Tesis Doctorado Lola Del C. Rojas I..pdf

UNIVERSIDAD SIMÓN BOLÍVAR DECANATO DE ESTUDIOS DE POSTGRADO COORDINACIÓN DE BIOLOGÍA DOCTORADO EN CIENCIAS BIOLÓGICAS

TESIS DOCTORAL

LA PROTEÍNA BiP/Hsp70 DE Trypanosoma vivax. CLONAMIENTO, EXPRESIÓN Y RESPUESTA INMUNE HUMORAL DE BOVINOS INFECTADOS

por

LOLA DEL CARMEN ROJAS INFANTAS

06 de octubre, 2010

Universidad Simón Bolívar

LA PROTEÍNA BiP/Hsp70 DE Trypanosoma vivax. CLONAMIENTO, EXPRESIÓN Y RESPUESTA INMUNE HUMORAL DE BOVINOS INFECTADOS

Tesis Doctoral presentada a la Universidad Simón Bolívar por

Lola Del Carmen Rojas Infantas

Como requisito parcial para optar al título de Doctor en Ciencias Biológicas

Realizado con la asesoría de:

Dr. Pedro María Aso Dra. Mary Isabel Gonzatti Caracas, 06 de octubre 2010

ii

06 de octubre de 2010

ii

iii

DEDICATORIA

A

Dios

por

oportunidad

darme de

la

realizar

este sueño y poner en mi camino

a

maravillosa.

gente

tan

iv

AGRADECIMIENTOS

- A mi tutor Pedro María Aso, por ayudarme no sólo poniendo a mi disposición sus conocimientos y los medios necesarios para emplearlos de la forma más adecuada en la realización de esta Tesis, sino por haber depositado en mí su confianza y afecto para llevar a cabo este largo camino en busca de los mejores resultados, lo que espero haber conseguido. Muchas gracias de todo corazón. A mi cotutor Dra. Mary Gonzatti, por acogerme en el Grupo de Hemoparásitos, haciéndola mi segunda casa. A los profesores del departamento de Biología Celular, que de alguna manera directa ó indirectamente, me han ayudado con la elaboración de esta tesis y, especialmente, por la calidad de formación académica que me han dado. A la profesora Antonieta Porco, …”super teach”…, por dedicarme parte de su tiempo escuchando mis inquietudes y problemas en la tesis, por su dedicación en lograr las soluciones de ellos. También, porque en los momentos más difíciles en los que me encontraba y estaba a punto de declinar, usted estaba allí para animarme y siempre lograr una salida sabia……infinitamente, gracias!!!!! - A los profesores Karen Noris, Maritza Calabokis, José Bubis, Lilian Spencer y René Utrera, les doy las gracias porque mas que ser profesores han sido mis amigos, por estar allí cuando hay que estar, sin esperar nada a cambio; muchas gracias. - A la Dra. Teresa Abate, por abrirme las puertas de su laboratorio y compartir sus conocimientos conmigo. Al Dr. Oscar Noya y a su grupo de Proteómica, por su disposición en la síntesis de los péptidos sintéticos….. MIL GRACIAS! - A mi segunda familia, el Grupo de Hemoparásitos… Profe., Henry Caballero, gracias por su cariño y amistad, siempre tendrá mi afecto y estará presente en mis recuerdos, Profe. Salvador Giardina, aunque ya no lo tenemos en el grupo, guardo gratos recuerdos y le doy las gracias por sus enseñansas. La verdad es que no sé cómo escribir todo lo que tengo que agradecer a todos mis compañeros del grupo, porque no hay orden ni fecha, sino un gran cariño que espero perdure siempre. Me gustaría agradecerles muchas más cosas porque la lista es interminable, pero simplemente les diré gracias, por haberme hecho sentir que formo parte sus vidas. A mi gran amiga Eva Collovini, por todo el cariño y amistad verdadera que siempre me brindó. ¡Eternamente gracias! A Vanesa, Francia, Iralis, Giannina, Joylinet, Maru, Erika, Armando Díaz, Armando Nuñez, Bernardo y Adolfo; gracias por su apoyo y cariño;….¡los voy a extrañar!. A las que ya no están en el laboratorio, Adrianita, Luis, Gladinex, Joar y Lala, gracias por su compañía y gratos momentos. A Charlie, mi querido Carlitos, te fuiste como un suspiro, tan rápida e inesperadamente; gracias por los bellos momentos que compartimos en el laboratorio y, era cierto lo que me decías: “te haces la dura, pero sé que nos vas a extrañar”; pues sí, no sabes cuánto extrañé cada una de tus ocurrencias, tus chistes y esas largas conversaciones personales….¡Que brille para ti, la luz perpetua, Carlitos!!!!!!!

v - A Trinita Perrone; sé que en estos momentos no estás conmigo para compartir este logro, pero también sé que en donde estás, estas feliz por ello; porque tú siempre estuviste pendiente, me brindaste tu amistad y ayuda incondicional, me abriste las puertas de tu laboratorio cuando lo necesitaba. Gracias amiga, no sabes cuánto se te extraña; dejaste una huella imborrable en nuestras vidas..... ¡Que Dios te tenga en su gloria! - A mis amigos del Pabellón de Biología Celular: Carolina, Karlena, Silvia, Lisette, Vanessa, Roybel, Elena, Deysi, Anita, Jesús, Suhail, Mayela, Nelson, Leo, Liomary, Leo y María Laura, cada uno aportó un granito a esta tesis; agradezco a Dios por haberme dado el placer de tener su amistad. - A toda la gente del Bioterio: Luis, José, Félix y Rosarito, igualmente, muchísimas gracias por su colaboración. - Al Dr. Alberto Maekelt por mostrarme lo bello é interesante que es la investigación y por enseñarme que la paciencia y la constancia son la clave en la investigación y a la Dra. Graciela León por que por ella conocí al prof. Pedro Aso (mi tutor). - A mis padres, a quienes les debo todo lo que soy, por estar ahí de la manera más altruista, por enseñarme a ver la vida como es, por no existir en mi diccionario la palabra “no se puede”, por todo…… Papá, no pudiste llegar hasta este día, pero tengo la certeza que desde donde te encuentras, siempre me estás acompañando y disfrutando mis logros como siempre lo hiciste en vida… ¡Te Amo Papá! A mi madre, Beatriz, por su amor incondicional, por enseñarme, mediante el ejemplo, a no rendirme jamás. Es mucha la paciencia que has tenido para ver llegar este momento. Con todo mi corazón…….. para ti, madre querida. - A mis hermanas: Rossy, Isabel y Luisa, por compartir conmigo los momentos más importantes de mi vida y especialmente por todo su cariño y apoyo incondicional. - A mi gran compañero, amigo y esposo Victor, por emprender juntos iniciativas e ilusiones, llevando a cabo nuestros proyectos. Gracias por estar a mi lado en todo momento, por tu comprensión, apoyo y amor. - A todas las personas que de una forma u otra han hecho posible el que yo esté hoy aquí escribiendo los agradecimientos de esta Tesis Doctoral. A todos muchas gracias. Por último, quiero expresar que la culminación de esta tesis y los momentos vividos durante su realización, han sido una gran experiencia que me ha enriquecido académica y humanamente. A todos los llevaré siempre en mi corazón………. ¡GRACIAS! - A los proyectos: G21 del Decanato de Investigación y Desarrollo, USB; G98-3462 del FONACID; N° 003716 de la Unión Europea Trypadvac2 y al 2007-1425 de Misión Ciencia.

vi

UNIVERSIDAD SIMÓN BOLÍVAR DECANATO DE ESTUDIOS DE POSTGRADO COORDINACIÓN DE POSTGRADO EN BIOLOGÍA DOCTORADO EN CIENCIAS BIOLÓGICAS

LA PROTEÍNA BiP/Hsp70 DE Trypanosoma vivax. CLONAMIENTO, EXPRESIÓN Y RESPUESTA INMUNE HUMORAL DE BOVINOS INFECTADOS Estudiante: Lola del Carmen Rojas Infantas Carnet: 0383135 Tutor: Dr. Pedro María Aso 06 de octubre del 2010 RESUMEN La tripanosomiasis bovina, endémica en América tropical, es causada por Trypanosoma vivax y en Venezuela, junto con otros hemoparásitos, afectan la producción ganadera causando importantes pérdidas económicas. Con la intensificación de la comercialización de ganado entre los países de América del Sur, podría haber una dispersión de estas enfermedades a falta de controles sanitarios apropiados. Entre las proteínas con secuencias conservadas a través de la evolución y que podrían estar presentes en todo el curso de la infección por tripanosomas, están las proteínas de choque térmico (HSP). En la familia de las HSP70 se encuentra una Proteína de Unión a Inmunoglobulina (BiP), también llamada proteína 78 regulada por glucosa (Grp78), localizada en el lumen del retículo endoplasmático (RE). A pesar de su gran homología entre los miembros de la familia HSP70, BiP presenta diferencias en ciertas regiones del C- terminal de su secuencia entre diferentes especies. Esto podría proporcionar una herramienta clave para el desarrollo de pruebas de diagnóstico. El objetivo de este trabajo fue clonar, expresar y caracterizar inmunológicamente la proteína BiP/Hsp70 de T. vivax para evaluar las propiedades antigénicas de su forma recombinante. Los resultados mostraron la clonación en el vector pET160 del gen completo (1963 pb) y 4 fragmentos (253, 324, 383 y 1129 pb), correspondientes a epítopes antigénicos de la proteína. Utilizando la cepa de E. coli BL21 (DE3) Rosetta, se demostró su transcripción tanto del gen completo como de sus fragmentos. Siendo ésta una proteína heteróloga y conteniendo un porcentaje considerable de codones raros para E. coli, se logró expresar solamente el fragmento génico de 253 pb, correspondiente al polipéptido de 82 aminoácidos; de masa relativa de 14 kDa. La antigenicidad de este fragmento recombinante se evidenció en sueros bovinos infectados con T. vivax, indicando su potencial uso en el diagnóstico de la tripanosomiasis animal. Palabras Claves: T. vivax, BiP/Hsp70, expresión en procariotas, antigenicidad.

vii

ÍNDICE GENERAL

Pag APROBACIÓN DEL JURADO......................................................................

ii

DEDICATORIA............................................................................................... iii AGRADECIMIENTOS.................................................................................... iv RESUMEN.....................................................................................................

vi

ÍNDICE GENERAL........................................................................................

vii

ÍNDICE DE TABLAS.....................................................................................

x

ÍNDICE DE FIGURAS...................................................................................

xi

LISTA DE ABREVIATURAS.........................................................................

xiv

I. INTRODUCCIÓN……………………………………………...…………….....

1

I.1. Planteamiento del tema…………………………………………………...

1

I.2. Antecedentes…………………………………………………………….…

9

I.2.1 Familia de Chaperonas……………………………………………….

12

I.2.2 Función de las proteínas de choque térmico…………………….…

13

I.2.3 Respuesta Inmune relacionada con las HSP………......................

17

I.2.4 Proteína BiP, estructura y función..................................................

20

I.2.5 Mecanismos de la BiP....................................................................

24

I.2.6 Síntesis de la BiP ante la respuesta de proteínas no plegadas.....

28

I.2.7 Funciones antigénicas de la proteína BiP......................................

30

I.3. Justificación e Importancia del Tema planteado..................................

33

I.4. Problema.............................................................................................

34

I.5. Hipótesis y Objetivos...........................................................................

34

II. METODOLOGÍA........................................................................................

36

1. Materiales..............................................................................................

36

viii 1.1 Animales de experimentación..........................................................

36

1.2 Aislados de Tripanosomas...............................................................

36

1.3 Cepas bacterianas y vectores de clonación y expresion.................

37

1.4 Medios de cultivo.............................................................................

37

1.5 Antibióticos.......................................................................................

38

1.6 Mezcla de inhibidores proteolíticos..................................................

38

2. Métodos.....................................................................................................

40

2.1 Criopreservación..............................................................................

40

2.2 Purificación de T. evansi..................................................................

40

2.3 Purificación de T. vivax....................................................................

40

2.4 Aislamiento de ADN.........................................................................

42

2.4.1 Aislamiento del ADN genómico de T. vivax y T. evansi.........

42

2.4.2 Aislamiento del ADN plasmídico de E. coli............................

43

2.4.3 Cuantificación de ADN...........................................................

44

2.5 Amplificación del gen bip/hsp70 de T. vivax y T. evansi a partir del ADN genómico por PCR.................................................................

45

2.5.1 Diseño de los oligonucleótidos degenerados para el gen bip/hsp70 de T. vivax y T. evansi....................................................

45

2.5.2 Diseño de los oligonucleótidos específicos para el gen bip/hsp70 de T. vivax......................................................................

50

2.5.3 Estandarización de la amplificación del gen que codifica para la proteína BiP/Hsp70 por PCR..............................................

53

2.5.4 Electroforesis de ácidos nucleicos en geles de agarosa.......

57

2.5.5 Purificación del amplicón a partir de geles de agarosa.........

58

2.6 Clonación del gen completo y parcial de la proteína Bip/Hsp70 de T. vivax............................................................................................

60

2.6.1 Preparación de células competentes de E. coli DH5α, BL21/DE3) y Rosett/DE3)..................................................

60

2.6.2 Ligación.................................................................................

60

2.6.3 Transformación en E. coli......................................................

63

ix 2.6.4 Selección de clones transformantes de E. coli......................

63

2.6.5 Confirmación de la presencia de insertos..............................

64

2.7 Expresión de la proteína BiP/Hsp70 de T. vivax..............................

64

2.7.1 Inducción de la Expresión........................................................

64

2.7.2 Lisis Celular.............................................................................

65

2.7.3 Transcripción de la proteína BiP/Hsp70..................................

66

2.7.3.1 Aislamiento del ARN Celular total................................

66

2.7.3.2 Electroforesis en geles de agarosa.............................

67

2.7.3.3 Cuantificación espectrofotométrica del ARN...............

68

2.7.3.4 RT-PCR.......................................................................

68

2.7.3.5 PCR con el cADN........................................................

70

2.7.4 Análisis de la proteína por electroforesis en geles de poliacrilamida en condiciones disociantes (EGP-SS)............ 2.7.5

Electrotransferencia

de

proteínas

a

membrana

de

nitrocelulosa...................................................................................... 2.7.6

Detección

de

la

proteína

recombinante

70 73

mediante

inmunotinción....................................................................................

74

2.8 Obtención de la proteína recombinante purificada............................

75

2.8.1 Diálisis y concentración del sobrenadante..............................

75

2.8.2 Purificación de la proteina rBiP/Hsp70 por cromatografía de afinidad.............................................................................................

75

2.9 Diseño y obtención de péptidos sintéticos.........................................

76

2.10 Antigenicidad y Potencial diagnóstico de la rBiP/Hsp70 y de los Péptidos Sintéticos............................................................................

78

III. RESULTADOS.......................................................................................... 82 IV. DISCUSIÓN..............................................................................................

138

V. CONCLUSIONES......................................................................................

153

VI. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS........................................................

155

VII. ANEXOS.................................................................................................. 165

x

TABLAS

Tabla I II III IV V VI VII VIII IX X XI XII XIII XIV XV

Título

Pág.

Funciones de algunas chaperonas y chaperoninas 15 Cepas Bacterianas 39 Vectores de clonación y expresión 39 Secuencias alineadas con gran homología con el gen Antígeno p69 de T. congolense 47 Frecuencia del uso de codones por T. vivax 47 Secuencia de los oligonucleótidos degenerados que amplifican dentro de la región ORF del gen Antígeno p69 de T. cogolense 48 Secuencia de los oligonucleótidos específicos para el gen bip/hsp70 de T. vivax 52 Mezcla de la reacción de la amplificación para el gen completo bip/hsp70 de T. vivax 54 Programa de la amplificación para el gen completo con la enzima Go Taq 55 Programa de la amplificación para el gen completo con la enzima termófila ThermalAce 55 Temperaturas de hibridación para el gen parcial bip/hsp70 de T. vivax 56 Rendimientos en la purificación de T. vivax por cromatografía de intercambio aniónico, DEAE- Celulosa en presencia de una solución de Krebs modificada, pH 7,2 87 Rendimiento en la obtención de T. vivax a partir del plasma con 0,5% de glucosa 87 Lista de los juegos de oligonucleótidos específicos. 96 Concentración de ARN (µg/ml) y la obtención de la pureza (A260/A280). 120

xi

ÍNDICE DE FIGURAS

Fig.

Título

Pág.

1

7

2

Estructura de los dominios de la Hsp70 Engrosamiento en diferentes regiones del cromosoma de Drosophila melanogaste

3

Expresión de los genes amplificados, vistos por Ritossa en 1962

11

4

Plegamiento asistido por chaperonas

11

5

Modelo del rol de las chaperonas bacteriales en el plegamiento de proteínas recién sintetizadas Efectos de las chaperoninas moleculares en el plegamiento de proteínas BiP en el Retículo Endoplasmático

6 7 8 9

10 11 12 13 14 15 16 17

18 19 20

Estructura de las proteínas de la familia HSP70 Esquema de las participación de BiP para sellar el poro acuoso del translocón durante la integración de la proteína y así evitar el paso de iones Sitios de unión de BiP a la inmunoglobulina BiP y las lectinas en el ensamblaje de nuevos péptidos La respuesta a la proteína no plegada regula la degradación de proteínas asociadas al RE Distribución de la secuencia con mayor homología con la secuencia del gen antígeno p69 de T. congolense por Blast Ubicación de los oligonucleótidos degenerados en la secuencia del gen Antígeno p69 de T. congolense Ubicación de los oligonucleótidos específicos en la secuencia del gen bip/hsp70 de T. vivax Protocolo de purificación del amplicón a partir del gel de agarosa por medio de acetato de sodio Aspectos clínicos y parasitológicos más resaltantes de la evolución de las infecciones experimentales con T. vivax, tanto en bovinos como en ovinos Electroforesis en gel de agarosa al 0,8% mostrando la integridad del ADN genómico de T. evansi. Aislamiento del ADN genómico de T. vivax. Extracción del ADN plasmídico recombinante con dos protocolos

9

14 16 21 23

23 26 28 29 46 49 51 59

85 90 90 91

xii

21 22

23

24

25 26

27

28 29

30 31 32

33 34 35 36 37

Alineamiento múltiple de las secuencias nucleotídicas del gen bip/hsp70 de T. vivax, T. congolese y T. brucei Electroforesis en gel de agarosa al 0,8% de los productos amplificados con los oligonucleótidos degenerados para el gen completo bip/hsp70 de T. vivax y T. evansi Amplificación con los oligonucleótidos degenerados internos (lcri2) que amplifica un fragmento de ~520 pb del gen bip/hsp70 de T. vivax a diferentes temperaturas de hibridación Electroforesis en gel de agarosa de las amplificaciones de ADN por la técnica de PCR utilizando combinaciones de oligonucleótidos específicos que acotan en diferentes lugares de la secuencia del gen bip/hsp70 de T. vivax Cromatograma de la secuencia de una fracción del gen Te_bip/hsp70 enviada por el CeSAAN Distribución de las secuencias con mayor homología con la secuencia de nucleótidos del fragmento amplificado con los oligonucleótidos degenerados y e ADN de T. evansi Alineamiento de la secuencia de aminoácidos del fragmento amplificado con el ADN de T. evansi, con la secuencia de la proteína BiP/Grp78 de T. brucei y el antígeno p69 de T. congolense Análisis de secuencia del producto amplificado con oligonucleótidos degenerados y ADN genómico de T. vivax. Alineamiento múltiple de la secuencia obtenida del gen bip/hsp70 de T. vivax con la secuencia putativa obtenida de la base de datos del GeneDB Alineamiento múltiple de la secuencia obtenida del gen bip/hsp70 de T. vivax con la secuencia del gen p69 de T. congolense. Alineamiento múltiple de la secuencia obtenida del gen bip/hsp70 de T. vivax con la secuencia del gen bip/grp78 de T. brucei. Análisis de similitud de las secuencias de aminoácidos de Tv_BiP/Hsp70 obtenida con las secuencias de las proteínas BiP/Grp78 y P69 de T. brucei y T. congolense, respectivamente Predicción de las secuencias antigénicas en la proteína BiP, para T. evansi y T. brucei Predicción de las secuencias antigénicas en la proteína BiP, para T. vivax y T. congolense Predicción de las secciones más accesibles, antigénicas e hidrofílicas dentro de la secuencia r253a-1/BiP de T. vivax Representación esquemática de la ubicación e los diferentes fragmentos del gen bip/hsp70 de T. vivax clonados en pET160 Amplificaciones con ADN plasmídico del vector recombinante pET 160 y con los oligonucleótidos T7

92

93

93

95 99

100

101 103

104 106 108

111 113 114 115 117 117

xiii 38

39 40 41 42

43

44

45 46 47 48 49

Electroforesis en gel de agarosa al 1% de la PCR con el ADN genómico de T. vivax y el ADN plasmídico pET160 recombinante con los oligonucleótidos específicos Análisis de la presencia de codones de baja frecuencia en E. coli de la proteína BiP/Hsp70 de T. vivax Electroforesis del ARN en geles de agarosa al 1% con Bromuro de Etidio Electroforesis en gel de agarosa de los productos de PCR con cADN y ADN plasmídico Crecimiento bacteriano en la expresión con y sin inducción con 1mM IPTG, a 37°C de los clones 324-6, 253a-1, 384-4, p2-1-2 y E. coli Rosetta® sin inserto con 1 h de intervalo Análisis electroforético en geles de poliacrilamida al 20% en condiciones disociantes teñida con nitrato de plata, Transferencia a una membrana de nitrocelulosa d 0,45µm y la detección de polipéptidos por inmunotinción con el anticuerpo anti-histidina de los clones recombinantes 253a-1, 324-6 y 384-4 Inmunotinción de las fracciones purificadas por cromatografía de afinidad en columna de níquel y luego separadas en geles de poliacrilamida (20%) en condiciones desnaturalizantes ELISA indirecto con el polipéptido recombinante 253a-1 ELISA Indirecto con el polipéptido recombinante r253a-1/BiP con diferentes soluciones de bloqueo. ELISA indirecto con el polipéptido recombinante r253a-1/BiP utilizando sueros experimentales infectados con T. vivax Determinación de la antigenicidad del polipéptido recombinante 253a1/BiP mediante el “Western blot” Determinación de la antigenicidad de los péptidos sintéticos correspondientes a la proteína BiP/Hsp70 de T. vivax por la técnica de inmunotinción

119 119 121 121

122

126

127 130 131 132 136

137

1

I. INTRODUCCIÓN I.1. Planteamiento del Tema La tripanosomiasis es definida como una enfermedad parasitaria producida por protozoarios hemotrópicos de ubicación exoglobular, pertenecientes al género Trypanosoma. En animales: T. vivax, T. evansi, T. theileri, entre otros; en humanos: T. cruzi, T. rangeli, T. brucei gambiense y T. brucei rhodesiense.

El T. vivax, agente causal de la tripanosomiasis bovina, es señalado por primera vez en Venezuela por el doctor Enrique Tejera (1920), quien lo llama T. cazalboui. Se dice que su introducción en América está relacionada con una importación de bovinos cebú, en 1830, traídos desde Senegal a la Guyana Francesa y las islas de Guadalupe y Martinica (Toro, 1987). En Venezuela, la tripanosomiasis bovina está bien difundida en las diferentes regiones del país y su transmisión se debe a los insectos hematófagos como tábanos, moscas bravas, etc.

La tripanosomiasis causada por Trypanosoma vivax es una enfermedad con características clínicas-patológicas muy variables, debido en parte a la virulencia de la cepa, la susceptibilidad de las especies hospedadoras, inmunidad del animal infectado, entre otros (Masake, 1980; Ventura et al, 2001).

T. vivax, pertenece a la sección Salivaria del género Trypanosoma, al igual que su homólogo, T. congolense, también en este grupo se encuentran T. brucei, T. b. evansi, T. b. gambiense, T. b. rhodesiense, T. b equiperdum y T. (Pycnomonas) suis.

2 La tripanosomiasis es una enfermedad cosmopolita, distribuida principalmente en áreas tropicales o subtropicales de África y América. En Venezuela, está ampliamente difundida en las

diversas

regiones

ganaderas, afectando

la

productividad (Espinosa et al., 1999) y reproductividad en rebaños vacunos y equinos (Bolívar, et al., 2007).

En el campo de los cambios hematológicos que ocurren en la tripanosomiasis animal, se han realizado estudios comparativos que indican que las infecciones por tripanosomas por lo general presenta tres fases: En la primera fase induce a una crisis aguda con presencia de una alta parasitemia y una pancitopenia, en donde el animal puede morir ó pasar a la segunda fase ó crisis crónica; aquí la parasitemia es de menor intensidad aunque se mantiene la anemia y la trombocitopenia

y en

algunos casos, la leucopenia. Los animales que sobreviven a esta fase, pasan a una tercera fase de recuperación (Valera et al, 2005).

La biología molecular de los tripanosomatídeos a diferencia de otros eucariotas, presenta una transcripción policistrónica (Muhich & Broothroyd,

1988); el

procesamiento del ARN se lleva a cabo mediante el corte y empalme (“transsplicing”) (Murphy, et al., 1986) y el proceso de la edición del ARN se realiza en la mitocondria (Simpson, 1987). Se sabe que los tripanosomas presentan dos genomas relativamente pequeños: el nuclear y el mitocondrial o kinetoplasto formado por una estructura compleja que consta de minicírculos y maxicírculos. Los maxicírculos son el homólogo funcional del ADN mitocondrial de los eucariotas, poseen un tamaño que varía entre 20 y 40 kb y están altamente conservados (Vallejo, 1998; RodríguezSalinas, et al., 2009). En ellos están los genes que codifican para los ARN ribosómicos mitocondriales y para las proteínas que participan en los procesos energéticos de la mitocondria (Stuart & Feaging, 1992). Los minicírculos presentan un tamaño que varía entre 0,5 y 2,9 kb, que a diferencia de los maxicírculos,

3 presentan un alto grado de variabilidad de secuencia con pequeñas regiones conservadas (Rodríguez-Salinas, et al. 2009). Los minicírculos codifican para los ARN-guía (gARN), necesarios para la edición de los ARN mitocondriales (RNAediting), proceso característico de la expresión génica en los tripanosomatídeos (Cruz-Reyes, et al. 2001), en donde la expresión de los maxicírculos implica un proceso de modificación de los transcritos primarios, en el que son eliminados o añadidos residuos de uridina hasta crear mensajeros funcionales (Stuart, 1991). Algunos genes en los maxicírculos tienen “errores” que necesitan ser corregidos y los ARN guías son importantes para ello.

Bajo el efecto de cualquier factor estresante, la célula inmediatamente inicia la producción de las proteínas de choque térmico ó de estrés (HSP, del inglés heat shock proteins) (Rico, et al., 1998) que se acumulan en el nucléolo, lugar de formación de los ribosomas, responsables de la síntesis de proteínas (Mathew & Morimoto, 1998). Las proteínas de choque térmico (HSP) protegen a las proteínas que se sinteticen a partir de ese momento y además pueden unirse a las ya desnaturalizadas para bloquear la unión de las ubiquitinas, impidiendo el acceso de proteasas y facilitando la restauración de la estructura terciaria e inclusive participan en el ensamblaje dentro de estructuras oligoméricas.

La medida de los niveles de diferentes HSP es indicativa del grado de estrés de una célula y permite definir por ejemplo, en los estados de sepsis, la severidad de la afección, sirviendo por ende como parámetro de evaluación en el tiempo de la intensidad del proceso séptico y de su eventual pronóstico. (Arboleda & Matheus, 2005).

A pesar de su alta conservación filogenética, muchas HSPs han sido identificadas como grandes grupos antigénicos en patógenos (Authie et al., 1993,

4 Beissenger & Buchner, 1998; Bannai et al., 2003). Sorpresivamente, la reacción cruzada entre las Hsp70 del hospedador y del parásito raramente ocurre; esto podría resultar de la estructura dual de estas proteínas, ya que poseen un dominio Nterminal altamente conservado y pobremente antigénico y una región C-terminal parásito-específica que es altamente antigénica (Shinnick, 1991). Son antígenos inmunodominantes reconocidos por el sistema inmune. En la mayoría de los parásitos y en los tripanosomatídeos, las HSP 70 han sido denominadas “panantígenos”.

En vista de que la Hsp70 es una proteína abundante, que induce una respuesta humoral y celular específica muy marcada durante la infección, ha conllevado a su estudio como una herramienta para el diagnóstico inmunológico; aunque los estudios reportados en cuanto a su especificidad permanecen en controversia por algunos resultados contradictorios, como por ejemplo, en el caso de la Hsp70 de Leishmania donovani, Arora (1995) y su grupo de investigadores, llegan a la conclusión de que para el diagnóstico serológico del Kala azar no es útil, ya que las personas sanas también presentaron anticuerpos contra este antígeno. En cambio, MacFarlane (1990) y Wallace (1992) encontraron que la Hsp70 es específica para L. donovani. Por lo tanto, muchos investigadores están estudiando fragmentos de la proteína como es el caso de Amorim (1996) que utilizó una fracción del C- terminal de la proteína Hsp70 de L. braziliensis, encontrando una reacción cruzada con los sueros de pacientes relacionados con leishmaniasis mucocutáneos (MCL), L. cutanea (CL) y L. visceral (LV), mas no fue así para los sueros controles (pacientes sanos), sueros de pacientes con T. cruzi y de pacientes con L. amazonensis. Es por ello, necesario la búsqueda de determinantes antigénicos específicos, útiles para ser empleados en el diagnóstico inmunológico.

La proteína de unión a inmunoglobulinas (BiP) es una chaperona molecular con amplia especificidad que pertenece a la familia de las HSP70 (Munro & Pelma, 1986;

5 Hendershot et al, 1995), se expresa en forma constitutiva y está localizada en el lumen del retículo endoplasmático (RE) (Gething, 1999; Mayer et al, 2000). Se une temporalmente con las cadenas de polipéptidos recién sintetizados del RE y los mantiene en un estado competente para su posterior plegamiento y oligomerización. Por

ello

es

esencial

en

el

correcto

plegamiento

y

en

la

modificación

postranscripcional de las proteínas.

A nivel celular, la expresión de la proteína BiP es alta y aumenta cuando hay acumulación de proteínas desplegadas en el interior de las células y durante el estrés celular. La proteína BiP también es responsable de la transferencia de proteínas aberrantes al proteosoma para su posterior degradación. (Fiorentino, 2007).

En donde la ubiquitina se une a sitios específicos hidrofóbicos de las

proteínas destinadas al proteosoma, el cual reconoce a la ubiquitina y la proteína es desplegada a medida que son introducidas en el interior del mismo. Estos sitios hidrofóbicos también son reconocidos por la proteína BiP, la cual se une a la proteína mal plegada para evitar que sea destinada al proteosoma y de forma distinta, la proteína BiP se separa o simplemente no se une a dichos sitios de reconocimiento o de unión de la ubiquitina, dando lugar a la proteólisis por la vía del proteosoma.

En los estudios iniciales sobre la participación de estas chaperonas en los procesos de señalización celular, surgió que ellos actúan como mediadores proinflamatorios con acciones similares a la interleuquina-1 (IL-1) ó al factor de necrosis tumoral alfa (TNF-α). Sin embargo, recientes estudios conllevan a pensar que ciertas moléculas chaperonas como la Hsp70 y la BiP actúan como inhibidores de las acciones pro-inflamatorios en las células mieloides (Shamaei-Tousier, et al., 2007).

