115± 383.33* ± ARC-E2 3 7.07x10-5 23.57** a * Media de dos repeticiones. ** Los promedios (± error estándar) dentro de cada columna sin superíndice común difieren significativamente a P <0.05. Se realizó un análisis de varianza (ANOVA). 1

Agua Residual Cruda Estéril.

2

Agua con Fertilizante.

Varios autores proporcionan diversos rendimientos máximos de biomasa en aguas residuales. Sacristán et al [72], usa agua residual cruda y tratada como medio de cultivo y reporta para Scenedesmus acutus un rendimiento máximo de biomasa de 1179 mg/L, 770 mg/L y 910 mg/L para el agua cruda, tratada y el medio control respectivamente, siendo estos superiores a los encontrados en este estudio, mientras que en otro estudio la productividad máxima de la biomasa para Scenedesmus acutus fue menor a la de esta investigación, con 69.8 mg/L en el agua residual cruda [17]. Song et al [69], utilizó Scenedesmus acutus en agua residual artificial con diferentes concentraciones de nitrógeno y fósforo, alcanzando rendimientos máximos de biomasa en los medio de menor a mayor concentración de nutrientes, con, 660 ± 20 mg/L, 800 ± 120 mg/L y 960 ± 20 mg/L. En otro estudio, Mcginn [63] usó agua residual proveniente del efluente secundario con una productividad promedio máxima de biomasa de alrededor de 130 mg/L. Finalmente, Arenas [48], con Verrucodesmus verrucosus en agua residual obtuvo rendimientos de biomasa de 349 mg/L, mientras que para el medio control el valor fue de 771 mg/L, los cuales son aproximados a los resultados encontrados en este estudio. Se pueden observar diversas cantidades en los rendimientos en agua residual, debido a los diversos factores que pueden afectar el crecimiento del alga.

69

4.4 Remoción de nutrientes y coliformes fecales La remoción de amonio, fosfatos y nitratos en el agua residual es de gran importancia debido a los procesos de eutrofización que pueden llegar a generarse en ambientes acuáticos cuando las descargas de agua aún contienen cantidades considerables de estos nutrientes, pudiendo impactar de manera negativa a la fauna del lugar, por lo que es de suma importancia lograr erradicar estos nutrientes del agua [73]. Los coliformes fecales, por su parte, son indicadores de contaminación fecal, lo que podría traer consecuencias en la salud de las personas.

4.4.1 Caracterización Inicial Tabla 4.7. Caracterización de los diferentes medios de cultivo. Amonio (𝑁𝐻4+ ), Fosfatos (𝑃𝑂43− ) y Coliformes Fecales (NMP/ml).

PARÁMETROS

ARC1

ART2

ARC-E3

ART-E4

AF5

𝐍𝐇𝟒+ (ppm)

57.49 ± 1.26 a

0.10 ± 0.01 b

51.00 ± 7.96 ac

0.07 ± 0.02 b

40.80 c

𝐏𝐎𝟑− 𝟒 (ppm)

5.10 ± 0.31 a

1.21 ± 0.03 b

1.36 ± 0.11 b

0.93 ± 0.01 c

27.28 d

Coliformes Fecales (NMP/ml)

16.66 ± 2.88 a

3.66 ± 0.57 b

0

0

0

* Media de tres repeticiones. ** Los promedios (± error estándar) dentro de cada columna sin superíndice común difieren significativamente a P <0.05. Se realizó un análisis de varianza (ANOVA). 1

Agua Residual Cruda.

2

Agua Residual Tratada.

3

Agua Residual Cruda Estéril.

4

Agua Residual Tratada Estéril.

5

Agua con Fertilizante.

En la tabla 4.7 se puede observar altas concentraciones de amonio para ARC y ARCE, así como para el medio control, aunque este fue ligeramente menor al de los dos anteriores, ART y ART-E tuvieron las menores concentraciones. Para los fosfatos, la máxima concentración se obtuvo para AF, seguido de ARC y ARC-E, y finalmente, ART y ART-E. Se puede observar que después del proceso de esterilizado hay una ligera disminución de las concentraciones tanto de amonio, como de fosfatos, 70

habiendo diferencia significativa entre los fosfatos de los mismos medios, estériles y sin esterilizar, mientras que la reducción de amonio en los medios no provocó diferencias significativas.

