Tesis Jorge Mendez Final .docx

EVALUACIÓN DE LA EXPOSICIÓN OCUPACIONAL A COMPUESTOS ORGÁNICOS VOLÁTILES (COVs) EN TRABAJADORES DE ESTACIONES DE SERVICIO DE GASOLINA DE LA CIUDAD DE MONTERÍA, CÓRDOBA

JORGE ARDENIS MÉNDEZ ÁLVAREZ

UNIVERSIDAD DE CÓRDOBA FACULTAD DE CIENCIAS BÁSICAS PROGRAMA DE QUÍMICA MONTERÍA 2018

EVALUACIÓN DE LA EXPOSICIÓN OCUPACIONAL A COMPUESTOS ORGÁNICOS VOLÁTILES (COVs) EN TRABAJADORES DE ESTACIONES DE SERVICIO DE GASOLINA DE LA CIUDAD DE MONTERÍA, CÓRDOBA

Trabajo de grado presentado como requisito parcial para optar el título de Químico

JORGE ARDENIS MÉNDEZ ÁLVAREZ

DIRECTOR SAUDITH MARÍA BURGOS NÚÑEZ MSc Ciencias Ambientales

CODIRECTOR JOEL DAVID ALEAN FLÓREZ Químico

UNIVERSIDAD DE CÓRDOBA FACULTAD DE CIENCIAS BÁSICAS PROGRAMA DE QUÍMICA MONTERÍA 2018

UNIVERSIDAD DE CÓRDOBA TRABAJO DE GRADO – Restricciones de uso DERECHOS DE PROPIEDAD INTELECTUAL – Prohibición de reproducción

Todo el material contenido en este documento está protegido por la constitución política de Colombia y las leyes sobre propiedad intelectual concerniente a derechos de autor existentes en Colombia.

El uso de imágenes (figuras, mapas, fotografías, entre otras), tablas y demás elementos contenidos en este documento, que sea objeto de protección de la propiedad intelectual será únicamente para usos educativos e informativos y deberá citar la fuente donde la obtuvo, mencionando al autor o los autores. Cualquier uso distinto como el lucro o beneficio, reproducción, edición o modificación, entre otros aspectos, incurrirá en violación a la ley y estará sujeto a las sanciones que se establezcan con el fin de proteger los derechos del titular de la propiedad intelectual.

La responsabilidad ética, legal y científica de las ideas, conceptos y resultados del proyecto, serán responsabilidades de los autores. Artículo 61, acuerdo N° 093 del 26 de noviembre de 2002 del consejo superior.

III

DEDICATORIA Dedicó este logro primeramente a Dios, por darme sabiduría, fuerza y fortaleza en los momentos de debilidad, por darme vida y salud para poder seguir adelante en contra de cada una de las adversidades que se me presentaron en el camino para poder llegar a cumplir esta meta en mi vida profesional. A la memoria de mi padre Jorge Eliecer Méndez Cogollo Q.E.P.D., quien me brindo todo su amor y apoyo incondicional en vida y me dejo todas sus enseñanzas para poder seguir mi camino aun después de su muerte. El me enseño el poder de la fe y todos sus valores para ser una persona de bien y a no rendirme, si no a perseverar para superarme. A mi madre Brunilda Isabel Álvarez Montiel por ser ese ser tan maravilloso siempre abierta para sus hijos, con ese corazón tan grande que me motivó a ser alguien de bien y fuerte, a mis hermanos, Jorge Arley, Jorge Isacc y Nelson David por su apoyo durante la realización de mi carrera. A la señora lila por ser ese ser que me ayudó a mantenerme en mis estudios, ya que me brindo las comodidades de sostenimiento y mantenimiento en montería, para así poder culminar mi carrera. A mi directora de tesis Saudith Maria Burgos Nuñez por su apoyo y comprensión que me brindó el impulso necesario en esta etapa de mi vida. Por último a cada uno de esos maravillosos seres humanos que hicieron parte de mi formación académica, a esos docentes por su maravillosa labor y a mis compañeros de clases que hicieron de mi estadía en la universidad un hogar más.

IV

AGRADECIMIENTOS

Agradezco de manera muy especial a mis directores MSc. Saudith María Burgos Núñez y Q. Joel David Alean Flórez, por su tiempo, apoyo y por todos los conocimientos aportados.

A la universidad de córdoba por darme la oportunidad de una formación profesional de calidad; al Ph. D José Luis Marrugo Negrete por abrirme las puertas del Laboratorio de Toxicología y Gestión Ambiental, permitiendo

usar sus instalaciones y herramientas para desarrollar mi

trabajo de grado.

Agradezco la colaboración de los integrantes del grupo de investigación de Aguas, Química Aplicada y Ambiental, especialmente a los profesores German enamorado e Iván Urango; a Daniela

A mis amigos y profesores del departamento de Química por ser parte de mi proceso de formación y por darme lo mejor de cada uno.

V

TABLA DE CONTENIDO Pág. 1.

INTRODUCCIÓN ....................................................................................................................................... 14

2.

MARCO TEÓRICO .................................................................................................................................... 17 2.1. 2.2.

Formación .................................................................................................................................... 20

2.2.2

Estabilidad. .................................................................................................................................. 20

2.2.3

Propiedades físico-químicas. ...................................................................................................... 21

2.2.4

Principales vías de exposición .................................................................................................... 21

2.2.5

Ruta metabólica de los HAPs ..................................................................................................... 23

2.2.6

Biomarcadores de exposición. .................................................................................................... 25

2.2.7

Entrada de los HAPs al medio ambiente. .................................................................................. 27

2.2.8

HAPs efectos sobre la salud. ....................................................................................................... 28

HIDROCARBUROS AROMÁTICOS. .............................................................................................. 29

2.3.1.

Benceno ........................................................................................................................................ 29

2.3.2.

Generalidades sobre tolueno ...................................................................................................... 32

2.3.3.

Generalidades sobre xileno......................................................................................................... 36

2.4.

4.

HIDROCARBUROS AROMÁTICOS POLICÍCLICOS ................................................................ 20

2.2.1

2.3.

3.

ANTECEDENTES HISTÓRICOS ................................................................................................ 17

TÉCNICA ANALÍTICA ..................................................................................................................... 40

2.4.1.

Cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas GC/MS .................................. 40

2.4.2.

Cromatografía liquida de alta eficacia ..................................................................................... 44

2.4.3.

Validación de la técnica analítica............................................................................................... 48

OBJETIVOS ................................................................................................................................................ 50 3.2.

GENERAL............................................................................................................................................ 50

3.3.

ESPECÍFICOS ..................................................................................................................................... 50

MATERIALES Y MÉTODOS ................................................................................................................... 51

VI

4.1.

POBLACIÓN Y MUESTRAS DE ESTUDIO ................................................................................... 51

4.2.

EQUIPOS Y MATERIALES .............................................................................................................. 51

4.3.

OPTIMIZACIÓN DE LAS CONDICIONES CROMATÓGRAFICAS PARA LA

CUANTIFICACIÓN DE 1-HIDROXIPIRENO ............................................................................................. 53 4.3.1 4.4.

CONDICIONES CROMATOGRÁFICAS Y OPTIMIZACIÓN DE LA SPE ...................... 53

VALIDACIÓN DEL MÉTODO ANALÍTICO PARA LA CUANTIFICACIÓN DE 1-

HIDROXIPIRENO. .......................................................................................................................................... 54 4.4.1.

Método de extracción .................................................................................................................. 55

4.4.2.

Parámetros de validación ........................................................................................................... 55

4.5.

CUANTIFICACIÓN DE 1-DROXIPIRENO .................................................................................... 65

4.6.1 4.7.

CUANTIFICACIÓN DE ÁCIDO HIPÚRICO Y METILHIPÚRICO EN ORINA. ..................... 65

4.7.1. 4.8.

5.

Extracción y análisis de las muestras ........................................................................................ 66

DETERMINACIÓN DE CREATININA EN ORINA ...................................................................... 67

4.8.1. 4.10.

Preparación y análisis de las muestras ...................................................................................... 65

Preparación y análisis de muestras ........................................................................................... 68

ANÁLISIS ESTADÍSTICO ................................................................................................................ 68

RESULTADOS Y ANÁLISIS .................................................................................................................... 70 5.1.

CONDICIONES CROMATOGRÁFICAS ........................................................................................ 70

5.2.

PARÁMETROS DE VALIDACIÓN ................................................................................................. 72

5.3.

DETERMINACIÓN DE CREATININA EN ORINA .......................... Error! Bookmark not defined.

5.4.

CUANTIFICACIÓN DE 1-HIDROXIPIRENO, FENOL, ÁCIDO HIPÚRICO Y ÁCIDO

METILHIPÚRICO EN ORINA ...................................................................................................................... 73

VII

LISTA DE ACRÓNIMOS

COVs: Compuestos orgánicos volátiles HAPs: Hidrocarburos aromáticos policiclicos BTX: Benceno, Tolueno y xileno IARC: Agencia Internacional para investigación en cáncer OMS: Organización mundial de la salud PCDD: Dibenzodioxinas PCDF: Dibenzofuranos policlorados PCD: Bifenilos policlorados Pyr: Pireno 1OHPyr: 1-Hidroxipireno Long kow: Coeficiente de reparto octanol-agua Koc: Coeficiente de reparto carbono orgánico y agua HBM: Biomonitorización humana g: gramo H: Altura de platos LOD: Límite de detección LOQ: Límite de cuantificación L : Longitud de la columna NIOSH: Instituto Nacional para la Salud y Seguridad Ocupacional %R: Porcentaje de recuperación S: Desviación estándar S2: Varianza tr: Tiempo de retención X: Promedio AH: Ácido hipúrico MH: Metilhipúrico

VIII

LISTA DE FIGURAS

Pag. Figura 1. Metabolismo del pireno34 ............................................................................................................ 24 Figura 2. Estructura del 1-hidroxipireno 39................................................................................................. 27 Figura 3: Estructura química del benceno ................................................................................................. 30 Figura 4: Metabolismo del benceno52 ........................................................................................................ 31 Figura 5: Estructura química del tolueno ................................................................................................... 32 Figura 6: Metabolismo del tolueno 4 .......................................................................................................... 34 Figura 7: Estructura química del ácido hipúrico ........................................................................................ 35 Figura 8: Estructura química del xileno ..................................................................................................... 36 Figura 9: Metabolismo del xileno .............................................................................................................. 38 Figura 10: Estructura química del ácido 3-metil hipúrico (a) y del ácido 4-metil hipúrico (b). ................ 40 Figura 11: componentes de un espectrometro de masas. (Barquero, 2006) ............................................... 42 Figura 12: Esquema de un cromatógrafo de líquidos................................................................................. 45 Figura 13: Diagrama de Jablosnki. 63 ......................................................................................................... 46 Figura 14: Diagrama de causa y efecto para la incertidumbre de 1-hidroxipireno .................................... 61 Figura 15: Reacción de esterificación de: a. ácido hipúrico, b. ácido 3-metil hipúrico, ............................ 67 Figura 16: Cromatogramas de 1-hidroxipireno empleando como fase móvil a) MeOH:H2O b) ACN:H2O ............................................................................................................................................................ 70 Figura 17: Porcentajes de recuperación empleando diferentes columnas de extracción............................ 71 Figura 18: concentraciones de los metabolitos según grupo etáreo........................................................... 75 Figura 19: concentraciones de los metabolitos según antigüedad en la EDS ............................................. 75

IX

LISTA DE TABLAS

Pag. Tabla 1: Fuentes individuales de cada una de las incertidumbres .............................................................. 62 Tabla 2: Tipo de distribución de las fuentes individuales de incertidumbre ............................................... 62 Tabla 3: condiciones cromatográficas óptimas ........................................................................................... 70 Tabla 4: Resumen de los parámetros de validación para 1-hidroxipireno, estadística y criterios de aceptación ........................................................................................................................................... 72 Tabla 5: Resumen estadistico de los biomarcadores de exposición según el tipo de exposición laboral a COV´s ................................................................................................................................................. 74 Tabla 6: Porcentajes del hábito tabáquico y consumo de alcohol en el grupo expuesto y el grupo control 74

X

LISTA DE ANEXOS

Pag. ANEXO A: Estudio de la linealidad para 1-hidroxipireno ......................................................................... 89 ANEXO B: Análisis curva de calibrado de 1-hidroxipireno ...................................................................... 89 ANEXO C: Calculo de la incertidumbre de medición para 1-hidroxipireno. ............................................. 93 ANEXO D: Análisis de las curvas de calibrado de ácido hipúrico, metilhipúrico y fenol ......................... 97 ANEXO E: Datos de la cuantificación de los metabolitos en orina en la población muestreada ............. 102 ANEXO F: Equipos .................................................................................................................................. 106

XI

RESUMEN

Los compuestos orgánicos volátiles e hidrocarburos aromáticos policiclicos son un problema de contaminación, que se puede dar por el incremento considerable de las emisiones de subproductos de la combustión de los diferentes tipos de compuestos combustibles, estos contaminantes tienen efectos a corto y largo plazo sobre la salud humana. Por ello en el presente trabajo se evaluó la exposición ocupacional a COVs en trabajadores de estaciones de servicio de gasolina de la ciudad de Montería, con el fin de conocer el riesgo generado por estos contaminantes.

Se llevó a cabo un estudio descriptivo de corte transversal en 48 trabajadores (31 expuestos y 17 no expuestos). Se aplicó una encuesta, se tomaron muestras de orina al final de la jornada laboral, se midieron las concentraciones de 1-hidroxipireno por cromatografía liquida de alta resolución, fenol, ácido hipúrico y metilhipurico por cromatografía de gases. Se hizo el análisis estadístico y comparación de grupos. Se encontraron diferencias estadísticamente significativas para los metabolitos de HAPs y benceno entre el grupo expuesto

y el no expuesto.

Adicionalmente se encontraron concentraciones altas de 1-hidroxipireno y fenol, concentraciones que superaron los valores límites biológicos establecidos por ACGIH, con valores de 192.67, 180.43, 112.96 y 152.14 ug 1-OHPyr/mol de creatinina y 351.22 mg fenol/g creatinina.

Por otro lado se encontraron correlaciones entre las concentraciones de fenol con le edad y el hábito tabáquico (p<0.05), entre el ácido hipúrico con el hábito tabáquico, consumo de alcohol y el cargo en la EDS (p<0.05).De acuerdo a lo anterior, se determinó que existe exposición moderada a HAPs y benceno en las estaciones de servicio de gasolina de la ciudad de MonteríaCórdoba, según los límites establecidos por ACGIH. Además se recomienda continuar con el monitoreo de todos los metabolitos para adoptar medidas preventivas y correctivas sobre estos contaminantes, ya que los trabajadores de las EDS por su prolongada exposición ocupacional pueden presentar enfermedades relacionadas con estos contaminantes.

13

1. INTRODUCCIÓN

Los compuestos orgánicos volátiles (COV’s), están constituidos fundamentalmente por carbono que se convierte fácilmente en vapor o gas. En general son compuestos con puntos de ebullición que oscilan entre 50 y 260 °C (Guenther et al., 1995), por otro lado entre los COV’s los Hidrocarburos Policíclicos Aromáticos (HAP’s) constituyen un grupo de compuestos de dos o más anillos, formados a partir de la combustión incompleta de la materia orgánica (Mastandrea et al., 2005), mientras que el benceno, tolueno y el xileno, se obtienen de la destilación de la hulla y del petróleo (Vallejo, 1991).

Según la Internacional Agency for Research in Cáncer (IARC) y la Environmental Protection Agency (Health & Services, 1995) los HAP´s y el benceno son considerados cancerígeno y mutagénicos, en el caso del benceno la exposición prolongada puede producir leucemia mieloide aguda (Palma, Briceño, Idrovo, & Varona, 2015; Zuluaga Quintero, Valencia Ruiz, & Ortiz Trujillo, 2009). Algunas investigaciones efectuadas en población expuesta a vapores de gasolina durante largos períodos, también han demostrado una mayor incidencia de cáncer de esófago, ovario, testículo, colon y riñón (Guo et al., 2004). El tolueno es un inhibidor neuronal asociado con daño progresivo del sistema nervioso central y periférico, y pérdida de la memoria (Palma et al., 2015). La OMS no lo considera genotóxico ni carcinógeno en humanos ni animales, pero se ha reportado que en dosis bajas durante largo tiempo puede producir disfunción neurológica y daño hematológico (Shih et al., 2011), mientras que el xileno puede producir efectos neurotóxicos, así como hepatotoxicidad y nefrotoxicidad, y aunque existe controversia sobre su efecto hematotóxico, se sabe que cuando se absorbe por inhalación la exposición prolongada a isómeros de xileno lleva a la formación de productos tóxicos intermedios y finales semejantes a los del benceno, con efectos tóxicos en la médula (Caro Hidalgo, Gallego Fernández, & Montero Simó, 2009; Haro-García et al., 2012).

Ahora teniendo en cuenta que existe una población considerable que se encuentra expuesta, como se puede evidenciar en las estadísticas del Instituto Nacional de Salud donde para el 2008 14

se reportaron por el Sistema de Vigilancia de Salud Pública 211 casos por exposición a solventes y se han reportado a la semana epidemiológica 37 de 2009, 297 casos y esto comparado con el informe de enfermedad profesional en Colombia 2003-2005 del ministerio de la protección social donde se evidencia el subregistro de patologías derivadas de la exposición a sustancias químicas; es así que durante ese lapso se diagnosticó solo un caso de intoxicación por disolvente no derivado del petróleo.

En las estaciones de servicio de gasolina la exposición laboral a solventes orgánicos volátiles se debe a actividades como: atender la cisterna de carburantes, donde el trabajador de la estación de servicio tiene que estar presente para el control de la operación, al varillar tanques para determinar el volumen de los mismos o comprobar el correcto funcionamiento de la sonda de medición automática en los casos en que se disponga, en la comprobación de medidas de aparatos surtidores, en el suministro del carburante a demanda del cliente, la cual se realiza de forma continua, por lo cual es la que provoca mayor exposición. Además durante esta labor se liberan vapores del combustible que pueden ser inhalados por el personal de trabajo, también se pueden producir rebosamientos y salpicaduras de los carburantes líquidos que pueden entrar en contacto con la piel del trabajador (Kaserouni et al., 2001). En Colombia, la venta de estos carburantes tiene una alta importancia económica. Sin embargo, una de las consecuencias negativas de esta actividad es la liberación de COV’s y como en estudios realizados sobre mezclas de hidrocarburos aromáticos y aromáticos policiclicos derivados del petróleo, se han encontrado compuestos y algunas patologías de origen mutagénicos y carcinogénicos, estos estudios han tomado gran interés para la salud pública (Peng et al., 2013& Chen et al., 2008).

Por otro lado uno de los aspectos fundamentales para la prevención y el control de los efectos sobre la salud de los COV’s es la medición de los niveles de estos en el organismo (Koss et al. 1999), siendo el monitoreo biológico una de las herramientas para evaluar la exposición de los trabajadores a COV’s, mediante la determinación de la concentración de sus metabolitos en fluidos biológicos (Fernández, 1999). 15

Si bien se han realizado algunos estudios sobre este tipo de compuestos en el país, en la ciudad de montería no existe ningún reporte sobre la exposición ocupacional acerca de este tipo de contaminantes y ya que no se tienen reportes, no se conoce cuál es el grado de exposición a compuestos orgánicos volátiles de los trabajadores de las estaciones de servicio de la ciudad de montería, además de que existe desconocimiento por parte de los trabajadores sobre este tipo de sustancias y de las enfermedades que puede ocasionar la exposición a largo plazo y debido a que en Colombia el sistema de salud es pobre y que los trabajadores de estos lugares son personas de estrato por lo general 1, que no cuenta con asistencia médica inmediata y especializada para el tratamiento de las enfermedades que puedan generarse, hace esta problemática aún más compleja. Por todo lo anteriormente expuesto en este estudio se evaluó la exposición ocupacional a COV’s en trabajadores de estaciones de servicio, mediante la determinación de 1hidroxipireno, fenol, ácido hipúrico y metilhipurico en orina como indicadores biológicos de exposición ocupacional a este tipo de contaminantes.

16

2. MARCO TEÓRICO

2.1.

ANTECEDENTES HISTÓRICOS

La gasolina es una mezcla compleja de compuestos, principalmente parafinas, olefinas, naftenos e hidrocarburos aromáticos, mientras que el gasóleo es una mezcla de hidrocarburos parafínicos, olefínicos, aromáticos, policíclicos aromáticos y nafténicos. El riesgo intrínseco de la gasolina se debe a su volatilidad, siendo la vía inhalatoria la más importante en la exposición laboral, aunque también lo es la dérmica.