En condiciones de crecimiento, BiP se encuentra en mayor número, aunque no obstante, su síntesis es inducida cuando las condiciones son propicias durante el

6 estrés celular, para la acumulación de los polipéptidos que estén mal plegados en el RE por anoxia y privación de glucosa (Gething, 1999, Marciniak, et al, 2006), lo cual proporciona un marcador para los estados de enfermedad (como en los casos de tumor, cáncer y de articulaciones inflamadas) que resultan de las proteínas mal plegadas (Marciniak, et al., 2006).

Como miembro de la familia de las HSP70, BiP, presenta un dominio de unión al ATP en el extremo N- terminal y un sitio de unión al péptido en el extremo C- terminal (Boulangé, 2002). (Fig.1)

El dominio C- terminal de BiP posee ciertas regiones en su secuencia de aminoácidos que son específicas de la especie. Por ejemplo, se ha encontrado que de la BiP de T. congolense, es altamente homóloga a otros miembros de la familia (Boulangé et al, 2002), excepto por su región del C- Terminal de 40 aminoácidos, que pareciera ser específica para el tripanosoma (Boulangé & Authié, 1994). Este homólogo de BiP también está presente en T. brucei y en T. vivax, que al igual que T. congolense, poseen una pequeña variación en su secuencia en el C- terminal, en donde presentan una extensión correspondiente a su secuencia señal de retención (MDDL), la cual le hace diferente al resto de los eucariotas estudiados. Sin embargo, sus funciones de translocación de proteínas y de chaperona citosólica parecieran ser las mismas. (Bangs, 1993; Bringaud et al, 1995; Bossard et al, 2003).

7

Figura 1: Estructura de los dominios de la Hsp70: Un dominio N- Terminal que se pliega para formar el sitio catalítico ATPasa y un dominio de unión al sustrato CTerminal. (Tomado de: http://peregil.homelinux.org/intrawebs/aulavirtual/tema_4.html)

Cabe mencionar que en el ganado tripanosusceptible y en el tripanotolerante, la infección por tripanosoma a menudo se caracteriza por fases crónicas que están asociadas con niveles ligeros, fluctuantes e infrecuentes de parasitemia. Igualmente las técicas parasitológicas aplicadas como rutina, incluyendo la mayoría de métodos de concentración como la prueba de Woo y la técnica de la Capa de Glóbulos blancos (BCT, del inglés Buffy Coat technique), a menudo fracasan al revelar bajos niveles de tripanosomas en el corriente sanguíneo. Por tal motivo, la prevalencia del tripanosoma y su incidencia es subvalorada.

Existen

pruebas

como

el

ELISA

(siglas

del

inglés:

Enzyme

linked

immunoabsorvent Assay), que han sido desarrolladas para el diagnóstico de la tripanosomiasis bovina, como es el caso del Elisa-Ag (ELISA de captura), desarrollada para la detección de la parasitemia por T. congolense en ganado, la cual reveló una respuesta positiva antigénicamente en animales que fueron parasitológicamente negativos. Aunque esta técnica fue sensible en el caso de la detección crónica o para las infecciones repetidas, no lo fue para las infecciones recientes (Mattioli & Faye, 1996).

8 Otra prueba inmunoenzimática es la que ha sido desarrollada por Bossard, et al. (2003, 2010), quienes diseñaron un ELISA DE INHIBICION usando un anticuerpo monoclonal anti-BiP, 1F3, el cual es una IgG1 que se une a un epítope de la región C- terminal (C-25) de la molécula Hsp70/Bip (p69), y la proteína completa unida a la molécula de unión a la maltosa (MBP) recombinante. Dicha técnica resultó ser una prueba Pan-tripanosoma, es decir, no había diferencias entre las especies de tripanosoma implicadas. Cabe mencionar, que para estos ensayos previamente ellos evaluaron parasitológicamente las muestras.

Actualmente, la biología molecular a hecho de la amplificación in vitro de secuencias específicas de ADN una herramienta invaluable en el diagnóstico de agentes patógenos. La técnica de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) ha sido adaptada al diagnóstico de diferentes tripanosomatídeos. La alta sensibilidad en la detección de los parásitos T. evansi y T. vivax permitiría una mejor estimación de la presencia y distribución de estos parásitos (Nantulya, 1990).

El propósito del presente trabajo es identificar la proteína BiP/Hsp70 en aislados venezolanos de T. vivax y evaluar su capacidad antigénica a partir de la proteína recombinante (rBiP/Hsp70), parcial o total, utilizando tripanosomas de la especie T. vivax. Este antígeno será evaluado frente a sueros provenientes de bovinos infectados en forma natural o experimental con T. vivax para determinar su especificidad, sensibilidad y efectividad en el diagnóstico de la tripanosomiasis; de forma tal que a futuro se pueda seguir el curso y evaluación de infecciones experimentales con T. vivax en bovino para el estudio del tiempo de aparición, duración, isotipos y variación de los niveles de anticuerpos durante el curso de la infección y por último, comparar los resultados con los obtenidos mediante otros métodos a fin de conocer la validez de la prueba como instrumento para el diagnóstico y evaluación de la respuesta inmune humoral a esta proteína presente en los tripanosomas.

9 I.2. ANTECEDENTES Las proteínas de choque térmico, son un grupo de moléculas descubiertas accidentalmente hace 42 años por F.M. Ritossa, (Pockley, 2001; Kopecek et al., 2001) que observó en 1962 cómo el cromosoma de la Drosophila melanogaster presenta engrosamientos en diferentes partes (locis), pocos minutos después de que las moscas eran sometidas a incrementos en la temperatura ambiental (Fig. 2).

Estas estructuras corresponden a la amplificación de genes generadores de proteínas que fueron posteriormente identificadas por Tissiers et al., (1974), como proteínas de “choque térmico”, y las cuales tenían diferente peso molecular, pero entre las que sobresalía una de 70,000 daltons y que hoy se conoce como HSP70 (Figura. 3) (Tissiers et al, 1974; Kopecek et al., 2001).

Figura 2: Engrosamientos en diferentes regiones del cromosoma de Drosophila melanogaster. Ritossa (1962) observó a los pocos minutos de ser sometida a incrementos de temperatura, engrosamientos que correspondían a la amplificación de genes que codifican proteínas que posteriormente, en 1974, A. Tissier y col. las identificaron como proteínas de choque térmico (Tomado de: http://www.infrasauna.it/Studio_Sauna_Italia.pdf).

10 Posteriormente, otros investigadores encontraron que la producción de estas proteínas también se incrementan por otros factores de estrés, tales como metales tóxicos,

alcohol,

diferentes

subproductos

metabólicos,

trauma,

isquemia

y

quimioterapia, por lo cual hoy se les conoce como “proteínas de respuesta al estrés” (Pockley, 2001; Kopecek et al., 2001).

Su actividad requiere de ATP, es decir, hidrolizan ATP al unirse específicamente a los péptidos de las proteínas en formación y a las proteínas mal plegadas, con carácter hidrofóbico (Figuras 3 y 4) (Kohler et al, 1996; Parodi, 1998; Gething, 1999; Kleizen & Braakman, 2004). Es decir, en situaciones de estrés como el calor, se altera la conformación terciaria de las proteínas, desplegando las cadenas de aminoácidos y se exponen los aminoácidos hidrofóbicos, lo que provoca la pérdida de la función de la proteína.

Durante este fenómeno, denominado desnaturalización, las proteínas se agregan entre sí, mediante sus aminoácidos hidrofóbicos. En estas circunstancias las familias de HSP ayudan a la célula a conservar a las proteínas desnaturalizadas, manteniéndolas hasta recuperar su estado tridimensional y por lo tanto recuperar su función luego de que el estrés haya pasado, ó también la unión de las Hsps destina a las proteínas a ser degradadas tanto por la vía lisosomal como la vía proteosomal (sistema del Proteosoma-Ubiquitina) (Lodish et al, 2002; Lord & Frigerio, 2002).

11

Figura 3: Expresión de los genes amplificados, vistos por Ritossa en 1962.- Tissieres A. & col. en 1974 observaron la presencia de proteínas de diferentes pesos moleculares luego de aumentar la temperatura, en donde sobresalían las de 70.000 daltons (Hsp70). Tomado de: http://www.infrasauna.it/Studio_Sauna_Italia.pdf

Figura 4: Plegamiento asistido por chaperonas.- Se pliegan dentro de su propia estructura tridimensional con la asistencia de las Hsp70 y otras proteínas dependen de complejos como las chaperoninas eucariontes, o TCiP, las cuales son complejos multiméricos con forma de barril, compuestas de 8 unidades de Hsp60. Siendo su homólogo bacteriano: GroEL, con 14 subunidades. Tomado de: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/bookshelf/br.fcgi?book=mcb&part=A549

12 Las HSP están presentes tanto en eucariotas como en procariotas y son las proteínas más conservadas a través de la evolución (Kopecek et al, 2001; Boulangé et al, 2002;). Se localizan en el citosol y en casi todos los compartimientos celulares que incluyen la mitocondria, específicamente en la matríz, en donde el péptido se fija a una o más chaperonas que tienen funciones similares a las citosólicas. De igual manera pasa en el caso de las proteínas de secreción que se mueven desde el lumen del retículo endoplasmático rugoso (RER) hacia el complejo de Golgi y luego hacia la superficie celular (Ellgard & Helenius, 2001; Tsai et al, 2002; Kleizen & Braakman, 2004). I.2.1 Familia de Chaperonas Existen dos familias generales de chaperonas: 1) Chaperonas moleculares, que se unen y estabilizan a las proteínas no plegadas o parcialmente plegadas, por lo que impiden su degradación. Entre estas chaperonas, se encuentra la familia HSP70, que incluye la Hsp70 y las Hsc70 del citosol y de la matriz mitocondrial; BIP ó GRP78 en el RE (Munro & Pelma, 1986; Gething, 1999; Mayer et al, 2000) y en la bacteria, la principal proteína Hsp70 es DnaK y una segunda proteína, la HscA (Hesterkamp, 1998). En levaduras, existen por lo menos 14 proteínas conocidas, entre las que se encuentra la proteína citosólica Kar2p (SSD1), llamada también Kar2p/Bip que reside en el RE y una de sus funciones principales esta en la translocación de los polipéptidos recién sintetizados junto con la proteína Sec61 (Seppa, 2005). Aparte de la Hsp70, también se encuentran las Hsp90, las Hsp110, etc. (Fig. 5 y tabla1).

2) Las Chaperoninas, que facilitan la acción del plegamiento de las proteínas. Entre las chaperoninas eucariotas se encuentra TCip que está compuesta por 8 unidades de Hsp60 que forman una estructura de barril y su homólogo en procariotas, GroEL, que contiene 14 subunidades iguales, pero que a diferencia de la chaperonina eucariota, Tcip, ésta necesita de una co-chaperonina, GroES. (Ranson et al, 1998)

13 (Fig.6 y tabla 1) que sirve de cubierta o tapa en ambos extremos del complejo cilíndrico, por lo quea este complejo molecular se les denomina GroEL/GroES. I.2.2 Función de las proteínas de choque térmico Bajo el efecto de cualquier factor estresante, la célula inmediatamente inicia la producción de las HSP (Rico et al, 1998) que se acumulan en el nucleolo, lugar de formación de los ribosomas, responsables de la síntesis de proteínas (Mathew & Morimoto, 1998). Las HSP protegen a las proteínas que se sinteticen a partir de ese momento (Kopecek et al, 2001) y además pueden unirse a las ya desnaturalizadas para bloquear la unión de las ubiquitinas, impidiendo la unión de proteasas y facilitando la restauración de la estructura 3D (Ranson et al, 1998) e inclusive participan en el ensamblaje dentro de estructuras oligoméricas (Hartl, 1996; Kiang & Tsokos, 1998; Neuer et al, 2000; Frydman, 2001). Las moléculas de anticuerpos o del HLA (Antígeno leucocitario humano), formadas como respuesta a una agresión, requieren de esta protección de las HSP para poder ser excretadas o para lograr llegar a la membrana celular sin ser alteradas durante su tránsito por el citoplasma, (Pockley, 2001).

La medida de los niveles de diferentes HSP es indicativa del grado de estrés de una célula y permite definir, en estados de sepsis, por ejemplo, la severidad de la afección, sirviendo por ende como parámetro de evaluación en el tiempo de la intensidad del proceso séptico y de su eventual pronóstico (Authié et al, 1993; Römish, 1999; Bannai et al, 2003).

14

Figura 5: Modelo del rol de las chaperonas bacteriales en el plegamiento de proteínas recién sintetizadas. El factor disparador asociado al ribosoma, interactúa con los polipéptidos nacientes emergentes. Subsecuentemente, existen múltiples rutas que proporcionan una malla flexible para el plegamiento de las cadenas nacientes hacia estructuras nativas. Mientras que algunas proteínas recien sintetizadas, automáticamente se pliegan a su estado nativo, otras asociadas posttraduccionalmente con el sistema DnaK y/o con la maquinaria GroEL/GroES hasta que alcance su conformación correcta (Tomado de: Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology, 39:261-277, 2004)

15

Tabla I: Funciones de algunas Chaperonas y Chaperoninas

FUNCIÓN Disgregación dependiente de ATP y desnaturalización para Hsp 110/CIp

la degradación. Puede aumentar notablemente la eficiencia del sistema Hsp70/40.

Hsp90 (citoplasma)

Maduración de receptores de hormonas esteroides. -

Hsp70 (DnaK) GrpE/Bag

Estabilización

dependiente

de

ATP

de

regiones

hidrofóbicas de polipéptidos extendidos, mínimo 7 aa (XXXLLLXX) en su región N- terminal.

Hsp40/DnaJ

- El dominio J es un regulador de las Hsp70, estimulando la

Grp78/BiP

actividad de hidrólisis de las Hsp70; también interacciona directamente con el sustrato transfiriéndolo a las Hsp70.

Hsp60/Hsp10 GroEL/GroES Chaperoninas/cochaperoninas Pequeñas Hsps

Plegamiento terminal terciario dependiente de ATP. Puede utilizar péptidos extendidos o con estructura secundario (glóbulo fundido). Interacciones hidrofóbicas. Estabilización contra la agregación en situaciones de estrés (heat shock).

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Figura 6.- Efectos de las chaperoninas moleculares en el plegamiento de las proteínas. Chaperonas de diversos tipos se unen a polipéptidos recién sintetizados en los ribosomas, a proteínas que atraviesan las membranas de orgánulos o a proteínas que se han desnaturalizado. Esta unión, desempeña un papel protector y evita que las proteínas alcancen un estado de agregación irreversible. Sin negar que las chaperonas intervengan de forma directa en el plegamiento de las proteínas, en la mayoría de los casos parecen transportar los polipéptidos desnaturalizados hasta las chaperoninas, donde se pliegan. (Tomado de: http://www.ucm.es/info/antilia/asignatura/practicas/trabajos_ciencia/caperoninas.htm)

17 Por todo lo antes mencionado, podemos resumir que las HSP presentan tres funciones principales: 1)

Bajo condiciones fisiológicas, ellas actúan como chaperonas moleculares para

modular el proceso de plegamiento y deciden si una proteína naciente se deba plegar o si debería ser marcada por la ubiquitina para su degradación (Bangs et al, 1993; Hayes & Dice, 1996; Mathew & Morimoto, 1998; Gethhing, 1999; Römish, 1999; Kopecek et al, 2001; Pockley, 2001; Kabani et al, 2003), también participan en el transporte de otras proteínas y en algunos casos en el ensamblaje de estructuras oligoméricas. (Plemper & Wolf, 1999)

2)

Protegen a la célula cuando están sometidas a estrés celular.

3)

En ausencia de estrés (condiciones normales), las proteínas Hsp70 y la

constitutiva Hsc70, pueden servir como proteínas asistentes, por que pueden interactuar directamente con los ácidos grasos y de esta manera unirse a las membranas celulares (Leung & Hightower, 1997). Son capaces de penetrar en las membranas, bien sea por capacidad intrínseca o por asociación con complejos transportadores, lo que las convierte en candidatas para el diseño de conductores de drogas. (Leung & Hightower, 1997) I.2.3 Respuesta inmune relacionada con las HSP Estas proteínas han generado un mayor interés desde que fueron descritas como antígenos de microorganismos infecciosos (Moroi et al, 2000). Se ha sugerido que el reconocimiento por el sistema inmune de las HSPs del patógeno sirve como una primera línea de defensa, pero al tiempo es la forma por la que se puede desencadenar un proceso autoinmune como consecuencia de la aparición de una reactividad cruzada con las HSPs propias.

Como una consecuencia de su función de chaperona, las HSPs, se encuentran asociadas a un amplio espectro de péptidos derivados de las células de las que

18 estas proteínas se aíslan (Moroi et al, 2000). En células tumorales ó células infectadas por virus, la expresión de la Hsp72 es importante para la generación de respuesta inmune celular específica (Multhoff et al, 1995).

Estas observaciones sugieren que esta proteína modula una vigilancia inmune que activa a los linfocitos T, además de proporcionar una línea de defensa adicional contra la infección y en la transformación maligna, aumentando la sensibilidad a lisis mediada por células citocidas efectoras naturales (NK, del inglés natural killer). Por ello, en los estudios realizados en tumores, no resulta sorprendente que los complejos “HSP-péptidos” se comporten como antígenos específicos de tumores (Moroi et al, 2000; Quijano et al, 2003).

Tal es así, que hoy en día se están probando vacunas con estos complejos HSP-péptidos, lo cual induce respuestas inmunes protectivas frente al tumor del que fueron aislados dichos complejos (Quijano et al, 2003). Estudios recientes indican que las características antigénicas de las HSPs pueden ser explotadas para aumentar la respuesta inmune humoral y celular frente a proteínas de interés (Lewis, 2004 y Srivastava, 2008).

Hoy en día, se están desarrollando medicamentos que se fundamentan en las múltiples funciones que ejercen las proteínas de choque térmico; algunos inhiben proteínas y otros las activan en función de la enfermedad que combaten y de las Hsp que se estén utilizando o contra qué se dirigen (Srivastava, 2008). De modo tal que para inhibir a las HSP, se administran sustancias que las bloqueen porque en condiciones normales, ayudarían a que una célula cancerosa o infectada por virus ó bacteria, sobreviva. Este tratamiento de inhibición, ya sea por calor o por fármacos, solo se lleva a cabo cuando se requiere que el paciente deba proteger al órgano de interés, por ejemplo, durante tratamientos quirúrgicos. Para el tratamiento con

19 inmunoterapia, el desarrollo de vacunas purificando los complejos antigénicos HspPéptido e introducidos al organismo para desencadenar una respuesta inmune frente a un tumor o a un patógeno (Srivastava, 2008).

En el año 2003, Bannai y su grupo de investigadores, clonaron el gen de la proteína mitocondrial de choque térmico de 70kDa (MTP) de T. congolense, el cual es esencial tanto para la forma procíclica (PCF) como para la forma sanguínea (BSF). Utilizando una librería de cDNA y el anticuerpo monoclonal (AcMo) 10F9, realizaron un inmunoescrining de su estado PCF. Este clon de cDNA presenta un marco abierto de lectura (ORF, del inglés open reading frame) de 1977pb, el cual corresponde a una secuencia de 659 aminoácidos (aa) que es altamente homólogo a una serie de MTPs en Eucariotas y en DnaK (hsp70) de E. coli. La secuencia Nterminal de esta proteína contiene una secuencia de gran homología a la secuencia señal de trasporte en otras proteínas mitocondriales de los tripanosomatídeos. Ellos señalaron que esta secuencia señal, para algunas proteínas de la matriz mitocondrial, en los tripanosomas, pareciera ser relativamente corta (7 a 9 aminoácidos), pero el tamaño del péptido señal de la MTP de T. congolense es más larga que la del T. brucei (de 15 a 20 aminoácidos). Además demostraron que existe una región rica en glutamina (Q) cerca de la región C- terminal del MTP que no está presente en las MTP de Leshmania major y en células humanas; es decir, es una región única en T. congolense, por lo que se pensó que podría ser un epítope parásito-específico.

Anteriormente, los mismos autores demostraron que utilizando el AcMo específico para las Hsp70, 10F9, éste reconoció un antígeno de 76 kDa presente en el mitocondrión (mitocondria) de T. brucei, T. congolense y T. evansi. Por esta razón, decidieron utilizar el gen clonado de la proteína Hsp70 mitocondrial (MTP) de T. congolense y demostraron que efectivamente, existe un epítope antigénico específico que está localizado en la región de 206 aminoácidos del C- terminal y que

20 es reconocida por sueros de ratón (infectados experimentalmente con T. congolense) con infección primaria. Esto indica que podría inducir la producción de anticuerpos en el hospedador infectado, lo que le da la cualidad para ser un candidato como un antígeno de diagnóstico para infecciones primarias con T. congolense y dicha antigenicidad podría estar dado por la región rica en glutamina.

I.2.4 Proteína BiP, estructura y función: La proteína de unión a la inmunoglobulina (BiP), fue identificada originalmente como una proteína acoplada a los cuatro dominios de la cadena pesada de la inmunoglobulina (Ig) (Haas & Wabl, 1983; Knarr et al, 1995) y como una proteína regulada por glucosa, Grp78 (Pouyssegur et al, 1977; Gething, 1999; Lodish et al, 2002). Posteriores estudios demostraron que también se une a ambos dominios de la cadena ligera de la Ig. (Knarr et al, 1995) y que la liberación de ambas cadenas nacientes es dependiente de ATP (Kohler et al., 1996). La BiP es una chaperona molecular con amplia especificidad que pertenece a la familia de las Hsp70 (Munro & Pelma, 1986; Hendershot et al, 1995) y está localizada en el lumen del RE (fig. 7) (Gething, 1999; Mayer et al, 2000). La BiP se une transitoriamente a las proteínas recién sintetizadas del RE y las mantiene luego en un estado competente para su posterior plegamiento y oligomerización. También se une de forma más permanente a las proteínas que estén mal plegadas, hipoglicosiladas o que no se han ensamblado (Gething, 1999; Ferwell et al, 2001), por lo tanto, la conversión de oligómeros a monómeros activos conlleva a la estimulación de su actividad ATPasa (Blond-Elguindi et al., 1993). Por otra parte, estudios realizados con la forma sanguínea (BSF) del tripanosoma Africano, T. congolense; encontraron que en la matriz del mitocondrión se encuentra BiP y se requiere para la translocación y el replegamiento de proteínas (Bannai et al., 2003).

BiP podría retener tanto la proteína mal plegada como la retrotranslocación de polipéptidos durante su viaje desde el RE hasta el citoplasma vía el canal de

21 translocación denominado Sec 61p (Römish 1999; Taylor & Mertens, 1999; Ellgard & Helenius, 2001) ó podría ser la compuerta de entrada de este canal (Haigh & Jonson, 2002). BiP es una proteína que se encuentra en grandes cantidades bajo todas las condiciones de crecimiento, pero su síntesis está inducida acentuadamente bajo condiciones que conllevan a la acumulación de polipéptidos mal plegados en el RE (Gething, 1999), lo cual proporciona un marcador para los estados de enfermedad que resultan de las proteínas mal plegadas.

Figura 7.- BiP en el retículo endoplasmático.- Se une a las proteínas recién sintetizadas y previene su mal plegamiento y el no ensamblaje de multimeros así como anticuerpos desde que están en el RE prematuramente. (http://lifesci.rutgers.edu/~denhardt/couse/IntracellularTrafficI_2006rev.pdf)

La estructura de los dominios ATPasa de todas estas proteínas Hsp70 son muy similares a la proteína actina plegada por presentar una zona central implicada en la interacción con ATP (Beissenger & Buchner, 1998) y el dominio N- terminal de BiP es muy similar al de la Hsc70 citosólica, por lo tanto puede ser mapeado dentro de la estructura de la cadena polipeptídica de esta chaperona, sugiriendo que ambas proteínas tienen conformaciones semejantes, (Blond-Elguindi et al., 1993; Zhu et al., 1996). Las BiP están constituidas por dos lóbulos con 4 subdominios globulares cada uno y ambos lóbulos están separados por lazos que conectan a las hojas β y que forman una hendidura central donde se une el péptido en formación o mal plegado

22 (fig 8). Cabe mencionar que el ATP, Mg+2 y los dos iones de K+ están unidos por interacciones con ambos subdominios globulares. Estos lazos de conexión están estabilizados por una α-hélice y funcionan como una “tapa” que abre y cierra el sitio de unión al sustrato en una forma dependiente al ATP (Bakau & Horwich, 1998). Cuando el ATP se une al dominio N- terminal, induce la apertura de la α-hélice (“tapa”), mientras que cuando ocurre la hidrólisis del ATP, ocurre un cambio conformacional y como consecuencia el cierre de la α-hélice, encapsulando al péptido recién sintetizado en el canal (Fig.8 y 9), (Mayer & Bucal, 1998; Kabani et al., 2003).

Como es bien sabido, los dominios N- terminal y C- terminal de BiP se comunican para regular la afinidad y la duración de la unión al polipéptido en formación o mal plegado. Si el dominio de unión al sustrato (C- terminal) está ocupado por el ATP, su afinidad es baja pero de rápida unión al polipéptido en formación o mal plegado y por el contrario, si el dominio C- terminal está ocupado por ADP la afinidad es alta pero de bajo intercambio. Por otro lado, el acoplamiento del polipéptido en formación o mal plegado al dominio C- terminal incrementa la velocidad de hidrólisis del ATP en el dominio ATPasa del N- terminal. Así un polipéptido mal plegado acompañado por BiP puede experimentar ciclos de acoplamiento y liberación, que dependen de la velocidad de un recambio en el nucleótido de adenina (ATP/ADP) y la hidrólisis de ATP de la proteína BiP (Flynn et al., 1989; Blond-Elguindi et al., 1993; Chevalier et al., 1998; Kiang & Tsokos, 1998; Mayer et al., 2000).

Entre las funciones de BiP se encuentra el importante rol en el transporte retrógrado a través de la membrana del RE de proteínas aberrantes, destinadas para la degradación por el proteosoma (Hendershot et al., 1995; Hamman et al., 1998;

23

Figura 8: Estructura de las proteínas de la familia HSP70: El dominio ATPasa (a) y el dominio de unión al sustrato (b). Tomado de: CMLS, Cell. Mol. Life Sci. Vol. 62, 2005

Fig. 9: Esquema de la participación de BiP para sellar el poro acuoso del translocón durante la integración de la proteína y así evitar el paso de iones.- En el lado citoplásmico de la membrana del RE, el ribosoma une al translocón para sellarlo mientras que se desplaza un polipéptido naciente al lumen del RE. Pero el ribosoma debe romper este sello para permitir que un dominio citoplásmico se extienda en el citoplasma, por lo que BiP se requiere para sellar el poro. Esta actividad de BiP necesita de la hidrólisis del ATP (Haigh & Jonson, 2002).

24 Römish, 1999; Haigh & Jonson, 2002; Apear & Davis, 2001). En la translocación, BiP también interviene para mantener la barrera de permeabilidad de la membrana del RE, sellando el extremo del lumen del poro del translocón, antes é inmediatamente después de la translocación y así evitar el flujo de iones (Haigh & Jonson, 2002) (Fig. 9).

Experimentos realizados en levaduras proporcionan evidencia adicional para los múltiples roles de BiP en el RE, como es el caso de la proteína Kar2, una BiP, en Saccharomyces cerevisiae, la cual es esencial para: (a) el plegamiento de la proteína recién sintetizada o mal plegada en el lumen del RE, (b) para la translocación a través de la membrana del RE de precursores secretorios recién sintetizados y (c) para el transporte retrógrado de la membrana de los polipéptidos aberrantes destinados para la degradación por el proteosoma (Horwich et al., 1999; Yu et al., 2000; Höhfeld et al., 2001). I.2.5 Mecanismos de la BiP BiP se une a las secuencias extendidas de 7 residuos, de los péptidos, que incluye los residuos hidrofóbicos que normalmente en la proteína nativa no se encuentran expuestos. Interactúa más permanentemente con proteínas mal plegadas o que no están ensambladas y a quienes tienen bloqueado su transporte desde el RE al citoplasma; pero no se unen a proteínas nativas. Es decir que la BiP juega un papel en el plegamiento y ensamblaje de proteínas recién sintetizadas en el lumen del RE (Knarr, et al., 1995). In vitro, BiP puede interactuar con pequeños polipéptidos sintéticos cuyos acoplamientos estimulan su actividad ATPasa (Flynn et al., 1989; Knarr et al., 1995) y altera su estado oligomérico (Blond-Elguindi et al., 1993, Gething, 1999).

Knarr y colaboradores, en 1995, estudiaron las secuencias de unión de BiP a anticuerpos, para determinar si en verdad el sitio de unión de BiP a las

25 inmunoglobulinas estaba confinado al dominio CH1 de la cadena pesada del anticuerpo, como previamente fue sugerido por otros autores. Para ello, utilizaron un sistema computarizado para predecir los sitios de unión de BiP en secuencias de la proteína primaria de las inmunoglobulinas, para lo cual utilizaron los anticuerpos monoclonales MAK3 y 3D6 que fueron utilizados en los estudios de plegamiento por otros autores. Estos autores mapearon la secuencia de unión de BiP dentro de la estructura 3D del fragmento Fd de los anticuerpos y encontraron que la secuencia de unión de BiP está localizada tanto en el dominio VH y CH1 de la cadena pesada del anticuerpo 3D6 y en el dominio CH3 de la cadena pesada del anticuerpo MAK3 (Fig. 10).

Se demostró de esta manera que el sitio potencial de unión en la cadena pesada de la inmunoglobulina está distribuida en dominios VH y CH, y que la mayoría involucra residuos que participan en los sitios de contacto entre la cadena pesada y liviana. Lo que sugiere que las chaperonas BiP participan en el plegamiento y ensamblaje de las moléculas de anticuerpos por su unión a las regiones hidrofóbicas expuestas en las cadenas aisladas de las inmunoglobulinas que subsecuentemente participan en los contactos intercadenas. Es decir, en la cadena naciente de la inmunoglobulina, se estaría uniendo al monómero de la cadena liviana y al mismo tiempo al homodímero de la cadena pesada; para luego disociarse y permitir el ensamblaje del oligómero. Hoy en día se sabe que se une tanto a las cuatro regiones de la cadena pesada como a las dos de las cadenas livianas.

En 1999, Knarr y colaboradores hicieron un “screening” con librerías de gran diversidad de péptidos y demostraron que existe una gran “promiscuidad” en la interacción de BiP con una amplia variedad de polipéptidos nacientes no relacionados en el lumen del RE, y que generalmente muestra una marcada hidrofobicidad, lo que coincide con la probabilidad de que BiP interactúe recíprocamente con las secuencias normalmente localizadas en el interior de la

26 proteína. Los análisis revelaron un motivo heptamérico Hy-(W/X)-Hy-X-Hy-X-Hy, donde Hy es un residuo aromático o hidrofóbico (frecuentemente triptófano, fenilalanina o leucina, pero también metionina o isoleucina), W es triptófano y X cualquier aminoácido.

Fig. 10.- Sitios de unión de BiP a la inmunoglobulina. Está localizada tanto en el dominio VH y CH1 de la cadena pesada del anticuerpo 3D6 y en el dominio CH3 de la cadena pesada del anticuerpo MAK3. Tomado de: http://www.cultek.com/aplicaciones.asp?p=Aplicacion_Anticuerpos&opc=tec nicas

En S. cerevisiae, se han hecho estudios que demuestran que la BiP (Kar2) interactúa con tres proteínas Hsp40 localizadas en el RE como son la Sec63p, la Scj1p y la Jem1p. La proteína Sec63 atraviesa la membrana varias veces y su dominio J está localizado en el lumen del RE (Gething, 1999; Yu et al., 2000). El dominio J de Sec63p interactúa con la forma de BiP unida al ATP y estimula la

27 hidrólisis del trifosfato promoviendo la captura rápida de los péptidos, los que luego son liberados en el intercambio del nucleótido. Esto sugiere que el dominio J podría agrandar el rango de los péptidos que se unen eficientemente a BiP (Gething, 1999).