4.4.2 Primer escalado de 250 ml

Las concentraciones en el tiempo cero, de amonio (tabla 4.8) no muestran diferencias significativas entre las muestras de mismos medios estériles y no estériles, mientras que AF no tiene diferencia significativa con ARC y ARC-E. La máxima concentración de fosfatos (tabla 4.9) se encuentra en AF, mientras que los demás tratamientos tuvieron menores cantidades del compuesto que van de entre 8.77 ± 0.22 a 4.04 ± 0.32. Se observó diferencia significativa entre ARC y ARC-E, siendo estos los mismos tipos de medio, mientras que ART, ART-E y ARC-E, no presentan diferencia significativa entre ellos, lo que indica que el proceso de esterilización afectó en las concentraciones de este compuesto en el agua residual cruda, aunque a pesar de esta disminución de fosfatos en el medio estéril, las algas presentaron un buen crecimiento en ARC-E, por lo que el proceso de esterilización no influyó de manera negativa en el tratamiento. Todos los medios aumentaron su concentración después de la inoculación del alga, ya que el medio que la contenía era agua destilada con bayfoland forte, el cual tiene altas concentraciones de estos nutrientes, según los resultados mostrados en la tabla 4.7, durante la caracterización.

Los coliformes fecales (tabla 4.8) tuvieron una gran disminución en su concentración en comparación con la caracterización inicial, posiblemente debido al proceso de filtrado, ya que se elimina gran parte de la materia orgánica, y estos se alojan en los sedimentos [74]. La mayor remoción se obtuvo para ARC, con un 42% y la menor para ART, con un 18.18%. Otros estudios reportan porcentajes de remoción superiores [45] [58], lo que puede deberse al tiempo de cultivo y a las bajas concentraciones de estos microorganismos en el medio usado para los tratamientos, debido al proceso de filtrado realizado.

71

Tabla 4.8. Concentración inicial de Amonio (𝑁𝐻4+ ), Fosfatos (𝑃𝑂43− ) y Coliformes Fecales (NMP/ml) para los diferentes medios de cultivo durante el primer escalamiento. PARÁMETROS

ARC1

ART2

ARC-E3

ART-E4

AF5

𝐍𝐇𝟒+ (ppm)

59.27* ± 3.71** a

7.50 ± 1.32 b

55.04 ± 3.88 a

7.15 ± 0.59 b

44.48 a

𝐏𝐎𝟑− 𝟒 (ppm)

8.77 ± 0.22 a

4.64 ± 0.12 b

5.12 ± 1.08 b

4.04 ± 0.32 b

30.90 d

Coliformes Fecales (NMP/ml)

16.66 ± 2.88 a

3.66 ± 0.57 b

0

0

0

* Media de tres repeticiones. ** Los promedios (± error estándar) dentro de cada columna sin superíndice común difieren significativamente a P <0.05. Se realizó un análisis de varianza (ANOVA). 1

Agua Residual Cruda.

2

Agua Residual Tratada.

3

Agua Residual Cruda Estéril.

4

Agua Residual Tratada Estéril.

5

Agua con Fertilizante.

La máxima remoción de amonio (tabla 4.9) se obtuvo para ART-E con 83.36%, seguido de ART con 83.07%, ARC-E tuvo una menor remoción con 40.19%, mientras que ARC logró 24.99%, y finalmente, AF tuvo 0.52%. Las mayores remociones para ART-E y ART podrían deberse a la baja concentración inicial de amonio en estos medios, por lo que su consumo fue bastante rápido. ARC-E y ARC tuvieron bajas remociones de nitrógeno, sin embargo, podría deberse al tiempo que se le permitió crecer en el agua residual, ya que la cinética no alcanzó a llegar a la fase estacionaria. AF por otro lado, tuvo una remoción de amonio prácticamente nula, sin embargo, el medio comercial bayfoland, cuenta con otros nutrientes, como nitritos y nitratos, que también pudieron ser usados por el alga.