A pesar de que no se ha podido establecer una relación causa efecto entre la exposición laboral y cáncer de riñón u otros tipos de cáncer y a la luz de una clara evidencia entre la relación causa efecto en la aparición de cáncer en roedores expuestos a vapores gasolina, la ACGIH clasifica la gasolina como un cancerígeno A3 (sospechoso de carcinogenicidad en animales), por otro lado uno de los compuestos que contiene la gasolina y que merece especial atención es el benceno por su clasificación como cancerígeno humano de categoría 1. La IARC dispone de una monografía sobre la gasolina en la que la clasifica como cancerígeno 2B (posible carcinógeno para los humanos) dado que no hay evidencias de carcinogenicidad en humanos y evidencia limitada en animales. Sin embrago, se describen casos de una mayor incidencia de cáncer (leucemia, páncreas) entre los trabajadores de las estaciones de servicio en varios países europeos (Hygienists, 1995)

Los HAPs históricamente fueron los primeros agentes químicos en ser reconocidos como causantes de tumores malignos en humanos. Ya en 1775, el médico británico Percival Pott (Pott, 1775) observó una prevalencia elevada entre los deshollinadores de cierta edad de un tipo de cáncer genital, relacionando de esta forma el hollín con la formación del tumor. Cien años después el médico von Volkmann y poco después Joseph Bell volvieron a relacionar, esta vez, los derivados del petróleo, con la incidencia de cánceres en los trabajadores industriales expuestos (Vives, Grimalt, & Guitart, 2001). 17

Estos indicios han seguido siendo confirmados en años posteriores. En 1918 los patólogos Yamagawa e Ichikawa establecieron una relación entre el cáncer de piel y el alquitrán experimentando con orejas de conejo (Robins, Alexe, Harris, & Levine, 2007). La complejidad de la matriz del alquitrán no permitió descubrir qué compuestos eran los responsables de la incidencia del cáncer hasta que Bloch y Dreifuss en 1921 dieron la primera pista sobre las características químicas de los compuestos responsables de la aparición del cáncer en los pacientes (Phillips, 1983). Este grupo químico debía de pertenecer a los hidrocarburos policíclicos. En esa misma época, se realizó un experimento sobre sustancias que producían cáncer y se obtuvieron compuestos carcinogénicos similares, sometiendo a altas temperatura o pirolizando materia orgánica (Amakura et al., 2016).

La determinación de estos químicos o de sus metabolitos en fluidos humanos comenzó en estudios de medicina laboral para la protección de la salud de los trabajadores expuestos, siendo posteriormente extendidos a la población en general. Estados Unidos y Alemania fueron pioneros en este tipo de estudios (Schulz et al., 2009).

El Centro de Investigaciones Toxicológicas de La Universidad de Carabobo-Cituc publica en el año 2010, un estudio realizado en trabajadores de una empresa de pintura automotriz, donde se investigó los niveles urinarios de ácido hipúrico y fenoles; los resultados hallados en este estudio, se encuentran dentro de los rangos de los valores de referencia de la población "sana", lo que sugiere teniendo en cuenta las limitaciones, que al momento de realizar el estudio, la población evaluada estaba laborando en condiciones adecuadas, en lo que respecta a la exposición de los solventes orgánicos monitoreados (Brizuela & Jiménez, 2010).

Ramírez y Sánchez realizaron un estudio en la ciudad de Lima, en el año 2001, en trabajadores de talleres de venta de lubricantes y de servicio de mecánica automotriz; se determinó que los niveles de ácido hipúrico estaban por encima de los valores normales (M. Oliveira, Ribeiro, Delgado, & Abreu, 2009).

18

La determinación de 1-hidroxipireno en muestras de orina en Colombia ha sido estudiada por distintos autores por las características mutagenicas y carcinogénicas de los HAPs, se ha realizado estudios en la industria de la goma (Piñero et al., 2013), cuantificación de hidrocarburos policiclicos aromáticos urinarios en policías de área metropolitana de Bogotá, efectos genotóxicos de las mezclas complejas de hidrocarburos en estaciones de servicio de gasolina en barranquilla (González Torres, Moreno Rossi, & Quintana Sosa, 2015). También se han realizado estudios sobre la determinación de BTX, se ha evaluado la exposición a solventes orgánicos en trabajadores pertenecientes a laboratorios analíticos y empresas de tipo manufacturero, químico o metalmecánico en Bogotá (Pérez Ramos & Miranda Garcia, 2014), al igual que en trabajadores de fábricas de pintura y pegantes, el cual fue realizado por el Instituto Nacional de Salud y cofinanciada por el Instituto de Seguro social.

En el año 2007, en la ciudad de Bogotá, se realizó un estudio en trabajadores de una fábrica de pintura, donde se evaluó los biomarcadores de exposición al benceno, tolueno y xileno en orina, para el monitoreo de la concentración de BTX en el ambiente de trabajo y como biomarcadores de efectos genéticos tempranos, la frecuencia de micronúcleos y rompimiento de cadenas simples de ADN fueron evaluadas en células mononucleares a partir de muestras de sangre periférica. En este estudio, los niveles de solventes orgánicos internamente efectivos parecen ser bajos lo cual se explica con la ausencia de efectos genotóxicos en las células examinadas (Pérez Ramos & Miranda Garcia, 2014).

En el año 2013 Yadiris E., Vargas Ramos y Marrugo Negrete llevaron a cabo un estudio sobre la exposición a COVs en fábricas de muebles de dos poblaciones del norte de Colombia (Sincelejo y Sampués) encontrando concentraciones estadísticamente significativas entre el grupo expuesto y el grupo control para benceno, tolueno y m/p-xileno.

19

2.2. HIDROCARBUROS AROMÁTICOS POLICÍCLICOS

2.2.1 Formación

Los hidrocarburos aromáticos policíclicos (HAPs) son un grupo numeroso de compuestos orgánicos formados por la condensación de dos o más anillos bencénicos que pueden organizarse formando estructuras lineales, angulares o dispuestos en racimos. El compuesto más sencillo de esta familia es el naftaleno formado por

tan sólo dos anillos, se forman por pirólisis o

combustión incompleta de materia orgánica que contiene carbono e hidrógeno. A elevadas temperaturas, la pirólisis de compuestos orgánicos, produce fragmentos de moléculas y radicales que se combinan para dar lugar a los HAPs; La composición de los productos de la pirosíntesis depende del combustible, la temperatura y el tiempo de permanencia a altas temperaturas. Los combustibles que forman HAPs son metano, otros hidrocarburos, hidratos de carbono, ligninas, péptidos, etc. Sin embargo, los compuestos insaturados y las estructuras cíclicas suelen favorecer la formación de las HAPs (Kazerouni, Sinha, Hsu, Greenberg, & Rothman, 2001). Además la formación de aerosoles que contienen HAPs permite que puedan ser transportados a grandes distancias, alejados de la fuente de emisión, creando una contaminación difusa no controlada, estos pueden encontrarse en el alquitrán de hulla, combustibles fósiles, erupciones volcánicas, incendios forestales, plantas industriales, tráfico de vehículos, calefacciones, humo de cigarrillos, además de generarse en la manipulación de alimentos ahumados, asados al horno o carbón y tostados. Estas fuentes, tanto naturales como antropogénicas, permiten que estén presentes en el aire, el agua, los suelos, los alimentos u otros productos de consumo, como por ejemplo los cosméticos. Su ubicuidad y persistencia hace que se les considere contaminantes prioritarios (Eljarrat & Barcelo, 2003)

2.2.2 Estabilidad. Los sistemas conjugados de orbitales π de los HAPs son los responsables de su estabilidad química. Son sólidos a temperatura ambiente y su volatilidad es pequeña. Dependiendo de su carácter aromático los HAPs absorben la luz ultravioleta y producen un espectro fluorescente 20

característico. Son solubles en muchos disolventes orgánicos, pero prácticamente insolubles en agua, tanto menos cuanto mayor sea su peso molecular (Mastandrea et al., 2005).

2.2.3 Propiedades físico-químicas.

En su forma pura, los HAPs son sólidos incoloros o con un color amarillo o verde pálido. A temperatura ambiente son sólidos con alto punto de fusión y ebullición y baja presión de vapor. Son lipofílicos, tanto mayor cuanto mayor es su peso molecular, por lo que suelen ser insolubles en agua (Albers, 1995). Su coeficiente de reparto octanol-agua (log Kow) se sitúa en el rango de 3,4-6,5. Estos altos coeficientes de partición indican que pueden ser absorbidos a través de los diferentes tejidos biológicos, tales como la piel (Oliveira, 2010)

Los HAPs son compuestos no polares o muy débilmente polares, que tienen afinidad por las fases orgánicas hidrofóbicas, presentando una baja solubilidad en agua. Dicha solubilidad disminuye con el aumento del tamaño de la molécula y, con la excepción del naftaleno, que es relativamente soluble, los HAPs no suelen presentar solubilidad en dicho medio. Su coeficiente de reparto entre el carbono orgánico y agua (Koc) también es alto, por lo que en sistemas acuosos tienden a concentrarse en los sedimentos o se asocian a la materia orgánica en suspensión, lo que explica su persistencia en el medio ambiente (Costa, 2001).

2.2.4 Principales vías de exposición

2.2.4.1.Vía inhalatoria

Los HAPs están presentes en el aire, entrando a través de los pulmones al respirar. Esto puede ser debido a la inhalación de humo de tabaco, aire contaminado de zonas industrializadas, tanto debidos a fábricas como a vehículos, inhalación de desechos industriales o inhalación de humo en incendios. En zonas rurales los niveles suelen oscilar entre los 0,02 y 1,2 ng/m3, mientras que 21

en urbanas se detectan del orden de 1,15-20 ng/m3. Estas concentraciones suelen aumentar en los meses de invierno debido sobre todo al aumento de emisiones industriales, tráfico de vehículos y calefacciones domésticas cuyo uso se incrementa durante este período Para algunos trabajadores el ambiente laboral es la principal fuente de exposición a los HAPs, siendo la vía inhalatoria la vía de exposición principal (ATSDR, 1995; Wallace, 1996).

2.2.4.2. Vía digestiva

Una importante vía de exposición es la dieta, debido al consumo de agua o alimentos que contengan HAPs, ya sea por contaminación en su origen como por generación de los mismos en su manipulación o procesado, tales como vegetales, cereales y lácteos procedentes de suelos o atmósferas contaminadas. También pueden encontrarse HAPs en carnes cocinadas en barbacoa, pescados o alimentos con contenido en grasas donde pueden acumularse, frutos o semillas, aceites, etc. El contenido de B[a]Pyr en alimentos asados oscila en torno a 0,17-10,5 ug/kg, dependiendo del alimento y viendo su cantidad aumentada con el contenido en grasa. El pescado ahumado contiene niveles relativamente elevados del orden de 4-16 ug/kg de B[a]Pyr, consecuencia de la combustión de madera necesaria para su elaboración. Las referencias de HAPs en agua potable oscilan entre los 4 y 24 ng/L (García-Martínez, 2005).

2.2.4.3.Vía dérmica

La exposición a los HAPs por vía dérmica puede producirse al entrar en contacto con partículas del suelo contaminado, o productos tales como la creosota. También debido al uso de algunos medicamentos en los que se emplean en su composición diversos hidrocarburos (tratamiento de eccemas, psoriasis o dermatitis), o por contacto directo con estas sustancias (Mastandrea et al., 2005)

22

2.2.5 Ruta metabólica de los HAPs

La biotransformación de los HAPs involucra una serie de enzimas que catalizan reacciones de oxidación, reducción e hidrólisis (enzimas del citocromo P-450-CYP) y de enzimas que catalizan reacciones de conjugación (sulfotransferasa, epóxido hidrolasa, glutatión, S-tranferasa y UDPglicotransferasa). Estos sistemas enzimáticos se encuentran distribuidos a lo largo de todos los tejidos del organismo (Mastandrea et al., 2005). El proceso metabólico tiene lugar principalmente en el hígado aunque puede darse en otros tejidos metabólicamente activos. Los HAPs son primeramente oxidados a mono y dihidroxiderivados, conjugando la molécula de glutatión para conseguir su solubilidad en medio acuoso, favoreciendo de este modo su eliminación por la orina como glucurono y sulfo conjugados. En la oxidación también se producen epóxidos, muy reactivos, que le dan al compuesto su capacidad genotóxica (Jacob & Seidel, 2002).

Un paso crítico en la carcinogénesis de los HAPs en los mamíferos parece ser debido al enlace covalente de las especies metabólicas a los residuos nucleofílicos, entre los que se incluye el ADN (Shimada et al., 1996).

2.2.5.1. Metabolismo del pireno

La biotransformación del pireno (Pyr) en 1OHPyr y su posterior transformación en sus conjugados solubles pueden consultarse en la Figura 1. La biotransformación del Pireno incluye una serie de enzimas que catalizan reacciones de oxidación, reducción e hidrólisis (enzimas del citocromo P450 CYP), así como enzimas que catalizan reacciones de conjugación (sulfotransferasas, epóxido hidrolasa, glutatión Stransferasa y UDP-glicotransferasas).

23

Figura 1. Metabolismo del pireno(Giessing & Lund, 2002)

El metabolismo del Pyr pasa por dos etapas. En la fase I, las mono-oxigenasas dependientes del citocromo P450 (CYP IA), una familia de enzimas, oxida el Pyr añadiendo un grupo hidroxi en la posición 1 y formando de esta forma el 1OHPyr, el principal metabolito del pireno. El 1OHPyr puede volver a oxidarse por otros citocromos P450, formándose el 6- dihidrodiol o 1,8dihidrodiol pireno. Cuando actúa el citocromo P450 IIB se forma el 5 epoxi, 4,5-dihidropireno y el 4,5-dihidrodiolpireno. En la segunda fase metabólica, estos metabolitos pasan a conjugarse con las enzimas tipo glucoronosil transferasa/sulfotransferasa y glutatión-s-transferasa formándose los derivados conjugados carbohidrato o sulfato, para que puedan ser excretados por el cuerpo principalmente por la orina (Shahtaheri, Ibrahimi, Golbabaei, Hosseini, & Fouladi, 2006). Las rutas de eliminación principal son la bilis, orina y las heces (Rey-Salgueiro, MartínezCarballo, García-Falcón, González-Barreiro, & Simal-Gándara, 2009). Se ha observado que el 1OHPyr encontrado en orina es 10 veces mayor que el encontrado en leche, en concordancia con el hecho de que la orina es la mayor ruta de eliminación de los xenobióticos (Rey-Salgueiro et al., 2009).

24

2.2.6 Biomarcadores de exposición.

2.2.6.1. Matrices biológicas

Las matrices biológicas consideradas deben ser fácilmente accesibles y en cantidad suficiente para realizar los análisis y por supuesto, sin suponer un riesgo para la salud de los individuos, es decir, intentar que la toma de muestra sea lo menos invasiva posible. En los estudios de la HBM se emplean principalmente como matrices biológicas la orina y la sangre. Muchas sustancias lipofílicas persisten en la sangre, tanto en el suero como en el plasma. La sangre está en contacto con todos los tejidos, lo que permite determinar la presencia de contaminantes en este medio manteniendo una muy buena correlación entre los niveles observados y su exposición. Sin embargo, la recogida de esta matriz es invasiva por lo que puede condicionar la participación de voluntarios en el estudio. Además, se necesita personal especializado para su recogida, siendo una matriz compleja en el que los bajos niveles pueden necesitar un esfuerzo de metodología analítica adicional, mientras que la orina permite el análisis de contaminantes hidrofílicos que se excretan y pueden ser recogidos fácilmente de manera no invasiva, además se pueden recoger volúmenes mayores de muestra.

2.2.6.2. Elección del biomarcador.

Otro aspecto del que debe encargase la HBM es la elección del biomarcador más adecuado a cada sustancia en estudio. Deber ser el elemento representativo del grupo general, presentando una correlación directa entre la exposición que se pretende evaluar y su concentración. Del biomarcador va a depender el diseño de la metodología analítica e interpretación de los resultados. Ha de ser lo más representativo y específico posible de la sustancia inicial, siendo sus niveles en la matriz de estudio detectables con un resultado fiable y adecuado a los niveles de corte buscados.

25

El control de la exposición de los HAPs se realiza básicamente en orina mediante el control de los metabolitos hidroxilados que se eliminan en unos pocos días tras la exposición en su forma libre (Jacob & Seidel, 2002). De una manera fiable y específica se han determinado en orina el 1OHPyr, hidroxifenantrenos (OHPhe) o el 1,2-hidroxinaftaleno, entre otros. La determinación del 3-hidroxibenzo[a]pireno (3OHB[a]Pyr) en orina es un gran progreso ya que esta sustancia presenta un alto grado de potencial carcinogénico, de ahí la importancia de su determinación. Sin embargo, no está claro que de momento, sea el biomarcador adecuado para los análisis de rutina (Angerer, Ewers, & Wilhelm, 2007; Jacob & Seidel, 2002).

2.2.6.3. Bioindicadores de dosis biológica.

Los bioindicadores de dosis biológica son los que indican la cantidad de sustancia que actúa sobre los sitios biológicos significativos, es decir, serán los parámetros que permitan evaluar la exposición y los efectos bioquímicos y biológicos de estas sustancias, una vez integrados al organismo. Las sustancias mutagénicas o carcinogénicas se unen a las macromoléculas, especialmente proteínas, ARN o ADN. Esto es debido a que las sustancias electrofílicas reaccionan con los sitios nucleofílicos de dichas macromoléculas formando aductos. La unión entre este aducto con el ADN es una etapa crítica de la carcinogéneis química y la determinación de estos compuestos puede ser útil como bioindicador precoz para la determinación de cáncer (Mastandrea et al., 2005).

2.2.6.4. El 1-hidroxipireno como principal biomarcador

El Pireno un hidrocarburo aromático policíclico formado por cuatro anillos conjugados que es rápidamente distribuido, metabolizado y eliminado como 1-OHPyr en orina, representando una fracción constante, un 90% del total de Pyr excretado (Bartolomé et al., 2015). El 1-OHPyr es un derivado hidroxilado del pireno, donde un grupo hidroxilo sustituye uno de los carbonos de la estructura en la posición 1. Tiene una vida media de 4 a 35 horas decayendo su concentración a las 48 horas siguientes a la exposición. Por lo tanto, el 1OHPyr puede ser usado para evaluar la 26

exposición reciente a HAPs (Piñero et al., 2013). La estructura química del 1OHPyr es la mostrada en la Figura 2.

Figura 2. Estructura del 1-hidroxipireno (Valenciano, 2016).

Desde 1985, el 1OHPyr es considerado un indicador representativo, sensible y fiable de la exposición de HAPs (F. J. Jongeneelen, 1994). Es el metabolito empleado habitualmente en la determinación de dicha exposición ya que existe una relación directa entre la exposición industrial a los HAPs y la excreción urinaria del 1OHPyr. Los resultados demuestran que la concentración de pireno está estrechamente relacionada con la suma total de los HAPs (Mercado-Calderon, 1992). El 1OHPyr ha sido, por tanto, considerado el mejor biomarcador, siendo objeto de numerosos estudios (Chetiyanukornkul et al., 2002; Jacob & Seidel, 2002; Lee et al., 1999).

2.2.7 Entrada de los HAPs al medio ambiente.

Los HAPs entran al medio ambiente principalmente a través de las emisiones al aire de los volcanes, los incendios forestales, la quema de madera en los hogares y los gases de los tubos de escape de automóviles y camiones. También pueden entrar a las aguas de superficie a través de las descargas de las plantas industriales y las plantas de tratamiento de aguas residuales y pueden ser liberados a los suelos de los sitios de desechos peligrosos si se escapan de los contenedores de almacenamiento.

La movilización de los HAPs en el medio ambiente depende de las propiedades de cada uno de ellos, como qué tan fácilmente se disuelven en el agua y qué tan fácilmente se evaporan en el 27

aire. Por lo general, los HAPs no se disuelven fácilmente en el agua. En el aire están presentes como vapores o se encuentran adheridos a las superficies de pequeñas partículas sólidas. Los HAPs pueden viajar largas distancias antes de regresar a la tierra en forma de agua de lluvias o por asentamiento de partículas.

2.2.8 HAPs efectos sobre la salud.

En 1775, un médico inglés, Sir Percival Pott, describió por primera vez un cáncer de origen profesional. Asoció el cáncer de escroto de los deshollinadores con su prolongada exposición a alquitrán y hollín, en condiciones deficientes de higiene personal. En el decenio de 1930 se describió el cáncer de pulmón en los trabajadores de la industria del acero y del coque y en 1933 se demostró que el BaP, presente en el alquitrán de hulla era cancerígeno. Los estudios epidemiológicos indican una mayor frecuencia de cáncer de pulmón en los trabajadores de las industrias de coque, aluminio y acero (Kazerouni et al., 2001). No todos los HAPs han mostrado poseer efectos carcinogénicos, genotóxicos o mutágenos y muchas veces el efecto se atribuye a la presencia conjunta de más de un compuesto de la familia y de algunos de sus derivados, principalmente los nitroderivados.

Actualmente se admite que los HAPs son previamente activados en el organismo antes de ejercer su efecto como disruptor endocrino o cancerígeno/mutágeno. Tras la exposición prolongada pueden producir cáncer cutáneo (escroto y cara), cáncer broncogénico en vías respiratorias, cáncer de vejiga; en el sistema hematopoyético pueden originar leucemia y linfoma (Lawerys, 1994). En la especie humana la vía respiratoria es considerada la más importante, particularmente para individuos ocupacionalmente expuestos, de igual manera la vía dérmica pues ser tanto o más importante.

28

Un esquema propuesto para la carcinogenicidad por exposición ambiental considera las siguientes etapas: exposición, activación metabólica, formación de aductos entre HAPs y ADN, mutaciones en genes críticos como, por ejemplo, el p53 (gen represor de tumores) y sucesión de mutaciones en otros genes (Denissenko, Pao, Tang, & Pfeifer, 1996; Mastandrea et al., 2005)

Es importante recalcar que la aparición del cáncer es un proceso que involucra varias etapas, siendo también influenciado por susceptibilidad individual y otros factores, tales como la edad, sexo, etnia, estado de salud, nutrición y polimorfismo genético. En general, una mayor concentración de aductos HAPs-ADN se encuentra en personas ocupacionalmente expuestas.