En el lumen del RE, BiP coopera con otras moléculas chaperonas para acelerar el plegamiento y ensamblaje de nuevos polipéptidos, como es el caso de Grp94 (Familia HSP90) y con proteínas como las lectinas homólogas: calnexina y calreticulina que se unen a ciertos carbohidratos que están unidos a estas proteínas recién sintetizadas (Mc. Cracken & Brodsky, 1996; Yu et al., 2000) y a la proteína disulfuro isomerasa (PDI) (Fig 11).

Durante el plegamiento de la glicoproteína G del virus de la estomatitis vesicular, que a diferencia de las otras proteínas virales, es sintetizada por los ribosomas ubicados en el RE, esta proteína G, se une a las chaperonas calnexina y BiP, las cuales intervienen para asegurar un apropiado plegamiento (Gething, M. J., 1999). También ocurre la interacción entre la calnexina y la BiP con la cadena pesada del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) (Flynn et al., 1989).

Todos estos hallazgos demuestran que para la catálisis del plegamiento existen muchas

chaperonas

moleculares

que

puede

actuar

simultáneamente

o

secuencialmente en las diversas etapas del proceso de maduración conformacional de las proteínas a ser secretadas.

28

Figura 11.- BiP y las lectinas en el ensamblaje de nuevos péptidos. BiP ayuda a las lectinas (calnexina y calreticulina) y a la proteína disulfuro isomerasa (PDI) para acelerar el plegamiento y ensamblaje de los nuevos péptidos.http://www.biologia.unige.it/corsi/morelli-04/4.pdf

I.2.6 Síntesis de la BiP ante la respuesta de proteínas no plegadas Ante la acumulación de polipéptidos mal plegados en el lumen del RE, tanto en levaduras como en células de mamíferos, se produce una sobreregulación transcripcional de muchos genes que codifican a las chaperonas del RE como el homólogo de la BiP en humanos, el gen kar2 (Stedman & Back, 1996; Wickner et al., 1999) (Fig 12).

Durante el proceso de plegamiento y de ensamblaje de las inmunoglobulinas en el RE; las cadenas ligeras y pesadas de la inmunoglobulina se reasocian transitoriamente con BiP en una secuencia de 7 aminoácidos que incluyen residuos hidrofóbicos que normalmente no están expuestos en la superficie de la proteína nativa (Knarr et al., 1995). BiP junto con la Proteína Disulfuro Isomerasa (PDI) in

29 vitro, participan en el plegamiento oxidativo de la inmunoglobulina; BiP se une a la cadena liviana, no plegada y la mantiene en una conformación en el cual los residuos de Cys de la cadena pesada son accesibles para la PDI, la cual cataliza la formación de los enlaces disulfuro (Fig. 10) (Mayer et al., 2000; Chillarón & Haas, 2000).

En la síntesis de la BiP está presente el elemento respuesta a la proteína no plegada llamada UPR (del inglés, “Unfolded Protein Response”) que emite una señal, la cual se dispara cuando la concentración de BiP libre baja, por que BiP es secuestrado por las proteínas no plegadas. Este UPR se ha estudiado mejor en la levadura S. cerevisiae, donde ya han sido identificados los componentes principales de la ruta de traducción de señal en respuesta a las proteínas no plegadas, en donde se demuestra que es una reacción no convencional de “splicing” en respuesta al estrés del RE por las proteínas mal plegadas (Apear & Davis, 2001).

Figura. 12.- La respuesta a la proteína no plegada regula la degradación de proteínas asociadas al RE. La acumulación de proteínas no plegadas en el RE incrementa la capacidad para degradar estas proteínas. Las proteínas mal plegadas son retrotranslocadas a través del poro del translocón (Sec61p), modificado por ubiquitinización, y degradado por el proteosoma 26S. Los genes regulados por UPR involucrados en ERAD incluye a SEC61, CUE1, DER1 (no demostrado), HRD1/DER3, HRD3 (no demostrado), UBC7, y KAR2 (BiP). Spear, E. & Davis T.W. Ng. (2001). Trafic 2:515-523

30 Algunos investigadores, utilizando genes de mamíferos, como Kar2, que carecen de los elementos de choque térmico (HSEs) funcionales, los colocaron bajo condiciones de estrés tales como ausencia de glucosa (inhibición de la glicosilación), presencia de agentes reductores o la inhibición del transporte vesicular y mediaron la inducción de kar2 (BiP) a través del elemento UPR del DNA cis-acting en S. cerevisiae (Stedman & Back, 1996; Apear & Davis, 2001). Estos estudios permitieron concluir que la transcripción del gen kar2 (BiP) está regulado por tres elementos independientes ”cis-acting”: (1) un elemento funcional de choque térmico (HSE) que tiene una secuencia consenso de 5’-CNNGAANNTTCNNG-3´ ó conteniendo arreglos de unidades de 5pb: NGAAN ó NTTCN (Stedman & Buck, 1996; Authié et al., 1993; Bangs et al., 1993); (2) una región rica en pirimidina (G, C) que contribuye al alto nivel de la expresión basal del gen (Bannai et al., 2003) y (3) un elemento de 22pb (UPR) que es requerido para la inducción del mRNA de BiP por las proteínas no plegadas (Gething, 1999). I.2.7 Funciones antigénicas de la proteína BiP Las HSP participan en muchos procesos de la respuesta inmune como es el procesamiento y presentación del antígeno, el ensamblaje del complejo mayor de histocompatibilidad I y II y el ensamblaje de las cadenas de inmunoglobulinas. Taylor et al., (1996) estudiaron la respuesta humoral por los linfocitos B en bovinos infectados con Trypanosoma congolense y se encontró que hay diferencias entre animales tripanotolerantes (raza N´DAMA) de los tripanosusceptibles (raza BORAN). En el caso de los primeros, se producen durante la infección, altos niveles de IgG1 específicos contra las glicoproteínas variables de superficie (VSG) del parásito y contra dos antígenos invariantes del tripanosoma, una cistein proteasa (CP) y una Hsp70/BiP. También produce IgG2, pero no es importante para la respuesta específica de anticuerpos para la VSG, la CPs y para la Hsp70/BiP. Sin embargo, en el caso del ganado tripanosusceptible, se produce IgM específica para las VSG del parásito, para la CP, para la Hsp70/BiP y sorprendentemente para el antígeno noparásito, la ovoalbúmina.

31 Por lo tanto, el rasgo inmunológico más importante entre estos dos tipos de razas bovinas, es la respuesta de anticuerpos sericos en donde los niveles de anticuerpos secretados por las células B (ASC) del ganado tripanotolerante N’ DAMA responden más rápido y produce una respuesta humoral cuantitativamente y cualitativamente diferente que el ganado tripanosusceptible BORAN (Taylor et al., 1996).

Por otro lado, Bossard y col., en el 2003 y 2010, demostraron la antigenicidad de BiP de T. congolense, tanto con la tercera porción del C-terminal (C-25), utilizando un ELISA indirecto, como con la proteína de fusión (MBP- Hsp70/Bip) completa, utilizando un anticuerpo monoclonal anti BiP en un ELISA de inhibición; encontrando, con ambos ensayos, que no es detectable cuando hay una primera infección (infección primaria), aunque si lo es cuando hay una infección por segunda vez (infección secundaria); por lo que en el caso del ganado expuesto a infecciones repetidas (que por lo general es lo que se da en la naturaleza) la porción C-25 podría ser más provechosa que el antígeno total en la detección de infecciones activas y por supuesto, sería más valiosa para la resistencia de las poblaciones tripanotolerantes (Boulangé et al., 2002). La abundancia de las HSP pueden explicar el por qué de este comportamiento, como antígenos dominantes en la respuesta inmune a una variedad de patógenos.

También se ha estudiado la participación de estas proteínas de choque térmico (HSP, como la Hsp70 en humanos), en la generación de respuesta inmune contra diversos tipos de tumores, en donde se ha encontrado que las proteínas Hsp70 (forma inducible) se pueden asociar a péptidos provenientes de la proteólisis intracelular en la célula tumoral, y expresarse en forma directa sobre la membrana donde sirve de blanco de las células asesinas naturales. Los análisis de epítopes de muchas Hsp70 indican la existencia de múltiples epítopes de células B y T en toda

32 su estructura primaria (Rico et al., 1998). Aunque esto no ha sido demostrado con BiP, ésta podría tener la misma participación en la respuesta inmune.

El uso de estas Hsp como proteínas de fusión, unidas a proteínas reporteras como por ejemplo la maltosa (MBP) y la ovoalbúmina, preferentemente, inducen a una respuesta inmune (Rico et al., 1998). En estudios realizados por Rico y colaboradores (1998), utilizando ratones inmunizados con la proteína de fusión MBPHsp70, demostraron que, preferentemente, induce una respuesta inmune Th1; lo que significa que las Hsp70 tienen un efecto de adyuvante en la respuesta inmune contra una proteína reportera unida covalentemente. En otros estudios utilizando la proteína Hsp70 micobacterial recombinante unida covalentemente a la proteína de fusión, ovoalbúmina, estimuló la producción de linfocitos T citotóxicos (CTL), CD8, específicos para la ovalbúmina. Los linfocitos T citotóxicos reconocen un octapéptido inmunodominante de la ovalbúmina, SIINFEKL, ya que este péptido es procesado naturalmente en las células de ratón. Esta proteína de fusión inyectada como una proteína soluble en el ratón, puede generar un procesamiento del MHC clase I a través de la ruta de las células presentadoras de antígeno y estimulando la producción de CD8 (Suzue et al., 1997).

Estos tipos de proteínas de fusión podrían ser buenos candidatos para la elaboración de vacunas como blanco potencial para interrumpir la tripanosomiasis producida por el T. vivax. Hasta ahora se han desarrollado vacunas para bovinos infectados con tripanosomas africanos (como el T. congolense) basadas en la VSG, pero ahora estas investigaciones están enfocadas en las proteínas invariantes del tripanosoma (CP y HsP70/BiP) (Taylor & Mertens, 1999).

Por otro lado en estudios con ratones inmunizados con las HSPs obtenidas de las células tumorales de ratón, se observó la inducción de linfocitos T citotóxicos

33 CD8, que reconocen a péptidos de estas células tumorales en asociación con el MHC clase I (Suzue et al., 1997). La capacidad de las proteínas de choque térmico derivadas del tumor para inducir inmunidad específica y protectiva, podría tener un profundo efecto en el tratamiento y control de pacientes con enfermedades malignas (Pockley, 2001). I.3. JUSTIFICACIÓN E IMPORTANCIA DEL TEMA PLANTEADO La enfermedad causada por Tripanosoma vivax y por otros tripanosomas (T. evansi, T. brucei, etc), se han convertido en una de las principales limitantes para el desarrollo de la ganadería en las zonas tropicales y subtropicales.

Las especies más relevantes son el T. evansi y T. vivax (León, E. & col., 2000); señalados en el país por Rangel (1905) y Tejera (1920) respectivamente (citado por León et al., 2000).

En la actualidad con la comercialización de ganado entre países de América del Sur, podría aumentar la propagación de estas enfermedades, al no existir los controles sanitarios adecuados. Se suma a esto la variabilidad antigénica que presentan en su superficie estos organismos, por lo que, al hospedador le resulta difícil controlar inmunológicamente al parásito.

Los sistemas de diagnóstico disponibles para la tripanosomiasis animal, tienen sus limitaciones, por lo que se requiere estudiar proteínas que presenten secuencias conservadas y que podrían estar presentes durante todo el curso de la parasitemia, como es el caso de las proteínas de choque térmico (HSP) y que además presentan pequeñas secuencias variables que posiblemente sean específicas para cada especie, lo cual podría proporcionar una herramienta importante para el desarrollo de pruebas de diagnóstico que sean sensibles y específicas, ya que la detección certera

34 de la infección y la definición precisa del parásito involucrado, son esenciales para definir el mejor tratamiento quimioterapéutico contra esta enfermedad.

I.4. PROBLEMA Evaluar la antigenicidad de la proteína recombinante, con el fin de desarrollar un método de diagnóstico serológico para la tripanosomiasis animal, especialmente la causada por T. vivax. I.5. HIPÓTESIS Y OBJETIVOS Hipótesis Si la proteína BiP/Hsp70 es capaz de comportarse como un antígeno invariante de T. vivax, la versión recombinante de la proteína completa y/o parcial, podría ser reconocida por los sueros de animales infectados natural ó experimentalmente con T. vivax Objetivo General Identificar, clonar, expresar la proteína de unión a inmunoglobulina (BiP), como posible antígeno invariante del Trypanosoma vivax y evaluar su reconocimiento por sueros de animales infectados. Objetivos Específicos 1. Purificación del T. vivax por cromatografía de intercambio ionico, DEAECelulosa. 2. Amplificar, clonar y secuenciar el gen bip/hsp70 de T. vivax. 3. Expresar el gen completo o parcial bip/hsp70 de T. vivax en un sistema procariote.

35 4. Estandarizar un ensayo de ELISA indirecto a fin de evaluar el reconocimiento de anticuerpos séricos de bovinos infectados a la proteína total ó parcial recombinante. 5. Determinar la especificidad de la proteína recombinante utilizando sueros de bovinos infectados con otros hemoparásitos.

36

II. METODOLOGÍA 1 Materiales 1.1 Animales de experimentación: a) Bovinos: Raza Holstein, machos de 4 a 8 meses de edad. b) Ovinos: Mestizos de las razas: West African, Persa cabeza negra y Barbados Barriga Negra c) Ratas: Raza Sprague Dawley 1.2 Aislados de Tripanosomas: a) T. evansi: Mantecal.- Aislado venezolano obtenido en campo, de un caballo de la localidad de Mantecal, estado Apure; propagado en ratas y criopreservado con 10% DMSO. Donado por el Dr. Pedro María Aso del grupo de hemoparásito de la Universidad Simón Bolívar (USB). b) T. vivax: Falcón.- Aislado venezolano obtenido en campo, de un bovino de la localidad de Tucacas, estado Falcón; propagado en ovinos y bovinos, y criopreservado con 10% DMSO. Gentilmente donado por el Prof. Rafael Rodríguez, de la cátedra de Parasitología de la Universidad Nacional Experimental Francisco de Miranda (UNEFM). c) T. vivax: LIEM 176.- Aislado venezolano obtenido en campo en el estado Trujillo; propagado en ovinos y bovinos, y criopreservado con 20% Glicerol. Gentilmente donado por el Dr. Armando Reyna de la Universidad Nacional Experimental Rómulo Gallegos (UNERG).

37 1.3 Cepas bacterianas y Vectores de clonación y expresión Las cepas bacterianas y vectores de clonación y expresión que se utilizaron para el desarrollo de esta tesis, se muestran en las tablas II y III respectivamente. Los eucariotas contienen secuencias de codones que a menudo son poco frecuentes en E. coli, como por ejemplo los codones de Arginina, AGA y AGG, lo cual conduce a una baja producción de la proteína. Esto puede aliviarse por la introducción de genes para la sobreexpresión de los tRNA correspondientes en el E. coli. Una de las cepas de E. coli de sobreexpresión de estos tRNA raras, es la llamada Rosetta, disponible en Novagen ó BL21 Codon Plus de Invitrogen. Esta cepa contiene al plásmido pRARE que le confiere la resistencia al cloranfenicol y lo suministra de estos codones tRNA de la AUA, AGG, AGA, CUA, CCC y GGA; de modo tal, que facilita la expresión de proteínas heterólogas como la BiP/Hsp70 de T. vivax (anexo I).

En este trabajo se utilizó la cepa de E. coli DH5α para la expansión del plásmido recombinante y las cepas BL21 Star™ (DE3) y Rosetta™ (DE3) para la expresión. 1.4 Medios de cultivo Medio S.O.C: 2% triptona, 0,5% extracto de levadura, 10mM NaCl, 2,5 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM MgSO4, 20 mM glucosa; pH 7,0. Medio LB caldo: 1% triptona, 0,5% extracto de levadura y 1% NaCl, pH 7,0. Medio LB Agar: Medio LB conteniendo 1,6% de agar nutritivo. Medio Terrific caldo: 1,2% triptona, 2,4% extracto de levadura y 0,5% glicerol. Suplementado con el tampón fosfato (2,3% KH2PO4 y 12,54% K2HPO4), pH 7,0.

38 1.5 Antibióticos - Ampicilina (Ap): Concentración final en el cultivo de 100 µg/ml. - Cloranfenicol (Cm): Concentración final en el cultivo de 34 µg/ml. - Ac Nalidíxico (Nal): Concentración final en el cultivo de 50 µg/ml. Todos esterilizados por filtración. 1.6 Mezcla de Inhibidores Proteolíticos Solubles en agua con amplia especificidad de la inhibición de la serina, cisteína y metaloproteasas (Sigma P2714): AEBSF (4-(2-aminoetil) fluoruro bencenosulfonilo), E-64, Hidrocloruro de Bestatin, Leupeptina, Aprotinina y EDTA.

39 Tabla II. Cepas bacterianas Designación

Genotipo/Descripción

Referencia

E. coli, DH5α

F- Φ80lacZ∆M15 ∆(lacZYA-argF) U169 recA1 endA1 hsdR17 (rk-, mk+) phoA supE44 thi-1 gyrA96 relA1 tonA

Invitrogen

E. coli, BL21 Star™

F- ompT hsdSB (rB-mB-) gal dcm rne131

(DE3)

(DE3)

E. coli, Rosetta™ (DE3)

Deriva de la BL21. Presenta el gen de la resistencia al cloranfenicol y contiene al plásmido pRARE que expresa seis tARNs para los codones AUA, AGG, AGA, CUA, CCC, GGA; especialmente para aumentar la expresión de proteínas eucariotas que poseen codones de baja frecuencia en E. coli (Donado por el Dr. J. L. Concepción, ULA).

Invitrogen

Novagen®

Tabla III. Vectores de clonación y expresión. Mapas de vectores (anexos II y III, respectivamente) Designación pET100-D-TOPO

pET160/GW/DTOPO

Descripción

Tamaño

Referencia

Presenta el promotor del fago T7 para regular la expresión de los genes regulados.

5764 pb

Invitrogen

Permite que las proteínas recombinantes presenten en el extremo N-terminal 6 His y Lumio™ facilitando su purificación e identificación.

5839 pb

Invitrogen

40 2. Métodos 2.1 Criopreservación. Los agentes crioprotectores que se emplearon fueron DMSO ó Glicerol a una concentración final del 10% y 20%, respectivamente, mezclado en PBS-G, pH 7,2 (95mM Na2HPO4, 5mM, NaH2PO4 anhidro, 73mM NaCl y 1% de glucosa). Primero se colaron 250µl de la sangre infectada con tripanosomas (obtenida en los picos de parasitemia), en crioviales Nalgene® y luego se mezcló con 250µl de la solución PBS-G con un crioprotector. Inmediatamente se almacenaron en un tanque con nitrógeno. 2.2 Purificación de T. evansi La purificación se realizó a través de una columna cromatográfica de intercambio aniónico, DEAE-Celulosa, siguiendo el protocolo de Lanham & Godfrey (1970). 2.3 Purificación de Trypanosoma vivax

Bovinos y ovinos se infectaron experimentalmente con 106 y 107 parásitos totales; con los aislados venezolanos: Liem176/Trujillo y Falcón, mantenidos en forma criopreservada. Diariamente, se midió la temperatura, e interdiariamente la parasitemia y el hematocrito a partir de sangre de la vena yugular. El hematocrito se determinó

mediante

la

técnica

del

micro-hematocrito,

utilizando

capilares

heparinizados, centrifugados a 12.000 x g por 5 minutos y los valores expresados como el % de eritrocitos empaquetados con relación al volumen total de sangre. La parasitemia se determinó utilizando la técnica de Brener modificado (Perrone, 2006). Para ello 5 µl de sangre se pone sobre un porta objeto y se coloca un cubre objeto de 22 mm x 22 mm, de manera tal que la muestra quede totalmente extendía por toda el área del cubreobjeto y sin formación de burbujas. Se observa al microscopio, con el objetivo de 40X y se cuenta entre 20 y 100 campos y se aplica la siguiente fórmula:

41

Organismos = Oc x Fm x Fd Volumen (ml) Donde: Oc = N° de parásitos contados Fm = Factor óptico del microscopio1 Fd = Factor de dilución

Una vez obtenida la sangre infectada, una parte de esta muestra se criopreservó v/v con DMSO al 10% en PSG, pH 7,2 (95 mM Na2HPO4, 5 mM NaH2PO4, 73 mM NaCl, 1% Glucosa); con la otra parte se realizó la purificación de T. vivax; siguiendo el protocolo de Lanham y Godfrey (1970); mediante cromatografía de intercambio aniónico (Dietilaminoetil (DEAE)-Celulosa) modificado.

Teniendo en cuenta el orden de la carga negativa en la superficie de los tripanosomatídeos (Souto-Padrón, 2002), se adaptó especialmente para la purificación de T. vivax, utilizando una solución de Krebs modificada, pH 7.2 a la que se le agregó 1% más de Glucosa en el momento de la purificación para mantener viables a los tripanosomas. La solución de Krebs está compuesta de: Hepes (Sigma H4034) NaCl

131 mM

KCl

5,6 mM

NaHCO3

25 mM

NaH2PO4

1 mM

MgCl2

1mM

D(+) Glucosa

20 mM

10mM

Para cada 5 ml de sangre infectada, se requieren 20-30 ml de DEAE-Celulosa empacada y previamente equilibrada. 1

El Fm, es un valor constante que depende de las propiedades de fabricación de la óptica del microscopio utilizado, por lo que es diferente para cada equipo.

42 Cuando el hematocrito estaba entre 12% y 18%, la temperatura ≥40°C y la parasitemia llegaba a valores de 107a 108 T. vivax/ml, se extrajo 20 ml de sangre de la vena yugular en presencia de heparina sódica (10 U.I/ml) como anticoagulante. Posteriormente, la sangre se centrifugó a 2.465 x g por 15 min a 25ºC y sobre el plasma se le añadió ~0,5% de glucosa y se mantuvo durante 30 min a temperatura ambiente. Se retiró el plasma que al microscopio presentaba un número considerable de tripanosomas; los parásitos se cuantificaron por el método de Brener modificado (Perrone, 2006). Los tripanosomas presentes en el plasma se lavaron dos veces con la solución de Krebs modificado pH 7,2 mediante centrifugación a 2.465 x g por 15 min y a 25°C y los parásitos se almacenaron a -80°C hasta su uso.

Por otro lado, el paquete de eritrocitos con la capa blanca se resuspendió con la solución de Krebs a un volumen final de ~5 ml y se cuantificó los parásitos por la técnica de Brener. Este material se colocó sobre la columna de 20 a 30ml de DEAECelulosa equilibrada y empacada con la misma solución de Krebs modificado pH 7,2. Los parásitos fueron eluidos con la solución de Krebs glucosado y las fracciones eluidas se centrifugaron a a 2.465 x g por 15 min. a 25ºC. Se colectaron todos los sedimentos añadiéndoles solución de Krebs 7,2 modificada hasta llegar a un volumen de 3 ml; se determinó la parasitemia y se prepararon alícuotas de 500µl. Se realizó una centrifugación a 12.000 x g/5 min./4ºC, se descartó el sobrenadante y se almacenaron los tripanosomas a -20ºC hasta su posterior uso. 2.4 Aislamiento de ADN 2.4.1 Aislamiento del ADN genómico de T. vivax y T. evansi

El ADN genómico de T. vivax se aisló a partir de sangre de bovinos y/u ovinos infectados experimentalmente con el aislado LIEM 176 de T. vivax. El ADN genómico de T. evansi se aisló a partir de sangre de ratas infectadas experimentalmente ó de parásitos purificados por cromatografía de intercambio iónico según el procedimiento descrito por Lanham & Godfrey (1970).

43 Para la extracción del ADN genómico se realizó con el estuche comercial DNA Purification Wizard®Genomic de la casa comercial Promega® siguiendo las especificaciones del fabricante. Esta técnica consiste en la ruptura de la membrana citoplasmática y nuclear con detergentes aniónicos y no iónicos, seguido de la remoción del ARN con una solución de ARNasa y con la separación de las proteínas por una precipitación salina (“salting out”); la precipitación del ADN genómico con isopropanol y su disolución del ADN con 30-50µl de agua destilada MilliQ estéril, el cual se conservó a -20°C y/o 4°C. 2.4.2 Aislamiento de ADN plasmídico de E. coli.

La extracción del ADN plasmídico mediante lisis celular alcalina (“Miniprep”) se realizó con el estuche comercial Marligen® de Biosciences. Cada colonia fue crecida en 5ml del medio LB líquido con ampicilina y se distribuyeron en partes iguales en tubos eppendorf® de 1,5 ml estériles. El protocolo seguido fue el recomendado por el fabricante que proporcionó un buen rendimiento y dejó el ADN limpio y libre de ARN.

Alternativamente se extrajo el ADN plasmídico utilizando el protocolo modificado por Zhou (1990), que usa el Tampón TENS (10mM Tris-HCl pH8,0, 1mM EDTA pH8,0, 0,1 N NaOH y 0,5% SDS): Se tomó 1,5 ml del cultivo incubando toda la noche a 37°C. y se centrifugó a 8.000 rpm por un minuto para obtener el sedimento celular; eliminando el sobrenadante y dejando entre 50 y 100 µl del medio para resuspender las células con el uso de una micropipeta. Se añadió 300 µl del Tampón TENS y se mezcló por inversión é incubó a temperatura ambiente hasta observar una mezcla viscosa. Se añadieron 150 µl de 3M Acetato de Sodio pH 5,2 frío y mezcló brevemente por inversión (sin movimientos bruscos) durante 2 minutos. Se centrifugó a 14.000 rpm por 3 minutos para retirar los restos celulares y ADN cromosomal trasvasando el sobrenadante (~450µl) a un tubo eppendorf. Se añadieron 900 µl de etanol al 100% frío y mezcló por inversión seguido de una centrifugación a 14.000 rpm por 5 minutos y se descartó el sobrenadante. El

44 sedimento se resuspendió en 450 µl de etanol al 70% frío v/v y se centrifugó a 14000 rpm por 5 minutos. Se descartó el sobrenadante tratando de eliminar todo el resto de etanol y se secó bien. El sedimento se resuspendió en 30–40 µl de Tampón TE (10mM Tris-HCl pH 8.0, 1mM EDTA pH 8.0) ó agua MilliQ estéril, previamente calentada a 65°C. Se resuspendió suavemente con la pipeta y se dejó a temperatura ambiente por 10 minutos. Se añadió 1,5–2 µl de ARNasa, se mezcló e incubó por 30 minutos a 37°C. Se mezcló nuevamente y se guardó a 4°c y/o a -20°C.

Para volumenes más grandes (“Midi-prep”), se utilizó el estuche comercial Wizard® Plus SV Midiprep (Promega) siguiendo las recomendaciones del fabricante y también se pudo obtener un producto libre de ARN. 2.4.3 Cuantificación del ADN La cantidad y la calidad de la solución de ADN plasmídico y genómico, se determinó por: (a) electroforesis en gel de agarosa al 0,8% en tampon Tris-acetato, EDTA (TAE) 0.5X, pH 8 (0,04M Tris-acetato; 0,01M EDTA) teñido con SYBR Safe™ de la casa comercial INVITROGEN. La cantidad de ADN presente en la banda en estudio

se

estimó

por

comparación

de

su

intensidad

con

las

bandas

correspondientes a los marcadores de masa de ADN (INVITROGEN, Cat. # 10496016), (b) espectrofotométicamente por densidad óptica; teniendo en cuenta que un valor de absorbancia a 260 nm (A260) igual a uno (1) equivale aproximadamente a 50 µg/ml de ADN de doble cadena y a 40 µg/ml de cadena sencilla. La relación A260/A280 mayor a 1,75 – 1,8 indica que la solución de ADN está relativamente pura y valores inferiores a estos, indican contaminación por proteínas y si los valores son superiores, es que hay una contaminación por ARN (Sambrook et al., 1989) y (c) utilizando el fluorómetro Qubit™ de la casa comercial Invitrogen™, siguiendo las recomendaciones del fabricante.

45 2.5

Amplificación del gen bip/hsp70 de T. vivax y T. evansi a partir del ADN genómico, por la técnica del PCR. 2.5.1 Diseño de los oligonucleótidos degenerados:

En un inicio, cuando la secuencia putativa del gen bip/hsp70 de T. vivax, aún no había sido reportada, se buscó en el GenBank mediate el programa de alineamiento de secuencias BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) usando el servidor del NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi), las secuencias con mayor homología del gen bib/hsp70 en los tripanosomatídeos que afectan al ganado bovino, los cuales son: antígeno p69 (T. congolense) y bip/grp78 (proteína regulada por glucosa, T. brucei) (Fig. 13, tabla IV). Para el diseño de los oligonucleótidos inespecíficos (“degenerados”), tomando en cuenta tanto fuera como desde el marco abierto de lectura (ORF) y el sitio de culminación de la transcripción, se utilizaron: a) la secuencia de 1962pb del gen antígeno p69 de T. congolense (# de acceso en el genBank: Z22557), b) la secuencia de bip/grp78 de T. brucei (# de acceso en el genBank: L14477.1) y c) la secuencia del cromosoma 11 de T. brucei (# de acceso en el genBank: XM-823740); todas ellas fueron pasadas a formato FASTA y alineadas mediante el programa Clustal W usando el servidor del European Bioinformatics Institute (http://www.ebi.ac.uk).

Posteriormente, se utilizó la base de datos del uso de codones con mayor frecuencia del T. vivax (Tabla V), lo cual es una estrategia común para incrementar las posibilidades de hibridación con el gen blanco. Las frecuencias de uso de cada uno de los codones varían entre genomas y entre genes de un mismo genoma. El uso de codones está expresado en la fracción por 1000 codones, los cuales son calculados por la división del número absoluto del codón indicado por el número total de codones usados en toda la secuencia codificante (CDs) o el marco de lectura (ORF) de una proteína en el organismo de interés. Para este caso se utilizó la base de datos Kazusa.or.jp (http://www.kazusa.or.jp/codon) para así diseñar los

46 oligonucleótidos degenerados, los cuales fueron utilizados tanto para amplificar el gen bip/hsp70 de T. vivax como para gen bip/hsp70 de T. evansi.

Posteriormente, en febrero del 2008, fue publicada la secuencia putativa del gen de la proteína Bip/Hsp70 de T. vivax en GeneDB (http://www.genedb.org), con lo cual se diseñaron otros oligonucleótidos específicos para completar la secuencia y finalmente clonar (Tabla VI, Fig. 14). También en la figura 14 se puede observar la ubicación de cada uno de estos oligonucleótidos dentro de la secuencia codificante del gen p69 del T. congolense.

La secuencia del único oligonucleótido degenerado que se ubica fuera de la región ORF fué: Flcri1, cuya secuencia es: TAA RYW CAA GAT AAT YCM CCW CCC (Tm = 50.3 - 54.4 - 58.7); donde: W = A/T (Fig. 14).

Figura 13: Distribución de las secuencias con mayor homología con la secuencia del gen antígeno p69 de T. congolense por Blast.