72

Tabla 4.9. Concentración final de Amonio (𝑁𝐻4+ ), Fosfatos (𝑃𝑂43− ) y Coliformes Fecales (NMP/ml) para los diferentes medios de cultivo durante el primer escalamiento. Parámetro

ARC1

ART2

ARC-E3

ART-E4

AF5

𝐍𝐇𝟒+ (ppm)

44.46* ± 0.42** a

1.27 ± 0.06 b

32.92 ± 1.70 c

1.19 ± 0.11 b

44.25 a

𝐏𝐎𝟑− 𝟒 (ppm)

1.63 ± 0.08 a

0.27 ± 0.02 b

1.78 ± 0.17 a

0.83 ± 0.20 c

23.99 d

Coliformes Fecales (NMP/ml)

9.66 ± 1.15 a

3.00 ± 0.00 b

0

0

0

* Media de tres repeticiones. ** Los promedios (± error estándar) dentro de cada columna sin superíndice común difieren significativamente a P <0.05. Se realizó un análisis de varianza (ANOVA). 1

Agua Residual Cruda.

2

Agua Residual Tratada.

3

Agua Residual Cruda Estéril.

4

Agua Residual Tratada Estéril.

5

Agua con Fertilizante.

En el caso de los fosfatos (tabla 4.9), las máximas remociones se lograron para ART con 94.18% y ARC con 81.41%. ART-E obtuvo 79.46%, mientras que ARC-E 65.23%, finalmente, AF obtuvo la menor remoción con 22.36%. En general los fosfatos en el agua tuvieron buenas remociones, con excepción de medio control, debido a las altas concentraciones de este compuesto en el medio, a diferencia de los demás que tenían concentraciones menores.

4.4.3 Segundo escalamiento de 1 L En el tiempo cero del segundo escalado (tabla 4.10) se puede observar altas concentraciones de amonio para ambos medio y de fosfatos para el medio control, lo que podría ser debido a las altas concentraciones que aún contenían los medios en el primer escalado, ya que este se agregó en el momento de la inoculación.

73

Tabla 4.10. Concentración inicial de Amonio (𝑁𝐻4+ ) y Fosfatos (𝑃𝑂43− ) para los medios de cultivo durante el segundo escalamiento. Parámetro

ARC-E1

AF2

𝐍𝐇𝟒+ (ppm)

56.09* ± 0.53** a

99.27 b

𝐏𝐎𝟑− 𝟒 (ppm)

5.28 ± 0.22 a

79.06 b

* Media de dos repeticiones. ** Los promedios (± error estándar) dentro de cada columna sin superíndice común difieren significativamente a P <0.05. Se realizó un análisis de varianza (ANOVA). 1

Agua Residual Cruda Estéril.

2

Agua con Fertilizante.

Los porcentajes de remoción de amonio (tabla 4.11), fueron para ARC-E de 66.73%, mientras que para AF de 58.60%. Los fosfatos alcanzaron remociones de 78.22% para ARC-E y de 64.44% para AF. Se puede observar que las remociones son casi el doble de las logradas durante el primer escalamiento en el mismo tiempo, lo que podría deberse al sistema de aireación implementado durante esta etapa, ya que el CO 2 ayuda a regular el pH en el medio, el cual tiene efectos sobre la toxicidad del amoniaco y en la disponibilidad del fósforo [75]. Tabla 4.11. Concentración final de Amonio (𝑁𝐻4+ ) y Fosfatos (𝑃𝑂43− ) para los medios de cultivo durante el segundo escalamiento. Parámetro

ARC-E1

AF2

𝐍𝐇𝟒+ (ppm)

18.66* ± 4.29** a

41.10 a

𝐏𝐎𝟑− 𝟒 (ppm)

1.15 ± 0.22 a

28.11 b

* Media de dos repeticiones. ** Los promedios (± error estándar) dentro de cada columna sin superíndice común difieren significativamente a P <0.05. Se realizó un análisis de varianza (ANOVA). 1

Agua Residual Cruda Estéril.

2

Agua con Fertilizante.

4.4.4 Tercer escalamiento de 18 L

Las concentraciones iniciales para el tercer escalamiento (figura 4.7) fueron mucho menores, puesto que la dilución de inóculo en el medio fue mucho mayor, además de

74

que hubo mayores remociones de nutrientes en el escalado anterior. Para AF se puede observar una disminución inicial hasta el día ocho, a partir del cual, se observa un aumento en la cantidad de amonio hasta el día 28, en donde vuelve a haber una disminución. En ARC-E la disminución es más constante con excepción de un pequeño pico el día 16.

a

Figura 4.7. Remoción de amonio 𝑁𝐻4+ de los medio de cultivo durante el tercer escalado. Superíndice común difieren significativamente a P <0.05. Se realizó un análisis de varianza (ANOVA).