2.3. HIDROCARBUROS AROMÁTICOS.

2.3.1. Benceno

2.3.1.1. Propiedades fisicoquímicas

El benceno es un hidrocarburo líquido de olor agradable que se usa como disolvente de grasas, pinturas, etc. Su fórmula molecular es C6H6, formando un anillo, su punto de fusión es de 5.5ºC y su punto de ebullición es de 80ºC, teniendo una densidad (a 20ºC) de 0.879 (17,18). El benceno es un químico naturalmente encontrado en el petróleo crudo a los niveles a 4 g/L (Morrison & Boyd, 1976).

29

Figura 3: Estructura química del benceno

2.3.1.2. Fuentes de exposición

El benceno es un compuesto orgánico presente en la naturaleza, es un componente de petróleo (4%) y puede encontrarse en el agua del mar (0.8 ug/L) en las cercanías de depósitos naturales de petróleo y gas natural (Mage & Zali, 1992; Morrison & Boyd, 1976). Los niveles de benceno en el aire pueden aumentar por emisiones generadas por la combustión de carbón y petróleo, operaciones que involucran residuos o almacenaje de benceno, el tubo de escape de automóviles y evaporación de gasolina en estaciones de servicio (Quijano Parra & Meléndez Gélvez, 2014).

2.3.1.3. Metabolismo del benceno

El benceno se metaboliza en el hígado y luego en la médula del hueso donde ocurre el metabolismo secundario. Lo metabolitos del benceno pueden dañar las macromoléculas de la célula, produciendo así su toxicidad. El ácido fenilmercaptúrico y el ácido del trans trans mucónico son metabolitos menores del benceno (Moszczynski, 1981).

30

El metabolismo del benceno ocurre principalmente en el hígado a través del sistema citocromo P 450 IIEI y en menor grado, en aquellos tejidos blancos como la medula ósea. El primer paso en el metabolismo del benceno es oxidativo, produciéndose compuestos anulares hidroxilados. Existe también un citocromo P 450 en la medula ósea capaz de metabolizar el benceno. Los compuestos hidroxilados (fenol, catecol, hidroquinona y 1, 2, 4 trihidroxibenceno) son excretados en la orina como sulfato etéreos y glucorónidos (Gollmer, Graf, & Ullrich, 1984).

Figura 4: Metabolismo del benceno(Eusebio Salinas & Rodríguez Minaya, 2007)

2.3.1.4. Eliminación y excreción

La eliminación del benceno biotransformado es por vía urinaria, en forma de fenoles libres, sulfa y glucuro- conjugados (Figura 2).La vida media por inhalación del benceno en el ser humano, no parece seguir un modelo y se estima alrededor de 1 hora a 24 horas después de la inhalación (Gandarillas Gonzales, 2015). 31

2.3.2. Generalidades sobre tolueno

2.3.2.1. Propiedades fisicoquímicas.

El tolueno es un líquido incoloro, inflamable, móvil, de olor fuerte característico similar al benceno, sus vapores son explosivos. Es menos denso que el agua; su densidad, D= 0,872 a 20ºC; su punto de ebullición es de 109°C (García-Miranda, Muñiz, & Sánchez, 2010).

El tolueno es un homólogo del benceno y se diferencia de este por la presencia de un grupo metilo, Esta pequeña diferencia estructural hace que el tolueno sea más liposoluble y menos volátil que el benceno(Junes Olivera & Lookuy Avendaño, 2009).

Figura 5: Estructura química del tolueno

2.3.2.2. Fuentes de contaminación



Se presenta naturalmente en el petróleo crudo y en el árbol de Tolú.



Fuentes artificiales, lo cual depende de la producción y uso que se le da al tolueno.

Se nombran tres fuentes artificiales que son: 

Las fuentes de la producción, que consisten en las pérdidas del tolueno durante el proceso (Morrison & Boyd, 1976).



Las fuentes del uso, se produce la liberación del aire ambiental al usar el tolueno. 32



Las fuentes inadvertidas, como son la emisión del tolueno a través del uso de la gasolina (Morrison & Boyd, 1976).

2.3.2.3. Metabolismo del tolueno.

Casi todo el tolueno absorbido en el organismo sufre una rápida biotransformación. Del 60% al 80%, aproximadamente, el tolueno es metabolizado para transformarse en ácido benzoico por oxidación del radical metilo, que se convierte en radical carboxílico. El ácido benzoico se combina entonces con la glicina para formar ácido hipúrico, solamente una pequeña fracción de ácido benzoico puede combinarse con ácido glucorónico (Organization, 1982). El 20% del tolueno absorbido se excreta inmodificado por el aire espirado. La fracción retenida en el organismo (80%) es metabolizada por los microsomas del hígado por el sistema monooxigenasa (citocromo P-450 isozyma), que hidroxila al tolueno en su cadena lateral a alcohol bencílico (radical metilo pasa a carboxilo), posteriormente, las enzimas alcoholdeshidrogenasa (ADH) y aldehído-deshidrogenasa (AIDH) lo transforman en ácido benzoico que, por conjugación con la glicina, forma ácido hipúrico, que es el principal metabolito urinario debido a la excreción renal que suele producirse en los túbulos proximales (Health & Services, 1995).)

33

OH

H3C

CH3

CH3 NADPH + H+ + O2

+

Monooxygenase Cytocrome P450

95% Benzil alcohol

Tolueno

OH

Benzil alcohol

3%

O

Alcohol Dehidrogenase

O

+ O

HO

2%

O

Alcohol Dehidrogenase

Benzoic acid

Benzaldehyde

Glycine

O HO

NH

O

Hippuric acid

Figura 6: Metabolismo del tolueno (Health & Services, 1995)

2.3.2.4. Eliminación y excreción.

El 20% aproximadamente, del tolueno absorbido es exhalado y con la orina solamente se excretan algunos vestigios (0.06%, aproximadamente). El principal metabolito, que es el ácido hipúrico, es rápidamente eliminado con la orina. En las condiciones normales de exposición profesional, el ácido hipúrico es eliminado casi enteramente a las 24 horas de terminarse la exposición (Organization, 1982).

34

El ácido hipúrico se excreta por la orina con una vida media biológica de unas 3 horas. Su eliminación es completa a las 18 horas tras finalizar la exposición. La vida media biológica del tolueno en la sangre y el aire alveolar es de unas 20 horas (Moreno Jiménez, 2011)

La determinación del contenido de ácido hipúrico en la orina constituye un buen indicador biológico de exposición, teniendo en cuenta que pueden existir variaciones individuales y que la orina de trabajadores no expuestos puede contener ácido hipúrico procedente de alimentos, en especial frutas y hortalizas; además de alimentos que contienen preservantes como benzoatos y ácido benzoico.

2.3.2.5. Ácido hipúrico O OH NH O

Figura 7: Estructura química del ácido hipúrico

El ácido hipúrico fue descubierto por el químico Justus Von Liebig en el año de 1824 en la ciudad de parís, Francia. El ácido hipúrico es el resultado de la conjugación de la glicina con el ácido benzoico y es un componente habitual de la orina, sobre todo en herbívoros ya que se encuentra en alimentos de origen vegetal.

El nombre científico del ácido hipúrico es el ácido benzoilamino acético, cuya masa molecular es de 179.17g/mol y su fórmula condensada es la C9H9NO3. Es un polvo cristalino con punto de fusión de 187-188ºC, un gramo de AH se disuelve en aproximadamente 250 ml de agua fría, 1L de cloroformo, 400ml de éter y 60ml de alcohol amílico. Es totalmente soluble en

35

alcohol o agua caliente, también es soluble en fosfato de sodio. Prácticamente insoluble en benceno. Disulfuro de carbono y éter de petróleo (Smith, 2001).

2.3.3. Generalidades sobre xileno

2.3.3.1. Propiedades fisicoquímicas

Los xilenos o xiloles (isómeros del dimetilbenceno) pertenecen a la familia de los hidrocarburos aromáticos. A temperatura ambiente son unos líquidos incoloros, de olor dulce, perceptible a concentraciones del orden de 1 ppm, poco volátiles y prácticamente insolubles en agua pero solubles en la mayoría de los disolventes orgánicos (Torrado Rey et al., 2010).

Existen tres isómeros del xileno según la posición relativa de los grupos metilo en el anillo de benceno: orto- (o-), meta- (m-) y para- (p-). Son también conocidos por 1,2-dimetilbenceno, 1,3dimetilbenceno y 1,4-dimetilbenceno, respectivamente.

Figura 8: Estructura química del xileno

36

2.3.3.2. Fuentes de contaminación

Ocurre en el petróleo y el alquitrán y se produce en cantidades pequeñas durante incendios forestales.

2.3.3.3. Metabolismo del xileno

En el hombre, el 95 % aproximadamente del xileno absorbido se metaboliza rápidamente y los metabolitos son excretados con la orina; solo del 3 % al 6% del xileno se exhala sin transformación (Horowitz, 2001).

La principal vía de biotransformación de los isómeros del xileno tanto en el hombre como en los animales es la formación de ácido metilbenzoico por oxidación de uno de los grupos metilo, seguida de su combinación con glicina para formar el correspondiente ácido metilhipúrico (Skowronski, Turkall, Kadry, & Abdel-Rahman, 1990).

Estos ácidos se conjugan con la glicina para formar los ácidos orto, meta o para metilhipúricos, que son excretados por vía urinaria (Pérez Ramos & Miranda Garcia, 2014)

37

OH

H3C

CH3 CH3

CH3

CH3

+

NADPH + H + O2

+

Monooxygenase Cytocrome P450

95% o,m,p Benzil alcohol

o,m,p Xileno

OH

5%

O

CH3

HO

O CH3

CHAlcohol 3

Alcohol Dehidrogenase

Dehidrogenase

o,m,p Benzoic acid

o,m,p Benzaldehyde

o,m,p Benzil alcohol

O

Glycine

O NH

HO

O CH3

o,m,p Hippuric acid

Figura 9: Metabolismo del xileno

2.3.3.4. Excreción y eliminación

La vía de eliminación principal es renal. Alrededor de 90 – 95 % de los xilenos absorbidos son eliminados por la orina en forma de ácido metilhipúrico. La configuración meta del xileno es preferente sobre las otras dos.

Para una exposición única de 8 horas, el 71 % del xileno absorbido es excretado durante el tiempo de exposición y el 29 % las 16 horas siguientes. Tras finalizar la exposición, la eliminación urinaria de los ácidos metilhipúricos se efectúa en dos fases, una rápida y otra lenta. Este retraso corresponde a una liberación del xileno que se distribuye en los tejidos grasos 38

(donde la vida media de eliminación es de unas 60 horas). Estos ácidos son un indicador interesante ya que no se encuentran en personas no expuestas (Pérez Ramos & Miranda Garcia, 2014).

Los xilenos libres en orina representa menos del 0,005 % de los xilenos absorbidos. Algunos estudios los proponen como indicadores porque no tienen interferencia con la exposición a otros contaminantes (Pérez Ramos & Miranda Garcia, 2014).

2.3.3.5. Ácido metilhipúrico

El ácido metil-Hipúrico es el producto principal de la biotransformación de xilenos o dimetilbencenos. Recordemos que existe un gran uso de xileno en la industria química, plásticos, fibras sintéticas, cuero, telas y los papeles.

La absorción y distribución del xileno en el tejido es bastante rápida, concentrando su distribución en los tejidos ricos en lípidos. Se biotransforma dando lugar a los ácidos orto, meta y para-metilhipúrico y los dos últimos son los metabolitos urinarios más importantes de xileno.

La excreción urinaria del metabolito es al menos el 95% de la concentración absorbida. La eliminación se lleva a cabo en dos fases distintas, la primera en las primeras 10 horas (vida media de 2-5 horas) y el segundo a las 48 horas después del inicio de la exposición (vida media de 16-48 horas). El consumo de alcohol inhibe el proceso de biotransformación y provoca una disminución de la excreción urinaria de ácido metil-Hipúrico. El ácido Metil-Hipúrico es un excelente indicador de exposición al xileno, que se correlaciona ya sea bien con el nivel de xileno en el ambiente de trabajo y con la concentración total del disolvente absorbido por el individuo expuesto (Poo JL, 2000).

39

(a)

(b)

O

H3C O

OH NH

NH OH

O CH3

O ácido 4-metil hipúrico

ácido 3-metil hipúrico

Figura 10: Estructura química del ácido 3-metil hipúrico (a) y del ácido 4-metil hipúrico (b).

2.4. TÉCNICA ANALÍTICA

2.4.1. Cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas GC/MS

La cromatografía de gases (GC) permite la separación e identificación de compuestos volátiles en mezclas complejas. Esquemáticamente el proceso que tiene lugar en un cromatografo de gases es el siguiente: la muestra líquida se vaporiza en un inyector que está a temperatura elevada, donde una corriente de gas portador inerte y de alta pureza lo arrastra a lo largo de la columna proceso que se denomina elución, a diferencia de los otros tipo de cromatografía, la fase móvil no interaccionan con la moléculas del analito; su única función es la de transportar el analito a través de la columna. Allí tiene lugar el proceso de separación bajo condiciones controladas de temperatura; posteriormente el efluente de la columna pasa a un detector, cuya señal se recoge en función del tiempo en una carta o cromatograma. La separación por GC de los distintos compuestos presentes en una muestra depende de la diferencia en sus coeficientes de distribución entre la fase móvil y la estacionaria a una temperatura determinada, conociéndose perfectamente las condiciones para esta separación (Barquero, 2006).

40

La cromatografía de gases es una técnica separativa que permite la separación de mezclas muy complejas. Pero una vez separados, detectados, e incluso cuantificados todos los componentes individuales de una muestra problema, el único dato de que disponemos para la identificación de cada uno de ellos es el tiempo de retención de los correspondientes picos cromatográficos. Este dato no es suficiente para una identificación inequívoca, sobre todo cuando analizamos muestras con un número elevado de componentes. Los problemas con esta técnica se presentan cuando se trata de analizar compuestos de elevado peso molecular, termolábiles o polares. Desafortunadamente muchos tóxicos poseen grupos funcionales polares. Además durante los procesos metabólicos de biotransformación se introducen grupos polares en las moléculas para disminuir el carácter lipofílico y favorecer la excreción en la orina. Los métodos convencionales de GC no permiten el análisis de estas sustancias polares, por lo que la modificación de la molécula, mediante una derivatización adecuada, es un prerrequisito imprescindible. Otra gran limitación de la CG es que la información que proporciona no es definitiva, se basa sólo en el tiempo de retención y puede ocurrir que haya sustancias que eluyan juntas o muy próximas, por lo que se requiere un método de confirmación, como el que nos proporciona la espectrometría de masas. La GC es una técnica de separación que ha evolucionado rápidamente. A esta formidable capacidad de separación ha sido posible agregarle la alta especificidad de la espectrometría de masas, en lo que se constituye la técnica combinada GC/MS, una poderosa herramienta analítica que permite la separación y la identificación simultánea de mezclas complejas. Por medio de la GC/MS los componentes de la mezcla problema son separados, detectados, identificados y cuantificados. El uso de la espectrometría de masas en la detección cromatográfica permite identificar de modo casi inequívoco los componentes individuales de la mezcla.

Por otra parte, la espectrometría de masas puede identificar de manera casi inequívoca cualquier sustancia pura, pero normalmente no es capaz de identificar los componentes individuales de una mezcla sin separar previamente sus componentes, debido a la extrema complejidad del espectro obtenido por superposición de los espectros particulares de cada componente (Gutiérrez, 2002). El espectrómetro GC/MS es un equipo de gran importancia en los laboratorios analíticos debido a su gran sensibilidad, el compuesto al que se realice el análisis por 41

GC/MS, debe ser térmicamente estable (no descomponerse) a las temperaturas de la columna, y debe ser lo suficientemente volátil como para estar en fase gaseosa en el proceso de separación cromatográfica (punto de ebullición < 250ºC). Un espectrómetro de masas consta de varios componentes básicos: 

Dispositivo de introducción de la muestra



Cámara de ionización o fuente, donde se generan los iones a partir de las sustancias químicas a analizar



Analizador, que diferencia los iones generados en función de su relación m/Z



Detector que produce una señal eléctrica amplificada para cada uno de los iones generados

Figura 11: componentes de un espectrometro de masas. (Barquero, 2006)

Así, una vez separadas las sustancias en el cromatografo la muestra es ionizada (y por tanto destruida) usando diversos procedimientos para ello. De todos ellos el más usual y/o utilizado es la técnica denominada de Impacto Electrónico consistente en el bombardeo de la muestra (previamente vaporizada mediante el uso de alto vacío y una fuente de calor) con una corriente 42

de electrones a alta velocidad. Mediante este proceso, la sustancia pierde algunos electrones y se fragmenta dando diferentes iones, radicales y moléculas neutras, este proceso tiene lugar en la cámara de ionización.

Los iones (moléculas o fragmentos cargados) son entonces conducidos mediante un acelerador de iones sobre el que existe un fuerte campo magnético a un colector/analizador sobre el que se recogen los impactos de dichos iones en función de la relación carga/masa de los mismos (Esteban, 1993). Existen varios tipos de analizadores, siendo el más usado el denominado cuádruplo debido a su gran robustez para análisis de rutina y su relativo bajo costo comparado con otros. Este analizador se compone de 4 barras alargadas conectadas eléctricamente entre sí en pares opuestos a los que se le aplica un voltaje variable y, para un voltaje dado, sólo iones con una m/Z determinada presentaran una trayectoria estable y podrán ser detectados (iones resonantes) mientras que el resto son expulsados del cuádruplo y no llegan al detector (iones no resonantes).

Cada compuesto es único, y cada uno de los compuestos se ionizará y fragmentará de una determinada manera, y en este principio se basa la espectrometría de masas para identificar cada analito. En cuanto a la detección, los espectrómetros de masas actuales pueden operar en dos modos diferentes, el de registro total o full scan y el de iones seleccionados selected ion monitoring (SIM). En la modalidad de registro total, el espectrómetro barre todos los iones presentes dentro de un rango de valores masa/carga, que normalmente oscila entre 40 y 650. El espectro de masas o patrón de fragmentación obtenido proporciona una información estructural muy útil. En la modalidad SIM, el instrumento se prepara para detectar únicamente uno (single ion monitoring) o varios (multiple ion monitoring) iones de abundancia relativamente grande, o de relación masa/carga significativa, en el espectro de masas del compuesto de interés, resultando un cromatograma que responde sólo a compuestos en cuya fragmentación estén presentes los iones seleccionados. (Skoog, Holler, Nieman, & Gómez, 2001)

43

2.4.2. Cromatografía liquida de alta eficacia

La cromatografía liquida es importante porque la mayoría de los compuestos no son suficientemente volátiles para que se les pueda aplicar la cromatografía de gases. La cromatografía líquida utiliza una presión elevada para forzar el paso del disolvente por una columna que contiene partículas muy finas, consiguiendo así separaciones de gran resolución.

La cromatografía líquida de alta eficacia se encuadra dentro de la cromatografía de elución. En ésta, un líquido (fase móvil) circula en íntimo contacto con un sólido u otro líquido inmiscible (fase estacionaria); al introducir una mezcla de sustancias (analitos) en la corriente de fase móvil, cada analito avanzará a lo largo del sistema con una velocidad diferente que dependerá de su afinidad por cada una de las fases. Esto supone que después de terminado el proceso de la muestra por la columna, cada una de las sustancias introducidas en el sistema eluirá con un tiempo diferente, es decir, estarán separadas.

Los componentes básicos de cromatógrafo de líquidos son: 

Dispositivo de suministro de eluyentes (bomba y dispositivo de mezclado de eluyentes)



Dispositivo de inyección



Conducciones y conexiones



Detector y registrador



Columna

44

Figura 12: Esquema de un cromatógrafo de líquidos

2.4.2.1.Fenómenos de fluorescencia

La mayoría de los HAPs son compuestos fluoróforos, es decir presentan fluorescencia. La emisión luminiscente va a depender de la estructura molecular del compuesto. En concreto, en el caso de los HAPs, esta propiedad es debida a la rigidez que les confiere la estructura aromática, con electrones π deslocalizados y distribuidos a través de toda la molécula. Este sistema conjugado de orbitales π proporciona una estructura molecular que les hace químicamente estables. Los HAPs absorben luz ultravioleta y al emitirla producen un espectro de fluorescencia característico de cada compuesto que puede ser empleado para identificarlos con ayuda de un detector fluorimétrico (Shaw & Connell, 1994).

La fluorescencia es un proceso de emisión en el cual las moléculas son excitadas por la absorción de radiación electromagnética. Las especies excitadas se relajan al estado fundamental, liberando su exceso de energía en forma de fotones. Este proceso se produce porque las moléculas tienen diferentes estados llamados niveles de energía donde los electrones se encuentran ocupando dichos niveles. En fluorescencia estos niveles se refieren a estados vibracionales y electrónicos. Las moléculas que presentan fluorescencia tendrán un estado 45

electrónico basal (S0), o estado de baja energía, y un estado electrónico excitado de mayor energía (S1). Dentro de cada uno de estos estados electrónicos hay diferentes estados vibracionales (Skoog, West, & Holler, 1997). Un esquema de lo anteriormente expuesto puede consultarse a través de la Figura 12. El diagrama representado se denomina diagrama de Jablonski e ilustra los estados electrónicos de una molécula y las transiciones que se pueden producir entre estos estados (Shaw & Connell, 1994).