47 Tabla N° IV: Secuencias con mayor homología con el gen p69 de T. congolense (bip/hsp70)

Tabla V: Frecuencia del uso de codones por T. vivax. (Consultado en la base de datos http://www.kazusa.or.jp/codon/)

48

Tabla VI. Secuencia de los Oligonucleótidos degenerados que amplifican dentro y fuera de la región ORF del gen p69 de T. congolense. Nombre FTv_bip/hsp70 RTv_bip/hsp70

Secuencia ATG TCK RGG AYG TNG CTG TTA MAG RTS RTC CAT GGG NTG

Flcri1

TAARYWCAAGATAATYCMCCWCCC

Flcri2

AGA ARG TKA ARA ACG CKG T

Flcri3

ACATGGACCTCTTCAAGGG

Flcri4

ACG AGA ACA GYA TCC TGC AG

Rlcri 1

ACM GCG TTY TTM ACY TTC T

Rlcri2

CCCTTGAAGAGGTCCATGT

Rlcri3

CTG CAG GAT RCT GTT CTC GT

Rlcri4

CANTTAMAGRTCRTCCAT

Ubicación en la secuencia completa

T°m (°C)

# nuclótidos

53,9

18

1-18

21

20242044

24

58-81

19

579-597

54,8 53,354,458,7 47,4 y 56,7 52,4 47,4, 52 y 56,7 47,4, 52 y 56,7 52,4 54,1 y 57,5 41,246,351,4

* Donde: K=G/T, R=A/G, Y=T/C, M=A/C, S=G/C, N=G/A/T/C

19 20 19 19 20 18

10801098 16021621 579-597 10801098 16021621 20302046

49

Figura 14: Ubicación de los oligonucleótidos degenerados en la secuencia del gen p69 (bip/hsp70) del T. congolense. Nótese las ubicaciones de cada uno de los oligonucleótidos degenerados que amplifican fragmentos de la secuencia del gen, incluso el oligonucleótido Flcri1 que se ubica fuera del ORF. Los nucleótidos en rojo indican dónde se localizan las combinaciones de nucleótidos (degenerado) y los nucleótidos en azul, demarcan la región del ORF.

50 Los oligonucleótidos degenerados se evaluaron manualmente porque no pudieron ser evaluados utilizando los programas como el IDT Sci Tools (http://www.idtdna.com/SciTools/SciTools.aspx)

y

el

Primer

3

(http://frodo.wi.mit.edu/primer3/) por su condición de degenerados.

La temperatura de fusión (Tm) se calculó con la siguiente fórmula: Tm = 4(G+C) + 2(A+T), donde A, T, C y G indican, respectivamente, el número de adeninas (A), timinas (T), citosinas (C) y guaninas (G) en la región de solapamiento. Obteniéndose así que el extremo 3’ del oligonucleótido, la Tm, fuera suficientemente alta como para permitir una buena hibridación con el ADN molde. 2.5.2 Diseño de los Oligonucleótidos específicos para el gen bip/hsp70 de T. vivax:

Se diseñaron a partir de las secuencia obtenida de la secuenciación del amplicón con los oligonucleótidos degenerados lcri2 y posteriormente de la secuencia putativa del gen de la proteína 78 regulada por glucosa (BiP/GRP78) de T. vivax (# de acceso en el GeneDB: Tviv1246g12.p1k_1) (Fig. 15). Dichos oligonucleótidos fueron evaluados utilizando los programas IDT Sci Tools (http://www.idtdna.com/SciTools/SciTools.aspx)

y

Primer

3

(http://frodo.wi.mit.edu/primer3/), para comprobar que las secuencias oligoméricas no formen estructuras secundarias ni que sean complementarias a los otros oligonucleótidos en la misma reacción.

En la tabla VII se presentan las secuencias de estos oligonucleótidos específicos, en la que se muestra la secuencia CACC que les fueron añadidas a las regiones que se utilizaron para la clonación en los vectores pET por la propia condición del mismo, así como los codones de terminación, CTA o TTA a las secuencias antisentido.

51 Con todos estos oligonucleótidos se realizaron combinaciones, que se muestran más adelante, para llegar a obtener la secuencia completa del gen BiP/Hsp70 de T. vivax.

Figura 15: Ubicación de los oligonucleótidos específicos en la secuencia putativa del gen bip/hsp70 de T. vivax

52

Tabla VII. Secuencia de los oligonucleótidos específicos para el gen bip/hsp70 de T. vivax. Nombre Flcri2put

Flcri3put

FTput1 FTvput2 FTvlcri3

RTvlcri3

Rlcri1put

Rlcri1 RTvput2 RTvput1

Rlcri2

Secuencia CAC CAT GGC GAA GGC GAT GCG G CAC CAT GGA CGT GAG CAA GGA CCA GAA G CAC CAT GTT GGC GGC GAG GAC TGC TTG TGG GTG GCT CTG AAG AAG AGC GAC ATC CAC CTA GTG GAT GTC GCT CTT CTT CAG TTA CAG GTC GTC CAT CGG C CTC GTA CGA CAG CAG CTT CTT TTA CAG GTC GTC CAT C CTA TCG CTG ATC AGC TGC TGC CCC TTG AAC AGG TCC ATG T

T°m (°C)

# nuclótidos

71,6

22

66,6

25

60,9

18

47,0

15

53,6

21

56,1

24

55,4

19

53,7

21

38,9

16

57,4

21

52,4

19

53 Los oligonucleótidos que franquean secuencias internas del gen también se diseñaron en función de que puedan ser evaluados con los programas mencionados anteriormente y que estén ubicados en secuencias antigénicas de modo que puedan servir en el desarrollo de un eventual sistema de diagnóstico. Estas secuencias antigénicas dentro del gen bip/hsp70 de T. vivax se analizaron utilizando las siguientes direcciones: http://immunax.dfci.harvard.edu/Tools/antigenic.pl http://www.cbs.dtu.dk/services/BepiPred

2.5.3 Estandarización de la amplificación del gen que codifica para la proteína BiP/Hsp70 por PCR.

Las reacciones de PCR fueron ejecutadas en un termociclador en gradiente para estandarizar la temperatura de hibridación. La mezcla de reacción para amplificar el gen completo bip/hsp70 de T. vivax, se realizó generalmente para un volumen final de 10µl (tabla VIII). Los programas de amplificación variaban según el fragmento del gen a amplificar (tablas IX, X, XI). Como se mencionó anteriormente, tanto para la secuencia completa como para los fragmentos que se utilizaron para la clonación y expresión, se le añadieron a los oligonucleótidos respectivos, 4 nucleótidos (CACC) para la clonación en los vectores pET y además se le añadieron 3 ó 6 nucleótidos (nt), correspondientes a los nt de iniciación y/o terminación (según sea el caso) a estos oligonucleótidos que amplifican los fragmentos. Para la amplificación de los fragmentos, se utilizaron enzimas de alta fidelidad como la polimerasa Pfu y ThermalAce, que generan un producto con extremos romos necesarios para la clonación en los vectores pET.

54

Tabla VIII: Mezcla de reacción de la amplificación para el gen completo bip/hsp70 de T. vivax. Enzima Polimerasa Reactivos

GoTaq™ (Promega)

ThermalAce™ (Invitrogen)

1 mM

-.-

1X

1X

0,8 mM

0,8 mM

Oligonucleótido Sentido

2 µM

0,28 µM

Oligonucleótido Antisentido

2 µM

0,34 µM

0,25 U/µl

0,187 U/µl

~100 ng/µl

~100 ng/µl

10 µl

10 µl

MgCl2 Tampón dNTP (mezcla)

Enzima ADN Agua

c.s.p.

Nota: Con los oligonucleótidos degenerados, se añadió a la mezcla de reacción 10% DMSO.

55

Tabla IX. Programa de amplificación para el gen completo con la enzima GoTaq®

Etapa

Temperatura (°C)

Tiempo

1

Desnaturalización

94

5´

2

Desnaturalización

94

3´

3

Hibridación

64,6

1´

4

Elongación

72

2´30´´

5

Repetir desde la etapa 2 a la 4, 30 veces

6

Elongación

72

8´

7

Finalización

4

α

Tabla X. Programa de amplificación para el gen completo con la enzima ThermalAce® Etapa

Temperatura (°C)

Tiempo

1

Desnaturalización

98

3´

2

Desnaturalización

98

30´´

3

Hibridación

66

30´´

4

Elongación

72

2´

5

Repetir desde la etapa 2 hasta la 4, 30 veces

6

Elongación

72

10´

7

Finalización

4

α

56 Tabla N° XI: Temperatura de hibridación para el gen parcial de bip/hsp70 de T. vivax JUEGOS DE

TAMAÑO

TEMPERATURA DE

OLIGONUCLEÓTIDOS

(pb)

HIBRIDACIÓN

Flcri2put/Rlcri1put

1959

58.3 – 64.4

Flcri2put/Rlcri2

1019

52.5 – 54.3

Flcri3put/Rlcri1put

1129

52.5 – 60.3

FTvput2/Rlcri1put

872

58.7

FTput1/RTvput1

383

62.6

FTput1/RTvlcri3

324

62.6

Flcri3put/RTvlcri3

243

58.7

Se realizaron combinaciones entre los diferentes juegos de oligonucleótidos (ver tabla N° XI) hasta lograr una buena amplificación entre los diferentes pares de oligonucleótidos.

Para la clonación del gen completo o para sus fragmentos con la enzima DNA polimerasa ThermalAce™, la cual es extremadamente termoestable, se realizaron las PCR diseñadas para un alto rendimiento de amplificación en PCR con secuencias de ADN ricos en GC- (>65% de contenido GC) como se presenta en este gen. Adicionalmente esta polimerasa amplifica exitosamente fragmentos largos de

57 hasta 25 kb. Además esta enzima genera productos con extremos romos muy apropiados para la ligación en los vectores pET.

Alternativamente se utilizó la enzima ADN polimerasa Pfu que también genera productos amplificados con extremos romos y su actividad exonucleasa 3´-5´ le da la habilidad de corregir errores.

2.5.4 Electroforesis de ácidos nucleicos en geles de agarosa La separación de los fragmentos de ADN amplificados, en función de su tamaño se llevó a cabo en geles de agarosa a concentraciones entre 0,8% y 1% (p/v), según el tamaño del producto. Las electroforesis se desarrollaron en tanques horizontales a voltaje constante (100v) y usando como tampón de corrida y como diluente de la agarosa, TAE 0,5X (Tampón TAE 50X: 2M Tris-HCl pH 7.2, 50 mM EDTA pH 8.0, 5,71% de ácido acético glacial y agua bidestilada).

Las muestras de ADN se mezclaron con el tampón de carga de alta densidad (“blue/orange Loading buffer 6X”) de la casa comercial PROMEGA, compuesto básicamente de azul de bromofenol y glicerol.

La visualización del ADN, se obtuvo añadiendo SYBR® Safe 1X (Invitrogen™) a la preparación de agarosa y exponiendo a luz ultra violeta a través de un analizador de geles modelo FOTODYNE, el cual también permite obtener la imagen digitalizada.

El tamaño de los fragmentos de ADN se estimó comparando las distancias recorridas en el gel de agarosa con las del marcador de peso molecular de 1kb ó 100 pb (Promega).

58 2.5.5 Purificación del amplicón a partir de geles de agarosa Una vez obtenido el amplicón del tamaño esperado, se procedió a su recuperación desde el gel de agarosa mediante la solubilización del mismo y la adsorción del ADN a una matriz de lana de vidrio en presencia de alta concentración salina (0,3 M acetato de sodio, concentración final), la cual permite la precipitación de las proteínas que pudieran estar presente; posteriormente se precipitó el ADN con etanol al 98% (v/v) (Fig. 16). En algunas oportunidades, también se utilizó el estuche comercial de purificación de ADN GFXTMPCR (GE Healthcare) según las recomendaciones del fabricante.

El fragmento de ADN purificado fue utilizado para su secuenciación y/o para su ligación a un vector plasmídico.

Figura 16: Protocolo de purificación del amplicón a partir del gel de agarosa por el método de acetato de sodio. Notese el taco de lana de vidrio (para la retención de la agarosa) puesto dentro del tubo de 0,6ml previamente perforado con una agua, calibre 21G y este tubo puesto sobre otro de 1,5 ml, para colectar el ADN eluido.

59

60 2.6 Clonación del gen completo y parcial de la proteína Bip/Hsp70 de T.vivax 2.6.1 Preparación de células competentes E. coli DH5α, BL21 (DE3) y Rosetta (DE3) Para la preparación de las células competentes, se tomó una colonia de cada cepa y se creció en 2,5 ml de medio LB toda la noche a 37°C con agitación vigorosa. Es importante mencionar, que a las células DH5α primero se las puso a crecer en medio LB con ácido nalidíxico (Nal) (50µg/ml) para descartar alguna contaminación con otras E. coli; luego se creció en LB sin antibiótico; así también a las células E. coli Rosetta® con cloramfenicol (34µg/ml). De este cultivo se hizo una dilución 1/20 en medio LB (sin antibiótico) con 2 mM de glucosa estéril para un volumen total de 25 ml (la glucosa puede ayudar a reprimir la expresión basal de la T7 ARN polimerasa y así estabilizar al constructor pET). El cultivo se dejó a 37°C con agitación vigorosa, hasta que alcanzara una DO600 de 0,5–0,7; posteriormente, el cultivo se transfirió a tubos Falcon® de 50 ml fríos y se mantuvo en hielo durante 5 minutos. Posteriormente las células se recogieron por centrifugación a 2.700 x g, durante 15 minutos a 4°C; éstas, se resuspendieron en 30 ml de 80 mM MgCl220mM CaCl frío; se incubó en hielo por 30 minutos y se centrifugó a 1.000 x g por 10 minutos a 4°C, se eliminó el sobrenadante y se añadió 1,5 ml 0,1 M CaCl2 frío; se mezcló muy suavemente con ayuda de una micropipeta y se dejó en baño de hielo a 4°C por 12 a 16 horas para su posterior transformación y/o se realizaron alícuotas de 50 µl con 30% de glicerol en eppendorf nuevos y estériles, para almacenar a -80°C hasta su uso. 2.6.2 Ligación Para la ligación del gen completo y de sus fragmentos, se utilizaron dos vectores: 1) pET160/GW/D-TOPO® (Invitrogen™). Este sistema de clonación, al igual que todos los pET, utiliza solo 5 minutos para clonar direccionalmente un producto de PCR con terminaciones romas. También confiere resistencia a la ampicilina y

61 contiene un promotor T7lac, para expresión en fase con una cola de histidina (6xHis) en el N-terminal que facilita su detección y purificación del producto protéico recombinante en columnas de afinidad (Anexo 3).

Los fragmentos de ADN insertados sólo se expresan en presencia de un agente inductor como el IPTG y de una fuente de T7 ARN polimerasa suministrada por la cepa de E. coli BL21 Star™ (DE3) regulada por el operón lac. Este vector presenta un sistema de Lumio™, el cual utiliza un reactivo bi-arsénico que se une y detecta las proteínas que contienen la secuencia tetra-cisteina (por ejemplo la señal Lumio™). Este reactivo bi-arsénico se vuelve fuertemente fluorescente solamente si se une a la tetracisteina, permitiendo así la detección especifica de las proteínas de fusión Lumio™ en el N- terminal directamente en el gel sin necesidad de realizar una inmunotransferencia (“western-blot”).

2) pET100/D-TOPO® (Invitrogen™): Este sistema de clonación también necesita solo 5 minutos para clonar direccionalmente un producto de PCR con terminaciones romas. Confiere resistencia a la ampicilina y contiene un promotor T7lac, para expresión en fase con una cola de histidina (6xHis) en el N-terminal que facilita su detección y purificación del producto proteico recombinante en columnas de afinidad. El promotor T7lac contiene la fusión del promotor de T7 ARN polimerasa y el operador lac (lacO). Los fragmentos de ADN insertados sólo se expresarán en presencia de un agente inductor como el IPTG y de una fuente de T7 ARN polimerasa. Así, se establece un doble control, ya que tanto la expresión de la polimerasa como la de la proteína recombinante requieren la presencia del inductor. Por otro lado, este vector presenta un sitio de reconocimiento (EK) de una proteasa para separar la cola de histidina de la proteína recombinante si se requiere (Anexo 2).

62 - Para la ligación con el vector pET160 TOPO® Direccional, los amplicones se purificaron con el kit CONCERT™ Rapid PCR (GIBCO BRL) siguiendo las especificaciones del fabricante y la siguiente fórmula para la ligación:  Vector (ng) x Inserto (Kb)     Vector (Kb)  

Inserto (ng) = 

2   1

Sabiendo que la concentración del vector está entre 15 y 20 ng y que su tamaño es de 5,8 Kb. A la reacción se le añade 1µl de solución de sal, 1 µl del vector y agua libre de ARNasa c.s.p 6 µl. Posteriormente, se dieron ligeros golpes al tubo y se realizó una pequeña centrifugación (“spin”) de 10 segundos aproximadamente; se incubó por 45 minutos a temperatura ambiente y finalmente, se colocó en hielo a 4°C toda la noche.

- Para el caso de la ligación con las pET100 TOPO® Direccional, el cual presenta un tamaño de 5.7 kb, se utilizó la siguiente fórmula:

 Vector (ng) x Inserto (Kb)    Vector (Kb)  

Inserto (ng) = 

 3   1

Al igual que con el vector pET160 TOPO®, se utilizó 1 µl de la solución de sal y 1 µl del vector; el volumen del producto de PCR requerido según la concentración de ADN que se tenga y agua MilliQ estéril c.s.p 6 µl.

A pesar que estos sistemas de vectores no necesitan de la enzima ligasa, ya que tienen a la topoisomerasa en su sistema, se vio la necesidad de utilizar la ADN ligasa del fago T4 (Promega) que cataliza la formación de enlaces fosfodiéster entre los extremos 3’-OH y 5´-P de ADN adyacentes, ya que en un intento de ligación anterior, no funcionó. Transcurridos 18 – 24 hr de la reacción, se le añadió a la

63 reacción 0,1µl de ligasa con 1 µl del Tampón y se dejó incubando cerca de 2 horas a temperatura ambiente antes de la transformación. 2.6.3 Transformación en E. coli

El proceso de transformación en E. coli (DH5-α, BL21 (DE3) y BL21-Rosetta), se realizó mediante choque térmico: A un vial con 50 µl de células competentes se le añadieron 3 µl de la reacción de ligación, se mezclaron con ligeros golpes al tubo y se incubó en hielo por 30 minutos. Posteriormente se aplicó un choque térmico a 42°C por 30segundos sin agitación e inmediatamente se incubó en hielo por 5 minutos. Se agregaron 250 µl de medio SOC a temperatura ambiente, los tubos se taparon bien y se incubó a 37°C en baño de maría, colocando los tubos en forma horizontal por 1 hora con agitación suave. Por último, las bacterias se concentraron por centrifugación suave (13.000 x g por 10 segundos), se resuspendieron con la mitad del sobrenadante y se sembraron diferentes volúmenes en placas Petri con agar LB y en caldo LB ambos con ampicilina (100µg/ml) para las rDH5α y rBL21 (DE3) y cloranfenicol (34µg/ml) con ampicilina (100µg/ml) para rRosetta (DE3). A continuación se incubaron a 37°C por 12 a 18 horas. 2.6.4

Selección de los clones transformantes de E. coli

Dado que todos los plásmidos utilizados portan el gen de resistencia a la ampicilina y que además, en el caso de las células E. coli Rosetta portan al plámido pRARE, el cual le confiere la resistencia al cloranfenicol (Anexo 1); se realizó la selección de los transformantes basado en el hecho de que sólo las células transformadas pueden crecer en un medio que contenga estos antibióticos (uno y/o ambos según sea el caso). La selección de los clones que portaban los plásmidos recombinantes se realizó inoculando clones al azar en 2,5 ml de medio LB-ampicilina ó LB-ampicilina/cloranfenicol (para las Rosetta transformadas) y creciendo el cultivo a 37°C de 12 a 18 hrs.

64 2.6.5

Confirmación de la presencia de los insertos Se extrajo el ADN plasmídico (apartado 2.4.2) y se analizó por electroforesis

en geles de agarosa al 0,8% y con SYBR® Safe (Invitrogen™) a fin de constatar la calidad del plásmido purificado y posteriormente para confirmar la presencia de los insertos en los diferentes clones obtenidos, se realizó el ensayo de la PCR “anidada”, en

donde

primero

se

TAATACGACTCACTATAGGG;

utilizaron

los

Antisentido:

oligonucleótidos

T7

TTATTGCTCAGCTGG),

(Sentido: siendo

la

temperatura de hibridación, en este caso, de 54,1°C y luego, este producto se amplificó con los oligonucleótidos específicos. De esta manera se confirmó la presencia del inserto y se envió al CeSAAN para su secuenciación. 2.7 Expresión de la proteína Bip/Hsp70 de T. vivax 2.7.1 Inducción de la expresión Se probaron diferentes dondiciones para evaluar el nivel de expresión de la proteína recombinante de manera cualitativa por electroforesis en geles de poliacrilamida con SDS. Primero se realizó un control piloto de la expresión (anexo 4) para estandarizar la técnica y como control negativo se creció la bacteria no transformante de BL21 y Rosetta. Los extractos proteicos totales se obtuvieron partiendo de cultivos que van de 125 ml a 1Lt. Cuando se encontraban en fase logarítmica ó exponencial tardía, justo antes de entrar en la fase estacionaria (A600: 05-0.7), se agregó 1mM de IPTG al medio LB selectivo con 2 mM de glucosa é inmediatamente se incubó a 37°C y a 42°C toda la noche.

Cabe mencionar que para la estandarización de la concentración de IPTG, se utilizaron cuatro concentraciones: 0,5 mM, 1 mM, 2 mM y 4 mM, quedándose la concentración de 1mM para las subsiguientes expresiones. En cuanto al tiempo de incubación, se evaluaron en tiempo 0, 1, 2, 3, 4, 5 ,6 y toda la noche, de manera tal de obtener mayor expresión de la proteína. Para la estandarización de la

65 temperatura se indujo a 16°C, 28°C, 32°C, 37°C y a 42°C, por tratarse de una proteína de choque térmico. 2.7.2 Lisis celular

Para ello, se creció a 37°C, los clones transformantes en medio LB selectivo: Para las E. coli Rosetta LB con Amp/Cm y las células BL 21 con Amp. Los clones no transformantes (control negativo), se crecieron sin el medio selectivo, es decir, las E. coli-Rosetta solo en LB/Cm y las BL21 solo en LB. Cuando estos cultivos alcanzaron la fase exponencial (Ab600: 4–7), se le agregó 1mM de IPTG y 2mM de glucosa e inmediatamente, se llevó a 42°C de incubación por toda la noche (también se realizaron solo a 37°C). Las células se recogieron por centrifugación a 2.000 x g por 15 minutos a 4°C y el sedimento fue resuspendido en 1 ml de la solución de lisozima (0,2mg/ml) en Tampón Tris-HCL pH 8; la mezcla se agitó con vortex rápida y suavemente, se incubó a 37°C por 30 minutos. Por tratarse de una proteína eucariota expresada en E. coli, lo cual frecuentemente hace que las proteínas sean secuestradas en cuerpos de inclusión insolubles, se decidió resuspender en el tampón de lisis celular pH 8 (100 mM NaH2PO4, 10 mM Tris-HCl, 8 M Urea, 0,5% Tritón X-100, 10% Glicerol, 10 mM Imidazol) con la mezcla de inhibidores proteolíticos (1X). Se mezcló en “vortex” por 1 min para su homogenización y se sonicó con 6 ciclos con pulsos (15 watts de potencia) de 30 seg y con intervalos de 30 seg entre los pulsos, manteniendo la muestra en hielo y confirmando la lisis celular se confirmó por observación al microscopio. Cabe mencionar, que en un principio se realizaron sonicaciones largas de 2 min cada pulso, pero esto posiblemente hacía se que se eliminaran algunas colas de histidina, ya que luego de su purificación, partiendo de la misma cantidad de cultivo, al realizar las inmunotinciones, la misma presentaba baja señal, a diferencia que cuando se cambió la sonicación a 30 seg cada pulso.

El lisado se centrifugó a 17.000 x g por 10 minutos a 4°C (Centrífuga Eppendorf 5810R). Se separó el sobrenadante del sedimento y este último se

66 resuspendió (igual volumen que el sobrenadante) con el tampón de lisis conteniendo el coctel de inhibidores (antes descrito).

Como el Tampón lisis tiene en su composición una concentración alta de Urea (8M), lo que hace difícil la medición de la concentración de proteínas y la corrida electroforética en SDS-PAGE,, los lisados se dializaron contra el tampón 50mM TrisHCl, pH 7,6 en agua bidestilada y se concentraron utilizando filtros Millipor’s Amicon® Ultra-15, efectuando de dos a tres lavados con el Tampón Tri-HCL pH7, 6. Cabe mencionar, que estos filtros también sirven para dializar la muestra.

La concentración de proteínas se midió por fluorometría con el equipo Qiubit™ (Invitrogen), siguiendo las instrucciones del fabricante y también la determinación de proteínas se realizó por el ensayo de proteínas de Bio-Rad, que se basa en el método de Bradford (1976), el cual se realizó con el protocolo para microplacas según las especificaciones del fabricante. Para ello, se realizaron curvas de calibración con soluciones de BSA en un rango de 0 a 2000 µg/ml y la absorbancia de las muestras fueron leídas en un espectrofotómetro (BECKAMN DU® 640) a 595 nm.

2.7.3 Transcripción de la proteína BiP/Hsp70 Por la condición de ser una proteína heteróloga para E. coli, se tuvo el propósito de evaluar la presencia o ausencia de la transcripción, tanto de la proteína completa recombinante, como de sus fragmentos.

2.7.3.1 Aislamiento del ARN celular total Para ello, se dispensaron 10 ml de los cultivos para la expresión, incubados a 42°C toda la noche, tanto los inducidos como los no inducidos con 1mM de IPTG. Cada muestra se colocó en un tubo falcon® de 15ml y se colocaron en hielo por un

67 par de minutos, posteriormente se centrifugaron a 14.000xg por 30 minutos. Se eliminó el sobrenadante dejando el sedimento bien seco; luego se añadió 1 ml de Trizol (para precipitar el ARN), homogenizando suavemente con una micropipeta y se transfirió a un tubo eppendorf de 1,5 ml. Las bacterias se homogenizaron pasándolas 15 veces por una inyectadora con aguja de calibre 21G. La mezcla se dejó reposar por 5 a 10 minutos a TA y se añadieron 200 ul de cloroformo mezclándose fuertemente por inversión, para luego dejar reposar en hielo por 5 minutos y centrifugar a 14.000 rpm por 15 minutos. Se obtuvo 2 fases: Una capa acuosa (superior) y otra orgánica (inferior). Se extrajo cuidadosamente la fase acuosa (transparente) con una micropipeta (contando el volumen) teniendo cuidado de no tocar la capa intermedia, luego se transfirió a un tubo eppendorf nuevo y estéril, al que se le añadió igual volumen de Isopropanol, mezclándose luego por inversión. Se dejó reposar en hielo por 15 minutos y se centrifugó a 14.000 rpm por 15 minutos. Se conservó el sedimento y se decantó la fase acuosa. El sedimento se lavó con 1 ml de etanol frío al 75%, mezclando suavemente por inversión. Se realizó una última centrifugación a 7.500 rpm por 15 minutos a 4°C y se eliminó totalmente el sobrenadante por decantación y luego con ayuda de una micropipeta se retiró lo que pudo haber quedado. Inmediatamente, el sedimento se resuspendió con 40µl de agua libre de ARNasa con agitación mediante ligeros golpes al tubo que luego se colocó en hielo por un par de minutos y se almacenó a -80°C hasta su posterior uso. 2.7.3.2 Electroforesis en geles de agarosa El ARN se evaluó mediante electroforesis horizontal en geles de agarosa con bromuro de etidio (1% Agarosa Genagar, 10% MOPS10X, 2,5% Formaldehido 37%, 0,5 µg/ml Bromuro de Etidio). El Tampón de Corrida que se utilizó está compuesto de 10% formaldehido al 37%, 10% MOPS 10X, diluido en agua bidestilada con 0,02% dietilenpirocarbonato (DEPC) para inactivar ARNasas. La composición del Tampón de carga para las muestras consta de MOPS 10X, formaldehido 37%, formamida desionizada, Glicerol, Bromuro de Etidio y Bromo fenol. Para la preparación de la muestra se utilizaron 8 µl de muestra de ARN, 2 µl agua con DEPC

68 y 5 µl Tampón de carga y se calentó a 68°C por 3 minutos antes de cargar el gel. La electroforesis se realizó a 100 volt – 50 mA por 45 minutos.

Tampón MOPS 0,2M

MOPS

0,01M

EDTA

0,05M

Acetato de sodio Ajustar el pH a 7,0

2.7.3.3 Cuantificación espectrofotométrica del ARN Se determinó la concentración de ARN a cada una de las muestras mediante espectrofotometría. Se calculó teniendo en cuanta que una unidad de DO260 equivale a 40µg de ARN/ml; es decir: [µg/ml RNA] = D.O 260nm x 40 x Factor de dilución Para la determinación de la pureza del ARN se tomó en cuenta las siguientes consideraciones: La relación DO260/DO280 <2, indica que hay contaminación con proteínas

ó

fenol

y

no

se

puede

realizar

una

cuantificación

precisa

espectrofotométricamente. Por el contrario, si la relación DO260/DO280 está entre 1.8 y 2, proporciona una estimación de la pureza del ARN y permite calcular la concentración de ARN presente en la muestra. 2.7.3.4 RT-PCR La Reacción de la cadena de Polimerasa de transcripción Reversa (RT-PCR del inglés Reverse Transcription polymerase chain reaction), es una variante de la PCR, en donde una hebra de ARN es retrotranscrita en ARNm, es decir, ADN

69 complementario (ADNc) usando la enzima transcriptasa reversa, y el resultado se amplifica en un PCR tradicional.

En primer lugar se realizó una dilución de las muestras de ARN a la concentración adecuada para obtener una concentración de 1 µg/µl, en un volumen final de 20 µl. Posteriormente todas las muestras fueron incubadas durante 5 minutos a 80°C, para eliminar las posibles estructuras secundarias del ARN. Las muestras fueron mantenidas en hielo hasta el momento de ser utilizadas.

En un eppendorf libre ARNasa, se preparó la pre-mezcla inicial de la RT-PCR en el que se colocaron 2µl ARN (500ng/µl), 1 µl dNTPs (10mM), 1µl “Radom Primers” (100 ng/µl) y 4 µl de agua Milli Q estéril; se calentó a 65°C por 5 minutos, se dejó 1 min a TA y se colocó en hielo por 1 minuto. Se realizó una breve centrifugación (“spin”). A esta mezcla inicial se le añadió los 11µl de la pre-mezcla que contiene 4µl Tampón Primera cadena (“First Strand”), 2µl de 0,1M DTT, 1 µl de inhibidor de ARNasa y 4µl agua Milli Q estéril. Se selló el tubo con Parafilm® y se mezcló suavemente por inversión, se incubó a 37°C por 2 minutos en una plancha térmica; posteriormente se añadió 1µl de la enzima transcriptasa reversa (M-MLV) (Invitrogen™). Se dejó a TA (25°C) por 10 min, luego se pasó a un baño de maría a 37°C por 50 minutos y por último se inactivó por calentamiento a 70°C por 15 minutos en un mezclador térmico. El cDNA, posteriormente, se almacenó a -20°C hasta su posterior uso. El programa de RT-PCR utilizado fue el siguiente:

70 2.7.3.5 PCR con el cADN El protocolo seguido fue el mismo que para la PCR con los cebadores específicos para el gen completo, como para cada uno de los fragmentos del gen bip/hsp70 de T. vivax, solo que en este caso se utilizó de 8 a 10 veces más el volumen de la muestra, según sea el caso. Luego se realizaron electroforesis en geles de agarosa 0,8% y 1% diluídos en tampón Tris-acetato, EDTA (TAE) 0.5X, pH 8, teñido con SYBR Safe™ de la casa comercial INVITROGEN. Luego se visualizaron las bandas en un fotodocumentador con luz ultravioleta (LUV) para geles. 2.7.4 Análisis de Proteínas por Electroforesis en geles de poliacrilamida en condiciones disociantes (EGP-SDS) Para determinar la solubilidad de la proteína parcial recombinante, se realizó el análisis de los polipéptidos presentes en los lisados bacterianos, tanto el sobrenadante como el sedimento mediante electroforesis en geles de poliacrilamida según

el

método

de

Laemmli

(1970),

bajo

condiciones

disociantes

y

desnaturalizantes. El sedimento fué resuspendido en 5 ml con el tampón de lisis. Las muestras antes de ser aplicadas en los bolsillos del gel se mezclaron con el tampón de carga 4X (326mM Tris (pH 6,8), 40% glicerol, 16% β-mercaptoetanol (BME), 8% SDS y 0,008% azul de bromofenol) para condiciones desnaturalizantes y luego fueron calentadas a 100°C por 5 min, posteriormente se dejó enfriar a TA por 10 min.