Los porcentajes de remoción de amonio para AF y ARC-E fueron de 80.35% y de 78.91% respectivamente, observándose una mayor remoción para AF, aunque sin diferencia significativa (P<0.05), lo que indica que el alga es capaz de consumir de manera adecuada el amonio en el agua residual, a pesar de que esta tenga altas cargas de compuestos inhibidores. Otros estudios en agua residuales muestran resultados similares. En una investigación realizada con Scendesmus sp. cultivada agua residual artificial [76], se alcanzó una remoción máxima de amonio de 79.4%, mientras que en otra realizada con Scendesmus obliquus a diferentes temperaturas, con y sin agitación [67], se alcanzó un porcentaje máximo de 100% para el tratamiento con agitación y temperatura de 25°C y un mínimo de 79% para el cultivo sin agitación 75

a 35°C, en ambas investigaciones se pueden observar porcentajes de remoción menores a los reportados por esta investigación. Otros estudios reportan mayores porcentajes, como el de Lekshmi et al [77], en donde utilizan la especie Scenedesmus abundans, cultivada en agua residual colectada de un tanque de aireación de una planta de tratamiento de aguas residuales y reportan un porcentaje de remoción máximo de 98.68%. Arenas [48], en un estudio con agua residual cruda, obtuvo una remoción máxima de amonio en agua residual cruda, con V. verrucosus de 99% y en el medio control, de 64%.

Para el fosfato en AF (figura 4.8), se observó un incremento el día 28, a partir del cual las concentraciones comenzaron a bajar, mientras que en ARC-E su concentración disminuyó casi en su totalidad, a partir del día 4, lo que pudo deberse no solo al consumo del alga, puesto que se trataba de una etapa temprana de crecimiento, sino también a la adsorción del compuesto en las celulas y en las paredes del reactor [67].

ab

Figura 4.8. Remoción de fosfatos (𝑃𝑂43− ) de los medio de cultivo durante el tercer escalado. Superíndice común difieren significativamente a P <0.05. Se realizó un análisis de varianza (ANOVA).

Los porcentajes de remoción de ARC-E y AF, fueron de 83.44% y 32.71%, respectivamente. AF presentó menores porcentajes, debido posiblemente a que las 76

concentraciones iniciales fueron mucho mayores en comparación con ARC-E, por lo que no fue posible consumir la mayoría del fosfato presente. En tiempos diferentes, a lo largo de los tratamientos, hay aparentes aumentos en la concentración de fosfatos, fenómeno probablemente relacionado con la ruptura de las células en el medio, derramando su contenido de fosforo [67] [78].

Diversos estudios en agua residual muestran resultados similares, Andrade et al [78], realizan un estudio con el alga Scenedesmus sp. utilizando agua residual de una pescadería como medio de cultivo y obtienen una remoción de fosfatos de 77.54% en dicho medio, de la misma forma, Sacristán et al [72], utilizó agua residual cruda, tratada y un medio enriquecido para el crecimiento de la microalga Scenedesmus acutus y obtuvo remociones de fosfatos de hasta el 65%, así como en otra investigación en donde usaron agua residual artificial [76], en donde alcanzaron remociones de hasta el 59.1%; Arenas [48], por su parte, con V. verrucosus, obtuvo remociones máximas de 99% en agua residual y de 64% para el medio control, observándose remociones inferiores en la mayoría de los casos en comparación con las logradas en esta investigación, con excepción del estudio con V. verrucosus en el cual las remociones fueron bastante altas. Cabe mencionar que las variaciones en porcentajes de remoción tanto de amonio como de fosfatos, dependen de la especie algal usada, así como de las características del medio y las condiciones ambientales. Tabla 4.12. Concentración inicial y final de (𝑁𝑂3− ) y porcentaje de remoción de los medios de cultivo durante el tercer escalamiento. Concentración inicial de

Concentración final de

nitratos (𝑵𝑶𝟑− ) en mg/L

nitratos (𝑵𝑶𝟑− ) en mg/L

AF2

85.74 a

13.83 a

83.86

ARC-E1

14.09 ± 0.19 b

0.17 ± 0.01b

98.73

Medios

Remoción (%)

* Media de dos repeticiones. ** Los promedios (± error estándar) dentro de cada columna sin superíndice común difieren significativamente a P <0.05. Se realizó un análisis de varianza (ANOVA). 1

Agua Residual Cruda Estéril.

2

Agua con Fertilizante.