Figura 13: Diagrama de Jablosnki. (Lakowicz)

Cuando una molécula absorbe un fotón con energía (hv) de excitación, uno de sus electrones pi salta a un nivel de mayor energía y la molécula se dice que se ha promovido desde un estado basal S0 a un estado singlete S1 superior. Normalmente el tiempo de vida media de una especie excitada es breve porque existen mecanismos de liberación de energía que hacen retornar al estado fundamental. Las colisiones con otras moléculas causan que la molécula excitada pierda energía vibracional hasta que alcanza el estado vibracional más bajo del estado electrónico excitado. En este caso se habla de relajación vibracional, señalada por las flechas onduladas cortas de la Figura 4 , entre los niveles de energía vibracionales. La molécula desciende luego a uno de los distintos niveles de vibración del estado electrónico basal, emitiendo un fotón en el 46

proceso, es decir, el electrón vuelve de este estado excitado al estado basal. Dicho fotón, con menor energía, es decir, con mayor longitud de onda, es entonces emitido, siendo este proceso conocido como fluorescencia de emisión o fotoluminiscencia (Skoog et al., 2001), representado por las flechas continuas de color verde del diagrama de Jablonski de la Figura 4. La fluorescencia está limitada, por tanto, a un número relativamente pequeño de sistemas que incorporan características estructurales que hacen que la velocidad de los procesos de desactivación sin radiación se reduzca hasta el punto que la reacción de emisión pueda competir cinéticamente produciendo dicha emisión. A esto hay que añadir que tanto las longitudes de onda de excitación como las de emisión son características de cada molécula, por lo que se puede concluir que la fluorescencia es un proceso muy particular.

La fluorescencia más intensa la presentan los compuestos que contienen grupos funcionales aromáticos como es el caso de los HAPs, particularmente favorecida en moléculas que poseen estructuras rígidas. La eficacia cuántica, es decir, la relación entre el número de moléculas que emiten fluorescencia respecto al número total de moléculas excitadas, es alta, aumentando ésta con el número de anillos y su grado de conjugación. La sustitución en un anillo aromático causa desplazamientos en la longitud de onda de absorción máxima. En general, los HAPs con pocos anillos aromáticos requieren grandes energías de excitación (cortas longitudes de onda), mientras que las moléculas de mayor número (5 o más anillos) requieren menores energías (Beyer, Jonsson, Porte, Krahn, & Ariese, 2010). Por ejemplo, el pireno (Pyr) tiene una gran capacidad de llevar a cabo el fenómeno de emisión de fluorescencia, debido a su alta conjugación al estar constituido por cuatro anillos aromáticos fusionados. El Pyr posee un alto rendimiento cuántico y un tiempo de vida extendido en el estado excitado (Kalyanasundaram & Thomas, 1977).

Se puede concluir entonces que, como consecuencia de la especificidad de los procesos de fluorescencia, los HAPs van a presentar propiedades únicas para su determinación, siendo ésta una de las características más atractivas de los métodos de fluorescencia, ya que aportan a la metodología analítica una selectividad y sensibilidad inherentes al propio método. Las longitudes de onda a las cuales las moléculas son excitadas y en las cuales emiten fluorescencia son características de cada compuesto. Por ejemplo, en mezclas que contengan varias estructuras, las 47

diferentes propiedades fluorimétricas de cada uno de los HAP’s podrán dar una identificación preliminar de los compuestos.

2.4.3. Validación de la técnica analítica.

Validación es la confirmación mediante el suministro de evidencia objetiva de que se ha cumplido los requisitos para una utilización o aplicación específica prevista (OAA, 2003)

2.4.3.1. Rango lineal e intervalo lineal

Rango lineal: rango de concentraciones de analito para las cuales el método brinda resultados proporcionales a la concentración.

Intervalo lineal: La linealidad de un sistema o método analítico es su habilidad para asegurar que los resultados analíticos, son proporcionales a la concentración de la sustancia dentro de un intervalo determinado.

2.4.3.2. Límite de detección

Es la menor cantidad que puede ser distinguida del fondo con cierto nivel de confianza especificado (OAA, 2003)

48

2.4.3.3. Límite de cuantificación

Es la menor cantidad que puede ser determinada cuantitativamente con una incertidumbre asociada, para un dado nivel de confianza (OAA, 2003)

2.4.3.4. Exactitud

Proximidad entre el resultado de una medición y el valor verdadero del mensurando (OAA, 2003). La validación de un método busca cuantificar la exactitud probable de los resultados evaluando los efectos sistemáticos y azarosos sobre los resultados.

2.4.3.5. Precisión

Proximidad entre valores de una magnitud obtenidos por mediciones replicadas, en condiciones específicas (OAA, 2003). Es una medida de cuán cerca están los resultados unos de otros y generalmente se expresa por medidas como la desviación estándar que describe la dispersión de los resultados. Las dos medidas de precisión más comunes son repetibilidad y reproducibilidad, que representan los dos extremos de la precisión que se puede obtener.

2.4.3.6. Incertidumbre

Parámetro asociado al resultado de una medición, que caracteriza la dispersión de los valores que podrían ser razonablemente atribuidos al mensurando (OAA, 2003). Generalmente es una desviación estándar o un intervalo de confianza y su estimación toma en cuenta todos los efectos reconocidos que operan sobre el resultado. 49

3. OBJETIVOS

3.2. GENERAL

Evaluar la exposición ocupacional a compuestos orgánicos volátiles (COVs) en trabajadores de estaciones de servicio de gasolina en la ciudad de Montería, Córdoba.

3.3. ESPECÍFICOS

•

Optimizar una metodología analítica para la determinación de 1-hidroxipireno en orina como biomarcador de exposición ocupacional a HAPs en trabajadores de estaciones de servicio de gasolina de Montería, Córdoba.

•

Analizar la concentración de 1-hidroxipireno en orina en trabajadores de estaciones de servicio de gasolina de Montería, Córdoba.

•

Cuantificar las concentraciones de fenol, ácido hipúrico y ácido metilhipúrico en relación a la concentración de creatinina como metabolitos urinarios de COV´s en trabajadores de estaciones de servicio de la ciudad de Montería, Córdoba.

50

4. MATERIALES Y MÉTODOS

Este trabajo fue realizado en las instalaciones del Laboratorio de Toxicología y Gestión Ambiental del grupo de investigación de Aguas, Química Aplicada y Ambiental de la Universidad de Córdoba.

4.1. POBLACIÓN Y MUESTRAS DE ESTUDIO

Para realizar el presente trabajo de investigación se evaluaron a 31 trabajadores de estaciones de servicio de gasolina (grupo expuesto) de la ciudad de Montería, Córdoba y un grupo control conformado por 17 trabajadores de las oficinas de la Universidad de Córdoba. El grupo expuesto fue seleccionado de acuerdo con los siguientes criterios de inclusión: tener mínimo un año de estar trabajando en la estación de servicio (EDS), participar de forma voluntaria en el estudio, estar expuesto al menos 8 horas diarias al combustible que manipulan, no haber estado expuesto a radiaciones (Rayos X) por lo menos 6 meses antes de la toma de muestras y no encontrarse bajo tratamiento farmacológico, ni haber padecido cáncer o enfermedades crónicas degenerativas de tipo infeccioso durante los tres meses anteriores a la toma de las muestras. Los criterios de inclusión del grupo control fueron principalmente ser

trabajadores no expuestos a HAP’s,

participar de manera voluntaria en el estudio, no estar expuesto a radiaciones (Rayos x) ni estar bajo medicación.

La toma y preservación de las muestras se realizó de acuerdo al método desarrollado por Jongeneelen et al (1987).

4.2. EQUIPOS Y MATERIALES 

Cromatógrafo líquido de ultra alta eficiencia con detector de fluorescencia molecular (HPLC-FLD) Ultimate 3000 marca Thermo Dionex 51



Columna Ultra AQC18 Restek® de 5µm de tamaño de partícula y 150 x 4.6 mm de longitud y diámetro interno respectivamente



Cromatografo de gases acoplado a masas con detector de fotomultiplicador marca Thermo Electron TRACE 1310 GC-ULTRA



Columna cromatográfica capilar Rtx-5 5% difenil 95% dimetil polisiloxano, de 30m, 0,32mm de diámetro interno y 0,25μm de espesor de película



Transfer-pipetas de 10-100 μL



Transfer-pipetas 100-1000 μL



Transfer-pipetas de 5mL



Matraces aforados de 1 mL



Balones volumétricos de 20 mL



Cartuchos HYPERSEP Retain PEP marca Thermo Scientific



Cartuchos C18 marca Thermo Scientific

Reactivos



Agua desionizada



Acetonitrilo grado HPLC



MeOH grado cromatografico



Ácido acético grado cromatografico



Acetato de Etilo grado cromatografico



HCl concentrado



Solución de HCl 2M en metanol



Diclorometano grado cromatografico



Acetato de sodio



Enzima β-glucoronidasa/arilsulfatasa marca Helix Pomadia



Solución estándar de 1-Hidroxipireno: se preparó a partir de un estándar certificado una solución de 690 mg/L en acetonitrilo marca y referencia del estándar. Se inyectó un volumen de la solución de 50ug/l en el sistema cromatografico bajo las condiciones de 52

trabajo con el fin de verificar los tiempos de retención del metabolito y la respuesta del equipo. 

Estándar de trabajo: A partir de la solución estándar se preparó un estándar de trabajo de 5mg/mL utilizando como solvente acetonitrilo.



Curva de calibrado: A partir del estándar de trabajo se prepararon 6 estándares utilizando como solvente acetonitrilo.



Solución estándar de Ácido Hipúrico, m-Hipúrico y p-Hipúrico: se preparó a partir de estándares certificados una solución de 10mg/L de forma que cada metabolito estuvo presente. Se realizó la posterior esterificación de acuerdo a la metodología de extracción de la muestra. Un volumen del extracto se inyectó en el sistema de GC

bajo las

condiciones de trabajo con el fin de verificar los tiempos de retención de cada compuesto y la respuesta del equipo. 

Estándar patrón interno: se preparó una solución de 2mg/L a partir de un estándar certificado con metanol como solvente. Se realizó la posterior esterificación de acuerdo a la metodología de extracción de la muestra y se inyecto bajo las mismas condiciones de los metabolitos y se verifico su tiempo de retención.



Estándares de trabajo: A partir de la solución estándar se prepararon mediante dilución en serie 5 estándares de diferentes concentraciones desde 0,25 hasta 5mg/L empleando metanol como solvente.

4.3. OPTIMIZACIÓN DE LAS CONDICIONES CROMATÓGRAFICAS PARA LA CUANTIFICACIÓN DE 1-HIDROXIPIRENO

4.3.1 CONDICIONES CROMATOGRÁFICAS Y OPTIMIZACIÓN DE LA SPE

53

El equipo (HPLC-FLD) Ultimate 3000 marca Thermo Dionex se programó para detectar y cuantificar el 1-hidroxipireno, para ello se realizaron varias pruebas inyectando un estándar de 100 μg/L para verificar su tiempo de retención en la columna, utilizando como fase móvil MeOH: H2O en proporción 80:20 y ACN: H2O en proporción 60:40 (Urbieta, Egiarte, & Montes, 2000). Para la optimización de la extracción en fase sólida se emplearon cartuchos de Octadecilsilano (C18) de Agilent e Hypersep retain PEP de Thermo Scientific de 500 y 200 mg de relleno respectivamente de 6 mL de volumen, acondicionados con metanol y agua, el agua grado HPLC fue obtenida con un desionizador (Barnstead Easypure II)-Thermo Scientific (USA), la extracción en fase solida (SPE) se realizó en una cabina con puerto de vacío con controlador de flujo marca Restek (USA) y el material de limpieza de los extractos se realizó con oxido de aluminio 90 (0.63-0.20 mm) y florisil (0.150-0.250 mm) suministrados por Merck.

4.4. VALIDACIÓN DEL MÉTODO ANALÍTICO PARA LA CUANTIFICACIÓN DE 1HIDROXIPIRENO

Para la determinación de 1-hidroxipreno se realizó la validación del método analítico, basado en el desarrollado por Jongeneelen et al (1987) con algunas modificaciones. El método utilizado es aceptado en España por el Instituto Nacional de Seguridad e Higiene en el trabajo (INSHT), además de que ha sido sometido a un protocolo de validación por organizaciones oficiales competentes en el área de normalización de métodos analíticos.

En esta fase de la validación se evaluaron las etapas de preparación de la muestra y de análisis instrumental. Como criterios de aceptación se establecieron los descritos por la AOAC Internacional. Los parámetros utilizados para validar el método fueron: linealidad, exactitud, precisión como repetibilidad y precisión intermedia, límite de cuantificación y límite de detección del método.

54

4.4.1.

Método de extracción

Se prepararon alícuotas de 10 mL de orina a cada una se les agregó una concentración conocida de 1-hidroxipireno (1,10 y 100 μg/L), se agregaron 10 mL de una solución buffer de ácido acético/acetato de sodio para regular el pH a 5.0 más 100 μL de enzima βglucoronidasa/Arilsufatasa y se llevó a un baño termostatizado a 37°C por 17 horas a 30 rpm; posteriormente se le realizó extracción en fase solida con cartuchos Hypersep Retain PEP marca Thermo Scientific, acondicionados con un volumen de 5.0 mL de metanol y 5.0 mL de agua desionizada, se pasó la muestra a través del cartucho a un flujo constante, una vez finalizado se secó por 1 minuto con una bomba de vacío y se eluyó con 10 mL de acetonitrilo. Una vez eluida se realizó la limpieza de los extractos usando una columna empacada con alúmina y acondicionada con 1.0 mL de acetonitrilo. Finalmente, se tomó 1.0 mL del extracto y se inyectó en el sistema cromatografico UHPLC-FLD Ultimate 3000 marca Thermo Dionex.

4.4.2.

Parámetros de validación

4.4.2.1.

Linealidad

En la evaluación de la linealidad se prepararon soluciones estándar de diferentes concentraciones del metabolito que variaron desde 0.1 ug/L hasta 100 ug/L en acetonitrilo, cada nivel de concentración se analizó por duplicado por UHPLC-FLD. Se graficó la relación del área del pico del metabolito vs la concentración del metabolito para evaluar la respuesta lineal del equipo a estas concentraciones. Para la cuantificación se construyó la curva de calibración teniendo en cuenta el comportamiento lineal de la gráfica, esta se determinó por medio de la evaluación del r2 de la regresión lineal generando la ecuación:

𝒚 = 𝒎(±𝒔𝒎 )𝒙 + 𝒃(±𝒔𝒃 ) (𝟏) 55

Dónde: x: es la concentración del analito (1-OHPyr) b: es el intercepto y: es la respuesta del instrumento m: es el valor de la pendiente

Tratamiento estadístico de datos

Para comprobar que la correlación lineal es significativa, se realizó el test estadístico t de student, calculando tr con la ecuación (1) con n-2 grados de libertad y se comparó con el t tabulado para un nivel de confianza establecido (α=0.05) y t regresión debe ser mayor que el t de tabla, para rechazar la hipótesis nula y asi la correlación lineal es significativa. 𝒕𝒓 =

|𝒓|√(𝒏 − 𝟐) √𝟏 − 𝒓𝟐

(𝟐)

Dónde: r: Coeficiente de correlación r2: Coeficiente de determinación n: número de puntos en la curva de calibrado tr: valor de t calculado (n-2): grados de libertad

Además, para afirmar la validez del modelo lineal se realizó un análisis de residuos, se calculó la prueba t de significancia para la pendiente y el intercepto y se realizó una análisis de varianza.

56

4.4.2.2.

Precisión evaluada como repetibilidad y precisión intermedia

Repetibilidad: Se analizaron el mismo día muestras de orina fortificadas a 3 niveles de concentración por triplicado (1ug/L; 50ug/L; 100ug/L). A todas las concentraciones se les aplicó el procedimiento de extracción ya establecido. Se calculó la precisión como el coeficiente de variación con la ecuación 5. Los criterios de aceptación en cada nivel de concentración y como promedio de las 3 concentraciones diferentes, fueron CV ≤ 15.

Tratamiento estadístico de datos

Para establecer si la concentración no afecta la variabilidad de los resultados se aplicó un test de Cochram (Ec. 3), además se evaluó la precisión utilizando como criterios de aceptabilidad el coeficiente de variación de Horwitz (Ec 4) como criterio de aceptación debe cumplirse qué %CVr < %CVh/2. 𝐆𝐜𝐚𝐥𝐜 = (

𝟐 𝐬𝐌𝐀𝐗 ) (3) ∑ 𝐬𝐈𝟐

Dónde: S2MAX: varianza mayor en la curva de calibrado. ∑S2I: suma de las varianzas de todos los puntos de la curva de calibrado. Y luego se compara con el G tablas para k= 4; n= 3 y α= 0.05 Donde k es el número de grupos y n el número de determinaciones por grupo

𝑪𝑽𝒉 % = 𝟐(𝟏−𝟎.𝟓) 𝐥𝐨𝐠 𝑪 (4)

Dónde 57

C= valor nominal del analito expresado en potencia de 10

4.4.2.3.

Precisión intermedia

Se realizó aplicando el procedimiento de extracción respectivo en tres muestras en 2 días diferentes por distinto analista. Esta se evaluó a una concentración de 50 ug/L para el metabolito y se determinó con la ecuación (5)

𝑠 𝐶𝑉(%) = ( ) 100 (5) 𝑥

Dónde:

𝑠 = desviación estándar ̅ =media aritmética de los resultados 𝒙

Tratamiento estadístico de datos

Se compararon las medias de las inyecciones en los días diferentes mediante una prueba t; no debe haber diferencia significativa al nivel de confianza del 95% (α=0,05). |

𝒕𝒄𝒂𝒍 =

𝟏− 𝟏 𝟏 + 𝒏𝟏 𝒏𝟐

𝑺√

Dónde: 1:

media de medidas día 1

2:

media de medidas día 2

n1: número de medidas día 1 n2: número de medidas día 2 58

𝟐|

(6)

S viene dada por 𝑺𝟐 =

4.4.2.4.

(𝒏𝟏 −𝟏)𝑺𝟐𝟏 +(𝒏𝟐 −𝟏)𝑺𝟐𝟐 𝒏𝟏 +𝒏𝟐 −𝟐

(7)

Límite de cuantificación y detección.

Se determinaron mediante un scam al inyectar estándares de 0.01 y 0.025 ug/L por debajo del primer punto de la curva de calibrado y se calcularon los límites de cuantificación y detección como 5 y 3 veces el valor de la señal/ruido respectivamente para cada uno

4.4.2.5.

Exactitud.

Se fortificaron muestra de orina a 3 niveles de concentración (1ug/L; 50ug/L; 100ug/L) dentro de la curva de calibrado. La exactitud del método se evaluó determinando el porcentaje de recuperación de 1-hidroxipireno en las muestras fortificadas y se determinó el porcentaje de recuperación con la ecuación 8: %𝑹 = (

𝑿𝒐𝒃𝒕 ) 𝟏𝟎𝟎 (8) 𝑿𝒇𝒐𝒓𝒕

Dónde: Xobt es la media de las recuperaciones de las réplicas. Xfort es la concentración a la que se fortifica Como criterio de aceptación en base al valor obtenido para la recuperación se utilizaron los criterios de la AOAC del 2012 de España.

59

Tratamiento estadístico de datos Se realizó la prueba t student bilateral para un nivel de confianza del 95% con la ecuación 9. Si el tcal≤tcrit no existen diferencias estadísticamente significativas. 𝒕𝒄𝒂𝒍 =

4.4.2.6.

|𝟏𝟎𝟎 − %𝑹| 𝑺𝑿√𝒏

(𝟗)

Calculo de la incertidumbre de medida para 1-hidroxipireno

Se realizaron los cálculos de los componentes de la incertidumbre del método para el análisis de 1-hidroxipireno en orina para estándares a nivel bajo, medio y alto preparados en el laboratorio y para calcular la incertidumbre combinada total, se realizó la suma individual de los componentes (Eurachem, 2012).

Especificación del mensurando

Determinar la cantidad de 1-hidroxipireno (ug de 1-OHPyr/ mol creatinina) en muestras de orina tomando un volumen de 10 mL de orina al que seguidamente se le agrega 10 mL de una solución buffer de ácido acético/acetato de sodio 0.2 M a pH 5.0 y 100 μL de la enzima βglucoronidasa/Arilsufatasa,, se ajusta el pH a 5.0

con la adición de ácido acético (si es

necesario) y se lleva a un baño termostatado a 37°C por 17 horas a 30 rpm, posteriormente se le realiza una extracción en fase sólida con cartuchos Hypersep retain PEP, previamente acondicionados con 5mL de metanol y 5.0 mL de agua desionizada. Se hace pasar la muestra a través del cartucho a un flujo constante, una vez finalizado se seca por 1 minuto con una bomba de vacío y se eluye con 10 mL de acetonitrilo; ya eluidos los extractos se le realiza una limpieza usando una columna empacada con alúmina previamente acondicionadas con 1.0 mL de acetonitrilo. Finalmente, se lleva a analizar en el sistema cromatográfico.

60

Identificación de las fuentes de incertidumbre

Las mediciones involucradas en el ensayo y sus respectivos aportes a la incertidumbre del resultado se pueden apreciar en la figura 14.