El gel de corrida para el análisis de polipéptidos pequeños fue de 17 a 20% de acrilamida y para los grandes o para la proteína completa fue de 10 a 15%. La concentración de acrilamida para el gel concentrador ó de apilamiento fue de 5%. A continuación se presenta la composición de los mismos:

71

Al igual que el gel de corrida, al retirar el peine, el gel de apilamiento se lavó con agua destilada 2 veces y 2 veces con el Tampón de corrida para eliminar la poliacrilamida no polimerizada.

Las proteínas se separaron a 70voltios (voltaje constante) hasta que el frente de azul de bromofenol llegase al final del gel de apilamiento o concentrador y posteriormente se subió el voltaje a 100 ó 120 voltios hasta que el frente llegase al final del gel.

72 Tinción de Geles Terminada la electroforesis, se procedió a teñir los geles por tinción de azul de Coomassie o por tinción con plata, dependiendo la cantidad de proteína presente en las muestras sembradas.

El coomassie se une a las proteínas, y la intensidad de la coloración es relativa y hasta cierto punto independiente de la concentración y de la natualeza química de las proteínas; de esta forma, cuando se tiene que cuantificar una proteína es el colorante más recomendado, puede detectarse hasta un rango mínimo de 0,3 a 1 µg de proteína/banda (Harlow, 1988). El metanol y el ácido acético presentes en la solución colorante, permiten que las proteínas se fijen en el gel y no eluyan durante el proceso de tinción y desteñido del gel, además que el metanol es el solvente ideal para disolver el Coomassie.

En este caso los geles se tiñeron por 18 a 24 hr con la solución colorante (25% Isopropanol, 10% ácido acético glacial, 0,3% azul de Coomassie R-250) y después son colocados en solución decolorante (25% Isopropanol, 10% ácido acético) hasta la observación de las bandas proteicas.

Cuando se requirió de más sensibilidad en la detección de las bandas, se tiñeron los geles con una solución de plata, debido a que su rango mínimo de detección está por el orden de los nanogramos, aproximadamente de 2 a 5 ng de proteína/banda (Harlow, 1988). En este caso, los geles fueron colocados en la solución A (10% ácido acético glacial, 30% etanol) dentro de un recipiente de vidrio con agitación moderada y constante, durante toda la noche. Luego se lavó 3 veces con la solución B (30% etanol) por 20 min cada uno, seguidamente se realizaron 2 lavados con agua destilada durante 15 min, con 4 recambios. Luego los geles se

73 colocaron en una solución C sensibilizadora (0,025% ditionito de sodio) exactamente por 1 min e inmediatamente después se lavó 2 veces por 1 min cada vez, con agua destilada. Posteriormente, los geles se dejaron por 20 a 30 min en agitación constante con la solución D (0,2% AgNO3 en agua MilliQ); luego se lavó en agua destilada por 1 min. Las bandas se observaron al colocar los geles en la solución E reveladora (4% Na2CO3 ó K2CO3, 20 µM Na2S2O3), con agitación constante hasta obtener una coloración intensa, luego de lo cual se detuvo la reacción añadiendo directamente 10 ml de ácido acético glacial; se agitó por 10 min aproximadamente y se lavó 4 veces con agua destilada durante 30 min. Al finalizar, el gel se conservó en una solución al 20% de etanol.

2.7.5 Electrotransferencia de proteínas a membranas de nitrocelulosa. Luego de realizada la electroforesis en geles de poliacrilamida con SDS, las proteínas fueron transferidas a membranas de nitrocelulosa de 0,45 µm (Bio-Rad), en un proceso que utiliza el sistema de transferencia semi-seco con el aparato de transferencia Trans-Blot® Semi-dry Transfer Cell de Bio-Rad®.

Tanto el gel de

poliacrilamida como la membrana de nitrocelulosa y el papel de filtro (Whatman 3 MM) fueron equilibrados durante 15 min en tampón de transferencia (25 mM Tris-HCl (pH 8,3), 192 mM glicina y 20% metanol).

Para geles grandes, especialmente para las electroforesis de los polipéptidos pequeños, se utilizó 25 V por 30 min y 15 V por 60 min y para los geles pequeños, cuando las muestras eran de la proteína completa ó de los polipéptidos grandes, 10V por 30 min ó 15 V por 15 min.

74 La presencia de las proteínas transferidas a las membranas de nitrocelulosa se reveló por tinción con rojo Ponceau S por 10 min en agitación hasta la apareción de las bandas y posteriormente se lavó con agua destilada hasta retirar el exceso del colorante. El gel de poliacrilamida fue teñido con azul de Coomassie para verificar que tan completa había sido la transferencia.

2.7.6 Detección de la proteína recombinante mediante Inmunotinción (Western blot)

Las transferencias de membranas de nitrocelulosa obtenidas anteriormente, fueron lavadas 3 veces, 5 min cada uno, con PBS-1%Tritón X-100 (0,8% NaCl, 0,02% KCl, 0,144% Na2HPO4, 0,024% KH2PO4, 1% tritón) y se bloqueó toda la noche a 4°C con la solución bloqueadora (4% Albúmina bovina en PBS-1%Tritón X-100). A las 24 horas, se lavó una vez con PBS y se incubó 1 hr con el anticuerpo primario (anti-Histidina de ratón) diluido 1/2000 en la solución de bloqueo. Luego de la incubación se lavó dos veces seguidas con PBS-1%Tritón X-100 y una vez, por 1 min, con la solución U-G-T (2M urea, 0,1 M Glicina y 0,1% Tritón X-100 en PBS). La urea permite eliminar las proteínas que no se fijaron a la membrana de nitrocelulosa. Inmediatamente después se lavó dos veces seguidas con PBS-1%Tritón X-100 y 4 veces por 10 min en agitación con PBS Tritón X-100; se incubó 1 hr con el anticuerpo secundario (anti IgG de ratón acoplado a peroxidasa) diluido 1/2500 en la solución de bloqueo, para luego lavar dos veces seguidas con PBS-1%Tritón X-100, una vez con U-G-T por 1 min; nuevamente se lavó 2 veces seguidas con PBS1%Tritón X-100 y cuatro veces por 10 min cada uno, en agitación suave constante. Por último se reveló con TBS-DAB (0,6 mg/ml de diaminobenzidina, 0,015% v/v de H2O2 en Tampón TBS: 50 mM Tris-HCl, pH 7,6). Para parar la reacción, se le añadió agua destilada y se dejó secar sobre papel de filtro.

75 2.8 Obtención de la proteína recombinante purificada 2.8.1 Diálisis y Concentración del sobrenadante. El material soluble del lisado bacteriano se concentró mediante centrifugación (956 x g por 30 minutos a 4°C) con dispositivos Amicon® Ultra-15 (Millipore) y al mismo tiempo que se dializó para retirar el exceso de urea, utilizando 5 ml de la solución tampón 10mM Tris-HCl, pH8, haciendo 3 lavados con el mismo volumen. Posteriormente, se midió la concentración de proteínas con el fluorómetro Qubit® (Invitrogen™). 2.8.2 Purificación de la proteína recombinante Bip/Hsp70 por Cromatografía de Afinidad. Conteniendo la proteína recombinante los seis residuos de histidinas consecutivos (6xHis) en el extremo amino terminal, permitió su purificación utilizando una cromatografía de afinidad con una resina a la que se le une un ión metálico como Ni2+ que tiene afinidad por las histidinas. Para ello, las purificaciones se realizaron usando una resina de níquel-ácido nitriloacético (Ni-NTA) (Sigma). Para cada 100 ml de cultivo, se utilizó 200 µl de resina empacada, la cual fue equilibrada con el tampón de lisis B (500mM NaCl, 20mM PBS (pH 8), 2mM Imidazol y 0,5% NP40), mezclándola por 30 min. Se colocaron 600 µl de la muestra y se incubó con agitación suave toda la noche a 4°C. La resina se empacó en una columna de ~ 7 mm de diámetro (inyectadora de 1 cc), activándose el flujo y eluyendo el material no enlazado (FT, del inglés flow-through), el cual se almacenó a 4°C hasta realizar un análisis por SDS-PAGE.

La resina con los polipéptidos unidos se lavó con 2 ml de la solución de lavado (Tampón de lisis B, pH 8), haciendo fracciones de 0,5 ml; posteriormente se eluyó con la solución de elución (300 mM NaCl, 20mM Tampón fosfato pH 8) con concentraciones crecientes de imidazol (20mM, 40mM, 60mM, 80mM, 100mM, 150mM y 200mM), realizando 2 lavados de 1 ml cada uno con el tampón de lisis B

76 entre cada elución con imidazol a diferente concentración. Se recolectaron 4 fracciones de 250µl de cada una de las concentraciones de imidazol, que posteriormente se almacenaron a -20°C hasta su utilización.

Todas las fracciones fueron suplementadas con la mezcla de inhibidores proteolíticos (apartado 1.6). La concentración de proteínas purificadas fueron medidas en el fluorómetro Qubit® (Invitrogen™), siguiendo las especificaciones delfabricante. 2.9 Diseño y obtención de Péptidos Sintéticos. El hecho en que se puede mimetizar sitios antigénicos de la proteína nativa, nos llevó a diseñar posibles péptidos sintéticos (PS) que sean antigénicos, es decir, que posean la capacidad de unirse específicamente al paratope de las Igs específicas y que pertenezcan a la forma nativa, ya que el hecho que la reactividad antigénica de una proteína no es la misma en la forma nativa que en la forma desnaturalizada. Este punto es muy importante ya que era para realizar ensayos de fase sólida como el ELISA.

Relacionando todos los parámetros que utilizan los métodos de predicción de epítopes, se han podido desarrollar programas de computación que permiten tal predicción, así como de sus características en cuanto a su estructura secundaria, su accesibilidad al solvente, su carga, etc. de una determinada secuencia. En nuestro trabajo utilizamos las siguientes direcciones de programas computacionales:
http://tools.immuneepitope.org/tools/bcell/iedb_input
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/CN3D/cn3d.shtml


http://www.cbs.dtu.dk/services/NetMHCIIpan/

77 Estas direcciones en función de la correlación entre la antigenicidad y estructura, tomaron en cuenta la hidrofilicidad, anfifilicidad, movilidad segmental y accesibilidad de las regiones aminoacídicas que pudieran ser utilizadas como antígenos.

Posteriormente estos análisis se enviaron al Laboratorio Nacional de Proteómica e Inmunoquímica de proteínas, en el Instituto de Medicina Tropical (IMT) de la Universidad Central de Venezuela (UCV), donde fue evaluado y perfeccionado el diseño de los péptidos, utilizando otros programas computacionales como ANTHEPROT 6.0.

La síntesis de los PS, fue realizada por el personal del laboratorio de síntesis péptídica del IMT, a través del método de protección que emplea el grupo lábil en medio básico 9-fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc) con radiaciones microondas. Todos los péptidos tienen el peso molecular esperado y fueron verificados por espectrometría de masas, MALDI.

La longitud de las secuencias peptídicas sintetizadas por el Laboratorio Nacional de Proteómica e Inmunoquímica de proteínas fue de 15 aminoácidos, siendo estos:

78 2.10 Antigenicidad y potencial diagnóstico de la Bip/Hsp70 recombinante y de los Péptidos Sintéticos. - Bip/Hsp70 recombinante, r253a-1

La Bip/Hsp70 recombinante purificada mediante la columna de niquel, fue empleada en ensayos de reconocimiento por anticuerpos presentes en sueros de animales infectados naturalmente y experimentalmente con T. vivax, así como también se evaluaron sueros de bovinos infectados experimental y naturalmente con A. marginale y Babesia bovis, a través de dos métodos inmunoenzimáticos, ELISA indirecto e Inmunotinción (Western Blot).

Estandarización del ELISA Indirecto. Se utilizaron microplacas de 96 pozos (PolySorp de Nunc®), fondo cóncavo. Para la primera estandarización, se hicieron 3 concentraciones del antígeno (polipéptido recombinante 253a-1): 5µg/ml, 10µg/ml y 20µg/ml; la placa fue sensibilizada con 100 µl del antígeno (polipéptido recombinante) en tampón de fijación (0,05M carbonato-bicarbonato a pH 9,6) durante toda la noche en cámara húmeda a 4°C. La solución antigénica que no se fijó a la placa fue descartada y cada pocillo se lavó tres veces por 3 minutos cada vez, con 200µl del tampón PBS-T (20 mM Tampón fosfato, pH 7.2, 150mM NaCl y 0,1% Tween20).

Para ocupar los posibles espacios libres en cada pocillo en donde no se adsorbió el antígeno, se añadieron 200 µl de la solución de bloqueo (0,5% Gelatina en 20 mM PBS) y se incubó a 37°C durante 2 horas a 37°C en cámara húmeda. Se hicieron 3 lavados con el tampón PBS-T, según lo descrito anteriormente. A continuación, se agregó a cada pocillo 100 µl del anticuerpo primario (como suero positivo se utilizó un suero de bovino infectado experimentalmente con el aislado LIEM 1762 de T. vivax y el suero negativo proveniente de un becerro recién nacido, previo

a

tomar

el

calostro,

por

lo

que

no

debería

tener

anticuerpos

79 (aganmaglobulinémico), diluido en la solución de bloqueo y se incubó a 37°C por una hora en cámara húmeda. Transcurrido este tiempo, se procedió a lavar la(s) placa(s) como ya fue descrito anteriormente.

Para el reconocimiento del anticuerpo primario, se le añadió a la reacción 100 µl del anticuerpo secundario, anti-IgG bovina acoplado a peroxidasa (Sigma) diluido 1/500, 1/1.000, 1/1.500, 1/2.000, 1/2.500 y 1/3.000 en el tampón PBS-T y se incubó a 37°C durante 1 hora en cámara húmeda; luego se hicieron otros 3 lavados y posteriormente se agregaron a cada pocillo 100 µl de la solución sustrato (36mM ABTS

y 0,005% H2O2 en 50 mM tampón citrato). Por último se determinó la

absorbancia a 405 nm en un lector para placas de ELISA (Modelo Sunrise de Genius), a los 15, 30, 45 y 60 min de incubación a temperatura ambiente y en oscuridad.

En la segunda estandarización, se utilizó 0,5 µg/ml del antígeno (polipéptido recombinante 253a-1) diluido en el tampón de fijación (0,05M carbonato-bicarbonato a pH 9,6) durante toda la noche en cámara húmeda a 4°C. La solución antigénica que no se fijó a la placa fue descartada y cada pocillo se lavó cinco veces por 5 minutos cada vez, con 200µl del tampón PBS-T (20 mM Tampón fosfato, pH 7.2, 150mM NaCl y 0,1% Tween20).

Para la estandarización del bloqueo, se evaluaron 3 soluciones: 0,5% gelatina en 20 mM PBS, 0,5% OVA en 20mM PBS-T y 0,5% OVA-2% Suero de conejo (SC); se añadieron 200 µl/pocillo de la solución de bloqueo respectivo y se incubó toda la noche a 4°C en cámara húmeda. Se hicieron 3 lavados consecutivos con el tampón PBS-T. Posteriormente, se agregó a cada pocillo 100 µl del anticuerpo primario (como suero positivo se utilizó un suero de bovino infectado experimentalmente con T. vivax y el suero negativo proveniente de un bovino sano, negativo para T. vivax, T.

80 evansi, Babesia, sp y para Anaplasma marginale por PCR y por frotis); diluidos en cada una de las soluciones de bloqueo y se incubó a 37°C por una hora en cámara húmeda. Transcurrido este tiempo, se procedió a lavar la(s) placa(s) cinco veces por cinco minutos cada vez.

Para el reconocimiento del anticuerpo primario, se le añadió a cada pocillo 100 µl del anticuerpo secundario, anti-IgG bovina acoplado a peroxidasa (Kirkegaard & Pery Laboratories Inc., KPL) diluido 1/2.000 y1/2.500 en el tampón de bloqueo 0,5% gelatina en 20 mM PBS-T y se incubó a 37°C durante 1 hora en cámara húmeda, luego se hicieron otros 5 lavados de 5 min cada uno y posteriormente se añadió a cada pocillo 100 µl de la solución sustrato (36mM ABTS y 0,005% H2O2 en 50 mM tampón citrato).

Por último se determinó la absorbancia a 405 nm en un lector para placas de ELISA a los 15, 30, 45 y 60 min de incubación a temperatura ambiente y en oscuridad.

Estandarización de la Inmunotinción (Western Blotting). Se realizó una electroforesis en gel de acrilamida al 17% en condiciones disociantes, utilizando un peine preparativo de 1, 5 mm de grosor. Del polipéptido recombinante, se colocó 8,088 ug de proteína en un volumen de 400µl. Finalizada la electroforesis, la proteína fué transferida a una membrana de nitrocelulosa (tamaño del poro: 0,45 µm), según el método descrito por Towbin y col. (1979).

La presencia de las proteínas transferidas a la membrana de nitrocelulosa se reveló por tinción con rojo Ponceau S y el gel de poliacrilamida fue teñido con azul de Coomassie para verificar que la transferencia había sido completa. La membrana coloreada con rojo Ponceau S, se puso a secar antes de ser decolorado con agua

81 destilada para poder cortar las tiras de ~3 mm de ancho. Las tiras fueron bloqueadas con 5% de OVA en el tampón TBST-150 (50mM Tris, pH8; 150 mM NaCl y 0,05% Tween-20) por 1 hora y agitación constante. Seguidamente se lavaron tres veces, 5 min cada vez, con TBS-T-150.

Posteriormente, se añadieron los sueros primarios negativo y positivo evaluados en el ELISA, diluidos 1/100 y 1/200 en el tampón TBST-300 (50 mM Tris, pH8; 300 mM NaCl y 0,05% Tween-20) con 0,5% OVA-2% Suero de Conejo e incubados por 1 hora, temperatura ambiente y agitación constante.

Luego se realizaron tres lavados de 5 min cada uno con con TBS-T-150. Seguidamente, el anticuerpo secundario (anti IgG de Bovino acoplada a la enzima Peroxidasa de Rábano Picante), diluido 1/2000 en TBST-150, fue incubado por 1 hora a temperatura ambiente y agitación constante.

Finalmente, la inmunotinción fue revelada con el sustrato soluble que generó producto coloreado precipitable, TBS-DAB (0,6 mg/ml de diaminobenzidina, 0,015% v/v de H2O2 en Tampón TBS: 50 mM Tris-HCl, pH 7,6). El desarrollo de color en las tiras se detuvo con lavados sucesivos de agua destilada y se dejó secar sobre papel de filtro. - Péptidos Sintéticos Bip/Hsp70. Estandarización de la Inmunotinción (Western Blotting). En este caso se utilizó el mismo protocolo que se utilizó para la proteína recombinante r253a-1, solo que en este proceso, se colocaron 48 µg, 36 µg, 33 µg y 60 µg de los péptido IMT-1883, IMT-1886, IMT-1887 y IMT-1888, respectivamente.

82

III. RESULTADOS 1. Aspectos Clínicos de las infecciones experimentales En la figura 17, se presentan algunos de los aspectos clínicos y parasitológicos más resaltantes de la evolución de las infecciones experimentales con T. vivax, tanto en bovinos como en ovinos.

- Bovino 616 (Fig. 17, panel A). En el día 1, se le infectó con un críopreservado en PBS-G con 10% DMSO del aislado LIEM/Trujillo el cual presentaba una parasitemia de 2,4 x106 tripanosomas/ml en el momento de su criopreservación. En el instante de la infección, el animal presentaba una temperatura corporal de 39°C y 29% de hematocrito.

El día 8, se pudo observar tripanosomas en sangre, coincidente con un aumento de la temperatura a 40,2°C y un hematocrito del 28%; siendo la parasitemia del 0,352 x 107 tripanosomas/ ml. El día 12, se presentó el primer pico de parasitemia, siendo este de 1,2x107 tripanosomas/ml. La temperatura era del 39,2°C y el hematocrito en 26%. El día 16, se presentó el segundo pico de parasitemia con la temperatura corporal de 39,5°C y 22% de hematocrito; la parasitemia fue de 1,5 x 107 tripanosomas/ml. El tercer pico se presentó seis días después (día 22) con 3,0 x 107 tripanosomas/ml, cuando la temperatura y el hematocrito eran de 38,3°C y 17%, respectivamente.

83 - Oveja 90 (Fig. 17, panel B). En el día 1 se infectó con 2ml de sangre infectada con el aislado LIEM/Trujillo, con una parasitemia de 7,0 x 107 tripanosomas/ml y críopreservado con PBS-1%Glucosa-20%Glicerol (v/v); en este momento, el animal presentaba una temperatura de 39°C y el hematocrito era de 38%.

La aparición de los parásitos en sangre, fue el día 4, presentando una parasitemia de 0,639 x 107 tripanosomas/ml, cuando el hematocrito descendió a 34% y la temperatura subió a 39,6°C. Se puede considerar que este fue el primer pico de parasitemia y en los días subsiguientes ya no se observaron parásitos en sangre. Un segundo pico de parasitemia se presentó en el día 10, siendo este de 1,11 x 107 tripanosomas/ml, cuando la temperatura estaba en 42°C y el hematocrito en 25%. El tercer pico de parasitemia se presentó en el día 22, cuando la temperatura que presentaba el animal era de 41,5°C y el hematocrito había descendido a 18%; la parasitemia fue de 7,15 x 107 tripanosomas/ml.

- Carnero NI (Fig. 17, panel C). El día 1 se le infectó con 10 ml de sangre infectada con el aislado FALCÓN de T. vivax, con 1 tripanosoma cada 10 campos (40X) y criopreservado en PBS-1%Glucosa-10%DMSO (v/v). En el momento de su infección experimental, el animal presentaba una temperatura de 39°C y 32% de hematocrito. En el día 3 se vieron los primeros tripanosomas en sangre, dando una parasitemia de 0,1 x 107 tripanosomas/ml, cuado la temperatura era de 39,6°C y el hematocrito de 32%.

El primer pico de parasitemia se presentó en el día 5 con 3,12 x 107 tripanosomas/ml; la temperatura fue de 41,2°C y el hematocrito 28%. Al día siguiente, la parasitemia bajó al igual que la temperatura y el hematocrito, pero ya en el día 8 se comenzó ver un aumento en la parasitemia de 0,8 x 107

84 tripanosomas/ml y el día 9, realmente hizo el segundo pico de parasitemia, con 3,4 x 107 tripanosomas/ml, cuando la temperatura era de 41,8°C y el hematocrito de 28%.

En todas las infecciones experimentales, ya sea en bovino ó en ovino, se pudo observar un perfil similar el cual se presenta una disminución del hematocrito y aumento de la temperatura corporal cuando la parasitemia aumentaba.

En el caso del bovino 616 y de la oveja 90, se pudo observar que las parasitemias fueron detectables hasta casi el final del período de muestreo, a diferencia del carnero NI. Por otro lado, poco después de haber realizado la infección en los ovinos, el hematocrito descendió, no así en el bovino.

En la figura 17, se puede observar una recuperación significativa del hematocrito, en los Ovinos, alrededor de los días 24 y 25 después de la infección; así como también que los dos únicos picos de parasitemia que se presentó en el carnero NI con el aislado Falcón fueron en los días 5 y 9 y posteriormente se mantuvo silente hasta el final del experimento a diferencia de las infecciones con el aislado LIEM/Trujillo.

85

Figura. 17: Aspectos clínicos y parasitológicos más resaltantes de la evolución de las infecciones experimentales con T. vivax, tanto en bovinos como en ovinos. Paneles A y B: Bovino 616 y Oveja 90, respectivamente, infectados con el aislado LIEM/Trujillo, Panel C: Carnero NI infectado con el aislado Falcón.

86 2. Purificación del Trypanosoma vivax. Como se puede apreciar en la tabla XII, las purificaciones utilizando una columna cromatográfica de intercambio aniónico, DEAE-Celulosa con la solución de Krebs modificada, dieron rendimientos muy satisfactorios, llegando a valores de hasta 91,26%. Estos valores se obtienen con parasitemias mayores de 1 x 107 tripanosomas/ml y hematocrito de ~18%; de esta forma, se aprovechó toda la sangre colectada sin saturar la columna con los glóbulos rojos.

Durante este trabajo se observó una migración de parásitos al plasma, aumentando hasta un 50 % cuando se le añadió 0,5% de glucosa y se mantuvo en reposo por media hora a temperatura ambiente posterior a la primera centrifugación (2.465 x g/15 min/ 25°C) de la muestra de sangre (sin separar el plasma de los glóbulos rojos). Esto permite una obtención adicional de tripanosomas puros con un rendimiento de la purificación a partir del plasma de 78,84% (Tabla XIII).

87 Tabla XII. Rendimientos en la purificación de T. vivax por cromatografía de intercambio aniónico, DEAE- Celulosa, en presencia de una solución de Krebs modificada, pH 7,2 1° 2° 3° Purificación Purificación Purificación (x107 p) (x107 p) (x107 p)

4° Purificación (x107 p)

5° Purificación (x107 p)

6° Purificación (x107 p)

Parásitos colocados

1,66

8,87

0,69

7,61

2,77

5,95

Parásitos eluidos

0,59

3,78

0,35

4,57

1,80

5,43

Rendimiento (%)

35,66

42,61

51,16

60,11

64,98

91,26

Tabla XIII. Rendimiento en la obtención de T. vivax a partir del plasma con 0,5% de glucosa Plasma 1 (x107 p)

Plasma 2 (x107 p)

Parásitos iniciales

12,56

6,34

Parásitos en plasma

2,16

2,6

Parásitos obtenidos

1,2

2,05

55,55

78,84

Rendimiento (%)

88 3. Amplificación del gen completo y parcial bip/hsp70 de tripanosomas 3.1 Extracción de ADN 3.1.1 Aislamiento del ADN genómico de T. evansi y T. vivax Se pudo obtener un material libre de ARN y de alta calidad utilizando el estuche comercial Wizard® (Invitrogen), tanto para el ADN del aislado Mantecal de T. evansi (Figura 18), como para el ADN del aislado LIEM176 de T. vivax (Figura19). 3.1.2 Aislamiento del ADN plasmídico recombinante.

Al igual que la purificación del ADN genómico, el aislamiento del ADN plasmídico se realizó utilizando un estuche comercial (Marligen®) obteniéndose una purificación más limpia que la realizada con la solución TENS, lo que nos favorece al momento de realizar el PCR y sobretodo para la posterior secuenciación (Figura 20). El exceso de ARN en las muestras obtenidas con TENS, pudo ser disminuido, añadiéndole ~8µl de ARNasa e incubando a 37°C por dos horas. 3.2

Amplificación con los oligonucleótidos degenerados para el gen

bip/hsp70 de T. evansi y T. vivax.

La estandarización de la PCR con los oligonucleótidos degenerados, Forward: 5´-ATGTCKRGGAYGTNGCTG-3´,

Tm

53,9

y

Reverse:

5´-

TTAMAGRTSRTCCATGGGNTG-3’, Tm 54,8, se efectuó quedando la concentración final del cloruro de magnesio en 4mM; la concentración de la taq polimerasa para T. evansi en 0,03 U/µl y para T. vivax 0,02 U/µl, para ambas amplificaciones se utilizó 10% de DMSO y 3,2 mM de la mezcla de dNTP; la temperatura de hibridación fue 53,3°C – 54,3°C ya que a temperaturas mayores no había amplificación.

89 Para el gen completo de bip/hsp70, de T. vivax, se obtuvo un producto amplificado de cuatro bandas (Figura 22), siendo las de 1.500 pb, ~650 pb y ~450 pb, las de mayor señal y una de menor intensidad de casi 2.500 pb; pero la banda de interés (~2.000 pb) no se pudo observar posiblemente por una pobre amplificación, debido a que hay una diferencia de cinco nucleótidos en el oligonucleótido sentido del N- terminal, con respecto a la secuencia obtenida de las amplificaciones con el ADN del aislado LIEM176 de T. vivax del gen que codifica para la proteína Bip/Hsp70 para T. vivax (bip/hsp70), como se muestra en la figura 21. No obstante, con uno de los oligonucleótidos degenerados internos se obtuvo una banda del tamaño esperado (520pb) aunque con la presencia de algunas bandas inespecíficas tenues de mayor tamaño, como se observa en la figura 23, las cuales fueron eliminadas en la extracción del fragmento a partir del gel de agarosa al 0,8%. Este producto fue reamplificado y nuevamente eluido a través de la lana de vidrio (Figura 16) para su secuenciación y, a partir de este resultado, se pudieron diseñar dos de los oligonucleótidos específicos utilizados en la construcción de la secuencia completa.

Para el caso del gen bip/hsp70 de T. evansi, con los mismos oligonucleótidos degenerados utilizados para la amplificación del gen completo bip/hsp70 de T. vivax, se logró obtener un sola banda correspondiente al tamaño esperado (~2.000 pb), que fue purificada para su secuenciación (Fig.22).

90

Figura 18. Registro fotográfico de la electroforesis en gel de agarosa al 0,8% mostrando la integridad del ADN genómico de T. evansi (aislado Mantecal). En el carril 1, 1µl del ADN a partir de parásitos purificados y en el carril 2, 3µl del ADN a partir de sangre de rata infectada con T. evansi, aislado Mantecal.

Figura 19. Registro fotográfico de la electroforesis en gel de agarosa al 2% del ADN genómico de T. vivax (aislado LIEM176) purificado, utilizando el estuche comercial wizart®, a partir de sangre de ovino infectado con aislado LIEM176 de T. vivax, de los días 1 al 26 post infección.

91

Figura 20. Registro fotográfico de la extracción del ADN plasmídico recombinante con dos protocolos. Se extrajo el plásmido proveniente de 2 a 3 colonias de cada uno de los clones recombinantes. En el panel A, se observa el resultado de la extracción del ADN plasmídico con la solución TENS con una cantidad considerable de ARN y en el panel B, la extracción con el estuche comercial Marligen sin la presencia de ARN.

92

Figura 21. Alineamiento múltiple de las secuencias nucleotídicas del gen bip/hsp 70 de T. vivax, T. congolense y T. brucei. Se puede apreciar parte de las secuencias del N- terminal y del C- terminal dentro del marco abierto de lectura, en donde están localizados los juegos de oligonucleótidos degenerados que acotan al gen completo. Los nucleótidos en verde indican la diferencia que existe entre la secuencia real del gen bip/sp70 de T. vivax y lo enmarcado, el oligonucleótido degenerado utilizado que fue diseñado previo a la publicación de la secuencia putativa.