77

Las remociones de nitratos fueron bastante altas, con un 98.73% para el agua residual (ARC-E) y un 83.86% para el medio control (AF), lo que indica problemas de disponibilidad del amonio, ya que se ha demostrado que las algas tienen una mayor afinidad por este compuesto [79], sin embargo, este es bastante inestable en el medio, de acuerdo a la siguiente ecuación [67]: Ecuación 4.1 𝑁𝐻4+

+ 𝑂𝐻 − ⇋ 𝑁𝐻3 + 𝐻2 𝑂

Lo que ocasiona disminuciones y aumentos del mismo, diversos estudios evalúan la remoción de nitratos del alga en medios enriquecidos, tal es el caso de Arias et al [60], los cuales obtienen una remoción promedio durante el período experimental del 58% y Sacristán et al [72], el cual usó tres medios de cultivo, agua residual cruda, con un 71.1% de remoción de nitratos, agua residual tratada, con un 42.9% y el medio enriquecido usado como control, con 30.7%, ambos estudios por debajo de la cantidad obtenida en esta investigación.

4.5 Comportamiento del pH El pH es un factor de gran importancia en los tratamientos con algas y debe ser regulado cuidadosamente, ya que tiene influencia directa sobre la disponibilidad de los nutrientes y el carbono inorgánico para el alga [75]. La adición de CO2, puede hacer que este disminuya, gracias a la formación de iones de HCO− 3 en el medio, mientras que la actividad fotosintética, tiende a aumentar el pH en el agua, debido al consumo de este [79]: Ecuación 4.2 𝐻𝐶𝑂3− ⇆ 𝐶𝑂2 + 𝑂𝐻 −

Por otro lado, la utilización metabólica de los iones NH4+ disminuye el pH, de acuerdo con la siguiente ecuación [80]:

78

Ecuación 4.3 NH4+

⇋ NH3 + H + ⇋ org − N + H +

4.5.1 Primer escalamiento de 250 ml

a

a

b

c

Figura 4.9. Comportamiento del pH durante el primer escalamiento de 250 ml durante 10 días. Superíndice común difieren significativamente a P <0.05. Se realizó un análisis de varianza (ANOVA).

En la figura 4.9 se puede observar que ART tuvo un aumento constante del pH, hasta alcanzar un valor máximo de 9, este tratamiento tuvo altas concentraciones de Verrucodesmus verrucosus en el agua, por lo que el pH elevado puede atribuirse a la actividad del alga en el medio. ART-E y ARC-E se mantuvieron más o menos constantes el día 0 y el día 4, con un incremento a partir de ese momento hasta llegar a un pH aproximado al 9, lo que puede ser debido a la actividad fotosintética en el agua, la cual fue poca en los primeros días y comenzó a elevarse al mismo tiempo que el crecimiento de las algas era más notorio. ARC, aumentó su pH de manera constante hasta alcanzar las 8.9 unidades, sin embargo, este tratamiento tuvo el menor 79

crecimiento algal, por lo que se puede concluir que en el medio seguramente existían otros microorganismos fotosintéticos que compitieron con la especie utilizada. Finalmente AF tuvo un aumento poco acelerado del pH hasta el día 8, a partir del cual éste incrementó, lo que se le atribuye de la misma forma, a la poca actividad del alga los primeros días y un aumento en la fase final. Cabe mencionar que el pH se mantuvo dentro del rango indicado para el crecimiento de las algas, lo que indica que las agitaciones manuales realizadas diariamente para la adición del CO 2 en esta etapa fueron suficientes para lograr un correcto desarrollo de la especie en los medios. 4.5.2 Segundo escalamiento de 1 L

a

a

b

Figura 4.10. Comportamiento del pH durante el segundo escalamiento de 1 L durante 10 días. Superíndice común difieren significativamente a P <0.05. Se realizó un análisis de varianza (ANOVA).

La figura 4.10 presenta el comportamiento del pH para el segundo escalado, en donde se puede observar que es similar para ambos tratamientos. En el día 2 ocurre una disminución en el pH, posiblemente debido a la mínima actividad fotosintética presentada en el medio, puesto que la concentración de las algas era poca en ese momento, además de que la adición de CO2 a los tratamientos reduce estas unidades, 80

al formar ácido carbónico. El día 4 el pH aumentó, puesto que hubo un mayor crecimiento del alga, disminuyendo los días 6 y 8, posiblemente debido al consumo de amonio del medio, y aumentando finalmente el día diez. Al finalizar el tratamiento estos alcanzaron valores de 9.1 para ARC-E, y de 8.95 para AF. Se puede observar que el pH estuvo fuera del rango de 7-9, para el medio control con 6.8 unidades el día 2, mientras que ARC-E con 9.1 unidades el día 10, sin embargo, esto no influyó en el crecimiento de las algas, pues se pudo observar una mayor concentración celular en comparación con el primer escalado, ya que la adición de CO2 ayuda en el crecimiento autótrofo del alga.