Figura 14: Diagrama de causa y efecto para la incertidumbre de 1-hidroxipireno

61

Tabla 1: Fuentes individuales de cada una de las incertidumbres Proceso

preparación de las soluciones estándares

Curva de calibración

Análisis de muestras

Factor Pureza del patrón Alícuota de solución concentrada a partir de la cual se prepara cada dilución (el aporte se cuenta tantas veces como diluciones se efectúan) Volumen preparado de solución diluida (el aporte se cuenta tantas veces como diluciones se efectúan) Alícuota de estándar (el aporte se cuenta tantas veces como blanco y estándares se procesan para la curva de calibración) Absorbancia de los estándares Preparación de la muestra* Área de la muestra

Fuentes individuales Certificado del reactivo Calibración de la pipeta aforada Temperatura de medición Diferencia de T respecto a 20 ºC Repetibilidad de medición* Calibración del balón aforado Diferencia de T respecto a 20 ºC Repetibilidad de medición* Calibración de la pipeta aforada Temperatura de medición Diferencia de T respecto a 20 ºC Repetibilidad de medición* Repetibilidad de medición* Ajuste de pH* Eficacia de la extracción de la muestra* Interferencias en el proceso* Repetibilidad de medición* Repetibilidad de medición*

Calibración de la pipeta aforada Temperatura de medición Alícuota de muestra a diluir Diferencia de T respecto a 20 °C Repetibilidad de medición* Dilución de muestras Calibración del balón aforado Temperatura de medición Volumen de aforo de la dilución Diferencia de T respecto a 20 °C Repetibilidad de medición* desviación estándar de la pendiente curva de calibrado Cálculo del intercepto Cálculo del resultado desviación estándar de los residuales Resultado final* Redondeo de cifras* * El aporte de estas fuentes está incluido en el valor de repetibilidad de medición, por cuanto éste se obtuvo de los resultados de medición de varias muestras y estándares durante varios días, lo que implica la variación aleatoria de tales fuentes.

Tabla 2: Tipo de distribución de las fuentes individuales de incertidumbre Fuentes individuales Certificado de pureza de los reactivos Tolerancia de los matraces Temperatura de medición Diferencia de T respecto a 20 °C Repetibilidad de medición Calibración de la balanza Resolución de la balanza

Tipo de distribución Rectangular Triangular Rectangular Triangular Promedio Expandida Rectangular

62

Modelo Matemático

(Á𝑟𝑒𝑎 − 𝑏) ∗ 𝑉𝐹 𝑢𝑔 1 − 𝑂𝐻𝑃𝑦𝑟 = ∗ 𝐹𝐶𝐸 ∗ 𝐹𝑃 ∗ 𝐹𝑅 ∗ 𝐹𝐶𝑅 + 𝐹𝑅𝐸𝐷 (21) 𝐿 𝑉𝐼 ∗ 𝑚 Dónde: FCE: Concentración de estándares FCR: Factor de corrección de creatinina FP: Factor de precisión FR: Factor de recuperación FRED: Factor de redondeo b: Intercepto m: Pendiente VF: Volumen final del extracto VI: Volumen inicial de muestra

Cuantificación de los componentes de la incertidumbre

Cada una de las fuentes individuales de incertidumbre se cuantificó según los lineamientos establecidos en el procedimiento de estimación de incertidumbre Eurachem (2012), con los resultados reales mostrados en cada una de las componentes. Para cada fuente individual de la incertidumbre su respectivo valor se obtiene del origen indicado en dicha matriz que se muestra en la tabla 2 y para convertir cada componente de la incertidumbre a su respectiva incertidumbre estándar se emplean los criterios según el tipo de función de distribución indicado, mostrados en la tabla 3.

63

Por otro lado las contribuciones de cada una de las variables a la incertidumbre del resultado se calcularon como el cuadrado de cada incertidumbre multiplicada por el cuadrado del respectivo coeficiente de sensibilidad con la ecuación 10.

𝑛

𝑈𝐶 (𝑦(𝑥𝑛 )) =

𝑛

2 √∑ 𝑐𝑗2 𝑢(𝑥𝑗 ) 1

2

= √∑ 𝑢 (𝑦, 𝑥𝑗 ) (10) 1

Para los factores que se multiplicaban o dividían entre sí, se calculó la suma geométrica de las incertidumbres estándares relativos con la ecuación 11

2

𝑢𝑐 (𝑦(𝑝, 𝑞, … ) = 𝑦√(

2

𝑢(𝑝) 𝑢(𝑞) ) +( ) + … (11) 𝑝 𝑞

Para factores que se sumaban o restaban entre sí, se calculó la suma geométrica de las incertidumbres estándares individuales con la ecuación 12.

𝑢𝑐 (𝑦(𝑝, 𝑞, … ) = √𝑢(𝑝)2 + 𝑢(𝑞)2 + ⋯ (12)

Finalmente, la incertidumbre combinada mediante alguno de los tres modelos anteriores, se expandió por un factor de K=2 para que el valor calculado correspondiera aproximadamente al 95% de probabilidad de ser atribuido al mensurando, con lo que la incertidumbre expandida uc se calculó a nivel bajo, Medio y alto con la Ecuación 13.

𝑢𝑐 (𝑦) = 2𝑢𝑐 (𝑦) (13) 64

4.5. CUANTIFICACIÓN DE 1-HIDROXIPIRENO

Para el análisis cuantitativo de 1-OHPyr, se aplicó el método previamente validado a las muestras obtenidas durante el periodo de muestreo. La identificación del analito se realizó comparando el tiempo de retención de la muestra con el del estándar correspondiente. El análisis cuantitativo se realizó integrando el área bajo la curva de la respuesta del 1-OHPyr y aplicando la ecuación de regresión obtenida durante la validación del método. Los resultados de hidroxipireno urinario individuales fueron ajustados con la excreción de creatinina, por lo que los resultados se reportan en μg 1-OHPyr/mol de creatinina.

4.6. CUANTIFICACIÓN DE FENOL

Para el análisis cuantitativo de fenol, se aplicó el TÉCNICA 8305/85 de la NIOSH. Determinación de Fenol Y p-Cresol en orina (Garcia A, 2012). El cual es un método previamente validado en el laboratorio de Toxicología y Gestión Ambiental de la Universidad de Córdoba.

4.6.1 Preparación y análisis de las muestras

Se tomaron 5.0 mL de orina en un vial de 12.0 mL y se le adicionó 1.0 mL de ácido clorhídrico concentrado (HCl), se calentó en un baño de agua a 95°C por 90 minutos, se dejó enfriar y se le adicionó el estándar interno (nitrobenceno) y se extrajo con 2.0 mL de éter dietilico grado cromatografico. El extracto obtenido fue analizado en un cromatógrafo de gases acoplado a masas (con detector de impacto electrónico) marca Thermo Electron TRAGE 1310 GC-ULTRA.

4.7. CUANTIFICACIÓN DE ÁCIDO HIPÚRICO Y METILHIPÚRICO EN ORINA 65

Para la determinación de los metabolitos urinarios se tomó como referencia el método 8301 de la NIOSH (2003) con algunas modificaciones al método de Kongtipa . El cual es un método previamente validado en el laboratorio de Toxicología y Gestión Ambiental de la Universidad de Córdoba, por villar y valencia (2012).

4.7.1. Extracción y análisis de las muestras

Se tomó 1.0 mL de la muestra de orina y se le adicionó agua destilada. La mezcla se extrajo con acetato de etilo; seguidamente se evaporó la fase orgánica, Los residuos se reconstituyeron con una solución 2.0 M de HCl/MeOH, posteriormente se agregó 0.3 mL de la solución del patrón interno (ácido heptadecanoico), luego se lleva a calentamiento a 40°C por 35 minutos. La mezcla se dejó enfriar a temperatura ambiente y se extrajo con diclorometano después de la adición de agua destilada. El extracto fue analizado en un cromatógrafo de gases acoplado a masas (con detector de impacto electrónico) marca Thermo Electron TRAGE 1310 GC-ULTRA.

a. ácido hipúrico. O

O

O

OH NH

+

NH H3C

OH

CH3

HCl

+

H2 O

O

O ácido benzoilamidoacético

benzoilamidoacetato de metilo, BAAM

b. ácido 3-metil hipúrico. O

O

O

OH NH

+

H3C

OH

NH

HCl

CH3

+

H2 O

O

O CH3

CH3 ácido 3-metilbenzoilamidoacetico

3-metilbenzoilamidoacetato de metilo,

66

3MBAAM

c. ácido 4-metil hipúrico.

H3C

H3C

+

NH

H3C

OH

O

HCl

+

O

NH

OH

H2O

CH3 O

O ácido 4-metilbenzoilamidoacetico

O 4-metilbenzoilamidoacetato de metilo, 4MBAAM

d. ácido heptadecanoico. O H3C

O

OH

15 ácido heptadecanoico

+

H3C

OH

HCl

H3C

CH3 O 15 heptadecanoato de metilo

+

H2 O

Figura 15: Reacción de esterificación de: a. ácido hipúrico, b. ácido 3-metil hipúrico, c. ácido 4-metil hipúrico y d. ácido heptadecanoico.

4.8.

DETERMINACIÓN DE CREATININA EN ORINA

Para la determinación de creatinina en orina se tomó como referencia el Método de Detección Ultravioleta en modo Isocratico/Cromatografía Liquida de Alta Resolución MTA/MB – 027/A08 del INSHT (2008) de España. La concentración de creatinina se calculó con el objetivo de corregir los valores de concentración de los metabolitos determinados en este estudio por efecto de los fenómenos de dilución o saturación excesivas que se pueden ocasionar en muestras puntuales para control biológico como es el caso de la orina, ya que esta es un producto final endógeno del metabolismo humano y su paso o aclaramiento desde la sangre al túbulo renal se realiza por filtración glomerular, no se reabsorbe por los túbulos renales y es teóricamente proporcional a su concentración en sangre. Puesto que la excreción de creatinina permanece relativamente constante para cada sujeto, mientras que el volumen de excreción urinario puede variar 67

apreciablemente, se utiliza el nivel de creatinina en la orina como índice al que referir los valores de sustancias y/o sus metabolitos que se eliminan de igual forma a través de filtración y no se reabsorben (Alessio et al, 1985), como es el caso del 1-hidroxipireno.

4.8.1. Preparación y análisis de muestras

La muestra de orina se llevó a temperatura ambiente, seguidamente se tomaron 10 μL en viales para inyector automático y se adicionó 990 μL de agua desionizada, se encapsuló el vial y se determinó la concentración de creatinina mediante HPLC-UV en un espectrofotómetro Ultimate 3000 marca Thermo Dionex

4.9. CONTROL DE CALIDAD

Para obtener un grado de confiabilidad de los resultados obtenidos en la cuantificación de los metabolitos, se establecieron distintos criterios de control, entre los cuales estuvieron: curva de calibrado, aceptada si poseía un coeficiente de correlación mínimo de 0.995. Se incluyó la medición de blancos para determinar la calidad óptima de los reactivos y la recuperación para establecer la reproducibilidad del método. Se midieron duplicados junto con las muestras y se les calculó la desviación estándar de las medidas.

4.10. ANÁLISIS ESTADÍSTICO

Para el análisis estadístico se utilizó el paquete estadístico Statgraphics Centurión XVI. Se evaluó en primer lugar si los datos tenían o no distribución normal mediante la prueba de Shapiro-Wilk, el sesgo estandarizado, la curtosis estandarizada, para luego describir las variables continuas mediante medidas de tendencia central y dispersión, los datos no presentaron una distribución normal, por lo que se aplicó estadística no paramétrica. Se realizó el test de Mann 68

Whitney para evaluar diferencias estadísticamente significativas entre el grupo control y el expuesto, posteriormente se evaluó la correlación entre los biomarcadores y las variables edad, hábito tabáquico, consumo de alcohol, género y tiempo laborando en las EDS mediante correlaciones de Spearman, las cuales no se ven influidas por los valores fuera de rango (valores atípicos).

Con el fin de facilitar la interpretación de los datos, los valores de referencia seleccionados fueron los establecidos por el comité de la Conferencia Americana de Higienistas Industriales del Gobierno de los Estados Unidos (American Conference of Govemmental Industrial Hygienists ACGIH) y el Instituto Nacional de Seguridad, Salud y Bienestar en el Trabajo (INSSBT, 2018) de España.

69

5. RESULTADOS Y ANÁLISIS

5.1. CONDICIONES CROMATOGRÁFICAS

Un scam con el FLD permitió seleccionar las longitudes de onda de mayor señal para 1hidroxipireno la cual fue de 242 nm para la longitud de onda de excitación y de 388 nm para la longitud de onda de emisión. En la tabla 3 se muestran las condiciones cromatográficas óptimas para el análisis de 1-OHPyr y en la figura 16 los cromatogramas empleando como fases móvil a) MeOH:H2O y b) ACN:H2O . Tabla 3: condiciones cromatográficas óptimas A agua B metanol Isocratica B-A 80-20 % Excitación 242 nm Emisión 388 nm 30° C 1ml/min 10 μL 10 minutos

Fase móvil Elución Longitud de onda Temperatura Flujo Volumen de inyección Tiempo de análisis

a)

b)

Figura 16: Cromatogramas de 1-hidroxipireno empleando como fase móvil a) MeOH:H2O b) ACN:H2O

70

En la figura 16 se puede observar que cuando se trabajó con MeOH:H2O en las proporciones indicadas en la tabla 4 se obtiene una buena separación, pico simétrico y totalmente resuelto, además de una buena reproducibilidad, mientras que con ACN:H2O no se dio una buena resolución, ni reproducibilidad del pico del analito, lo cual se podría deber a que el acetonitrilo presenta una mayor fuerza eluyente que el metanol, por tanto desplaza al analito.

Por otro lado la extracción en fase solida (SPE) mostró mejores resultados de extracción del metabolito empleando columnas de Hypersep Retain PEP, acondicionados con metanol y eluidos con acetonitrilo, que las columnas de C18 empleado el mismo acondicionamiento, lo cual se debe a que las columnas de Hypersep Retain PEP presentan mayor capacidad de adsorción, mayor cinética de adsorción/desorción y alta selectividad por el analito. En la limpieza de los extractos obtenidos de la extracción se obtuvo mejores resultados empleando alúmina en vez de florisil, lo cual se podría deber a que la alúmina no presenta o tiene menor interacción con el analito que el florisil, por tanto este no es retenido en ella. Los resultados obtenidos se pueden apreciar en la figura 17

Figura 17: Porcentajes de recuperación empleando diferentes columnas de extracción

71

5.2.

PARÁMETROS DE VALIDACIÓN

Tabla 4: Resumen de los parámetros de validación para 1-hidroxipireno, estadística y criterios de aceptación PARÁMETROS

RANGO LINEAL

0.1-100

ESTADÍSTICOS Treg=235.992 T STUDENT Ttabla= 2.776 F=11523.13 A. VARIANZA Fcrit=4.516E-08 Ttabla=2.13 P. T PENDIENTE Texp=84.94

2

r :0,9999

Ttabla=2.13

P. T INTERCEPTO CONCENTRACIONES LÍMITES P. REPETIBILIDAD PRECISIÓN (%CV) P. INTERMEDIA

EXACTITUD

INCERTIDUMBRE

%R

K=2

Texp=1.64

CRITERIOS Treg>Ttabla F>Fcrit Texp>Ttabla Texp
LOD

0.01

S/N>3

-

LOQ

0.02

S/N>5

-

BAJO

5.96

MEDIO

5.92

<15%

ALTO

5.35

<30%

BAJO

4.47

<15%

MEDIO

5.91

ALTO

5.88

<30%

BAJO

101.59

40-120

MEDIO

92,39

TEST DE COCHRAM

PRUEBA T

PRUEBA T

Gexp=0.082 Gtabla=0.767

Tcal=2.512 Tcrit=2.776

Tcal=0.842 Tcrit=4.303

<21%

<21%

60-110

ALTO

89.69

80-110

BAJO

1 ± 0.02

-

MEDIO ALTO

50 ± 1.88 100 ± 5.42

-

En la tabla 4 se observa un resumen de los parámetros de validación. El rango lineal para la curva de calibrado de 1-hidroxipireno estuvo comprendido entre 0.1-100 ug 1-OHPyr/L, con coeficiente de correlación de 0.9999; el análisis estadístico t student

mostró una relación

estadísticamente significativa entre las variables área y concentración, el análisis de varianza demostró que la pendiente es distinta de cero, los residuales presentaron una distribución aleatoria y no reflejaron ninguna tendencia demostrando homocedasticidad, la significancia estadística para la pendiente y la ordenada en el origen muestran que la pendiente es significativamente distinta de cero y que el intercepto es significativamente igual a cero. De acuerdo a los datos anteriores se puede decir que existe linealidad en la curva de calibrado para 1-OHPyr, siendo así aprobado el intervalo de trabajo para la validación de 1-hidroxipireno.

72

El límite de detección del método fue de 0.01 μg/L calculado como 3 veces el valor de la señal/ruido, mientras que el límite de cuantificación fue de 0.02 calculado como 5 veces el valor de la señal/ruido, la precisión evaluada como repetibilidad y precisión intermedia se encontró dentro de los coeficientes de variación aceptables (<15%) establecidos por la AOAC (2002), demostrando que el método es repetible en los niveles de concentración de la curva de calibrado y preciso. Además el análisis del test de Cochram mostró que el factor concentración no influye en la variabilidad de los datos y en la prueba t de student para precisión intermedia no se encontraron diferencias estadísticamente significativas entre las medias, lo que quiere decir que la probabilidad de que exista una diferencia debida al azar es menor del 0.05%.

Los %R obtenidos cumplen con los criterios de aceptación según la AOAC (2002) (Tabla 4) para cada uno de los niveles en estudio (1, 50 y 100 ug 1-OHPyr/L) además la prueba t student determinó que no existen diferencias estadísticamente significativas entre los % R (Tabla 4) por lo que no fue necesaria ninguna corrección, finalmente se calculó la incertidumbre expandida por un factor de K=2, mostrando incertidumbres menores al 10% para cada uno de los niveles de concentración en estudio como se observa en la Tabla 4. En conclusión los resultados obtenidos para la validación en este trabajo cumplieron con los criterios de aceptación establecidos por la AOAC (2002), además coinciden con los reportados por otros autores (F. Jongeneelen, Anzion, & Henderson, 1987; Montes, Urbieta, & Eguiarte, 2001) e inferiores al reportado por (Chetiyanukornkul et al., 2002) demostrando así, que el método aquí validado puede ser empleado para el análisis de 1-OHPyr en orina.

5.3. CUANTIFICACIÓN DE 1-HIDROXIPIRENO, FENOL, ÁCIDO HIPÚRICO Y ÁCIDO METILHIPÚRICO EN ORINA

En relación con la concentración de 1-hidroxipireno en el grupo expuesto (Tabla 5), la mediana fue de 29.59 ug/mol creatinina para 1-OHPyr con diferencias estadísticamente significativas entre la población expuesta y la no expuesta para 1-OHPyr (M-W=67, p<0.001).

73

Tabla 5: Resumen estadistico de los biomarcadores de exposición según el tipo de exposición laboral a COV´s Biomarcador

Media

Mediana

46.86 14.95

29.59 10.97

26.84

1.40

ug 1-OHP/mol creatinina EXPUESTOS NO EXPUESTOS Fenol mg/g creatinina Expuestos

Mínima

Máxima

Sesgo Estandarizado

Curtosis Estandarizada

ValorP S-W

ValorP M-W

47.92 7.45

8.99 4.12

192.67 59.81

4.51 4.41

4.37 6.63

<0.05

<0.001

3.90

ND

351.22

6.06

11.70

<0.05

0.004

<0.05

0.02

<0.05

0.19

<0.05

0.05

R. INT.

0.69 0.39 1.31 ND 2.20 1.78 -0.09 No expuestos mg AH/g creatinina 33.09 8.22 25.07 ND 154.07 3.41 0.88 EXPUESTOS 12.35 2.88 6.50 ND 67.69 3.57 2.77 NO EXPUESTOS mg Acid 3-MH/g creatinina 0.43 0.26 0.28 ND 1.55 2.92 1.86 EXPUESTOS 0.18 0.12 0.25 ND 0.34 1.17 NO EXPUESTOS mg Acid 4-MH/g creatinina 0.44 0.29 0.24 ND 2.04 4.65 5.97 EXPUESTOS 0.28 0.14 0.18 ND 0.87 1.96 0.07 NO EXPUESTOS S-W: prueba Shapiro-Wilk; M-W: prueba w de Mann-Whitney; ND: No detectable; R.INT= rango intercuartilico

Tabla 6: Porcentajes del hábito tabáquico y consumo de alcohol en el grupo expuesto y el grupo control Grupo (n)

Cargo

Administrador Expuesto (31) Despachador

Género

Hábito Tabáquico

Consumo de Alcohol

Fuma (%)

No fuma (%)

Si (%)

No (%)

M

3.23

6.45

6.45

3.23

F

3.23

12.90

16.13

-

M

9.68

58.06

58.06

9.68

F

6.45

-

6.45

-

M

-

43.75

37.5

6.25

F

-

56.25

43.75

12.5

Control (17)

74

1-OHPyr

Fenol

log 10 mg metabolito/g creatinina

100

Acido 3-MH AH Acido 4-MH

10

1

0.1

0.01 20-30 años

31-40 años

>40 años

Figura 18: concentraciones de los metabolitos según grupo etáreo

log 10 mg metabolito/g creatinina

1000

1-OHPyr

AH

Fenol

Acido 3-MH Acido 4-MH

100 10 1 0.1 0.01 <5 años

5-10 años

11-20 años

>20 años

Figura 19: concentraciones de los metabolitos según antigüedad en la EDS

Al comparar los resultados de 1-OHPyr del grupo expuesto y del grupo control (Anexo E), se puede observar que la mayor concentración de 1-OHPyr se encontró en el grupo expuesto perteneciente al área administrativa y de género femenino, con una concentración promedio de 80.14 ug 1-OHPyr/mol de creatinina, cabe resaltar que en este grupo es donde se encuentra la persona con mayor concentración de 1-OHPyr de 192.67 ug/mol de creatinina, esto puede ser debido a que el área administrativa está cercana al área de los despachadores, además de que él 75

sujeto manifestó que fumaba e ingería bebidas alcohólicas; adicionalmente, como se puede observar en la Tabla 6, en el área administrativa (pertenecientes al género femenino) el 3.23% fuma y el 16.13% consume bebidas alcohólicas, lo cual puede aumentar el riesgo cancerígeno de los HAP´s, ya que el alcohol tiene un efecto estimulante en la actividad del sistema enzimático P-450, lo cual puede ocasionar un aumento en la concentración de los metabolitos de los HAP´s considerados procancerigenos, ya que el citocromo P-450, además del papel detoxificador también puede ser mediador de la activación de precarcinógenos (Zhang et al, 2001 ), no obstante, en los resultados no se encontró correlación estadísticamente significativa entre los valores promedios de 1-OHPyr y el consumo de alcohol, a diferencia de otros autores, entre ellos Van Delft et al (2001) y Zhang et al (2001), quienes encontraron que el consumo de alcohol afecta la excreción de 1-OHPyr y Chen et al (2007), quien concluyó en su estudio que el hábito tabáquico incrementa los niveles de 1-OHPyr por la presencia de HAP´s en el humo de cigarrillo.