93

T. vivax T. evansi Paso

T°C

T’

Reactivos

C1

C2

1

94

5’

MgCl2

50mM

4mM

2

2

94

1’

Buffer

10X

1X

2,5µl

3

53,3- 54,3

1’

dNTP

40mM

3,2 mM

2µl

4

72

2’30”

F1

100µM

0,2µM

0,5µl

Repetir 35 veces desde el 2do paso

R1

100µM

0,2µM

0,5µl

DMSO

100%

10%

Tag Pol

5U/µl

5 6

72

10’

7

4

α

ADN H2O MQ

2,5ug/µl

V1

2,5µl

**0,03U/µl 100ng/µl

c.s.p 25µl

**0,150µl 1µl 13,85

V2:

25µl

** Para T. vivax, 0,02 U/µl de Taq Polimerasa

Figura 22. Registro fotográfico de la electroforesis en gel de agarosa al 0,8% de los productos amplificados con los oligonucleótidos degenerados para el gen completo bip/hsp70 de T. vivax y T. evansi. Única banda amplificada (flecha roja), de un tamaño aproximado de 2.000 pb con el ADN de T. evansi; y 3 bandas bien marcadas (flechas negras), con tamaños de aproximadamente 1.500 pb, 650 pb, 450 pb y una banda de menor intensidad cercana a los 2500 pb en la amplificación con el ADN de T. vivax. Las bandas menores de 253 pb probablemente correspondan a dímeros de oligonucleótidos formados.

Figura 23. Registro fotográfico de la amplificación con los oligonucleótidos degenerados internos (lcri2) que amplifica un fragmento de ~520pb del gen bip/hsp70 de T. vivax a diferentes temperaturas de hibridación. Lo remarcado se extrajo y se aisló el ADN para su posterior secuenciación.

94 3.3 Amplificación con los Oligonucleótidos específicos para el gen bip/hsp70

A partir de la secuencia de los productos obtenidos con los oligonucleótidos degenerados, se diseñaron oligonucléotidos específicos que, junto con los de la secuencia putativa, publicada posteriormente (Febrero, 2008) por GeneDB (Acceso: Tviv1246g12.p1k_1), se lograron diseñar varias combinaciones, teniendo en cuenta, las regiones que son más antigénicas para posteriormente clonar los fragmentos amplificadas (Tabla XIV). Con estas combinaciones se amplificaron varios fragmentos del gen de T. vivax, como se muestra en la figura 24. Luego de estandarizar la PCR, se llegó a tener, en su mayoría, una banda muy bien definida y ausencia de amplificaciones inespecíficas. Todas estas bandas fueron extraídas del gel y eluídas para su posterior secuenciación y análisis informático.

95

Figura 24: Registro fotográfico de la electroforesis en gel de agarosa mostrando las amplificaciones de ADN por la técnica de PCR utilizando combinaciones de oligonucleótidos específicos que acotan en diferentes lugares de la secuencia del gen bip/hsp70 de T. vivax. Carril 1: amplicón de ~182pb (Flcri3put/Rlcri2); carril 2: amplicón de ~250pb (Flcri3put/RTvlcri3); carril 3: amplicón de ~302pb (Flcri3put/RTvput1); Carril 4: amplicón de ~321pb (FTput1/RTvlcri3); carril 5: amplicón de ~360pb (Flcr2put/Rlcri1), carril 6: amplicón de ~373pb (FTput1/RTvput1), carril 7: amplicón de ~872pb (FTvput2/Rlcri1put), carril 8: amplicón de ~872pb (FTvput2/RTvput2), carril9: amplicón de ~1122 (Flcri3put/Rlcri1put); carril 10: amplicón de ~1140pb (Flcri2put/RTvput1); carril 11: amplicón de ~1193pb (FTput1/RTvput2); carril 12: amplicón de ~1959 pb (Flcri2put/Rlcri1put).

96 Tabla XIV: Lista de los juegos de oligonucleótidos específicos. Su ubicación dentro de la secuencia putativa del gen bip/grp78 de T. vivax (GeneDB: Tviv1246g12.p1k_1), el tamaño que amplifican y la temperatura en que hibridaron. Temperatura de hibridación (°C)

Tamaño (pb)

Ubicación en la secuencia Putativa

Flcri3put/Rlcri2

~182

838 - 1019

53,4

Flcri3put/RTvlcri3

~243

838 - 1080

58,7

Flcri3put/RTvput1

~302

838 -1140

FTput1/RTvlcri3

~314

767 - 1080

62,6

Flcri2put/Rlcri1

~366

1 - 366

52,8

FTput1/RTvput1

~378

767 - 1140

62,6

FTvput2/Rlcri1put

~872

1088 - 1962

58,7

FTvput2/RTvput2

~872

1088 - 1962

55,5

Flcri3put/Rlcri1put

~1122

838 - 1962

62,6

Flcri2put/RTvput1

~1140

1 - 1140

62,6

FTput1/RTvput2

~1193

764 - 1962

60,0

Flcri2put/Rlcri1put

~1962

1 - 1962

63,9

Juego de Oligonucleótidos

50,58

97 4 Análisis bioinformático de secuencia Las secuenciaciones realizadas por el CeSAAN de las amplificaciones de T. vivax como de T. evansi, dieron los siguientes resultados: 4.1 T. evansi: Te_bip/hsp70

El cromatograma enviado por el CeSAAN para T. evansi con los oligonucleótidos degenerados se puede apreciar en la figura 25 y la secuencia obtenida del análisis del cromatograma fue el siguiente: >LCRITe1_lolyF (326nt)

GTG GGC ATC GAC CTC GGC ACA ACA TAC TCC GTT GTG GGT GTG TGG CAG AAG GGT GAT GTG CAT ATC ATC CCG AAC GAG ATG GGT AAC CGC ATC ACA CCT TCC GTC GTC GCC TTT ACC GAC ACA GAG CGG CTG ATC GGT GAC GGT GCG AAG AAT CAG CTT CCA CAG AAT CCG CAT AAT ACA ATC TAC ACC ATC AAG AGG CTG ATT GGC CGC AAG TAC ACG GAT GCG GCA GTG CAG GCT GAC AAG AAA CTG CTG TCG TAT GAG GTC ATT GCG GAC CGC GAC GGG AAG CCG AAG GTA CAA GTG ATG GTG GGT GGG AAA AAG AAA CAG

TT

El nucleótido en rojo y en negrita, indica la única diferencia con la secuencia nucleotídica del gen bip/grp78 de T. brucei, el cual en su lugar presenta una guanina (G). Esta secuencia de nucleótidos fue traducida a 108 aminoácidos utilizando la dirección bioinformática: http://users.ugent.be/~mdgroeve/bioinfx/: V P K K

G S R V

I V L Q

D V I V

L A G M

G F R V

T T K G

T D Y G

Y T T K

S E D K

V R A K

V G V W Q K G D V H I I P N E M G N R I T L I G D G A K N Q L P Q N P H N T I Y T I A V Q A D K K L L S Y E V I A D R D G K P Q

98 Se les realizaron los análisis informáticos apropiados, tanto de la secuencia nucleotídica (Blast y Clustal W2) como de la aminoacídica (Blast). Con el análisis realizado a la secuencia de nucleótidos, se pudo demostrar que se trata de un gen con una homología del 99% con el gen bip/grp78 de T. brucei y del 100% con el gen de la proteína 78 regulada por glucosa, TREU927 de T. brucei (Figura 26). En el caso del alineamiento de secuencia de aminoácidos de la proteína BiP/Hsp70 de T. evansi

con

la

BiP/Grp78

de

T.

brucei

utilizando

el

servidor

Blast

(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/cobalt/cobalt.cgi), se demostró que no habían diferencias significativas; teniendo una homología del 98% con la proteína Grp78 de T. brucei y con la proteína p69 de T. conolense (Fig. 27).

99

Figura 25: Cromatograma de la secuencia de una fracción del gen Te_bip/hsp70 enviada por el CeSAAN. Para la obtención de este cromatograma se utilizó el editor de alineamiento de secuencia BioEdit (http://www.mbio.ncsu.edu/BioEdit/bioedit.html).

100

Figura 26. Distribución de las secuencias con mayor homología con la secuencia de nucleótidos del fragmento amplificado con los oligonucleótidos degenerados y el ADN de T. evansi. Nótese el máximo porcentaje de identidad (100%) con las secuencias de grp78/BiP de T. brucei y con un 82% con la del gen p69/BiP de T. congolense.

101

Figura 27. Alineamiento de la secuencia de aminoácidos del fragmento amplificado con el ADN de T. evansi, con la secuencia de la proteína BiP/Grp78 de T. brucei y el antígeno p69 de T. congolense. Se puede apreciar una diferencia en solo uno de los aminoácidos (remarcados en líneas rojas), tanto en la secuencia de BiP/GRP78 de T. brucei, como en la secuencia del Antígeno P69 de T. congolense.

102 4.2 T. vivax: Tv_bip/hsp70

- Con el producto amplificado a partir del ADN de T. vivax, aislado LIEM176, usando los oligonucleótidos degenerados Flcri2/Rlcri2 (acotan una región interna de la secuencia del gen completo) y extraído para su secuenciación con el CeSAAN, se obtuvo una secuencia de 422 nt (anexo 5) y se le realizó los análisis bioinformáticos respectivos, dando una homología del 97% con la secuencia del gen de la proteína putativa de BiP, (Fig 28, B).

- Con la combinación de los oligonucleótidos degenerados y específicos, se pudo obtener la secuencia completa del gen bip/hsp70 de T. vivax (anexo 6), la cual presenta una homología en su secuencia nucleotídica del 98 % con su secuencia putativa y del 86 % con respecto a la secuencia del gen p69/hsp70 de T. congolense y 83% con la secuencia nucleotídica del gen grp78/bip de T. brucei (figuras 29, 30 y 31). Luego de convertir la secuencia de nucleótidos a la secuencia de aminoáacidos (anexo7)

con

el

programa

Attotron

(http://www.attotron.

com/cybertory/analysis/trans.htm) y con el programa Dearch Laucher, del servidor ExPASy Proteomics (http://searchlaucher.cm.tmc.edu/seq-util/options/sixframe.htm), se pudo realizar el análisis de similitud en las secuencias aminoacídicas, encontrando que presenta una homología del 90% con la secuencia de la proteína BiP/Grp78 de T. brucei y del 89% con la secuencia de la proteína P69 de T. congolense; hallando algunas diferencias en el extremo N- terminal (Figura 32). En el anexo 4, se puede observar una de las secuencias enviadas por el CeSAAN, la misma que después correspondió a la proteína parcial y que posteriormente pudo ser expresada.

103

A

B

Figura 28. Análisis de secuencia del producto amplificado con oligonuceótidos degenerados y ADN genómico de T. vivax. A) Registro fotográfico del producto re-amplificado del fragmento del gen bip/hsp70 de T. vivax con los oligonucleótidos degenerados Flcri2/Rlcri2 que posteriormente fue purificado para su secuenciación,. B) La alineación de la secuencia con la putativa

104 del gen bip/hsp70 de T. vivax, mostrando una homología del 97% con la secuencia amplificada con los oligonucleótidos degenerados lcri2.

Tv_bip/hsp70 atggcgaaggcgatgcggctcgcagctgcggcgctgctcttggtggctgccgccactgct Putativa atggcgaaggcgatgcggctcgcagctgcggcgctgctcttggtggctgccgcgactggt ***************************************************** **** * Tv_bip/hsp70 gcgtgggctgcgccggaggcgagcgggaaggtggaggcgccgtgcgtgggcattgacctt Putativa gcgtgggctgcgccggaggcgagcgggaaggtggaggcgccgtgcgtgggcattgacctt ************************************************************ Tv_bip/hsp70 ggcacgacgtactcggtggtgggcgtgtggcagaagggcgacgtgcacatcatcccgaac Putativa gggacgacgtactcggtggtgggcgtgtggcagaagggcgacgtgcacatcatcccgaac ** ********************************************************* Tv_bip/hsp70 gagatggggaaccgcatcacgccgtctgtggtggcgttcacggagacggagcggctgatt Putativa gagatggggaaccgcatcacgccgtctgtggtggcgttcacggagacggagcggctgatt ************************************************************ Tv_bip/hsp70 ggcgacggcgcgaagaaccagctgccacagaacccgcacaacaccatctacacgatcaag Putativa ggcgacggcgcgaagaaccagctgccacagaacccgcacaacaccatctacacgatcaag ************************************************************ Tv_bip/hsp70 cgcctgattggccgcaagtactcggaccccgcggtgcaggcggacaagaagctgctgtcg Putativa cgcctgattggccgcaagtactcggaccccgcggtgcaggcggacaagaagctgctgtcg ************************************************************ Tv_bip/hsp70 tacgaggttgttgcggaccgtgacgggaagccgaaggtgcaggtgacgctgggcgggaag Putativa tacgaggttgttgcggaccgtgacgggaagccgaaggtgcaggtgacgctgggcgggaag ************************************************************ Tv_bip/hsp70 aagaaggagttcacgccggaggaggtgagcgcgatggtgctgcagaagatgaaggagatc Putativa aagaaggagttcacgccggaggaggtgagcgcgatggtgctgcagaagatgaaggagatc ************************************************************ Tv_bip/hsp70 gcggagacgtacctgggcgagaaggtgaagaacgcggtggtgactgtgcctgcgtacttc Putativa gcggagacgtacctgggcgagaaggtgaagaacgcggtggtgactgtgcctgcgtacttc ************************************************************ Tv_bip/hsp70 aacgacgcgcagcgccagtcgacgaaggacgcggggacgatcgcggggctgaacgtggtg Putativa aacgacgcgcagcgccagtcgacgaaggacgcggggacgatcgcggggctgaacgtggtg ************************************************************ Tv_bip/hsp70 cgcatcatcaacgagccgacggcggccgcaatcgcgtacgggctgaacaaggccggggag Putativa cgcatcatcaacgagccgacggcggccgcaatcgcgtacgggctgaacaaggccggggag ************************************************************ Tv_bip/hsp70 aagaacatcctggtgttcgacctgggtggcggcacgttcgatgtgtcgctgctgacgatc Putativa aagaacatcctggtgttcgacctgggtggcggcacgttcgatgtgtcgctgctgacgatc ************************************************************ Tv_bip/hsp70 gacgagggcttcttcgaggtggtggcgacgaacggcgacacgcaccttggcggcgaggac Putativa gacgagggcttcttcgaggtggtggcgacgaacggcgacacgcaccttggcggcgaggac ************************************************************ Tv_bip/hsp70 tttgacaacaacatgatgcgctactttgtggacatgctgaagaagaagcgcaacgtggac Putativa tttgacaacaacatgatgcgctactttgtggacatgctgaagaagaagcgcaacgtggac ************************************************************

105 Tv_bip/hsp70 gtgagcaaggaccagaaggcgcttgcccggctgcgcaaggcgtgcgaggcggcgaagcga Putativa gtgagcaaggaccagaaggcgcttgcccggctgcgcaaggcgtgcgaggcggcgaagcgc *********************************************************** Tv_bip/hsp70 cagctgtcgtcgcaccccgaggcgcgcgtggaggtggacagtctgacggagggctt-gac Putativa cagctgtcgtcgcaccccgaggcgcgcgtggaggtggacagcctgacggagggctttgac ***************************************** ************** *** Tv_bip/hsp70 -tcagcgagaagatcacgcgcgcgaagttcgaggagctgaacatggacctgttcaagggg Putativa ttcagcgagaagatcacgcgcgcgaagttcgaggagctgaacatggacctgttcaagggg *********************************************************** Tv_bip/hsp70 acgctggtgcccgtgcagcgcgtgctggaggacgcgaagctgaagaagagcgacatccac Putativa acgctggtgcccgtgcagcgcgtgctggaggacgcgaagctgaagaagagcgacatccac ************************************************************ Tv_bip/hsp70 gagattgtgcttgtgggtggctcgacgcgcgtgcccaaggtgcagcagctgatcagcgac Putativa gagattgtgcttgtgggtggctcgacgcgcgtgcccaaggtgcagcagctgatcagcgac ************************************************************ Tv_bip/hsp70 ttctttggcgggaaggagctgaaccgcgggatcaaccccgacgaggctgtggcgtacggc Putativa ttctttggcgggaaggagctgaaccgcgggatcaaccccgacgaggctgtggcgtacggc ************************************************************ Tv_bip/hsp70 gctgcggtgcaggccgcggtgctgacgggcgagagcgaggtgggcgggcgcgtggtgctt Putativa gctgcggtgcaggccgcggtgctgacgggcgagagcgaggtgggcgggcgcgtggtgctt ************************************************************ Tv_bip/hsp70 gtggacgtgatcccgctgtcgctgggcattgaggcggtgggcgggatcatgacgaagctg Putativa gtggacgtgatcccgctgtcgctgggcattgagacggtgggcgggatcatgacgaagctg ********************************* ************************** Tv_bip/hsp70 atcgagcgcaacacgcagatcccgaccaagaagagccaggtgttctccacgcacgcggac Putativa atcgagcgcaacacgcagatcccgaccaagaagagccaggtgttctccacgcacgcggac ************************************************************ Tv_bip/hsp70 aaccagcccggcgtgctgatccaggtgtacgagggcgagcgccagctgacgaaggacaac Putativa aaccagcccggcgtgctgatccaggtgtacgagggcgagcgccagctgacgaaggacaac ************************************************************ Tv_bip/hsp70 cggctgctcgggaagttcgagctgtccggcatcccgcctgcgccgcgcggcgtgccgcag Putativa cggctgctcgggaagttcgagctgtccggcatcccgcctgcgccgcgcggcgtgccgcag ************************************************************ Tv_bip/hsp70 atcgaggtgacgttcgacgtggacgagaacagcatcctgcaggtgagcgcggtggacaag Putativa atcgaggtgacgttcgacgtggacgagaacagcatcctgcaggtgagcgcggtggacaag ************************************************************ Tv_bip/hsp70 tcgtccgggaagaaggaggagatcacgatcacgaacgacaaggggcggctgagcgaggag Putativa tcgtccgggaagaaggaggagatcacgatcacgaacgacaaggggcggctgagcgaggag ************************************************************ Tv_bip/hsp70 gagattgagcgcatggtgcgcgaggctgcggagttcgagaacgaggaccgcaaggtgcgc Putativa gagattgagcgcatggtgcgcgaggctgcggagttcgagaacgaggaccgcaaggtgcgc ************************************************************ Tv_bip/hsp70 gagcgcgtggacgcgcgcaacacgctggagagcgtgacgtactcgctgcgcagccaggtg Putativa gagcgcgtggacgcgcgcaacacgctggagagcgtgacgtactcgctgcgcagccaggtg ************************************************************ Tv_bip/hsp70 aacgacaaggacaagctgggcgggaagctgagcgccgacgagaagagcactgtggaggct Putativa aacgacaaggacaagctgggcgggaagctgagcgccgacgagaagagcactgtggaggct ************************************************************

106 Tv_bip/hsp70 gcggtgaaggaggcgatccggttcctggacgagaacccgaacgcggagaaggaggagtac Putativa gcggtgaaggaggcgatccggttcctggacgagaacccgaacgcggagaaggaggagtac ************************************************************ Tv_bip/hsp70 gacgctgcgcgcgagaagctgcagggcgtgaccaaccccatcatccagaaggcctaccag Putativa gacgctgcgcgcgagaagctgcagggcgtgaccaaccccatcatccagaaggcctaccag ************************************************************ Tv_bip/hsp70 gctggtggcgagaagccgcagccgatggacgacctgtaa Putativa gctggtggcgagaagccgcagccgatggacgacctgtaa ***************************************

Figura 29.- Alineamiento múltiple con MAFFT (v6.818b) de obtenida del gen bip/hsp70 de T. vivax, secuenciada por el secuencia putativa del gen bip/hsp70 obtenida de la base GeneDB (# de acceso: Tviv1246g12.p1k_1). Se encontró un identidad del 98%.

la secuencia CeSAAN y la de datos del porcentaje de

Tv_bip/hsp70 T.congolense

atggcgaaggcgatgcggctcgcagctgcggcgctgctcttggtggctgccgccactgct atgtctgggacgtcgctgcgcaca---gcagcggtgctcttagtcgtggcagctgcggtc *** * * ** ** ** * ** ** *** ******* ** * ** ** * *

Tv_bip/hsp70 T.congolense

gcgtgggctgcgccggaggcgagcgggaaggtggaggcgccgtgcgtgggcattgacctt gccaccgcggcgcccgagagcggcgggaaggtggaagccccgtgcgtgggcattgatctc ** ** ***** *** ************* ** ***************** **

Tv_bip/hsp70 T.congolense

ggcacgacgtactcggtggtgggcgtgtggcagaagggcgacgtgcacatcatcccgaac ggcacgacctactccgttgttggcgtgtggcagaagggcgatgtgcacattatcccaaac ******** ***** ** ** ******************** ******** ***** ***

Tv_bip/hsp70 T.congolense

gagatggggaaccgcatcacgccgtctgtggtggcgttcacggagacggagcggctgatt gagatgggtaaccgcatcacgccgtccgtcgtcgccttcacagatacggagcgcttgatc ******** ***************** ** ** ** ***** ** ******** ****

Tv_bip/hsp70 T.congolense

ggcgacggcgcgaagaaccagctgccacagaacccgcacaacaccatctacacgatcaag ggcgatggcgccaagaaccagctgccacagaacccccacaacacgatctatacgatcaag ***** ***** *********************** ******** ***** *********

Tv_bip/hsp70 T.congolense

cgcctgattggccgcaagtactcggaccccgcggtgcaggcggacaagaagctgctgtcg cgcttgattggccgcaagtacacagacgcggcggtgcaggcggacaagaagctgctgtcg *** ***************** * *** * ******************************

Tv_bip/hsp70 T.congolense

tacgaggttgttgcggaccgtgacgggaagccgaaggtgcaggtgacgctgggcgggaag tacgaggtggtggctgatcgcgatggaaagccgaagttgcaggtgatggtgggcggccaa ******** ** ** ** ** ** ** ********* ********* * ******* *

Tv_bip/hsp70 T.congolense

aagaaggagttcacgccggaggaggtgagcgcgatggtgctgcagaagatgaaggagatc gcgaagcagtttacaccggaggaaatcagtgcgatggtactgcagaagatgaaggagatt **** **** ** ******** * ** ******** ********************

Tv_bip/hsp70 T.congolense

gcggagacgtacctgggcgagaaggtgaagaacgcggtggtgactgtgcctgcgtacttc gcggagacgtacctcggcgagaaggttaagaacgcggtggtgacagtgccggcctacttc ************** *********** ***************** ***** ** ******

Tv_bip/hsp70 T.congolense

aacgacgcgcagcgccagtcgacgaaggacgcggggacgatcgcggggctgaacgtggtg aatgacgcgcagcgccagtcgacgaaggatgccggcacgatcgctggcttgaacgtggtg ** ************************** ** ** ******** ** ***********

107 Tv_bip/hsp70 T.congolense

cgcatcatcaacgagccgacggcggccgcaatcgcgtacgggctgaacaaggccggggag cggattatcaacgagccaacggcggcagccattgcatacggactgaacaaggctggtgag ** ** *********** ******** ** ** ** ***** *********** ** ***

Tv_bip/hsp70 T.congolense

aagaacatcctggtgttcgacctgggtggcggcacgttcgatgtgtcgctgctgacgatc aagaacattctggtgtttgaccttggcggtgggacgtttgatgtatcgctgcttactatt ******** ******** ***** ** ** ** ***** ***** ******** ** **

Tv_bip/hsp70 T.congolense

gacgagggcttcttcgaggtggtggcgacgaacggcgacacgcaccttggcggcgaggac gacgagggcttctttgaggtggtggcaacgaacggtgacacgcaccttggtggtgaggac ************** *********** ******** ************** ** ******

Tv_bip/hsp70 T.congolense

tttgacaacaacatgatgcgctactttgtggacatgctgaagaagaagcgcaacgtggac ttcgacaacaacatgatgcggtacttcgtggacatgctgaagaagaagaagaatgttgac ** ***************** ***** ********************* ** ** ***

Tv_bip/hsp70 T.congolense

gtgagcaaggaccagaaggcgcttgcccggctgcgcaaggcgtgc-gaggcggcgaagcg atcagcaaggaccagaaggc-tttagccggctgcgcaaggcgtgcggaggcggcgaaacg * ***************** ** ******************* *********** **

Tv_bip/hsp70 T.congolense

acagctgtcgtcgcaccccgaggcgcgcgtggaggtggacagtctgacggagggctttga tcagctgtcgtcgcaccccgaggcacgagtggaggtggacagcctgacggagggcttcga *********************** ** ************** ************** **

Tv_bip/hsp70 T.congolense

cttcagcgagaagatcacgcgcgcgaagttcgaggagctgaacatggacctgttcaaggg cttcagcgagaagattacccgtgcgaagtttgaggagctgaacatggacctcttcaaggg *************** ** ** ******** ******************** ********

Tv_bip/hsp70 T.congolense

gacgctggtgcccgtgcagcgcgtgctggaggacgcgaagctgaagaagagcgacatcca cacgctaataccggtgcagcgtgtgctggaagacgcgaagctgaagaagagcgatatcca ***** * ** ******** ******** *********************** *****

Tv_bip/hsp70 T.congolense

cgagattgtgcttgtgggtggctcgacgcgcgtgcccaaggtgcagcagctgatcagcga cgagatggtacttgtgggcgggtcgacacgtgtgccgaaggtgcagcagctgatcagcga ****** ** ******** ** ***** ** ***** ***********************

Tv_bip/hsp70 T.congolense

cttctttggcgggaaggagctgaaccgcgggatcaaccccgacgaggctgtggcgtacgg tttcttcggtggcaaggagctgaaccgtggcatcaaccccgacgaggctgtggcgtacgg ***** ** ** ************** ** *****************************

Tv_bip/hsp70 T.congolense

cgctgcggtgcaggccgcggtgctgacgggcgagagcgaggtgggcgggcgcgtggtgct tgctgcggttcaggctgcggtgctgaccggtgagagtgaggttggcgggcgtgttgtgct ******** ***** *********** ** ***** ***** ******** ** *****

Tv_bip/hsp70 T.congolense

tgtggacgtgatcccgctgtcgctgggcattgaggcggtgggcgggatcatgacgaagct cgtcgatgtgattccactgtcgctgggcatcgagactgtgggtggtgtcatgacgaagct ** ** ***** ** ************** *** * ***** ** *************

Tv_bip/hsp70 T.congolense

gatcgagcgcaacacgcagatcccgaccaagaagagccaggtgttctccacgcacgcgga cattgagcgcaacacgcagattccaacgaagaagagccagatcttctcgacacacgcaga ** ***************** ** ** ************ * ***** ** ***** **

Tv_bip/hsp70 T.congolense

caaccagcccggcgtgctgatccaggtgtacgagggcgagcgccagctgacgaaggacaa caaccagcctggcgtgctgatccaggtgtacgagggtgagcgccaactgacgaaggacaa ********* ************************** ******** **************

Tv_bip/hsp70 T.congolense

ccggctgctcgggaagttcgagctgtccggcatcccgcctgcgccgcgcggcgtgccgca ccggctgctaggcaagttcgagctgacaggcatcccgccagcagcgcgtggtgtgccgca ********* ** ************ * *********** ** **** ** ******** gatcgaggtgacgttcgacgtggacgagaacagcatcctgcaggtgagcgcggtggacaa gatcgaggtgacgtgtgatgtggacgagaacagtatcctgcaggtgagcgcgatggacaa ************** ** ************** ****************** *******

Tv_bip/hsp70 T.congolense

Tv_bip/hsp70

gtcgtccgggaagaaggaggagatcacgatcacgaacgacaaggggcggctgagcgagga

108 T.congolense

gtcgtctggcaagaaggaggagatcacgatcacgaacgacaagggccgactgagcgagga ****** ** *********************************** ** ***********

Tv_bip/hsp70 T.congolense

ggagattgagcgcatggtgcgcgaggctgcggagttcgagaacgaggaccgcaaggtgcg ggagatcgaacggatggtgcgtgaggctgcggagtttgaggatgaggaccgcaagtacgg ****** ** ** ******** ************** *** * ************ *

Tv_bip/hsp70 T.congolense

cgagcgcgtggacgcgcgcaacacgctggagagcgtgacgtactcgctgcgcagccaggt ggagcgtgtggaggcgcggaactctctcgagagtgctgcgtactcgctgcgcaaccaggt ***** ***** ***** *** * ** ***** * *************** ******

Tv_bip/hsp70 T.congolense

gaacgacaaggacaagctgggcgggaagctgagcgccgacgagaagagcactgtggaggc gaatgacaaggacaagcttggcggcaagctcagtgctgacgataaggccgctgtggaggc *** ************** ***** ***** ** ** ***** *** * **********

Tv_bip/hsp70 T.congolense

tgcggtgaaggaggcgatccggttcctggacgagaacccgaacgcggagaaggaggagta tgccgtcaaggaggccatccgtttcctggatgagaaccccaacgccgagaaggaggagta *** ** ******** ***** ******** ******** ***** **************

Tv_bip/hsp70 T.congolense

cgacgctgcgcgcgagaagctgcagggcgtgaccaaccccatcatccagaaggcctacca caagacagcactcgacaccatgcaaagcgtcactaaccccattgtgcagaaggcctacca * * * ** * *** * **** **** ** ******** * **************

Tv_bip/hsp70 T.congolense

------ggctggtggcgagaagccgcagccgatggacgacctgtaa gtcggcgggcgcgggtgacaagccgcagcccatggatgacctttaa ** * ** ** *********** ***** ***** ***

Figura 30.- Alineamiento múltiple con MAFFT (v6.811.b) de las secuencias nucleotídicas de Tv-bip/hsp70 secuenciada por el CeSAAN y la secuencia del gen p69 de T. congolense. En este alineamiento se obtuvo un 86% de identidad.