4.5.3 Tercer escalamiento de 1 L

a

a

b

Figura 4.11. Comportamiento del pH durante el tercer escalamiento de 18 L durante 44 días. Superíndice común difieren significativamente a P <0.05. Se realizó un análisis de varianza (ANOVA).

En la figura 4.11 se observa una disminución del pH los primeros ocho días de tratamiento, posiblemente, al igual que en el escalamiento dos, debido al sistema de bombeo de CO2 atmosférico el cual aumenta la acidez del medio formando ácido carbónico y a la baja concentración celular de las algas, lo que provoca una baja 81

actividad fotosintética; en los siguientes días el pH se eleva y se observa un pico de disminución entre el día 20 y 32 para AF y 24 y 32 para ARC-E, los cual podría ser debido al consumo de amonio del medio. El pH durante el tercer escalamiento se mantuvo dentro del rango de 7-9, lo cual indica que el sistema de bombeo en este escalado fue adecuado para equilibrar el medio básico provocado por la actividad fotosintética del alga, con la acidez generada por el dióxido de carbono.

Los mismos comportamientos se presentan en diversos estudios con microalgas, Martínez et al [67], utiliza el alga Scenedesmus obliquus, en un experimento con diferentes temperaturas, con y sin agitación, y se observa que sin agitación el pH alcanza las 11 unidades, lo que se le atribuyó al consumo de CO2 del alga, además de que se demostró la gran influencia del pH en la remoción del amonio. Azov y Shelef [75], por su parte, demostraron los efectos del pH sobre los procesos de las microalgas y viceversa, en estanques de oxidación, en donde observaron que elevados valores de pH debido a la actividad fotosintética, pueden afectar el rendimiento de los estanques, mientras que las altas concentraciones de amoniaco en aguas residuales domésticas con valores elevados de pH pueden inhibir la fotosíntesis de las algas.

4.6 Evaluación del rendimiento de lípidos El porcentaje de lípidos extraídos de ambos medios se presentan en la tabla 4.12, para dicho análisis se utilizaron 2 g de biomasa seca, obteniéndose ligeramente una mayor cantidad para el medio control, aunque en el momento de realizar el análisis estadístico, dichos rendimientos no mostraron diferencia significativa. Al evaluar el rendimiento de lípidos con la biomasa máxima generada, tenemos una productividad máxima de 23.7 mg/L para AF y de 9.31 mg/L para ARC-E, sin diferencia significativa para ambas, lo que indica que la productividad para ARC-E fue adecuada.

82

Tabla 4.13. Rendimiento máximo de lípidos en % y en mg/L, en los tratamientos con ARC-E y AF. Rendimiento de lípidos (mg/L) AF2 2.00 0.08 3.95 a 23.70 a ARC-E1 2.00 0.05 2.43* ± 0.16** a 9.31 b * Media de dos repeticiones. ** Los promedios (± error estándar) dentro de cada columna sin superíndice Medio de Cultivo

Algas secas (g)

Lípidos (g)

Rendimiento de lípidos (%)

común difieren significativamente a P <0.05. Se realizó un análisis de varianza (ANOVA). 1

Agua Residual Cruda Estéril.

2

Agua con Fertilizante.