Por otro lado cabe resaltar que en el grupo expuesto los individuos que se desempeñan como despachadores fueron el grupo donde se presentó el mayor número de casos de trabajadores con niveles elevados de 1-OHPyr (180.43; 112.96 y 152.14 ug 1-OHPyr/mol de creatinina), situación esperada debido a que es el área de mayor exposición, demostrando así la alta exposición a HAP´s. los resultados de 1-OHPyr encontrados en este estudio (4.12 – 192.67 ug 1-OHPyr/mol de creatinina) fueron superiores a los hallados por Zhan et al (2008) (0.91-3.02 ug 1-OHPyr/mol de creatinina e Ifegwu et al (2012) (0.48 ug 1-OHPyr/mol de creatinina) en despachadores de estaciones de servicio.

Es preocupante que estas personas manejen tan altos niveles de este metabolito en sus riñones ya que podrían verse afectados a largo plazo, ya que aunque no se ha establecido un límite biológico de exposición (Oliveira et al., 2009) para el 1-OHPyr, el comité de la Conferencia Americana de Higienistas Industriales del Gobierno de Estados Unidos (American Conference of Industrial Hygienists-ACGIH, 2003), recomienda que un valor de dicho metabolito que exceda el nivel de 0.49 μmol de 1-OHPyr/mol de creatinina (106.94 μg 1-OHPyr/mol de creatinina) debe ser considerado como un nivel de exposición a HAP´s, debido a que dicho valor resulto de la observación en individuos sin exposición ambiental ni ocupacional significativa, incluyendo los 76

fumadores (Jongeneelen, 2004). En este estudio se encontraron valores por encima del establecido por la ACGIH en el 2003 para 1-OHPyr (180.43; 152.14; 112.96 y 192.67 μg 1OHPyr/mol de creatinina).

Estas altas concentraciones se debe a que los trabajadores no usan ningún tipo de elementos de bioseguridad, por lo cual no es posible mitigar la exposición al combustible en sus jornadas largas de trabajo, además de la exposición ambiental a la que podrían estar expuestos debido al flujo vehicular. Por otro lado cabe resaltar que en este estudio el 74% de los trabajadores expuestos son encargados del despacho del combustible (Anexo E). Por lo cual están expuestos a los vapores del combustible y debido a que las EDS se localizan en zonas de flujo vehicular se pudo producir exposición debido al tubo de escape de los automóviles o bien por la adherencia que presentan las partículas de HAP´s al polvo y otras partículas en el aire.

El mayor número de casos de 1-OHPyr por intervalos de concentración se encontró en el intervalo de 21-40 ug 1-OHPyr/g-creatinina con un 14%, los niveles de este metabolito según grupo etáreo (Figura 18) no presentaron diferencias estadísticamente significativas (K-W= 1.42; Valor-P= 0.49; α= 95%), al igual que los niveles de 1-OHPyr según antigüedad (Figura 19) en la EDS (K-W= 5.3; Valor-P= 0.15; α= 95%), cabe resaltar que en cada uno de los intervalos del grupo etáreo se encontró niveles por encima de los establecidos por ACGIH en el 2003, mientras que según la antigüedad en las EDS los valores más altos se encontraron en personas entre 0-10 años, encontrándose el mayor número de casos entre 5-10 años, no obstante al establecer el grado de asociación según grupo etáreo, antigüedad y género no se encontró correlación estadísticamente significativas (Anexo E).

La mediana para el fenol fue de 1.40 mg/g creatinina para el grupo expuesto y de 0.39 para el grupo control, fluctuando entre no detectables y 351.22, encontrándose la mayor concentración en el grupo expuesto de 351.22 mg fenol/g creatinina, el cual excede el límite biológico de exposición de 50 mg fenol/g creatinina (ACGIH, 2008).

77

Al relacionar la concentración del metabolito para el grupo expuesto y el grupo control (Tabla 5) se encontraron diferencias estadísticamente significativas (M-W=44; p=0.004), lo que nos confirma que evidentemente que las personas que laboran en las EDS se encuentran más expuestas a benceno, encontrándose en 1 (6.67%) trabajador expuesto la concentración más alta de 351.22 mg/g creatinina, perteneciente al grupo etáreo >40 años (Figura 18), con una antigüedad entre 21-30 años de estar laborando en la EDS (Figura 19) el cual superó el valor límite biológico establecido por ACGIH en el 2008. Además, no se encontraron diferencias estadísticamente significativas dentro del grupo etáreo (K-W=3.87, P=0.14), ni dentro de la antigüedad en la EDS (K-W=2.87, P=0.41).

Sin embargo, la mayoría de estas concentraciones se encontraron en el intervalo de 0-20 mg fenol/g creatinina, lo cual concuerda con los niveles de fenol encontrados en otros estudios a bajas exposiciones de benceno, Torres et al (2008) quienes hallaron en tan solo un 3.3% de los trabajadores expuestos niveles superiores a los índices fijados para el fenol urinario, además para concentraciones que sobrepasan los 20 mg/g creatinina, Lauwerys (1994) sugiere una probable exposición a benceno, aunque no concluyente. Por otro lado, al correlacionar las concentraciones del metabolito de acuerdo al género, grupo etáreo, antigüedad, cargo, hábito tabáquico y consumo de alcohol, solo se encontró correlación con el grupo etáreo ( p=0.049) y hábito tabáquico (p=0.04) con un nivel de confianza del 95% (Anexo E).

La presencia de fenol en la orina del grupo control no fumadores, pudiera explicarse en parte debido a exposición al humo de cigarrillo o al ambiente en general, además de que existen otras fuentes de exposición al benceno para la población, tales como las emisiones del tubo de escape de automóviles, además de que el benceno es un contaminate común del medio ambiente, de trabajo, del hogar y ambiente en general (Cárdenas et al, 2007)

En cuanto a la cuantificación de AH en el grupo expuesto la mediana fue de 8.22 mg AH/g de creatinina, fluctuando entre no detectables y 154.07 mg AH/g creatinina (Tabla 5). Las concentraciones más altas se encuentran en el grupo expuesto, en los despachadores con una 78

concentración promedio de 46.70 mg AH/g creatinina y con concentraciones de (154.07; 129.14; 127.40 y 124.36 mg AH/g creatinina), sin embargo ninguno de estos valores excede el límite de referencia establecido por ACGIH en el 2007 de 1600 mg AH/g creatinina, pero claramente se puede observar que los niveles de AH en las estaciones de servicio son mayores, debido a que se encontraron diferencias estadísticamente significativas entre el grupo expuesto y el grupo control (M-W=146.5, P=0,02).

El mayor número de casos se presentó en el intervalo de 0-10 mg AH/g creatinina con 15 (51.72%) trabajadores. Por otro lado en el grupo etáreo (Figura 18) la mayor concentración se presentó en los trabajadores cuya edad es mayor a 40 años con un promedio de 47.35 mg AH/g creatinina, con un mínimo de 2.88 y un máximo de 154.07 mg AH/g creatinina, mientras que según antigüedad en la EDS las concentraciones más altas se ubicaron en el rango de 11-20 años con un promedio de 41.41 mg AH/g creatinina, seguido del rango de <5 años con un promedio de 36.31 mg AH/g creatinina, sin embargo la persona con la concentración más alta se encontró en el rango de 5-10 años de antigüedad en la EDS, con 154.07 mg AH/g creatinina (Figura 19), pero no se encontraron correlaciones estadísticamente significativas entre la edad, antigüedad, género y las concentraciones de AH en orina (P>0.05), esto nos confirma que la concentración del metabolito en orina no depende del género, ni de la edad y al no existir correlación con la antigüedad en la empresa nos indica exposiciones recientes y por tanto no son útiles como indicadores de carga corporal (Huici, 2005). Esto se debe a que generalmente este metabolito se elimina completamente después de la jornada laboral (Caro Hidalgo et al., 2009) lo cual constituye una de las limitaciones señaladas por algunos autores para el uso de biomarcadores, los cuales mencionan que su uso parece restringirse a ratificar si existió o no biotransformación al momento del estudio en trabajadores (Haro, González, Chacón, Pérez, Juárez & Borja, 2008)

Se encontró correlación relativamente débil (p<0.05) entre el consumo de alcohol y la concentración de AH en la orina, este hecho podría ser explicado debido a que esta sustancia, junto con otras como gaseosas, enlatados con conservantes a base de ácido benzoico o benzoato de sodio, pueden ser metabolizadas a AH en el organismo por tanto puede provocar un aumento en los niveles de este metabolito en la orina. Este hecho puede hacer que a bajas concentraciones 79

de exposición a tolueno, la determinación de los niveles de AH resulte poco específica, ya que prevalecerían las diferencias individuales en ambos grupos, expuestos y no expuestos (Alessio et al, 1993 & Aldazábal, Manrique, Ortelli, Martínez & Calabrese, 2005), sin embargo se encontraron diferencias estadísticamente significativas entre los dos grupos (W=146.5; ValorP=0.02).

Por otro lado, no se encontraron diferencias estadísticamente significativas dentro de los rangos del grupo etáreo (K-W=1.61; Valor-P=0.65), ni dentro de los rangos según la antigüedad en la empresa (K-W=3.87; Valor-P=0.14), ni entre el género (K-W=1.14; Valor-P=0.28). Los resultados obtenidos en este estudio concuerdan con otros estudios donde los valores medios encontrados son <500mg AH/g creatinina (Cárdenas et al, 2007 & Torres et al, 2008) e inferiores a los reportados por Palma en el 2015 (0-4532.7 mg AH/g creatinina) por exposición ocupacional a tolueno.

En cuanto a la cuantificación de ácido 3- MH y 4-MH no se encontraron diferencia estadísticamente significativas entre el grupo expuesto y el grupo control (p>0.05), con medianas de 0.26 mg ácido 3-MH/creatinina y 0.29 mg ácido 4-MH/ g creatinina para el grupo expuesto y de 0.12 mg ácido 3-MH/creatinina y 0.14 mg ácido 4-MH/ g creatinina para el grupo control, al igual que no se encontraron correlaciones con el grupo etáreo, con la antigüedad en la EDS, hábito tabáquico y consumo de alcohol. Los resultados obtenidos en este estudio para ácido metilhipurico son inferiores a los reportados por Palma (2015) (0-2158.6 mg/g de creatinina) y por Pérez et al (2014) de (30-2227 mg/g creatinina), por lo que se podría decir que los valores de ácido metilhipúrico se encuentra dentro de los valores de la población sana.

Es importante tener en cuenta que cuando las actividades laborales implican contacto con solventes orgánicos, las medidas de higiene y seguridad industrial juegan un papel importante en la prevención de los efectos asociados a su uso y de enfermedades de alto costo social. En este estudio se evidenció el uso deficiente de los elementos de protección personal en la población expuesta, lo que hace que estas sustancias puedan penetrar fácilmente por vía inhalatoria y dérmica, con graves consecuencias en la salud debidas a la exposición, ahora si bien fue evidente 80

las diferencias entre el grupo expuesto y el no expuesto, ninguno de estos valores se encontró por encima del límite de referencia establecido por ACGIH en el 2007.

Vale la pena aclarar que los biomarcadores de exposición son indicadores de la dosis interna y no cuantifican el grado de exposición crónica ni de su acumulación. Por esto, son útiles sólo para exposiciones recientes o actuales, dado que tienen muy poca vida media y su utilidad se restringe a verificar si existió o no biotransformación en el momento de la observación de trabajadores crónicamente expuestos (Haro-García et al., 2012)

81

CONCLUSIONES

La evaluación de la exposición ocupacional a compuestos orgánicos volátiles, es una fuente de información importante para determinar si existió o no contaminación de los trabajadores de las estaciones de servicio de gasolina de la ciudad de Montería, ya que la determinación de sus metabolitos en muestras de orina, sirven como indicadores biológicos para valorar la exposición a este tipo de contaminantes. Los objetivos de este estudio se lograron alcanzar teniendo en cuenta que se evidencio la exposición de los trabajadores de las estaciones de servicio. 

Se optimizó una metodología analítica para la determinación de 1-OHPyr, los resultados de

la validación mostraron que la metodología es precisa y exacta, por tanto es confiable para utilizarla en la cuantificación de 1-hidroxipireno en orina como biomarcador ocupacional de la exposición a HAPs. 

Se encontraron concentraciones de 1-OHPyr por encima del valor de referencia establecido

por ACGIH en el 2003, lo que indica un mayor peligro para la salud de los trabajadores, ya que este metabolito es un indicador de la mayoría de los HAPs y algunos de ellos son considerados carcinogénicos y mutagénicos. 

El fenol presentó una correlación positiva moderada con el grupo etáreo y el hábito

tabáquico. esto indica que existe asociación entre la concentración de fenol con la edad y el hábito tabáquico, por tanto estas variables se deben de tener en cuenta en la determinación de fenol. Por otro lado se pudo evidenciar diferencias entre el grupo expuesto y el no expuesto, ratificando la exposición ocupacional a este metabolito. 

El AH presento correlaciones con el hábito tabáquico, el consumo de alcohol y el cargo.

Esto indica que estas variables presentan asociación con la concentración de ácido hipúrico y que por tanto se deben de tener en cuenta en la cuantificación de este metabolito. 

Las concentraciones de AH, 3-MH y 4-MH se encontraron dentro de los rangos de los

valores de referencia de la población “sana”, en lo que respecta a la exposición a tolueno y xileno.

82

RECOMENDACIONES



Concientizar al personal de trabajo de las estaciones de servicio que deben de minimizar la

exposición a estas sustancias con medidas como la vigilancia biológica y ambiental para determinar la concentración de estos compuestos en los lugares de trabajo y en los individuos. 

Establecer dotaciones de los elementos de protección personal indispensables para ejercer

las labores en las EDS y capacitarlos en su uso adecuado. 

Realizar actividades educativas y de capacitación para concientizar a los trabajadores sobre

los riesgos a los cuales están expuestos por el contacto con solventes y apego a las normas que garanticen el control de conductas inadecuadas, como el consumo de alimentos en el puesto de trabajo.

83

BIBLIOGRAFIA

Albers, P. (1995). Handbook of Ecotoxicology: Boca Raton: Lewis Publishers. Amakura, Y., Tsutsumi, T., Yoshimura, M., Nakamura, M., Handa, H., Matsuda, R., . . . Watanabe, T. (2016). Detection of Aryl Hydrocarbon Receptor Activation by Some Chemicals in Food Using a Reporter Gene Assay. Foods, 5(1). doi: 10.3390/foods5010015 Angerer, J., Ewers, U., & Wilhelm, M. (2007). Human biomonitoring: state of the art. International journal of hygiene and environmental health, 210(3), 201-228. ATSDR. (1995). Toxicological profile for polycyclic aromatic hydrocarbons. Disponible en http://www.atsdr.cdc.gov/toxprofiles/tp.asp?id=122&tid=25. Bartolomé, M., Ramos, J. J., Cutanda, F., Huetos, O., Esteban, M., Ruiz-Moraga, M., . . . Castaño, A. (2015). Urinary polycyclic aromatic hydrocarbon metabolites levels in a representative sample of the Spanish adult population: the BIOAMBIENT. ES project. Chemosphere, 135, 436-446. Beyer, J., Jonsson, G., Porte, C., Krahn, M. M., & Ariese, F. (2010). Analytical methods for determining metabolites of polycyclic aromatic hydrocarbon (PAH) pollutants in fish bile: a review. Environmental toxicology and pharmacology, 30(3), 224-244. Brizuela, J., & Jiménez, Y. (2010). Niveles urinarios de fenol y ácido hipúrico en trabajadores de una empresa de pintura automotriz. Salud de los Trabajadores, 18(2), 107-115. Caro Hidalgo, J., Gallego Fernández, M., & Montero Simó, R. (2009). Diferentes metodologías para la evaluación de riesgos originados por compuestos orgánicos volátiles (VOCs) en ambientes laborales. Seguridad y medio ambiente, 29(113), 20-36. Costa, A. F. (2001). Avaliação da contaminação humana por hidrocarbonetos policíclicos aromáticos: determinaçäo de 1-hidroxipireno urinário. Chetiyanukornkul, T., Toriba, A., Kizu, R., Makino, T., Nakazawa, H., & Hayakawa, K. (2002). Determination of 1-hydroxypyrene in human urine by high-performance liquid chromatography with fluorescence detection using a deuterated internal standard. Journal of Chromatography A, 961(1), 107-112. Denissenko, M. F., Pao, A., Tang, M.-s., & Pfeifer, G. P. (1996). Preferential formation of benzo (a) pyrene adducts at lung cancer mutational hotspots in p53. Science, 274(5286), 430. Eljarrat, E., & Barcelo, D. (2003). Priority lists for persistent organic pollutants and emerging contaminants based on their relative toxic potency in environmental samples. TrAC Trends in Analytical Chemistry, 22(10), 655-665. Eusebio Salinas, D., & Rodríguez Minaya, Y. E. (2007). Determinación de fenoles y ácido hipúrico en orina como indicadores de exposición al benceno y tolueno en trabajadores de confección y reparación de calzados del Mercado Virrey Amat del distrito del Rímac. Gandarillas Gonzales, O. (2015). Determinación de fenol en orina como indicador biológico de exposición al benceno en trabajadores de estaciones de servicio y vendedores de lubricantes en la zona central de la Ciudad de La Paz. García-Martínez, M. (2005). Los hidrocarburos policíclicos aromáticos asociados a combustibles fósiles: caracterización, análisis y remediación. Minas.

84

García-Miranda, C. E., Muñiz, B. F., & Sánchez, A. S. (2010). Organización de la actividad preventiva y gestión de la seguridad y salud laboral en la minería española: experiencia de las empresas certificadas ISO 9001. Dirección y Organización(40), 86-98. Garcia A, M. N. (2012). Validación de un método análitico para la dterminación de fenol en orina medinate cromatografia de gases acoplado a masas (GC-MS). Giessing, A., & Lund, T. (2002). Identification of 1‐hydroxypyrene glucuronide in tissue of marine polychaete Nereis diversicolor by liquid chromatography/ion trap multiple mass spectrometry. Rapid communications in mass spectrometry, 16(16), 1521-1525. Gollmer, L., Graf, H., & Ullrich, V. (1984). Characterization of the benzene monooxygenase system in rabbit bone marrow. Biochemical pharmacology, 33(22), 3597-3602. González Torres, H. J., Moreno Rossi, A., & Quintana Sosa, M. (2015). Genotoxiceffect of complex hydrocarbon mixtures in workers gasoline service stations. Revista Salud Uninorte, 31(1), 91-100. Guenther, A., Hewitt, C. N., Erickson, D., Fall, R., Geron, C., Graedel, T., . . . McKay, W. (1995). A global model of natural volatile organic compound emissions. Journal of Geophysical Research: Atmospheres, 100(D5), 8873-8892. Guo, J., Kauppinen, T., Kyyrönen, P., Heikkilä, P., Lindbohm, M. L., & Pukkala, E. (2004). Risk of esophageal, ovarian, testicular, kidney and bladder cancers and leukemia among Finnish workers exposed to diesel or gasoline engine exhaust. International Journal of Cancer, 111(2), 286-292. Haro-García, L., Vélez-Zamora, N., Aguilar-Madrid, G., Guerrero-Rivera, S., SánchezEscalante, V., R Muñoz, S., . . . Juárez-Pérez, C. (2012). Alteraciones hematológicas en trabajadores expuestos ocupacionalmente a mezcla de benceno-tolueno-Xileno (BTX) en una fábrica de pinturas. Revista Peruana de Medicina Experimental y Salud Pública, 29(2), 181-187. Health, U. D. o., & Services, H. (1995). Agency for toxic substances and disease registry. Toxicological Profile for Polycyclic Aromatic Hydrocarbons (PAHs),(update) PB/95/264370. Atlanta: US Department of Health and Human Services. Horowitz, R. (2001). Aromatic Hydrocarbons Chap 99 In Clinical Toxicology. 802-812. Ford M. Hygienists, A. C. o. G. I. (1995). Threshold limit values for chemical substances and physical agents and biological exposure indices. Jacob, J., & Seidel, A. (2002). Biomonitoring of polycyclic aromatic hydrocarbons in human urine. Journal of Chromatography B, 778(1), 31-47. Jongeneelen, F., Anzion, R., & Henderson, P. T. (1987). Determination of hydroxylated metabolites of polycyclic aromatic hydrocarbons in urine. Journal of Chromatography B: Biomedical Sciences and Applications, 413, 227-232. Jongeneelen, F. J. (1994). Biological monitoring of environmental exposure to polycyclic aromatic hydrocarbons; 1-hydroxypyrene in urine of people. Toxicology letters, 72(1-3), 205-211. Junes Olivera, R., & Lookuy Avendaño, C. L. (2009). Determinación de ácido hipúrico en orina como indicador de exposición al tolueno en trabajadores de imprentas en los distritos de la provincia de Lima. Kalyanasundaram, K., & Thomas, J. (1977). Environmental effects on vibronic band intensities in pyrene monomer fluorescence and their application in studies of micellar systems. J. Am. Chem. Soc.;(United States), 99(7).