Tv_bip/hsp70 Tb_bip/grp78

ATGGCGAAGGCGATGCGGCTCGCAGCTGCGGCGCTGCTCTTGGTGGCTGCCGCCACTGCT ATGTCGAG---GATGTGGCTGACCACTGCAGCGGTGTTCCTGACTGTGACGGTTGCAGCC *** *** **** **** * **** *** ** ** ** * * * * **

Tv_bip/hsp70 Tb_bip/grp78

GCGTGGGCTGCGCCGGAGGCGAGCGGGAAGGTGGAGGCGCCGTGCGTGGGCATTGACCTT GTCTCAGCAGCACCCGAAAGTGGCGGCAAGGTGGAAGCACCATGCGTGGGCATCGACCTC * * ** ** ** ** **** ******** ** ** *********** *****

Tv_bip/hsp70 Tb_bip/grp78

GGCACGACGTACTCGGTGGTGGGCGTGTGGCAGAAGGGCGACGTGCACATCATCCCGAAC GGCACAACATACTCCGTTGTGGGTGTGTGGCAGAAGGGTGATGTGCATATCATCCCGAAC ***** ** ***** ** ***** ************** ** ***** ************

Tv_bip/hsp70 Tb_bip/grp78

GAGATGGGGAACCGCATCACGCCGTCTGTGGTGGCGTTCACGGAGACGGAGCGGCTGATT GAGATGGGTAACCGCATCACACCTTCCGTCGTCGCCTTTACCGACACAGAGCGGCTGATC ******** *********** ** ** ** ** ** ** ** ** ** ***********

Tv_bip/hsp70 Tb_bip/grp78

GGCGACGGCGCGAAGAACCAGCTGCCACAGAACCCGCACAACACCATCTACACGATCAAG GGTGACGGTGCGAGGAATCAGCTTCCACAGAATCCGCATAATACAATCTACACCATCAAG ** ***** **** *** ***** ******** ***** ** ** ******** ******

Tv_bip/hsp70 Tb_bip/grp78

CGCCTGATTGGCCGCAAGTACTCGGACCCCGCGGTGCAGGCGGACAAGAAGCTGCTGTCG AGGCTGATTGGCCGCAAGTACACGGATGCGGCAGTGCAGGCTGACAAGAAACTGCTGTCG * ****************** **** * ** ******** ******** *********

109 Tv_bip/hsp70 Tb_bip/grp78

TACGAGGTTGTTGCGGACCGTGACGGGAAGCCGAAGGTGCAGGTGACGCTGGGCGGGAAG TATGAGGTCATTGCGGACCGCGACGGGAAGCCGAAGGTACAAGTGATGGTGGGTGGGAAA ** ***** ********** ***************** ** **** * **** *****

Tv_bip/hsp70 Tb_bip/grp78

AAGAAGGAGTTCACGCCGGAGGAGGTGAGCGCGATGGTGCTGCAGAAGATGAAGGAGATC AAGAAACAGTTCACACCAGAAGAGATCAGTGCCATGGTGCTGCAGAAGATGAAGGAAATT ***** ******* ** ** *** * ** ** *********************** **

Tv_bip/hsp70 Tb_bip/grp78

GCGGAGACGTACCTGGGCGAGAAGGTGAAGAACGCGGTGGTGACTGTGCCTGCGTACTTC GCAGAAACGTACCTTGGCGAGAAAGTGAAAAACGCTGTTGTAACGGTACCTGCGTACTTC ** ** ******** ******** ***** ***** ** ** ** ** ************

Tv_bip/hsp70 Tb_bip/grp78

AACGACGCGCAGCGCCAGTCGACGAAGGACGCGGGGACGATCGCGGGGCTGAACGTGGTG AATGACGCACAACGGCAGTCGACAAAGGATGCTGGGACCATCGCCGGTTTGAACGTAGTG ** ***** ** ** ******** ***** ** ***** ***** ** ******* ***

Tv_bip/hsp70 Tb_bip/grp78

CGCATCATCAACGAGCCGACGGCGGCCGCAATCGCGTACGGGCTGAACAAGGCCGGGGAG CGCATCATCAATGAGCCCACCGCAGCCGCCATCGCATATGGGCTAAACAAAGCCGGTGAG *********** ***** ** ** ***** ***** ** ***** ***** ***** ***

Tv_bip/hsp70 Tb_bip/grp78

AAGAACATCCTGGTGTTCGACCTGGGTGGCGGCACGTTCGATGTGTCGCTGCTGACGATC AAGAATATCCTGGTGTTCGATCTTGGTGGTGGTACCTTTGATGTGTCACTGCTGACAATC ***** ************** ** ***** ** ** ** ******** ******** ***

Tv_bip/hsp70 Tb_bip/grp78

GACGAGGGCTTCTTCGAGGTGGTGGCGACGAACGGCGACACGCACCTTGGCGGCGAGGAC GATGAGGGCTTCTTCGAAGTTGTGGCGACAAACGGTGATACGCACCTTGGTGGTGAGGAC ** ************** ** ******** ***** ** *********** ** ******

Tv_bip/hsp70 Tb_bip/grp78

TTTGACAACAACATGATGCGCTACTTTGTGGACATGCTGAAGAAGAAGCGCAACGTGGAC TTTGATAACAACATGATGCGACACTTTGTGGACATGCTGAAGAAGAAAAAGAATGTTGAC ***** ************** ************************* ** ** ***

Tv_bip/hsp70 Tb_bip/grp78

GTGAGCAAGGACCAGAAGGCGCTTGCCCGGCTGCGCAAGGCGTGCGAGGCGGCGAAGCGA ATCAGTAAGGACCAAAAGGCACTGGCACGTCTTCGCAAGGCATGTGAGGCTGCGAAGCGA * ** ******** ***** ** ** ** ** ******** ** ***** *********

Tv_bip/hsp70 Tb_bip/grp78

CAGCTGTCGTCGCACCCCGAGGCGCGCGTGGAGGTGGACAGTCTGACGGAGGGCTTTGAC CAGCTGTCGTCTCATCCCGAGGCGCGTGTGGAGGTGGACAGCCTTACGGAGGGCTTCGAT *********** ** *********** ************** ** *********** **

Tv_bip/hsp70 Tb_bip/grp78

TTCAGCGAGAAGATCACGCGCGCGAAGTTCGAGGAGCTGAACATGGACCTGTTCAAGGGG TTCAGCGAGAAAATCACACGTGCGAAGTTTGAGGAGCTGAACATGGACCTCTTCAAGGGG *********** ***** ** ******** ******************** *********

Tv_bip/hsp70 Tb_bip/grp78

ACGCTGGTGCCCGTGCAGCGCGTGCTGGAGGACGCGAAGCTGAAGAAGAGCGACATCCAC ACACTCGTGCCCGTGCAACGTGTGCTGGAGGATGCGAAGCTGAAGAAGAGTGACATCCAC ** ** *********** ** *********** ***************** ********* GAGATTGTGCTTGTGGGTGGCTCGACGCGCGTGCCCAAGGTGCAGCAGCTGATCAGCGAC GAGATTGTGCTCGTTGGTGGATCCACACGTGTGCCGAAGGTACAACAACTGATCAGTGAC *********** ** ***** ** ** ** ***** ***** ** ** ******** ***

Tv_bip/hsp70 Tb_bip/grp78

Tv_bip/hsp70 Tb_bip/grp78

TTCTTTGGCGGGAAGGAGCTGAACCGCGGGATCAACCCCGACGAGGCTGTGGCGTACGGC TTCTTCGGTGGGAAGGAACTGAACCGTGGTATTAACCCCGATGAAGCCGTAGCATATGGT ***** ** ******** ******** ** ** ******** ** ** ** ** ** **

Tv_bip/hsp70 Tb_bip/grp78

GCTGCGGTGCAGGCCGCGGTGCTGACGGGCGAGAGCGAGGTGGGCGGGCGCGTGGTGCTT GCCGCTGTGCAAGCTGCGGTGCTAACCGGTGAAAGCGAGGTTGGCGGGCGCGTTGTGCTT ** ** ***** ** ******** ** ** ** ******** *********** ******

Tv_bip/hsp70 Tb_bip/grp78

GTGGACGTGATCCCGCTGTCGCTGGGCATTGAGGCGGTGGGCGGGATCATGACGAAGCTG GTAGATGTGATCCCACTGTCGCTTGGTATTGAAACTGTAGGTGGTGTCATGACAAAACTC ** ** ******** ******** ** ***** * ** ** ** ******* ** **

110 Tv_bip/hsp70 Tb_bip/grp78

ATCGAGCGCAACACGCAGATCCCGACCAAGAAGAGCCAGGTGTTCTCCACGCACGCGGAC ATCGAGCGTAACACACAGATCCCCACCAAGAAGAGTCAGGTCTTTTCTACCCATGCGGAC ******** ***** ******** *********** ***** ** ** ** ** ******

Tv_bip/hsp70 Tb_bip/grp78

AACCAGCCCGGCGTGCTGATCCAGGTGTACGAGGGCGAGCGCCAGCTGACGAAGGACAAC AACCAGCCGGGTGTGCTTATCCAAGTGTATGAGGGTGAGCGCCAGCTGACAAAGGATAAC ******** ** ***** ***** ***** ***** ************** ***** ***

Tv_bip/hsp70 Tb_bip/grp78

CGGCTGCTCGGGAAGTTCGAGCTGTCCGGCATCCCGCCTGCGCCGCGCGGCGTGCCGCAG CGCCTCCTGGGCAAATTCGAGTTGTCGGGAATTCCTCCTGCCGCGCGTGGTGTGCCACAA ** ** ** ** ** ****** **** ** ** ** ***** **** ** ***** **

Tv_bip/hsp70 Tb_bip/grp78

ATCGAGGTGACGTTCGACGTGGACGAGAACAGCATCCTGCAGGTGAGCGCGGTGGACAAG ATCGAAGTGACATTTGACGTCGACGAGAACAGCATCCTGCAGGTGAGCGCTATGGACAAG ***** ***** ** ***** ***************************** ********

Tv_bip/hsp70 Tb_bip/grp78

TCGTCCGGGAAGAAGGAGGAGATCACGATCACGAACGACAAGGGGCGGCTGAGCGAGGAG TCGTCTGGAAAGAAGGAAGAGATCACCATCACCAACGACAAGGGTCGCCTGAGCGAGGAG ***** ** ******** ******** ***** *********** ** ************

Tv_bip/hsp70 Tb_bip/grp78

GAGATTGAGCGCATGGTGCGCGAGGCTGCGGAGTTCGAGAACGAGGACCGCAAGGTGCGC GAGATTGAGCGTATGGTGCGCGAAGCGGCAGAGTTCGAGGACGAGGACCGCAAGGTGCGC *********** *********** ** ** ********* ********************

Tv_bip/hsp70 Tb_bip/grp78

GAGCGCGTGGACGCGCGCAACACGCTGGAGAGCGTGACGTACTCGCTGCGCAGCCAGGTG GAGCGTGTGGATGCGCGTAACTCGCTGGAGAGCGTTGCGTATTCCCTACGCAACCAAGTG ***** ***** ***** *** ************* **** ** ** **** *** ***

Tv_bip/hsp70 Tb_bip/grp78

AACGACAAGGACAAGCTGGGCGGGAAGCTGAGCGCCGACGAGAAGAGCACTGTGGAGGCT AACGATAAGGATAAGCTTGGTGGGAAACTTGACCCCAATGACAAGGCTGCAGTGGAGACC ***** ***** ***** ** ***** ** * ** * ** *** * ****** *

Tv_bip/hsp70 Tb_bip/grp78

GCGGTGAAGGAGGCGATCCGGTTCCTGGACGAGAACCCGAACGCGGAGAAGGAGGAGTAC GCTGTTGCGGAGGCGATCCGCTTCCTTGACGAAAATCCGAACGCCGAAAAGGAGGAGTAC ** ** ************ ***** ***** ** ******** ** ************

Tv_bip/hsp70 Tb_bip/grp78

GACGCTGCGCGCGAGAAGCTGCAGGGCGTGACCAACCCCATCATCCAGAAGGCCTACCAG AAAACTGCCCTGGAAACTCTGCAGAGCGTGACCAACCCCATCATCCAGAAGACTTACCAA * **** * ** * ****** ************************** * *****

Tv_bip/hsp70 Tb_bip/grp78

GCTG------GTGGCGAGAAGCCGCAGCCGATGGACGACCTGTAA TCCGCCGGCGGAGGCGACAAGCCACAACCCATGGACGATCTGTAA * * * ***** ***** ** ** ******** ******

Figura 31.- Alineamiento múltiple con MAFFT (v.8.811.b) de las secuencias nucleotídicas del gen bip/hsp70 de T. vivax, secuenciada por el CeSAAN y la secuencia bib/grp78 de T. brucei. Se obtuvo un 83% de identidad.

Luego de convertir la secuencia de nucleótidos a la secuencia de aminoácidos (Anexo

7)

con

el

programa

Attotron

(http://www.attotron.com/cybertory/analysis/trans.htm) y con el programa Dearch Laucher, del servidor ExPASy Proteomics (http://searchlaucher.cm.tmc.edu/sequtil/options/sixframe.htm), se pudo realizar el análisis de similitud en las secuencias,

111 encontrando que presenta una homología del 90% con la secuencia de la proteína BiP/grp78 de T. brucei y del 89% con la secuencia de la proteína p69 de T. congolense; hallando algunas diferencias en el extremo N- terminal (Figura 32).

Tv_BiP/Hsp70 Tc_BiP/P69 Tb_BiP/Grp78 Tv_BiP/Hsp70 Tc_BiP/P69 Tb_BiP/Grp78 Tv_BiP/Hsp70 Tc_BiP/P69 Tb_Bip/Grp78 Tv_BiP/Hsp70 Tc_BiP/P69 Tb_BiP/Grp78 Tv_BiP/Hsp70 Tc_BiP/P69 Tb_BiP/Grp78 Tv_BiP/Hsp70 Tc_BiP/P69 Tb_BiP/Grp78 Tv_BiP/Hsp70 Tc_BiP/P69 Tb_BiP/Grp78 Tv_BiP/Hsp70 Tc_BiP/P69 Tb_BiP/Grp78 Tv_BiP/Hsp70 Tc_BiP/P69 Tb_BiP/Grp78 Tv_BiP/Hsp70 Tc_BiP/P69 Tb_BiP/Grp78 Tv_BiP/hsp70 Tc_BiP/p69 Tb_Bip/Grp78

AKAMRLAAAALLLVAAATAAWAAPEASGKVEAPCVGIDLGTTYSVVGVWQKGDVHIIPN M-GTSLRTAAVLLVVAAAVATAAPESGGKVEAPCVGIDLGTTYSVVGVWQKGDVHIIPN M-RMWLTTAAVFLTVTVAAVSAAPESGGKVEAPCVGIDLGTTYSVVGVWQKGDVHIIPN * . * :**::*..:.:.. ***:.******************************** MGNRITPSVVAFTETERLIGDGAKNQLPQNPHNTIYTIKRLIGRKYSDPAVQADKKLLS MGNRITPSVVAFTDTERLIGDGAKNQLPQNPHNTIYTIKRLIGRKYTDAAVQADKKLLS MGNRITPSVVAFTDTERLIGDGARNQLPQNPHNTIYTIKRLIGRKYTDAAVQADKKLLS *************:*********:**********************:*.********** EVVADRDGKPKVQVTLGGKKKEFTPEEVSAMVLQKMKEIAETYLGEKVKNAVVTVPAYF EVVADRDGKPKLQVMVGGQAKQFTPEEISAMVLQKMKEIAETYLGEKVKNAVVTVPAYF EVIADRDGKPKVQVMVGGKKKQFTPEEISAMVLQKMKEIAETYLGEKVKNAVVTVPAYF ***:********:** :**: :*****:******************************* DAQRQSTKDAGTIAGLNVVRIINEPTAAAIAYGLNKAGEKNILVFDLGGGTFDVSLLTI DAQRQSTKDAGTIAGLNVVRIINEPTAAAIAYGLNKAGEKNILVFDLGGGTFDVSLLTI DAQRQSTKDAGTIAGLNVVRIINEPTAAAIAYGLNKAGEKNILVFDLGGGTFDVSLLTI *********************************************************** EGFFEVVATNGDTHLGGEDFDNNMMRYFVDMLKKKRNVDVSKDQKALARLRKACEAAKR EGFFEVVATNGDTHLGGEDFDNNMMRYFVDMLKKKKNVDISKDQKALAGCARRAEAAKR EGFFEVVATNGDTHLGGEDFDNNMMRHFVDMLKKKKNVDISKDQKALARLRKACEAAKR ***************************:********:***:******** : ***** LSSHPEARVEVDSLTEGFDFSEKITRAKFEELNMDLFKGTLVPVQRVLEDAKLKKSDIH LSSHPEARVEVDSLTEGFDFSEKITRAKFEELNMDLFKGTLIPVQRVLEDAKLKKSDIH LSSHPEARVEVDSLTEGFDFSEKITRAKFEELNMDLFKGTLVPVQRVLEDAKLKKSDIH *****************************************:***************** IVLVGGSTRVPKVQQLISDFFGGKELNRGINPDEAVAYGAAVQAAVLTGESEVGGRVVL MVLVGGSTRVPKVQQLISDFFGGKELNRGINPDEAVAYGAAVQAAVLTGESEVGGRVVL IVLVGGSTRVPKVQQLISDFFGGKELNRGINPDEAVAYGAAVQAAVLTGESEVGGRVVL :********************************************************** DVIPLSLGIEAVGGIMTKLIERNTQIPTKKSQVFSTHADNQPGVLIQVYEGERQLTKDN DVIPLSLGIETVGGVMTKLIERNTQIPTKKSQIFSTHADNQPGVLIQVYEGERQLTKDN DVIPLSLGIETVGGVMTKLIERNTQIPTKKSQVFSTHADNQPGVLIQVYEGERQLTKDN **********:***:*****************:************************** LLGKFELSGIPPAPRGVPQIEVTFDVDENSILQVSAVDKSSGKKEEITITNDKGRLSEE LLGKFELTGIPPAARGVPQIEVTCDVDENSILQVSAMDKSSGKKEEITITNDKGRLSEE LLGKFELSGIPPAARGVPQIEVTFDVDENSILQVSAMDKSSGKKEEITITNDKGRLSEE ********:*****.********* ***********:********************** IERMVREAAEFENEDRKVRERVDARNTLESVTYSLRSQVNDKDKLGGKLSADEKSTVEA IERMVREAAEFEDEDRKYGERVEARNSLESAAYSLRNQVNDKDKLGGKLSADDKAAVEA IERMVREAAEFEDEDRKVRERVDARNSLESVAYSLRNQVNDKDKLGGKLDPNDKAAVET *************:**** **:***:***.:****.************..::*::**: AVKEAIRFLDENPNAEKEEYDAAREKLQGVTNPIIQKAYQA--GGEKPQPMDDL AVKEAIRFLDENPNAEKEEYKTALDTMQSVTNPIVQKAYQSAGAGDKPQPMDDL AVAEAIRFLDENPNAEKEEYKTALETLQSVTNPIIQKTYQSAGGGDKPQPMDDL ** *****************.:* :.:*.*****:**:**: .*:********

Figura 32.- Análisis de similitud de las secuencias de aminoácidos de Tv_BiP/Hsp70 obtenida con las secuencias de la proteína BiP/grp78 de T. brucei y el de la proteína p69 de T. congolense.

112 5.

Predicción de la antigenicidad de las secuencia parcial obtenida de Te_BiP/Hsp70 y de la secuencia completa, Tv_Bip/Hsp70, obtenida y del fragmento clonado; analizados en programas bioinformáticos. Se realizó la predicción de la probabilidad de antigenicidad de ambas secuencias obtenidas, tanto para la Bip/Hsp70 de T. vivax, como para la secuencia de Bip/Hsp70 de T. evansi., utilizando las siguientes direcciones: http://scratch.proteomics.ics.uci.edu/, http://tools.immuneepitope.org/tools/bcell/iedb_input

Ambas secuencias fueron comparadas con sus homólogos, BiP/Grp78 y p69/Hsp70 de T. brucei y T. congolense, respectivamente.

En la figura 33, se puede apreciar la predicción de las zonas más antigénicas del fragmento secuenciado de Te_BiP/Hsp70, y de su homólogo en T. brucei (BiP/Grp78). La predicción antigénica de ese fragmento es exactamente la misma para ambos.

En la figura 34, se observa que existen algunas diferencias en las zonas antigénicas del fragmento secuenciado de Tv_BiP/Hsp70 con su homólogo en T. congolense, p69/BiP. Existen zonas que están más expuestas en Tv_BiP/Hsp70 que en la proteína p69/BiP.

En cuanto al fragmento clonado y expresado, r253a-1/BiP de T. vivax, se pudo predecir su antigenicidad. Como se puede observar en la figura 35, ésta presenta un porcentaje considerable de antigenicidad en su secuencia lo que nos indica que la elección de los oligonucleótidos diseñados y utilizados para su obtención fue acertada.

113

Figura 33 Predicción de las secuencias antigénicas en la proteína BiP, para T. evansi y T. brucei. Se puede observar la semejanza del 100% en la probable secuencia antigénica de BiP/Hsp70 y BiP/Grp78 de T. vivax y T. brucei, respectivamente. Usando el programa: http://www.bioinformatics.org/JaMBW/3/1/7/

114

Figura 34 Predicción de las secuencias antigénicas en la proteína BiP, para T. vivax y T. congolense. Esta predicción se realizó, usando el programa http://tools.immuneepitope.org/tools/bcell/iedb_input. Se puede observar que existe una gran homología, pero también se encuentran pequeñas diferencias, como las que están enmarcadas en casilleros verdes y fucsias. Las zonas coloreadas en amarillo indican las porciones más antigénicas y expuestas en la secuencia y las verdes las menos expuestas y/o hidrofóbicas.

115

Figura 35. Predicción de las secciones más accesibles, antigénicas e hidrofílicas dentro de la secuencia r253a-1/BiP de T. vivax. Se realizó el análisis informático respectivo utilizando la base de datos Immune Epitope (http://tools.immuneepitope.org/tools/bcell/iedb_input). Las zonas amarillas indican las regiones más expuestas y antigénicas y la verde la menos accesible y/o hidrofóbica.

116 6

Clonación del gen completo y parcial de la proteína BiP/Hsp70 de T.

vivax. Luego de diseñar los oligonucleótidos y de combinarlos de forma tal que acoten las secuencias más antigénicas del gen (anexo 8), se amplificaron y luego se procedió a la ligación, tanto del gen completo bip/hsp70 de T. vivax como de sus fragmentos, con los vectores pET100 y pET160; los cuales generaron las colonias DH5α y BL21 transformantes, que posteriormente fueron crecidas en caldo selectivo LB/Amp+ para el aislamiento del plásmido y con ello realizar la PCR para verificar la presencia del inserto en estos vectores. En clonaciones anteriores con el gen completo y utilizando el vector pET100, a pesar de que las colonias obtenidas crecieron en el medio selectivo, no contenían el inserto. Los plásmidos se evaluaron realizando una PCR anidada (“Nested”); una primera reacción utilizando los oligonucleótidos T7, bajo las condiciones propias indicadas por el fabricante (INVITROGEN) y una segunda reacción de PCR, utilizando los oligonucleótidos específicos, en las condiciones estandarizadas. Con este tipo de PCR “anidada (“Nested”) se esperaba aumentar el factor de amplificación del inserto de interés. Sin embargo, aún así, no se obtuvieron las bandas esperadas. Adicionalmente se secuenciaron, y se confirmó la ausencia del inserto. Posteriormente, se realizó un experimento piloto de la expresión para luego efectuar una inmunotinción (“Westernblot”) con un anticuerpo anti histidina (GE Heathcare), dando resultados negativos (resultados no mostrados).

Las transformaciones con el vector recombinante pET160, fueron exitosas para los productos de la PCR del fragmento completo y también para las fracciones (figuras 37 y 38), donde se observan que las amplificaciones con los plásmidos recombinantes y los oligonucleótidos específicos generan las bandas esperadas, como también fue confirmado con la secuenciación. Sin embargo al inducir la expresión a las E coli (BL21) recombinantes, éstas no se expresaban a pesar que se hicieron múltiples ensayos: cambiando las concentraciones de IPTG

117 (0,5, 1 y 2 mM), utilizando medios con y sin glucosa, utilizando diferentes temperaturas de incubación luego de la inducción, desde 16°C hasta 37°C. También se usaron diferentes soluciones para la lisis bacteriana y varias condiciones de la sonicación, por si el problema era la lisis celular; pero aún así, no se obtuvo resultados satisfactorios.

Figura 36. Representación esquemática de la ubicación de los diferentes fragmentos del gen bip/hsp70 de T. vivax clonados en pET160.

T7 s/ inserto = 342 pb T7 c/ inserto (246) = 588 pb T7 c/ inserto (II)1972 = 2314 pb T7 c/ inserto (318) = 669 pb T7 c/ inserto (378) = 719 pb

Figura 37: Registaro fotográfico de las amplificaciones con ADN plasmídico del vector recombinante pET160 y con los oligonucleótidos T7. Se puede apreciar, la fuerte señal de las amplificaciones de los diferentes clones Tv_BiP/pET160, donde la gran mayoría de ellos presentan el tamaño esperado.

118 Por las dificultades anteriores se cambió las BL21 (DE3), por las E. coli Rosetta que también son BL21 (DE3) (Anexo 1). A diferencia de las primeras, éstas células llevan el plásmido pRARE que expresa 6 tARN raros ó de baja frecuencia para E. coli y como las proteínas que se quiere expresar son heterólogas para E. coli, la expresión es muy baja o nula, tal como nos demuestra el análisis realizado en http://www.doe-mbi.ucla.edu/%7Esumchan/caltor.html y http://www.genscript.com/cgi-bin/tools/rare_codon_analysis. De este análisis se obtuvo que la secuencia nucleotídica del gen de la proteína completa BiP/Hsp70 de T. vivax, presenta codones para Glicina (GGG) que son raros para E. coli y que además se repiten 18 veces en la secuencia; así como también el codón de Treonina, que se repite 31 veces. En la figura 39, se puede observar que estos codones también se encuentran consecutivos en algunas partes de la secuencia, lo que hace aún más difícil la expresión.

En la transformación de las E. coli Rosetta™, se utilizaron los plásmidos recombinantes que amplificaron en la PCR con los oligonucleótidos específicos y confirmados por la secuenciación. También se ligaron algunos productos de PCR purificados que no se habían clonado anteriormente, pero para esta ligación, se añadió 0,1 µl de la enzima ligasa a la reacción de ligación con los vectores pET 100 y pET160, porque previo a esta ligación, se realizaron otras que no dieron resultados satisfactorios. Posiblemente con el tiempo, los vectores habían perdido un poco su capacidad de ligación por parte de la Topoisomerasa. De esta mantera se pudo tener la ligación exitosamente para luego ser transformado en las bacterias Rosetta™.

119

Figura 38: Registro fotográfico de la electroforesis en gel de agarosa al 1% de la PCR con el ADN genómico de T. vivax y el ADN plasmídico pET160 recombinante con los oligonucleótidos específicos. Se pueden apreciar las bandas de los productos amplificados con el tamaño esperado y sin amplificaciones inespecíficas.

Figura 39: Análisis de la presencia de codones de baja frecuencia en E. coli de la proteína BiP/Hsp70 de T. vivax. Utilizando las direcciones: http://www.genscript.com/cgi-bin/tools/rare_codon_analysis y http://www.doembi.ucla.edu/~sumchan/caltor.html, se pudo obtener el número de codones de baja frecuencia en E. coli (en colores) de la secuencia nucleotídica del gen Tv-bip/hsp70 de T. vivax.

120 7. Transcripción de la proteína BiP/Hsp70 de T. vivax Se tomaron 10 ml de los cultivos de los clones transformantes de Rosetta™ que crecieron en medio LB selectivo con 100 µg/ml de ampicilina y 34 µg/ml de cloranfenicol e inducidos con 1mM de IPTG. Se les realizó un PCR a partir del ADN plasmídico para comprobar la presencia del inserto en los clones respectivos. Además, se llevó a cabo la extracción del ARN con ficoll, se midió su concentración y la pureza (Tabla XV) y posteriormente se realizó una electroforesis para confirmar la presencia del ARN (Figura 40). Luego, a estas muestras de ARN se les realizaron RT-PCR para su obtención del mARN y así realizar una PCR con los oligonucleótidos específicos; de esa forma constatar si hubo o no la transcripción de las mismas (Figura 41).

Tabla XV.- Concentración de ARN (µg/ml) y la obtención de la pureza (A260/A280). Para la medición de la concentración se tomó en cuenta que 1 unidad de A260 de ssRNA son 40 µg/ml. Muestra

Concentración (ug/ml)

Pureza (A260/A280)

253a-1

5083,2271

1,7

P2-1-2

5798,0220

1,7

384-4

5628,7769

1,7

324-6

5640,4883

1,7

Rosetta

6646,0850

1,7

8. Expresión de la proteína BiP/Hsp70 de T. vivax. A los clones transformantes en E. coli Rosetta™, que crecieron en medio LB selectivo con ampicilina y cloranfenicol y que dieron positivo en la prueba de la PCR anidada a partir del ADN plasmídico y también por PCR a partir del cDNA, se les determinó la cinética de crecimiento en las cinco primeras horas (T0 – T5) después

121 de la inducción con 1mM IPTG. Como se puede apreciar en la Figura 42, el IPTG detiene notablemente la velocidad de crecimiento, tal y como lo menciona Vilar y col. (2003).

23S 16S

Figura 40. Registro fotográfico de la electroforesis del ARN en geles de agarosa con Bromuro de etidio al 1%. Con esta electroforesis se pudo identificar el ARN de los clones recombinantes r253a-1, rp2-1-2, r384-4, r324-6 y de la E. coli Rosetta™ sin el inserto. Se pueden apreciar las bandas correspondientes al rRNA con dos de sus coeficientes de sedimentación (S), 23S y 16S.

Figura 41. Registro fotográfico de la electroforesis en gel de Agarosa de los productos de PCR con cADN y ADN plasmídico. Se puede apreciar el producto amplificado de ~2000 pb con el cADN y ADN plasmídico del gen completo proveniente del clon recombinante p2-1-2 y el amplicón de tres fragmentos recombinantes del gen, 253a-1pb, 324-6pb y 1129-1pb con cADN.

122

Figura 42 Crecimiento bacteriano en la expresión con y sin inducción con 1mM IPTG, a 37°C de los clones 324-6, 253a-1, 384-4, p2-1-2 y E. coli Rosetta sin inserto (control negativo) con 1 h de intervalo. Se puede apreciar que a medida que aumenta el tiempo de incubación, las células con IPTG detienen su tasa de crecimiento, no así los cultivos que no llevan IPTG.

123 9. Electroforesis en geles de poliacrilamida de la rBiP/Hsp70 de T. vivax y sus fragmentos en condiciones disociantes. Para los fragmentos pequeños de la proteína, generados por los clones recombinantes 253a-1, 324-6 y 384-4 inducidos con 1mM de IPTG, el análisis en geles de poliacrilamida en condiciones disociantes al 20% de acrilamida de las células lisadas, nos muestra una banda de menor tamaño (~ 14 kDa) con mayor intensidad, específicamente en los carriles 2 y 11 de la figura 43, panel A; correspondientes a la fracción soluble, dializado y sin dializar, respectivamente, del clon r253a-1. 10. Inmunodetección de los residuos de histidina de la proteína recombinante BiP/Hsp70 de T. vivax.

Para la identificación de la proteína recombinante expresada, se transfirieron los polipéptidos a una membrana de nitrocelulosa de 0,45 µm y para su comprobación de tal transferencia se tiñó con el colorante Rojo Ponceau S (Figura 43, Panel B). Consecutivamente se realizó una inmunotinción (Western blot), utilizando el anticuerpo primario anti-histidina proveniente de ratón (1/2000) y como anticuerpo secundario un anti-IgG de ratón acoplada a Peroxidasa; con ello se logró detectar una banda de mayor intensidad de aproximadamente 14 kDa, indicando que posiblemente estamos en presencia de la proteína parcial recombinante. En la figura 43, panel C se observa dicha banda tanto en las fracciones solubles dializadas y no dializadas, así como también en los homogenatos con y sin diálisis del polipéptido recombinante 253a-1/BiP a diferencia de los otros clones. Con lo que se demostró una vez más que sólo uno de los polipéptidos recombinantes pudo ser expresado. 11 Purificación de la proteína rBiP/Hspp70 de T. vivax por una columna de afinidad a Ni. Teniendo en cuenta los resultados de la inmunotinción con anti-histidina, se decidió tomar sólo el material soluble, dializado y concentrado del polipéptido

124 recombinante 253a-1/BiP. Se extrajo 600µl (1,668 mg) de este material y se incubó con la resina de Ni, con agitación suave toda la noche a 4°C; el material no enlazado (FT) fue lavado con el tampón de lisis B con 2 mM de Imidazol. La proteína unida se eluyó con 20 mM, 40 mM y 60 mM de imidazol.

El material purificado se analizó por electroforesis en geles de poliacrilamida seguido de una inmunotinción para confirmar la presencia del polipéptido 253a-1/BiP marcado con histidina eluido con 20, 40, 60, 80, 100, 150 y 200 mM de Imidazol.