Estudios reportan cantidades variables de lípidos. Kim et al [81], presenta un rendimiento máximo de ácidos grasos de 0.9% para Scenedesmus sp. cultivada en agua residual agrícola (orina fermentada de cerdo), con una productividad de lípidos de 1.77 mg/L, la cual está por debajo de la obtenida en este estudio. Gupta et al [82], usó agua residual floculada como medio de cultivo para Scenedesmus obliquus, y obtuvo un porcentaje de lípidos de entre 8.6% y 16.0%, cantidades mayores a las arrojadas por V. verrucosus, así como concentraciones máximas de biomasa de 68.77 mg/L, obteniendo un rendimiento de entre 5.91 y 11.00 mg/L, los cuales se acercan a la producción de lípidos en ARC-E. Por otro lado Arias et al [83], obtuvieron mayores concentraciones y productividades de lípidos en comparación con los resultados de este estudio, cultivando la microalga Scenedesmus incrassatulus y obtuvieron un porcentaje de lípidos extraídos de 19.5±1.5% al finalizar el tratamiento, así como una productividad de biomasa de 1,800 mg/L, obteniendo así, una productividad de lípidos al finalizar el cultivo de 351 mg/L. En estudios realizados mediante estrés por nutrientes, se esperan mayores concentraciones de lípidos pero menores de biomasa [26], tal es el caso de Cobos et al [43], en donde reportaron para un cultivo sin nitrógeno, concentraciones de lípidos para Scenedesmus quadricauda, de alrededor de 14% y productividades de biomasa de aproximadamente 60 mg/L (datos observados en gráficas), obteniendo así una productividad de lípidos aproximada de 8.4 mg/L de lípidos, mientras que para Scenedesmus sp. se obtuvo un rendimiento de lípidos de 24.33%, con una productividad de biomasa aproximada de 175 mg/L (dato observado en gráfica), obteniendo así un rendimiento de 42.57 mg/L de lípidos, por otro lado, en un estudio con V. verrucosus en agua residual cruda [48], se obtuvieron rendimientos de lípidos mayores que en este estudio, con porcentajes de 18.34% y 83

para el medio control de 8.14%. Se puede observar que las productividades de lípidos pueden variar dependiendo de la especie y las condiciones a las que se expongan, sin embargo no existe una gran diferencia entre los cultivos realizados bajo estrés por nutrientes y aquellos con altas concentraciones, por lo que el crecimiento de microalgas en medios con altas concentraciones de nutrientes podría ser viable para la producción de lípidos. Cabe mencionar que en el proceso, al ser realizado únicamente con hexano, solo fue posible extraer los lípidos no polares, mientras que los polares, que generalmente se encuentran dentro de la estructura de las membranas celulares, no fueron extraídos, por lo que posiblemente los porcentajes de lípidos sean mayores a los presentados.

Figura 4.12. Gráfica comparativa de la concentración inicial de amonio (𝑁𝐻4+ ) y la concentración final de lípidos.

Se puede observar en la figura 4.12, que a mayores concentraciones de nitrógeno en el agua residual, menor es la cantidad de lípidos acumulados en las células, proceso muy común en las microalgas, puesto que tienden a acumular estas grasas en mayor 84

concentración cuando el nitrógeno (principalmente), se encuentra en menores cantidades. Este principio se usa para inducir altas concentraciones de lípidos.

85

Capítulo 5 Conclusiones El agua residual cruda, tuvo altas concentraciones de amonio y fosfatos, mientras que el agua residual tratada presentó altas concentraciones de nitratos. Los tres nutrientes esenciales para el alga. Sin embargo, el agua residual cruda, presentó altas concentraciones de microorganismos que compiten con el alga y retrasan su crecimiento, por lo que se observó un mayor crecimiento en el agua residual estéril, ARC-E, con una concentración celular máxima de 5.67 x 105 ± 1.35 x 105 cel/ml, por otro lado en el agua residual tratada se observó un comportamiento contrario, el medio sin esterilizar, ART, tuvo un mejor crecimiento que el agua tratada estéril, ART-E, con 1.26 x 106 ± 1.08 x 105 cel/ml, lo que se le atribuyó posiblemente a algún tipo de relación simbiótica del alga con cierta bacteria. Los siguientes escalados se realizaron con ARC-E y AF, en donde se observó un crecimiento máximo sin diferencia significativa, con 1.57 x 106 cel/ ml para AF y 1.28 x 106 ± 2.36 x 105 cel/ml para ARC-E lo que indica que es posible la producción de microalgas en agua residual, obteniendo resultados favorecedores.

La remoción final de nutrientes de los medios fue bastante buena si se compara con otras investigaciones, habiendo variaciones en los porcentajes, debido a diversos factores que influyen en las algas. El medio control tuvo una mayor remoción de amonio en el agua residual, con un 80.35%, mientras que ARC-E obtuvo una remoción de 78.91%, no observándose diferencia significativa entre ellos. ARC-E, por otro lado, consumió la mayor cantidad de fosfatos, con un 83.44%, aunque es posible que parte de estos hayan sido adsorbidos en las células o en las paredes del reactor. Verrucodesmus verrucosus fue capaz de consumir amonio y fosfatos del agua residual, considerándose así, una especie con una buena capacidad de adaptación y tolerancia a ambientes adversos o poco favorables.