85

Kazerouni, N., Sinha, R., Hsu, C.-H., Greenberg, A., & Rothman, N. (2001). Analysis of 200 food items for benzo [a] pyrene and estimation of its intake in an epidemiologic study. Food and chemical toxicology, 39(5), 423-436. Lakowicz, J. R. Principles of Fluorescence Spectroscopy; Springer US, 2007. Lawerys, R. (1994). Cánceres de origen profesional. Toxicología Industrial e Intoxicaciones Profesionales. Barcelona, Madrid: Masson SA, 553-576. Lee, C.-K., Cho, S.-H., Kang, J.-W., Lee, S.-J., Ju, Y.-S., Sung, J., . . . Kang, D. (1999). Comparison of three analytical methods for 1-hydroxypyrene glucuronide in urine after non-occupational exposure to polycyclic aromatic hydrocarbons. Toxicology letters, 108(2), 209-215. Mage, D. T., & Zali, O. (1992). Contaminación atmosférica causada por vehículos automóviles; consecuencias sanitarias y medidas para combatirlas Contaminación atmosférica causada por vehículos automóviles; consecuencias sanitarias y medidas para combatirlas: OMS. Mastandrea, C., Chichizola, C., Ludueña, B., Sánchez, H., Álvarez, H., & Gutiérrez, A. (2005). Hidrocarburos aromáticos policíclicos. Riesgos para la salud y marcadores biológicos. Acta bioquímica clínica latinoamericana, 39(1), 27-36. Mercado-Calderon, F. (1992). The evaluation of 1-hydroxypyrene as a bioindicator of industrial exposure to polycyclic aromatic hydrocarbons. Salud publica de Mexico, 35(6), 607-613. Montes, N., Urbieta, M., & Eguiarte, I. (2001). Metabolitos de hidrocarburos aromáticos policíclicos en orina: Estudio comparativo de dos métodos cromatográficos para el análisis de 1-hidroxipireno. Moreno Jiménez, B. (2011). Factores y riesgos laborales psicosociales: conceptualización, historia y cambios actuales. Medicina y Seguridad del trabajo, 57, 4-19. Morrison, R., & Boyd, R. N. (1976). Química Orgánica, Fondo Educativo Interamericano: México. Moszczynski, P. (1981). Organic solvents and T lymphocytes. The Lancet, 317(8217), 438. OAA, O. (2003). Guía para la validación de métodos de ensayo. OAA: DC-LE-05. Oliveira. (2010). Determinação de biomarcadores e compostos organoestânicos em amostras de sedimentos superficiais de três regiões portuárias do estado de Santa Catarina, Brasil. Oliveira, M., Ribeiro, H., Delgado, J., & Abreu, I. (2009). The effects of meteorological factors on airborne fungal spore concentration in two areas differing in urbanisation level. International journal of biometeorology, 53(1), 61-73. Organization, W. H. (1982). Lim ́ ites recomendados por razones de salud en la exposición profesional a los plaguicidas: informe de un Grupo de Estudio de la OMS [se reuni'o en Ginebra del 15 al 22 de junio de 1981]. Palma, M., Briceño, L., Idrovo, Á. J., & Varona, M. (2015). Evaluación de la exposición a solventes orgánicos en pintores de carros de la ciudad de Bogotá. Biomédica, 35(2). Peng, C., Ouyang, Z., Wang, M., Chen, W., Li, X., & Crittenden, J. C. (2013). Assessing the combined risks of PAHs and metals in urban soils by urbanization indicators. Environ Pollut, 178, 426-432. Pérez Ramos, L. E., & Miranda Garcia, V. E. (2014). Determinación de fenoles, ácido hipúrico y ácido metilhipúrico en orina como indicadores biológicos de exposición al Benceno, Tolueno y Xileno en trabajadores expuestos en una fábrica de caucho en Lima Metropolitana. Phillips, D. H. (1983). Fifty years of benzo (a) pyrene.

86

Piñero, S., Rivero, E., Ruiz, S. G., Marrero, S., Juárez, G. R., & Arveláez, L. (2013). Niveles urinarios de 1-Hidroxipireno en trabajadores expuestos a Hidrocarburos Aromáticos Policíclicos en la Industria de la Goma. Salud de los Trabajadores, 21(2), 141-149. Pott, P. (1775). Chirurgical observations relative to the cataract the polypus of the nose, the cancer of the scrotum, the different kinds of ruptures, and the mortification of the toes and feet, by Percivall Pott, FRS: TJ Carnegy. Quijano Parra, A., & Meléndez Gélvez, I. (2014). IDENTIFICACIÓN DE HIDROCARBUROS AROMÁTICOS POLICÍCLICOS (HAPS) EN EL AIRE DE CÚCUTA-COLOMBIA: EFECTO GEN TÓXICO. IDENTIFICATION OF POLYCYCLIC AROMATIC HYDROCARBONS (PAHS) AIR-CUCUTA NORTE DE SANTANDER:GENOTOXIC EVALUATION., 11(21), 79-87. doi: 10.14508/reia.2014.11.21 Rey-Salgueiro, L., Martínez-Carballo, E., García-Falcón, M. S., González-Barreiro, C., & SimalGándara, J. (2009). Occurrence of polycyclic aromatic hydrocarbons and their hydroxylated metabolites in infant foods. Food chemistry, 115(3), 814-819. Robins, H., Alexe, G., Harris, S., & Levine, A. (2007). The first twenty-five years of p53 research 25 years of p53 research (pp. 1-25): Springer. Schulz, C., Angerer, J., Ewers, U., Heudorf, U., Wilhelm, M., & Agency, H. B. C. o. t. G. F. E. (2009). Revised and new reference values for environmental pollutants in urine or blood of children in Germany derived from the German environmental survey on children 2003-2006 (GerES IV). International journal of hygiene and environmental health, 212(6), 637-647. Shahtaheri, S., Ibrahimi, L., Golbabaei, F., Hosseini, M., & Fouladi, B. (2006). Optimization of Sample Preparation for 1-Hydroxypyrene as a Major Biomarker of Exposure to Polycyclic Aromatic Hydrocarbons Prior to High Performance Liquid Chromatography. Iranian Journal of Public Health, 35(1), 33-41. Shaw, G. R., & Connell, D. W. (1994). Prediction and monitoring of the carcinogenicity of polycyclic aromatic compounds (PACs) Reviews of environmental contamination and toxicology (pp. 1-62): Springer. Shih, H.-T., Yu, C.-L., Wu, M.-T., Liu, C.-S., Tsai, C.-H., Hung, D.-Z., . . . Kuo, H.-W. (2011). Subclinical abnormalities in workers with continuous low-level toluene exposure. Toxicology and industrial health, 27(8), 691-699. Shimada, T., Hayes, C. L., Yamazaki, H., Amin, S., Hecht, S. S., Guengerich, F. P., & Sutter, T. R. (1996). Activation of chemically diverse procarcinogens by human cytochrome P-450 1B1. Cancer research, 56(13), 2979-2984. Skoog, D. A., Holler, F. J., Nieman, T. A., & Gómez, M. d. C. M. (2001). Principios de análisis instrumental. Skoog, D. A., West, D. M., & Holler, F. J. (1997). Fundamentos de química analítica (Vol. 2): Reverté. Skowronski, G. A., Turkall, R. M., Kadry, A. R. M., & Abdel-Rahman, M. S. (1990). Effects of soil on the dermal bioavailability of m-xylene in male rats. Environ Res, 51(2), 182-193. Torrado Rey, S., Sada Muruzábal, Á., Rosell Farràs, M. G., Quirce Gancedo, S., Pascual del Río, J., Orriols Ramos, R. M., . . . Gallego Piñol, E. (2010). Agentes químicos en el ámbito sanitario: Escuela Nacional de Medicina del Trabajo. Urbieta, M., Egiarte, I., & Montes, N. (2000). 24th Scientific Meeting of the Group of Chromatogrephy and Related Techniques. BIO-P54.

87

Valenciano, M. S. (2016). Desarrollo de nuevos métodos de aislamiento y preconcentración para la determinación de 1-hidroxipireno en muestras biológicas. UNED. Vallejo, M. (1991). Riesgos y medidas de seguridad en el manejo de solventes industriales. Bogotá, Consejo Colombiano de Seguridad. Vives, I., Grimalt, J. O., & Guitart, R. (2001). Los hidrocarburos aromáticos policíclicos y la salud humana. Apuntes de Ciencia y Tecnología, 3(2), 45-51. Wallace, L. (1996). Environmental exposure to benzene: an update. Environmental Health Perspectives, 104(Suppl 6), 1129. Zuluaga Quintero, M., Valencia Ruiz, A. M., & Ortiz Trujillo, I. C. (2009). Efecto genotóxico y mutagénico de contaminantes atmosféricos. Medicina UPB, 28(1).

88

ANEXOS ANEXO A: Estudio de la linealidad para 1-hidroxipireno

Tabla A 1: Niveles de concentración usados para la determinación de la linealidad y rango lineal para 1-hidroxipireno Concentración (ug/L)

X

S

%CV

0,1 1 10 25 50 100

5831.02 53957.26 526711.94 1343621.79 2741533.66 5668185.49

82.65 520.20 987.69 254.19 1676.71 22757.60

1.42 0.96 0.19 0.02 0.06 0.40

ANEXO B: Análisis curva de calibrado de 1-hidroxipireno

Tabla B 1: Datos curva de calibrado de 1-hidroxipireno día 1 Concentración (ug/L)

X

S

%CV

0,1 1 10 25 50 100

5756.76 53566.98 538320.24 1374845.89 2747850.10 555468945

305.89 3180.78 10802.53 37022.02 8870.70 116466.41

5.31 5.42 1.83 2.46 0.29 1.91

Tabla B 2: Análisis de regresión lineal de 1-hidroxipireno día 1 Estadísticas de la regresión Coeficiente de correlación múltiple Coeficiente de determinación R^2 R^2 ajustado Error típico Observaciones

Regresión Residuos Total Intercepción Variable X

Grados de libertad 1 4 5 Coeficientes -10111.9295 55538.4256

ANÁLISIS DE VARIANZA Suma de Promedio de los cuadrados cuadrados 2.2991E+13 2,2991E+13 712813515 178203379 2.2992E+13 Error típico Estadístico t 7259.5158 -1.39292065 154.621135 359.190389

89

0.9999845 0.999969 0.99996125 13349.2838 6

F

Valor crítico de F

129017.736

3.6044E-10

6000000

y = 55538x - 10112 R² = 1

5000000 4000000 3000000 2000000 1000000

0 0

20

40

60

80

100

120

Residuos

Figura B 1: Curva de calibrado para 1-hidroxipireno. Día 1. 50000 0 0

20

40

-50000

60

80

100

120

Variable X 1

Figura B 2: Análisis de residuos para 1-hidroxipireno. Día 1.

Tabla B 3: Datos curva de calibrado de 1-hidroxipireno día 2 Concentración (ug/L) 0,1 1 10 25 50 100

X 5831.02 53957.26 526711.94 1343621.79 2741533.66 5668185.49

S 82.64 520.20 987.70 254.19 1676.71 22757.59

%CV 1.42 0.96 0.19 0.02 0.06 0.40

Tabla B 4: Análisis de regresión lineal de 1-hidroxipireno día 2 Estadísticas de la regresión Coeficiente de correlación múltiple Coeficiente de determinación R2 R^2 ajustado Error típico Observaciones

90

0.99982648 0.99965299 0.99956624 45545.0231 6

ANÁLISIS DE VARIANZA Suma de Promedio de los cuadrados cuadrados 2.3903E+13 2.3903E+13 8297396511 2074349128 2.3911E+13 Error típico Estadístico t 24767.9815 -1,33757195 527.535653 107.345871

Grados de libertad 1 4 5 Coeficientes -33128.9572 56628.7743

Regresión Residuos Total Intercepción Variable X

6000000

F 11523.1361

Valor crítico de F 4.516E-08

y = 56629x - 33129 R² = 0.9997

5000000

4000000 3000000 2000000 1000000

0 0

20

40

60

80

100

120

Figura B 3: Curva de calibrado para 1-hidroxipireno. Día 2.

Residuos

50000

0 0

20

40

-50000

60

80

100

Variable X

Figura B 4: Análisis de residuos para 1-hidroxipireno día 2

Tabla B 5: Datos curva de calibrado de 1-hidroxipireno día 3 Concentración (ug/L) 0,1 1 10 25 50 100

X 5682.51 53566.98 538320.24 1374845.89 2747850.10 5554689.45

S 210.02 2903.64 9861.32 33796.32 8097.81 106318.80

91

%CV 3.70 5.42 1.83 2.46 0.29 1.91

120

Tabla B 6: Análisis de regresión de 1-hidroxipireno día 3 Estadísticas de la regresión Coeficiente de correlación múltiple Coeficiente de determinación R^2 R^2 ajustado Error típico Observaciones

Regresión Residuos Total Intercepción Variable X

Grados de libertad 1 4 5 Coeficientes -10133,8581 55538,7336

ANÁLISIS DE VARIANZA Suma de Promedio de los cuadrados cuadrados 2.2992E+13 2.2992E+13 711285553 2.2992E+13 Error típico 7251.731 154.455326

6000000

0.99998453 0.99996906 0.99996133 13334.9686 6

F

Valor crítico de F

129296.322

3.5889E-10

177821388 Estadístico t -1.39743988 359.577977

y = 55447x - 15899 R² = 1

5000000 4000000 3000000 2000000 1000000 0 0

20

40

60

80

100

120

Residuos

Figura B 5: Curva de calibrado de 1-hidrxipireno. Día 3.

100000 0 0 -100000

20

40

60

80

100

Variable X

Figura B 6: Análisis de residuos para 1-hidroxipireno. Día 3.

92

120

ANEXO C: Calculo de la incertidumbre de medición para 1-hidroxipireno.

Tabla C 1: Incertidumbre estándar relativa de masa de tara del estándar patrón FACTOR masa tara del recipiente

FUENTE calibración resolución repetibilidad

APORTE 1.30E-03 5.00E-05 7.80E-05

IEA 6.50E-04 2.80E-05 2.40E-05

IEC

IER

6.50E-05

2.59E-05

IEA: Incertidumbre estándar aportada; IEC: Incertidumbre estándar combinada; IER: Incertidumbre estándar relativa

Tabla C 2: Incertidumbre estándar relativa para la masa de preparación del estándar patrón FUENTE Masa tara recipiente Masa recipiente con patrón

APORTE 6.50E-04 6.50E-04

IE APORTE 6.50E-04 6.50E-04

IEC

IER

9.20E-04

1.30E-04

Tabla C 3: Incertidumbre estándar relativa para el volumen de aforo de preparación de los estándares FUENTE Tolerancia del balón Temperatura medición Diferencia temperatura Repetibilidad medición

APORTE 4.00E-02 4.00E-03 4.00E-03 3.00E-03

IE APORTE 1.60E-02 2.00E-03 2.00E-03 2.00E-03

IEC

IER

1.70E-02

1.60E-03

Tabla C 4: Incertidumbre estándar relativa de la preparación del estándar patrón FUENTE Valor del E. patrón Volumen preparado Et Alícuota de Ep para Et

APORTE 1.3E-03 1.15E-03 1.6E-02

IEA 1.3E-03 1.15E-03 1.6E-02

IEC

IER

1.7E-02

2E-05

Tabla C 5: Incertidumbre estándar relativa para la preparación del estándar de trabajo FUENTE

APORTE

IEA

IEC

IER

Valor del E. patrón Volumen preparado Et Alícuota de Ep para Et

2.00E-05 1.6E-03 4.3E-04

2.00E-05 1.6E-03 4.3E-04

1.7E-03

3.5E-04

Tabla C 6: Incertidumbre estándar relativa de la preparación del estándar de la curva FUENTE Aporte Et Volumen Ec Alícuota Et para Ec

IEA 3.4E-04 1.60E-03 4.1E-05

93

IEC

IER

1.7E-03

1E-05

Tabla C 7: Incertidumbre estándar relativa para el el estándar bajo FUENTE aporte Ec volumen Eb alícuota Ec para Eb

IEA 6.92E-06 1E-02 5.1E-03

IEC

IER

1.14E-02

1.14E-02

Tabla C 8: Incertidumbre estándar relativa para el estándar medio FUENTE aporte Ec volumen Em alícuota Ec para Em

IEA 1E-05 1E-02 1E-04

IEC

IER

1E-02

2E-04

Tabla C 9: Incertidumbre estándar relativa para el estándar alto FUENTE aporte Ec volumen Eb alícuota Ec para Eb

IEA 3.5E-04 1E-02 1E-06

IEC

IER

1E-02

1E-04

Tabla C 10: Incertidumbre estándar relativa para el volumen inicial de muestra FUENTE Tolerancia del balón Temperatura medición Diferencia temperatura Repetibilidad medición

APORTE 6E-02 4E-03 1E-02 3.2E-03

IE APORTE 2.4E-02 2.3E-03 4.4E-03 1E-03

IEC

IER

2.5E-02

2.5E-03

Tabla C 11: Incertidumbre estándar relativa para el volumen final de muestra FUENTE Tolerancia del balón Temperatura medición Diferencia temperatura Repetibilidad medición

APORTE 8E-03 4E-04 1.1E-03 6E-04

IE APORTE 3.3E-03 2E-04 4.5E-04 2E-04

IEC

IER

3.3E-03

3.31E-03

Tabla C 12: Incertidumbre estándar relativa aportada por la precisión a condiciones de repetibilidad NIVEL Bajo Medio Alto

X 1.00 45.85 86.90

S 0.03 2.72 4.65

94

IER 0.03 0.06 0.05

Tabla C 13: Incertidumbre estándar relativa para la precisión intermedia NIVEL

ANALISTA 1

BAJO

MEDIO

ALTO

ANALISTA 2

BAJO

MEDIO

ALTO

CONC 0.99 1.09 0.98 48.94 43.84 44.77 81.62 90.39 88.70 0.99 1.01 1.05 49.29 44.17 45.10 91.40 83.28 94.39

X

S

IER

1.02

0.06

0.06

45.85

2.72

0.06

86.90

4.65

0.05

1.02

0.03

0.03

46.19

2.72

0.06

89.69

5.75

0.06

Tabla C 14: Incertidumbre estándar relativa para la recuperación Xobt (μg/L) 0.99 1.01 1.05 49.29 44.17 45.10 91.40 83.28 94.39

Nivel Bajo

Medio

Alto

Xfort (μg/L) 1

50

100

%R 98.89 100.92 104.84 98.57 88.34 90.20 91.40 83.28 94.39

Promedio

S

IER

101.55

3.025

0.03

92.37

5.450

0.06

89.69

5.750

0.06

Tabla C 15: Incertidumbre aportada por la curva de calibrado de 1-hidroxipireno FACTOR

NIVEL BAJO

NIVEL MEDIO

NIVEL ALTO

Sxx B1 Sres P N

7453.81 55538 4578.77 2 36

7453.81 55538 4578.77 2 36

7453.81 55538 4578.77 2 36

95

Co Cpromedio Incertidumbre IER

1 31.02 0.05 0.05

50 31.02 0.04 0.001

100 31.02 0.08 0.001

Tabla C 16: Incertidumbre estándar relativa para la curva de calibrado de creatinina FACTOR Sxx B1 Sres P N Co C.promedio Incertidumbre IER

NIVEL BAJO 1810.83 0.2931 0.03 2 12 1 20.17 0.010 0.010

NIVEL MEDIO 1810.83 0.2931 0.03 2 12 20 20.17 0.08 0.004

NIVEL ALTO 1810.83 0.2931 0.03 2 12 50 20.17 0.11 0.002

Tabla C 17: Incertidumbre final expandida para 1-hidroxipireno a nivel bajo VALOR 1.00E-05 1.14E-02 2.50E-03 3.30E-03 3.00E-02 6.00E-02 3.00E-02 1.00E-02 5.00E-02 Sumatoria Raíz Cx INCERTIDUMBRE FINAL EXP El valor es reportado como