El desarrollo del alga, así como las condiciones del medio, tuvieron gran influencia sobre el pH, el cual tuvo diversas variaciones a lo largo del proceso, observándose generalmente disminuciones a principio de los tratamientos con bombeo de aire, lo que 86

se le atribuyó a la adición de CO2, acidificando el medio, además de observarse pequeños picos de disminución de pH en etapas avanzadas del desarrollo del alga, posiblemente debido a la metabolización del amonio del medio.

La concentración de lípidos en el alga al finalizar los tratamientos no fue muy alta, aunque hay estudios en donde se observan menores rendimientos. Es posible que mediante el uso de una mezcla de solventes polares y no polares se logre extraer mayor cantidad de lípidos que solo con el hexano, el cual es un solvente polar y no logra extraer lípidos compuestos que se encuentran en las membranas celulares de las algas. A pesar de que la cantidad de lípidos fue poca, la biomasa generada es suficiente para alcanzar rendimientos de 23.70% para AF y de 9.31% para ARC-E.

87

Capítulo 6 Recomendaciones Incluir dentro de la caracterización de agua residual, concentraciones de nitrógeno total, fosforo total, así como la concentración de materia orgánica e inorgánica, para conocer su comportamiento antes y después del tratamiento, además de nitritos, puesto que estos también son consumidos por el alga, y finalmente de metales, ya que estos últimos son removidos por el alga y en altas concentraciones pueden llegar a inhibir su crecimiento.

Realizar en investigaciones futuras escalamientos mayores con agua residual tratada para conocer su productividad de biomasa y de lípidos.

Medir nitratos antes y después de los escalados con agua residual tratada, ya que es el nutriente que se encuentra en mayores concentraciones en este medio.

Realizar un perfil de lípidos con el fin de conocer el tipo y concentración de lípidos presentes en el alga, en especial los triglicéridos, los cuales son los principales productores de biodiesel. Es necesario realizar más investigaciones con Verrucodesmus verrucosus, ya que la información acerca de esta alga y sus procesos es poca, por lo que se espera futuros desarrollos de proyectos.

88

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ANEXOS ANEXO 1 Tabla. Composición del fertilizante orgánico foliar Bayfolandd Forte (% en peso/peso)

Nitrógeno Total (N) Potasio (K2O) Boro (B) Cobre (Cu) Fierro (Fe) Molibdeno (Mo) Zinc (Zn) Clorhidrato de tiamina Fósforo (P2O5) Azufre (S) Calcio (Ca) Cobalto (Co) Manganeso (Mn) Magnesio (Mg) Ácido indol acético

11.470 6.000 0.036 0.040 0.050 0.005 0.080 0.004 8.000 0.230 0.025 0.002 0.036 0.025 0.003

ANEXO 2

Regresiones lineales para las cinéticas de crecimiento del primer escalamiento:

Regresiones lineales para las cinéticas de crecimiento del segundo escalamiento:

Regresiones lineales para las cinéticas de crecimiento del primer escalamiento:

ANEXO 3 Tabla. Índice de NMP y límite de confianza del 95% para varias combinaciones de resultados positivos para una serie de 3 tubos cada uno con 0,1, 0,01 y 0,001 g ó mL de muestra. Límite de confianza del 95% Combinación de tubos positivos

NMP/g ó ml Inferior

Superior

0-0-0

<3

-

-

0-0-1

3

<0.5

9

0-1-0

3

<0.5

13

1-0-0

4

<0.5

20

1-0-1

7

1

21

1-1-0

7

1

23

1-1-1

11

3

36

1-2-0

11

3

36

2-0-0

9

1

36

2-0-1

14

3

37

2-1-0

15

3

44

2-1-1

20

7

89

2-2-0

21

4

47

2-2-1

28

10

150

3-0-0

23

4

120

3-0-1

39

7

130

3-0-2

64

15

380

3-1-0

43

7

210

3-1-1

75

14

230

3-1-2

120

30

380

3-2-0

93

15

380

3-2-1

150

30

440

3-2-2

210

35

470

3-3-0

240

36

1300

3-3-1

460

71

2400

3-3-2

1100

150

4800

3-3-3

≥2400

-

-