CUADRADO 1.0E-10 1.3E-04 6.3E-06 1.1E-05 9.0E-04 3.6E-03 9.0E-04 1.0E-04 2.5E-03 8.1E-03 9.0E-02 1 0.02 1

FUENTE IER preparación Ec IER para estándar bajo IER volumen final muestra IER volumen inicial muestra Repetibilidad Precisión intermedia % Recuperación IER corrección de creatinina curva de calibrado

±

0.02

Tabla C 18: Incertidumbre final expandida para 1-hidroxipireno a nivel medio VALOR

CUADRADO

FUENTE

1.00E-05 2.00E-04 2.50E-03 3.30E-03 6.00E-02 6.00E-02

1.0E-10 4.0E-08 6.3E-06 1.1E-05 3.6E-03 3.6E-03

IER preparación Ec IER para estándar medio IER volumen final muestra IER volumen inicial muestra Repetibilidad Precisión intermedia

96

3.6E-03 6.4E-03 1.6E-03 1.9E-02 1.4E-01 50 1.88 50

6.00E-02 8.00E-02 4.00E-02 Sumatoria Raíz Cx INCERTIDUMBRE FINAL EXP El valor es reportado como

% Recuperación IER corrección de creatinina curva de calibrado

±

1.88

Tabla C 19: Incertidumbre final expandida para un hidroxipireno a nivel alto VALOR 1.00E-05 1.00E-04 2.50E-03 3.30E-03 5.00E-02 5.00E-02 6.00E-02 1.10E-01 8.00E-02 Sumatoria Raíz Cx INCERTIDUMBRE FINAL EXP El valor es reportado como

CUADRADO 1.0E-10 1.0E-08 6.3E-06 1.1E-05 2.5E-03 2.5E-03 3.6E-03 1.2E-02 6.4E-03 2.7E-02 1.6E-01 100 5.42 100

FUENTE IER preparación Ec IER para estándar alto IER volumen final muestra IER volumen inicial muestra Repetibilidad Precisión intermedia % Recuperación IER corrección de creatinina curva de calibrado

±

5.42

ANEXO D: Análisis de las curvas de calibrado de ácido hipúrico, metilhipúrico y fenol

Tabla D 1: Relación área metabolito/estándar interno para los distinto niveles de concentración y metabolitos Niveles (ppm)

AH

Ácido 3-MH

Ácido 4-MH

0.25 0.5 1 2.5 5 % error 0.5

0.06 0.09 0.19 0.41 0.76 0.12

0.07 0.11 0.42 1.20 2.39 0.05

0.10 0.14 0.42 1.22 2.41 0.01

97

1

y = 0.1482x + 0.027 R² = 0.9984

0.8 0.6 0.4 0.2 0 0

1

2

3

4

5

6

Figura D 1: Curva de calibrado para el ácido hipúrico

Residuos

0.02 0 0 -0.02

1

2

3

4

5

6

Variable X

Figura D 2: Análisis de residuo para ácido hipúrico

Figura D 3: Análisis de regresión lineal para ácido hipúrico Estadísticas de la regresión Coeficiente de correlación múltiple Coeficiente de determinación R2 R2 ajustado Error típico Observaciones

Regresión Residuos Total Intercepción Variable X

Grados de libertad 1 3 4 Coeficientes 0,026975743 0,148204178

0,999179488 0,998359649 0,997812865 0,013632924 5

ANÁLISIS DE VARIANZA Suma de cuadrados Promedio de los cuadrados 0,33935119 0,33935119 0,00055757 0,00018586 0,33990876 Error típico Estadístico t 0,00885113 3,04771806 0,00346836 42,7302745

98

F 1825,87636

Valor crítico de F 2,821E-05

3 y = 0.4991x - 0.0839 R² = 0.9984

2.5 2 1.5 1 0.5 0 0

1

2

3

4

5

6

Figura D 4: Curva de calibrado para el ácido 3-metilhipúrico

Residuos

0.05 0 -0.05 0

2

-0.1

4

6

Variable X

Figura D 5: Análisis de residuos para el ácido 3-metilhipúrico

Tabla D 2: Análisis de regresión lineal para el ácido 3-metilhipurico Estadísticas de la regresión Coeficiente de correlación múltiple Coeficiente de determinación R2 R2 ajustado Error típico Observaciones

0,99917697 0,99835462 0,99780616 0,04598143 5

ANÁLISIS DE VARIANZA

Regresión Residuos Total Intercepción Variable X

Grados de libertad

Suma de cuadrados

Promedio de los cuadrados

F

1 3 4 Coeficientes -0,08389279 0,49910024

3,84861122 0,00634288 3,85495409 Error típico 0,02985328 0,01169818

3,84861122 0,00211429

1820,28382

Estadístico t -2,81016962 42,6647843

99

Valor crítico de F 2,834E-05

3

y = 0.4973x - 0.0606 R² = 0.9984

2.5 2 1.5 1 0.5 0 0

1

2

3

4

5

6

Figura D 6: Curva de calibrado del ácido 4-metilhipúrico

Residuos

0.1

0 -0.1

0

2

4

6

Variable X

Figura D 7: Análisis de residuos para el ácido 4-metilhipúrico

Tabla D 3: Análisis de regresión lineal para el ácido 4-metilhipúrico Estadísticas de la regresión Coeficiente de correlación múltiple Coeficiente de determinación R^2 R^2 ajustado Error típico Observaciones

0,9992104 0,99842142 0,99789522 0,04487296 5

ANÁLISIS DE VARIANZA

Regresión Residuos Total Intercepción Variable X 1

Grados de libertad

Suma de cuadrados

Promedio de los cuadrados

F

1 3 4 Coeficientes -0,06059475 0,49728355

3,82064491 0,00604075 3,82668566 Error típico 0,02913361 0,01141617

3,82064491 0,00201358

1897,43654

Estadístico t -2,0798913 43,5595746

Tabla D 4: Datos curva de calibrado de fenol Nivel 0,5 1 10 25 100

Área 38750248 41938547 92159849 228195521 759942685

Área EI 4186384 3845253 4230426 3563200 4379602

100

A metabolito/EI 1,28 2,93 13,81 56,06 165,54

Valor crítico de F 2,6632E-05

200.00 y = 1.6509x + 2.8557 R² = 0.9903

150.00 100.00 50.00 0.00 0

20

40

60

80

100

120

Figura D 8: Curva de calibrado para el fenol

Residuos

20 0 0 -20

50

100

150

Variable X

Figura D 9: Análisis de residuos para el fenol

Tabla D 5: Análisis de regresión lineal para el fenol Estadísticas de la regresión 0,99512403 Coeficiente de correlación múltiple 0,99027183 Coeficiente de determinación R2 0,9870291 R2 ajustado 7,90372652 Error típico 5 Observaciones

Grados de libertad Regresión Residuos Total Intercepción Variable X

1 3 4 Coeficientes 2,85573656 1,65086407

ANÁLISIS DE VARIANZA Suma de Promedio de los cuadrados cuadrados 19076,9201 19076,9201 187,406679 62,4688929 19264,3268 Error típico Estadístico t 4,37550359 0,65266466 0,09446895 17,4752028

101

F 305,382714

Valor crítico de F 0,00040842

ANEXO E: Datos de la cuantificación de los metabolitos en orina en la población muestreada

Tabla E 6: Resultados de la cuantificación de 1-OHPyr en orina en la población estudiada Código TX-190218-37 TX-190218-38 TX-190218-39 TX-190218-40 TX-190218-41 TX-190218-42 TX-190218-43 TX-190218-44 TX-190218-45 TX-190218-46 TX-190218-47 TX-190218-48 TX-190218-49 TX-190218-50 TX-190218-51 TX-190218-52 TX-190218-53 TX-190218-54 TX-190218-55 TX-050318-29 TX-050318-30 TX-050318-31 TX-050318-32 TX-050318-33 TX-050318-34 TX-050318-35 TX-050318-36 TX-050318-37 TX-050318-38 TX-050318-39 TX-050318-40

GRUPO EXPUESTO ug 1-OHP/mol creatinina ± U. Exp 180.43 ± 9.79 112.95 ± 6.73 28.33 ± 1.07 99.78 ± 5.41 30.44 ± 1.15 152.14 ± 8.25 29.59 ± 1.11 27.39 ± 1.03 20.30 ± 0.76 25.64 ± 0.96 101.38 ± 5.50 32.67 ± 1.23 69.39 ± 2.61 192.66 ± 10.47 54.73 ± 2.06 12.69 ± 0.21 74.91 ± 2.82 38.59 ± 1.45 51.00 ± 1.92 21.47 ± 0.81 33.96 ± 1.28 26.45 ± 1.00 23.95 ± 0.90 8.98 ± 0.15 23.65 ± 0.89 10.79 ± 0.18 26.90 ± 1.01 17.26 ± 0.65 14.26 ± 0.54 12.77 ± 0.21 38.82 ± 1.46

Código TX-160418-111 TX-160418-112 TX-160418-113 TX-160418-114 TX-160418-115 TX-160418-116 TX-160418-117 TX-160418-118 TX-160418-119 TX-160418-120 TX-160418-121 TX-160418-122 TX-160418-123 TX-160418-124 TX-160418-125 TX-160418-126 TX-160418-127

102

GRUPO CONTROL ug 1-OHP/mol creatinina ± U. Exp 12.27 ± 0.46 10.91 ± 0.41 4.12 ± 0.07 8.25 ± 0.13 7.32 ± 0.12 8.19 ± 0.13 59.81 ± 2.25 13.15 ± 0.21 11.03 ± 0.18 15.32 ± 0.24 21.38 ± 0.80 ND 6.05 ± 0.10 7.03 ± 0.11 15.09 ± 0.25 8.35 ± 0.14 30.97 ± 1.17

Tabla E 7: Resultados de la cuantificación de los metabolitos en el grupo expuesto y el grupo control Código Expuestos TX-190218-37 TX-190218-38 TX-190218-39 TX-190218-40 TX-190218-41 TX-190218-42 TX-190218-43 TX-190218-44 TX-190218-45 TX-190218-46 TX-190218-47 TX-190218-48 TX-190218-49 TX-190218-50 TX-190218-51 TX-190218-52 TX-190218-53 TX-190218-54 TX-190218-55 TX-050318-29 TX-050318-30 TX-050318-31 TX-050318-32 TX-050318-33 TX-050318-34 TX-050318-35 TX-050318-36 TX-050318-37 TX-050318-38 TX-050318-39 TX-050318-40 Control TX-160418-111 TX-160418-112 TX-160418-113 TX-160418-114 TX-160418-115 TX-160418-116 TX-160418-117 TX-160418-118 TX-160418-119 TX-160418-120 TX-160418-121 TX-160418-122 TX-160418-123 TX-160418-124 TX-160418-125 TX-160418-126 TX-160418-127

Creatinina g/l

1-hidroxipireno ug/g creatinina

Ácido hipúrico mg/g creatinina

Ácido 3-metilhipúrico mg/g creatinina

0,22 0,7 0,91 0,32 0,8 2,02 2,99 2,43 2,21 1,26 0,47 0,87 1,07 0,17 0,62 2,47 0,71 1,13 0,32 1,83 1,31 1,31 2,33 5,38 2,86 3,9 1,47 3,28 4,29 3,4 0,86

180,43 112,96 28,33 99,78 30,44 152,14 29,59 27,39 20,3 25,64 101,38 32,68 69,39 192,67 54,73 12,69 74,91 38,6 51 21,47 33,96 26,45 23,95 8,99 23,65 10,79 26,9 17,26 14,26 12,78 38,82

120,74 154,07 22,15 129,14 1,21 6,53 2,97 20,74 13,31 3,21 2,07 18,75 28,64 4,29 ND 87,74 4,17 5,67 ND 124,36 127,4 7,8 2,88 5,51 12,28 1,63 8,22 1,11 0,16 28,28 14,44

1,55 ND ND 0,9 0,36 ND 0,1 0,13 ND 0,35 ND 1,35 0,28 ND ND 0,5 ND 0,24 ND 0,13 0,36 ND ND 0,17 0,24 ND ND 0,08 ND 0,18 ND

2,04 1,17 ND 1,17 0,33 0,25 0,16 0,16 0,28 0,31 ND ND 0,73 0 ND 0,35 0,7 0,2 ND 0,23 0,4 0,29 0,12 0,14 0,37 0,09 0,24 0,07 ND 0,29 ND

26,65 ND ND ND ND 2,99 0,55 ND ND 351,22 ND ND ND ND ND 3,41 ND ND ND 1,95 1,01 4,46 ND ND 0,68 1,4 5,55 1,36 0,56 0,51 0,39

4,64 11,38 6,15 4,01 4,66 8,43 0,69 3,3 2,37 4,57 4,75 0,31 4,51 5,44 2,73 3,45 2,04

12,27 10,91 4,12 8,25 7,32 8,2 59,81 13,15 11,03 15,32 21,38 ND 6,06 7,03 15,09 8,35 30,97

7,72 67,69 0,28 4,18 0,35 8,63 67,08 3,2 1,22 2,03 2,04 2,88 0,42 0,83 35,28 3,96 2,19

0,09 0,34 ND ND ND ND ND 0,12 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

0,06 0,7 0,06 0,13 0,06 0,09 0,83 0,14 ND ND 0,07 0,87 ND ND 0,18 0,25 0,23

1,49 ND 0,18 0,18 0,07 0,07 1,52 1,82 0,19 0,19 0,6 0,67 0,22 0,39 2,2 ND 0,55

103

Ácido 4-metilhipúrico mg/g creatinina

fenol mg/g creatinina

Tabla E 8: Datos personales de la población muestreada M:1 ; F:2

1: 20-30; 2:3140; 3:>40

si 1; no 2

Código

Género

Grupo etáreo

Hábito tabáquico

TX-190218-37 TX-190218-38 TX-190218-39 TX-190218-40 TX-190218-41 TX-190218-42 TX-190218-43 TX-190218-44 TX-190218-45 TX-190218-46 TX-190218-47 TX-190218-48 TX-190218-49 TX-190218-50 TX-190218-51 TX-190218-52 TX-190218-53 TX-190218-54 TX-190218-55 TX-050318-29 TX-050318-30 TX-050318-31 TX-050318-32 TX-050318-33 TX-050318-34 TX-050318-35 TX-050318-36 TX-050318-37 TX-050318-38 TX-050318-39 TX-050318-40 TX-160418-111 TX-160418-112 TX-160418-113 TX-160418-114 TX-160418-115 TX-160418-116 TX-160418-117 TX-160418-118 TX-160418-119 TX-160418-120 TX-160418-121 TX-160418-122 TX-160418-123 TX-160418-124 TX-160418-125 TX-160418-126 TX-160418-127

1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 2 1 2 2 1 1 1 2 1 1 1 2 1 1 2 2 1 1 1 1 1 2 1 2 2 2 1 1 2 1 2 2 2 1 1 2 2 1

3 3 3 3 2 1 1 2 3 3 2 2 2 2 2 3 3 3 3 3 1 3 3 1 3 2 3 2 1 1 3 3

2 2 1 2 2 2 1 2 2 2 2 2 2 1 2 2 2 2 2 2 2 2 1 2 2 2 2 2 2 2 1 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2

2 3 3 1 1 3 3 3 2 1 2 2 1

1:si, 2: no

104

Consumo de alcohol 1 2 1 2 2 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 2 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 2 1 1 1 1 1 1 2 2 2 1 1 1 1

1: administrador; 2: supervisor, despacho

1<5, 2:5-10,3:11-20 4:>20

Cargo

Antigüedad

2 2 2 2 1 2 1 2 2 2 1 2 1 1 2 2 2 2 2 2 2 1 2 2 2 1 2 2 1 2 2 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1

2 2 2 3 2 1 1 2 3 3 2 2 1 2 3 3 2 1 2 1 1 4 3 1 3 2 2 4 1 1 2 4 1 1 3 4 1 1 1 1 3 3 3 2 1 2 2 3

Tabla E 9: Correlaciones de sperman de los metabolitos

GÉNERO Correlación Muestras Valor-P GRUPO ETÁREO Correlación Muestras Valor-P HÁBITO TABÁQUICO Correlación Muestras Valor-P CONSUMO DE ALCOHOL Correlación Muestras Valor-P CARGO Correlación Muestras Valor-P ANTIGÜEDAD Correlación Muestras Valor-P

1-hidroxipireno ug /mol creatinina

Fenol mg/g creatinina

Ácido hipúrico mg/g creatinina

Ácido 3-metihipúrico mg /g creatinina

Ácido 4metilhipúrico mg/g creatinina

0.112 31

0.039 15

-0.202 29

-0.052 16

-0.024 23

0.539

0.885

0.285

0.840

0.911

0.095 31 0.603

0.525 15 0.049

0.301 29 0.111

0.362 16 0.161

0.319 23 0.135

-0.128 31 0.49

0.545 15 0.04

0.142 29 0.45

0.365 16 0.16

0.361 23 0.09

0.086 31 0,637

0.000 15 0.000

0.132 29 0.487

0.174 16 0.500

0.242 23 0.256

-0.050 31 0.787

0.175 15 0.514

0.489 29 0.010

0.104 16 0.686

0.080 23 0.709

-0.100 31 0.582

0.421 15 0.115

-0.091 29 0.630

0.237 16 0.359

0.042 23 0.844

26% DESPACHO ADMINISTRACION

74%

Figura E 1: Desempeño actual en la estación de servicio

105

Tabla E 10: Parámetros de Fenol en el grupo expuesto y el grupo control Grupo

Cargo

Género

creatinina g/L

M

3.64

Fenol mg/g creatinina 0.56

F M

1.95 1.81

2.93 2.47

F M

2.86 3.91

0.68 0.31

F

3.90

0.60

Administrador Expuestos Despachador Control

Tabla E 11: Parámetros de ácido hipúrico en el grupo expuesto y el grupo control Grupo

Cargo

Género

creatinina g/L

mg AH/mol creatinina

Administrador

M F

2.69 1.38

1.45 8.89

Despachador

M F

1.66 2.00

46.70 9.0

M F

5.47 3.86

21.15 6.19

Expuestos

Control

Tabla E 12: Parámetros de ácido 3-metilhipúrico según grupo expuesto y grupo control Grupo

Cargo

Género

creatinina g/L

M F M F M F

2.69 1.38 1.66 2.00 5.47 3.86

Administrador Expuestos Despachador Control

mg Acid 3-MH mg/g creatinina 0.23 0.28 0.52 0.20 0.34 0.11

Tabla E 13: Parámetros de ácido 4-metilhipúrico según grupo expuesto y grupo control Grupo

Cargo Administrador

Expuestos Despachador Control

Género

creatinina g/l

mg Acid 3-MH/g creatinina

M F M F M F

2.69 1.38 1.66 2.00 5.47 3.86

0.25 0.37 0.50 0.30 0.46 0.20

Tabla E 14: Resultados de 1-OHPyr según grupo expuesto y grupo control 106

Grupo (n)

Cargo Administrador

Expuestos (31) Despachador Control (17)

Género

creatinina mol/l

ug 1-OHP/mol creatinina

M

0.03

24.76

F

0.01

80.14

M

0.02

50.34

F

0.02

31.13

M

0.04

18.68

F

0.01

12.72

Tabla E 10: Concentraciones de creatinina del grupo expuesto y del grupo control Expuestos Código TX-190218-37 TX-190218-38 TX-190218-39 TX-190218-40 TX-190218-41 TX-190218-42 TX-190218-43 TX-190218-44 TX-190218-45 TX-190218-46 TX-190218-47 TX-190218-48 TX-190218-49 TX-190218-50 TX-190218-51 TX-190218-52 TX-190218-53 TX-190218-54 TX-190218-55 TX-050318-29 TX-050318-30 TX-050318-31 TX-050318-32 TX-050318-33 TX-050318-34 TX-050318-35 TX-050318-36 TX-050318-37 TX-050318-38 TX-050318-39 TX-050318-40

Control Código TX-160418-111 TX-160418-112 TX-160418-113 TX-160418-114 TX-160418-115 TX-160418-116 TX-160418-117 TX-160418-118 TX-160418-119 TX-160418-120 TX-160418-121 TX-160418-122 TX-160418-123 TX-160418-124 TX-160418-125 TX-160418-126 TX-160418-127

Creatinina g/L 0.22 0.70 0.91 0.32 0.80 2.02 2.99 2.43 2.21 1.26 0.47 0.87 1.07 0.17 0.62 2.47 0.71 1.13 0.32 1.83 1.31 1.31 2.33 5.38 2.86 3.90 1.47 3.28 4.29 3.40 0.86

107

Creatinina g/L 4.64 11.38 6.15 4.01 4.66 8.43 0.69 3.3 2.37 4.57 4.75 0.31 4.51 5.44 2.73 3.45 2.04

ANEXO F: Equipos

Figura D 1: pHmetro HANNA HI 9126

Figura D 2: Balanza analítica Adventurer OHAUS

Figura D 3: cabina con puerto de vacío con controlador de flujo Restek (USA)

Figura D 4: Barnnstead Easypure II Thermo Scientific (USA)

106

Figura D 5: HPLC Dionex Ultimate 3000- Thermo Scientific (USA)

107