Teniendo uno de los clones recombinantes, 253a-1/BiP, expresado, se llevó a cabo su purificación utilizando cromatografía de afinidad, mediante, una columna de níquel. Luego de varios ensayos, se logró estandarizar la purificación, del polipéptido recombinante 253a-1 de la proteína BiP/Hsp70 de T. vivax. La proteína fue eluida empleando concentraciones crecientes de imidazol hasta llegar a 60 mM de Imidazol en el tampón de elución; pasada de esa concentración, la proteína dejó de eluir.

En la inmunodetección con el anticuerpo anti-histidina (1/2000), se evaluaron los materiales obtenidos en cada paso de la purificación, desde el extracto bacteriano inducido con IPTG hasta los eluatos con las diferentes concentraciones de Imidazol. En la figura 40 se puede apreciar a la proteína parcial detectada con el anticuerpo anti-histidina, hasta la fracción eluida con 60mM de imidazol; mayor de esta concentración ya no se detecta la banda correspondiente al polipéptido recombinante 253a-1/BiP, siendo esta de ~14 kDa.

La presencia de las bandas inespecíficas, aunque tenues, podría deberse a la interacción de esta proteína HSP con otras proteínas a través de su porción de 17 kDa en el dominio C- terminal, el cual es el sitio de unión a péptidos (función de

125 chaperona); además, mediante este sitio también se favorece la formación de agregados de la proteína (oligomerización) (Fouchaq y col, 1999; Charalampos y col, 1999). Por otro lado, es bien sabido que el anticuerpo anti-histidina no es completamente específico para la proteína recombinante marcada con una cola de histidina, ya que podrían estar presentes algunas proteínas de la bacteria que presenten secuencias, aunque cortas, de histidina.

Como en todas estas fracciones (figura 44, carriles del 4 al 15), la proteína fue eluida casi pura; se agruparon todos estos eluatos para los siguientes ensayos inmunológicos y se midió la concentración de proteínas utilizando el fluorómetro de Qubit™, obteniéndose una concentración de 2,17 mg/ml.

126

Figura 43. Registro fotográfico del análisis electroforético en geles de poliacrilamida al 20% en condiciones disociantes teñida con nitrato de plata, transferencia a una membrana de nitrocelulosa de 0,45 µm y la detección de polipéptidos por inmunotinción con el anticuerpo anti-histidina de los clones recombinantes 253a-1, 324-6 y 384-4: Panel A, gel de poliacrilamida teñida con nitrato de plata: Carril: (1) Control negativo, Homogenato de E. coli Rosetta sin inserto con inducción a 42°C/ON, (2) Fracción soluble dializado del clon 253a-1, (3) F. soluble dializado del clon 324-6, (4) F. soluble dializado del clon 384-4, (5) Homogenato dializado del clon 253a-1, (6) H. dializado del clon 324-6, (7) H. dializado del clon 384-4, (8) H. sin dializar del clon 253a-1, (9) H. sin dializar del clon 324-6, (10) H. sin dializar del clon 384-4, (11) F. soluble sin dializar del clon 253a-1, (12) F. soluble sin dializar del clon 324-6, (13) F. soluble sin dializar del clon 384-4 y (14) MPM. Paneles B y C, Transferencia a papel de nitrocelulosa, teñido con Rojo Ponceau S e Inmunotinción con el anticuerpo anti-histidina, respectivamente: (1) Control negativo, (2) F. soluble sin dializar del clon 253a-1, (3) F. soluble sin dializar del clon 324-6, (4) F. soluble sin dializar del clon 3844, (5) H. sin dializar del clon 253a-1, (6) H. sin dializar del clon 324-6, (7) H. sin dializar del clon 384-4, (8) F. soluble dializado del clon 253a-1, (9) F. soluble dializado del clon 324-6, (10) F. soluble dializado del clon 384-4, (11) H. dializado del clon 253a-1, (12) H. dializado del clon 324-6, (13) H. dializado del clon 384-4, (14) MPM, (15) Control positivo, rMSP5 de A. marginale. 126

127

Figura 44: Registro fotográfico de la Inmunotinción de las fracciones purificadas por cromatografía de afinidad en columna de níquel y luego de haber sido separadas en geles de poliacrilamida (20%) en condiciones desnaturalizantes. Se presentan las bandas inmunodetectadas por el anticuerpo primario anti-histidina (1/2000) en el extracto bacteriano inducido con IPTG (Figura 40, panel A) y eluído por la columna de afinidad a níquel a varias concentraciones de Imidazol (20 a 200mM). 127

128 12 Determinación de la antigenicidad del Fragmento recombinante rBip/Hsp70 por la técnica de ELISA indirecta e Inmunotinción. A la unión de todas las fracciones de la purificación por la columna de afinidad al níquel en donde la proteína parcial recombinante 253a1/BiP fue detectada, se le realizó la determinación de la concentración de proteína por el fluorómetro de Qubit™ (Invitrogen®), siendo esta de 2,78 mg/ml. - Elisa Indirecto Para estos ensayos se utilizó un suero proveniente de un bovino al que se le realizó una esplenectomía e infectado experimentalmente con T. vivax, aislado LIEM176/Trujillo y como controles negativos, un suero proveniente de un ternero recién nacido que aún no había tomado el calostro de la madre (suero Agammaglobulinémico), por lo que no debería tener anticuerpos y un suero pre inmune de un bovino adulto, previo a la infección experimental con T. vivax, aislado LIEM.

Se

ensayaron

diferentes

concentraciones

del

antígeno

(polipéptido

recombinante 253a-1/BiP) y diferentes diluciones del conjugado policlonal, anti IgG de bovino conjugado a Peroxidasa de Rábano Picante. En este primer ensayo, la concentración óptima del antígeno fue la de 10 µg/ml y la dilución del conjugado entre 1/500 y 1/1000; no obstante, las lecturas con el suero negativo eran ligeramente elevada, por lo que se decidió evaluar otras condiciones (Figura 45).

En el siguiente ensayo, se ensayaron dos sueros bovinos, un positivo y otro negativo. Se evaluaron dos diluciones del suero, 1/100 y 1/200, dos diluciones del conjugado, 1/2000 y 1/2500 y tres soluciones de bloqueo y diluente de suero: 0,5% de gelatina, 0,5% de ovalbúmina (OVA) y 0,5% OVA-2% Suero de conejo sano; todos diluidos en PBS-Tween. La composición que daba una diferencia significativa entre el positivo y el negativo (~12 veces), se obtuvo al combinar 0,5 ug/ml de antígeno, 1/100 la dilución del suero, 1/2500 del conjugado anti-IgG bovino acoplado a peroxidasa y con la solución de bloqueo y diluyente de suero, 0,5% OVA-2% Suero de conejo; aunque con la solución de bloqueo 0,5% OVA también dio una

129 considerable diferencia entre el positivo y el negativo, había un ligero incremento en la absorbancia con el negativo (figura. 46).

Teniendo una vez

todas

las

condiciones

óptimas

para

el

ensayo

inmunoenzimático, se decidió realizar el ensayo con la dilución del suero 1/200, quedando la combinación de: 0,5 µg del antígeno recombinante, solución de bloqueo: PBS-Tween, 0,5% OVA y 2% Suero de Conejo, dilución del suero 1/200 en la solución de bloqueo, 1/2000 la dilución del conjugado anti IgG de bovino diluido en PBS-Tween y 5 lavados de 5 minutos cada uno. Se procedió a evaluar 26 sueros de bovinos infectados experimentalmente con T. vivax; 7 son sueros pre-inmunes (negativos) y 19 son sueros post-infección (positivos). En la figura 47, se presenta graficado los diferentes valores de densidad óptica (405nm) de los sueros problemas a los 60 minutos de incubación y se puede apreciar la diferencia entre los sueros positivos y negativos, aunque también se presentan algunos sueros positivos con valores relativamente bajos, como es el caso del suero 4255 cuya D.O. (405nm) es de 0,362 y el suero negativo con mayor señal es la muestra 4604 con un valor de 0,343. Cabe mencionar que los controles en todos estos ELISA indirecto daban valores de D.O. menores o igual a 0,1, excepto el control de bloqueo (a), que pareciera que el suero se pega a la placa de forma más covalente, ya que este valor es de 0,254 a diferencia de los otros controles como el control del antígeno (b) cuya absorvancia dio 0,119 y el del control del conjugado (c), 0,114.

130

Figura 45: Estandarización de la concentración del antígeno y del conjugado en el ELISA indirecto con el polipéptido recombinante 253a-1 de la proteína Bip/Hsp70 de T. vivax como antígeno para la detección de anticuerpos de un bovino infectado experimentalmente con T. vivax, aislado LIEM176. Los controles son: a) sin Ag, con Ac primario (suero positivo) y con Ab secundario); b) con Ag, sin Ac primario, con Ac secundario; c) solo con Ac secundario; d) sin Ac secundario, con Ag y Ac primario, e) solo con Ac primario, f) solo con Ag.

130

131

ELISA indirecto con r253a-1/BiP a los 30 min. 2,0 1,8 1,6 1,4 1,2 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 0,0

1,810

1,756 1,417

1,351 1,015

1,003 0,579

0,647

0,597

0,753 0,518 0,300 0,155 0,092

0,323 0,196 0,136 ( +)

(-) Gel 0,5%

( +)

(-) OVA 0,5%

0,489

0,664 0,076 0,118 0,008

( +)

(-)

0,5% OVA-2% S. Conejo

Ag 0,5 µg/ml Ac2°: 1/2000 Ac1°:1/100

Ag 0,5 µg/ml Ac2°: 1/2000 Ac1°:1/200

Ag 0,5 µg/ml Ac2°: 1/2500 Ac1°:1/100

Ag 0,5 µg/ml Ac2°: 1/2500 Ac1°:1/200

Figura 46: Estandarización de la dilución del suero, concentración del conjugado y solución de bloqueo en el ELISA Indirecto con el polipéptido recombinante r253a-1/BiP. Con cada solución de bloqueo se utilizaron: 0,5 µg/ml de antígeno, 1/2000 del Anticuerpo secundario (anti-IgG de bovino acoplada a la Peroxidasa), diluciones del suero, 1/100 y 1/200. Se puede observar la diferencia significativa entre el suero positivo y negativo, siendo la mejor, la tercera combinación.

131

132

Figura 47: Elisa Indirecto con el polipéptido recombinante r253a-1 utilizando sueros experimentales infectados con T. vivax. Las lecturas de este gráfico corresponden a los 60 minutos de incubación con el sustrato, donde los controles son: a, sin antígeno, con anticuerpo primario positivo y con anticuerpo secundario; b, con antígeno, sin anticuerpo primario, con anticuerpo secundario; c, sin antígeno, sin anticuerpo primario y con anticuerpo secundario; d, con antígeno, con anticuerpo primario y sin anticuerpo secundario; e, sin antígeno, con anticuerpo primario y sin anticuerpo secundario; f, con antígeno, sin anticuerpo primario y sin anticuerpo secundario. La concentración del antígeno, 0,5 µg/ml. La muestra de campo es el suero negativo La Loma 22 (LL, gentilmente donado por el laboratorio del profesor Dr. José Bubis) y el resto de las muestras provienen de 2 animales experimentales infectados con T. vivax (aislado LIEM/Trujillo) tomadas antes y después de la inoculación. También se puede observar los días que fueron tomadas las muestras durante el experimento (negativos, pre-infección y positivos, postinfección).

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133 - Inmunotinción: En este ensayo se evaluaron 16 sueros de bovinos, de los cuales algunos de ellos se incluyeron en el ELISA indirecto indicados en el punto anterior. Además se incluyeron dos sueros de bovinos infectados experimentalmente con otros hemoparásitos, Anaplasma marginale y Babesia bovis con la finalidad de evaluar la existencia o no de reactividad cruzada con estos parásitos.

En la figura 48, se puede observar la presencia de una única banda en las tiras de nitrocelulosa que contenían el polipéptido recombinante r253a-1/BiP enfrentadas a sueros positivos; las tiras que no presentan la banda corresponden a las incubadas con los sueros negativos o con sueros provenientes de infecciones con otros hemoparásitos (A. marginale y B. bovis). Es importante señalar, que par esta corrida, la electroforesis se detuvo cuando el frente estaba por la mitad del gel, es por ello que la banda que aparece en la inmunotinción se encuentra en esa posición.

Este antígeno recombinante, 253a-1/BiP, fue reconocido por los sueros de los bovinos infectados con T. vivax a partir del 5-6 día de la infección, manteniéndose seropositivos hasta el ultimo día del muestreo (Bovino 913, día 51 ó Bovino 616, día 46). Además se demostró ser específico para la infección por tripanosoma, ya que no es reconocido por sueros de bovinos infectados con los hemoparásitos indicados. 13 Determinación de la antigenicidad de los péptidos sintéticos por la técnica de Inmunotinción.

En el presente trabajo, se seleccionaron cuatro regiones altamente antigénicas de la proteína BiP/Hsp70 del T. vivax, para sintetizar los péptidos correspondientes a estas cuatro regiones. Estos Péptidos Sintéticos (PS) fueron diseñados por el Laboratorio Nacional de Proteómica e Inmunoquímica de Proteínas, en el IMT de la

134 UCV, los cuales son: IMT-1883 (L273 – A287), IMT-1886 (R347 – E361), IMT-1887 (E473 – E487) e IMT-1888 (N614 – Q628). A continuación se muestra la ubicación de estos péptidos sintéticos en la secuencia de aminoácidos de la proteína BiP/Hsp70 de T. vivax:

MAKAMRLAAA ALLLVAAATG AWAAPEASGK VEAPCVGIDL GTTYSVVGVW QKGDVHIIPN EMGNRITPSV VAFTETERLI GDGAKNQLPQ NPHNTIYTIK RLIGRKYSDP AVQADKKLLS YEVVADRDGK PKVQVTLGGK KKEFTPEEVS AMVLQKMKEI AETYLGEKVK NAVVTVPAYF NDAQRQSTKD AGTIAGLNVV RIINEPTAAA IAYGLNKAGE KNILVFDLGG GTFDVSLLTI DEGFFEVVAT NGDTHLGGED FDNNMMRYFV DMLKKKRNVD VSKDQKALAR LRKACEAAKR QLSSHPEARV EVDSLTEGFD FSEKITRAKF EELNMDLFKG TLVPVQRVLE DAKLKKSDIH EIVLVGGSTR VPKVQQLISD FFGGKELNRG INPDEAVAYG AAVQAAVLTG ESEVGGRVVL VDVIPLSLGI ETVGGIMTKL IERNTQIPTK KSQVFSTHAD NQPGVLIQVY EGERQLTKDN RLLGKFELSG IPPAPRGVPQ IEVTFDVDEN SILQVSAVDK SSGKKEEITI TNDKGRLSEE EIERMVREAA EFENEDRKVR ERVDARNTLE SVTYSLRSQV NDKDKLGGKL SADEKSTVEA AVKEAIRFLD ENPNAEKEEY DAAREKLQGV TNPIIQKAYQ AGGEKPQPMD DL

La pureza de estos péptidos sintéticos (PS), fue comprobada por cromatografía en fase reversa (RP-HPLC) y fueron caracterizados por espectrometría de masas MALDI-TOF (del inglés, Matrix-Assisted Laser Desorption of Ions Time-of-Flight), corroborando que las masas moleculares experimentales se correspondan con las calculadas.

La capacidad antigénica de los péptidos sintéticos fue evaluada en el ensayo de Inmunotinción, donde se incluyeron cuatro sueros que fueron utilizaron en el ELISA indirecto con el polipéptido recombinante 245a-1/BiP, que son: La Loma 22 (suero de un bovino de campo), 4225 (suero del bovino experimental 616, esplenectomizado, a los 56 días antes de su infección con T. vivax), 4270 (suero del

135 bovino 616 a los 19 días post-infección) y el suero 4628 (proveniente del bovino experimental (N°913), al que se le realizó una esplenectomía, a los 12 días post infección). En la figura 49, se puede observar una única banda con el frente de la corrida electroforética y transferidas a tiras de nitrocelulosa incubadas con los sueros positivos, no así las tiras que se incubaron con los sueros negativos. Cabe mencionar que estas bandas están muy al frente de la corrida por que como su peso molecular es de casi 2 kDa (IMT-1883, 1757.10 Da; IMT-1886, 1781.3 Da; IMT-1887, 1847.2 Da e IMT-1888, 1793.9 Da), ellas bajan con el frente y, para lograr que no se salgan del gel de poliacrilamida, se detuvo la corrida a la mitad del tiempo (~ 1 hora).

Estos resultados de la inmunotinción (WB) con los sueros de bovinos, experimentales y de campo, coinciden con los resultados en el ELISA indirecto con el polipéptido recombinante 245a-1/BiP, en donde también, los sueros La Loma 22 y 4225 dieron negativo y los sueros 4270 y 4628 dieron positivo.

Figura 48: Determinación de la antigenicidad del polipéptido recombinante 253a-1/BiP mediante el “Western blot”. Se presentan tiras de nitrocelulosa con el polipéptido recombinante 253ª-1/BiP transferido é incubadas con sueros bovinos días antes (-) y días después (+) de la infección experimental con T. vivax. Se muestra, la D.O. (405nm) de estos sueros en el ELISA indirecto, concordantes con los resultados de la inmunotinción.

136

Figura 49: Determinación de la antigenicidad de los péptidos sintéticos correspondientes a la proteína BiP/Hsp70 de T. vivax por la técnica de Inmunotinción. Se muestra las tiras de nitrocelulosa en donde los PS fueron separados por una electroforesis en un gel de poliacrilamida (17%) en condiciones disociantes y transferidos a membranas de nitrocelulosa e incubados con sueros positivos y negativos evaluados anteriormente en el ELISA indirecto. Se aprecia el reconocimiento de los sueros positivos a cada uno de los PS. Estos resultados se comparan con la D.O. (405nm) de estos sueros en el ELISA indirecta.

137

138

IV. DISCUSIÓN Purificación de T. vivax. En general, los aislados de T. vivax no crecen en roedores, por lo tanto, para obtener tripanosomas es necesario mantenerlos en el ganado ovino o bovino; especies hospederas en los cuales la separación de los parásitos de las células sanguíneas es bastante difícil. Hasta la fecha, varios métodos se han descrito para la purificación de T. vivax, basados en que los tripanosomas presentan una mayor carga negativa en su superficie, debido a la presencia del ácido siálico asociado con glicoproteínas, glicolípidos y grupos fosfatos (Souto-Padrón, 2002). Según Lanhm (1968), mencionado en la publicación de Thaïs Souto-Padrón (2002), la diferencia de especies de las distintas formas de cepas sanguíneas de los tripanosomas podría estar dada por el siguiente orden de negatividad en la superficie:T. cruzi > T. lewisi > T. vivax > T. congolense > T. rhodesiense, T. gambiense, T. brucei y T. evansi; por lo tanto, la carga negativa presente en la superficie del T. vivax se asemeja a la del eritrocito, lo que hace que sea muy difícil su purificación por la metodología descrita por Lanham & Goodfrey, (1970), mediante cromatografía de intercambio aniónico (DEAE-celulosa), que se basa en la diferencia de carga eléctrica entre la superficie de eritrocitos y membrana celular del tripanosoma. Sin embargo, este procedimiento permite la separación del T. evansi en forma muy eficiente pero no así para T. vivax. Se han reportado el método usando un gradiente de Percoll® (Ndao et al., 2004) y el método combinado de Percol®l y DEAE-celulosa (González et al., 2005); en este trabajo utilizaron un sistema de purificación de T. vivax a partir de sangre total de ovino, combinando un gradiente de Percoll y una columna de DEAE-Celulosa, llegando a obtener un rendimiento entre 11 y 15%. Esto posiblemente se deba a que los tripanosomas pasan por cambios externos, afectando su motilidad y viabilidad, lo cual hace que muchos de ellos permanezcan adheridos en la columna. Es por ello que uno de los puntos importantes en la purificación, descrita en la presente tesis, es la relación

139 entre resina (20 a 30 ml de resina empacada) y muestra (~5 ml de sangre) puesta en la columna, porque se observa que mientras más grande es la muestra con relación a la resina, más tardan en eluir los parásitos y por ende la viabilidad disminuye. Tampoco se puede colocar menos resina, porque los eritrocitos siempre tienden a bajar un poco por la columna los eritrocitos, hasta que dejan de eluir; a diferencia de los tripanosomas que también están cargados negativamente, pero con ayuda de la solución de elución (Krebs), se facilita su trayectoria hasta su elución, conservando su viabilidad e infectividad.

Un aspecto significativo fue el uso de la solución tampón. Por ejemplo, Madruga et al. (2006) obtienen un rendimiento muy pobre utilizando el protocolo de Lanham & Goodfrey (1970). También ocurrió en nuestras manos, además de que parte del material eluído venía contaminado con glóbulos rojos. Por tal motivo se buscó otras soluciones diferentes y pH diferentes, resultando la más destacada la solución de Krebs modificada a pH 7,2. Cabe mencionar que en los primeros ensayos de la purificación del T. vivax, la solución tenía CaCl2 (2,5mM) dentro de sus componentes, que promovía la formación de un coágulo en el plasma y con ello quedaban atrapados la gran mayoría de los tripanosomas y por ende, no podían ser purificados. Ello se debió a que en el plasma se encuentran las plaquetas y proteínas que intervienen en la coagulación, como es el caso del fibrinógeno, el cual se convierte en fibrina en presencia de los factores de coagulación, como es el calcio. Esta fibrina es insoluble y forma unos filamentos muy finos que forman una red, dando lugar a la formación del coágulo, (Coronell, et al. ,2004 y Hendler, 2004). Por tal motivo, decidimos retirar este reactivo en la preparación de la Solución de Krebs y con esto se resolvió el problema de la coagulación del plasma conteniendo gran parte de los tripanosomas, porque comprometía también a la capa blanca.

140 Las purificaciones con la columna cromatográfica de intercambio aniónico, DEAE-Celulosa utilizando la solución de Krebs modificada, se logró llegar a valores de hasta 91,26% de rendimiento (Tabla XII).

Durante la realización del presente trabajo se observó que con parasitemias altas (~1x107 tripanosomas/ml), la obtención de Trypanosoma vivax a partir del plasma (Madruga, 2006), se mejora al añadirse 0,5% de glucosa al plasma (w/v), lo cual eleva un 50% el número de tripanosomas libres en este fluido que se obtienen por simple centrifugación a 1.811 x g (centrífuga eppendorf, 5810R).

Criopreservación de T. vivax. El criopreservar con 20% glicerol o con 10% DMSO fue igual porque con ambos los resultados fueron exitosos; lo importante fue la glucosa que se le añadió luego de retirar el vial del nitrógeno líquido. Se comprobó que después de la descongelación, los tripanosomas rápidamente se recuperaban al añadirle aproximadamente 0,2 mg/ml de glucosa y por ende, la posibilidad de que disminuyan su motilidad era menor.

Por otro lado, la glucosa como fuente de carbono, utilizada tanto para la purificación como en el momento de la descongelación de los tripanosomas, se comprobó que es esencial para su recuperación y supervivencia.

Diseño

de

oligonucleótidos

degenerados.

Los

oligonucleótidos

degenerados fueron diseñados en base a la gran homología que presentan las HSP70 entre los tripanosomatídeos, por lo que se tomó en cuenta las regiones conservadas de las secuencias de aminoácidos de las proteínas, p69 y Grp78/Bip (T. congolense y T. brucei, respectivamente) y el mayor porcentaje de uso de los codones de T. vivax; luego, se probó con diferentes concentraciones de

141 oligonucleótidos, MgCl, dNTP y diferentes temperaturas. Así como Sakanari et al. (1989) reportaron que en condiciones tan permisivas como la temperatura de alineación de 25°C, el PCR puede neutralizar el efecto de la degeneración de los cebadores y permitir la amplificación de los fragmentos específicos, así también, a pesar del alto contenido de GC, con 54°C, se logró amplificar el gen bip/hsp70 de Trypanosoma evansi, dando como resultado una sola banda cercana a los 2000pb (Fig. 22) que, luego de su secuenciación, reflejó un 99% de homología con la secuencia nucleotídica del gen grp78/bip de T. brucei; por lo que se infiere que se trata del gen de la proteína BiP/Hsp70 de T. evansi. Este resultado corrobora una vez más la gran homología que hay entre el genoma de T. brucei con el de T. evansi. Canelón et al. (2003), Lai et al. (2009), entre otros, sostienen que el T. evansi evolucionó a partir de T. brucei, al adaptarse a un modo de transmisión mecánica. En el caso de la amplificación del gen de la proteína BiP/Hsp70 de T. vivax con estos oligonucleótidos degenerados que acotan para la región ORF y fuera de ella, se logró una amplificación de cuatro bandas (1.500pb, 650pb, 450pb y ~2500pb), quizás debido a la hibridación falsa o no específica por ser altamente degenerados y, probablemente, el templado podría contener muchos sitios de alineamiento con dichos oligonucleótidos.

El presente trabajo evidencia que la proteína BiP/Hsp70 de T. vivax muestra diferencias significativas en la secuencia aminoacídica del N-terminal (primeros 30 aa) y menor diferencia en el C-terminal (últimos 32 aa) con respecto a la proteína BiP/Grp78 de T. brucei y la proteína P69/Hsp70 de T. congolense; haciendo presente que entre estas dos últimas, el porcentaje de homología es del 84%.

Por lo tanto, posiblemente, también presente diferencia en su secuencia nucleotídica fuera de la región codificante (aún no publicada en GeneDB (http://www.genedb.org) ó en el GeneBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/); y

142 por ende, la probabilidad de que hibridaran estos oligonucleótidos degenerados en el ADN de T. vivax, era baja.

Oligonucleótidos específicos.- La amplificación con los oligonucleótidos específicos para la secuencia codificante del gen completo y las combinaciones con otros oligonucleótidos diseñados a partir de regiones internas (Fig. 24, Tabla XIV), dieron lugar a la obtención de la secuencia completa del gen bip/hsp70 de T. vivax (Anexos 6 y 7). El diseño de estos fragmentos internos tuvo un doble propósito para alguno de ellos; es decir, a parte de la construcción de la secuencia completa del gen, era su clonación; en vista que especialmente acotaban regiones de más antigenicidad en la secuencia aminoacídica (Anexo 8). Dependiendo de las combinaciones de oligonucleótidos, se obtuvieron bandas del tamaño esperado (Figura, 24) como producto de la amplificación por PCR, que luego fueron exitosamente clonadas y transcritas (Fig. 41).

Análisis de secuencia aminoacídica. En el análisis comparativo de identidad de la secuencia real de la proteína Bip/Hsp70 de T. vivax, obtenida en el presente trabajo, con las secuencias de las proteínas homólogas Grp78/Bip y P69 pertenecientes a T. brucei y T. congolense, respectivamente, nos demostró que al menos dentro de los primeros 30 aminoácidos el porcentaje de homología entre ellas es relativamente baja (Anexos 7 y 9), siendo del 45% y 68% con respecto a la proteína BiP/Grp78 de T. brucei y a la proteína P69/Hsp70 de T. congolense y presenta una menor diferencia en el C-terminal con respecto a los últimos 32 aa de la proteína BiP/Grp78 de T. brucei (75% de identidad) y de la proteína P69/Hsp70 de T. congolense (65% de identidad) . Las regiones aminoacídicas más extensas con el 100% de homología entre las secuencias, Tv_BiP/Hsp70, Tb_Grp78/BiP y Tc_P69 están ubicadas entre los aminoácidos: G29-T74, S150-R267, E296-L342, V363E431, F455-L488 y D519-E553 (Anexo 9). Por lo tanto, si desde el aminoácido M1 al E473 se considera la región N- terminal, entonces, se podría decir que los dos tercios

143 amino-terminales de esta proteína están mucho más conservadas que la región carboxi- terminal. (Bangs et al., 1993; Boulangé et al., 2002; Bannai et al., 2003; Bossard et al., 2003; Bossard et al., 2010).

En el análisis de secuencia, también se observó que desde el aminoácido M1 al A23 se encuentra el péptido señal de importación al retículo endoplasmático (XXXLLLXX), indicando que son proteínas dependientes de ATP, y desde el aminoácido G83 al F144 corresponde a la secuencia de la enzima cianato liasa (cinasa), PERK; lo que parece indicar que se trata de una proteína que también pudiera intervenir cuando el retículo endoplasmático está en estrés; es decir, que bajo estas circunstancias pudiera intervenir en la suspensión de la traducción general de proteínas.

Ellas también presentan, en su extremo C- terminal, la secuencia señal de retención en esta organela, MDDL; característica que le hace diferente al resto de las proteínas BiP estudiadas en otros eucariotas (Bangs et al.1993).

Obtención de la proteína recombinante, rBiP/Hsp70. Se puede observar en la figura 38 que en el crecimiento bacteriano tras la inducción con IPTG, la tasa de crecimiento celular disminuyó probablemente porque gran parte de la energía celular se destina a esta producción. Esta característica se observó con ambas cepas de E. coli, BL21 (DE3) y BL21 (DE3)-Rosetta®, pero la diferencia entre ambas fue que con las BL21 (DE3) la proteína no se podía expresar, sólo se transcribía probablemente debido a que, por tratarse de una proteína heróloga, tenía en su secuencia codones de baja frecuencia para la bacteria. Esto coincide con numerosos estudios que han revelado que los codones de baja frecuencia o raros y los grupos de estos codones (dos o más juntos en la secuencia) son capaces de causar problemas en la

144 expresión como la calidad y la cantidad de la proteína recombinante (Kane, 1995; Gurrich et al.2005).

Estos problemas ocurren principalmente a nivel de la traducción antes que en los niveles de la transcripción, es decir, estos codones aislados o agrupaciones de codones de baja frecuencia, conllevan a la presentación de problemas; manifestados como una reducción en la traducción del gen en estudio, expresión baja o indetectable, aminoácidos mal incorporados, polipéptidos truncados o les ocurre una deleción y así son sintetizados o simplemente no llegan a sintetizarse (Chen et al.2006). Por lo tanto, se cambió de cepa hospedadora por la E. coli, BL21 (DE3)Rosetta®, la cual tiene la ventaja de llevar al plásmido pRARE, que expresa ciertos tRNA que no son comunes para E. coli; estos son: AGG/AGA, CGG (arginina), AUA (isoleucina), CUA (leucina), CCC (prolina) y GCA (glicina) (Anexo 1). Con esta cepa de E. coli se pudo expresar uno de los fragmentos de la proteína BiP/Hsp70 de T. vivax (253a-1/BiP) (Figuras 43 y 44), resultando ser un polipéptido de significativa antigenicidad (Figuras 35, 45, 62-48).

Los motivos por los cuales los otros clones (324-6, 384-4, 1129-6, pII6-1 y p21-2) no pudieron ser expresados, posiblemente se deba al número de codones de baja frecuencia en E. coli que tampoco los expresaba la cepa Rosetta y que alguno de éstos se repetían 3, 4, 9 y hasta 15 veces en la secuencia, mientras que otros formaban agrupaciones. Entre ellos, estos codones son: CGA (Arg), GGA (Gly), ACG (Thr) y GGG (Gly). Aunado a todo esto, presentaban un bajo valor en el índice de adaptación del codon (CAI); indicando que cuanto más bajo es este número, más alta es la probabilidad de que el gen sea mal expresado. Por lo tanto, el hecho de que E. coli emplee codones raros para su sistema, trae como consecuencia la reducción en la eficiencia de la traducción (anexos 4-6).

145 La temperatura de inducción con la que se obtuvo mayor expresión, fue a 42°C, por toda la noche (ON), sin embargo también hubo expresión a partir de las dos horas post inducción, aunque baja, luego de añadirle el 1mM IPTG (datos no mostrados); pero se prefirió dejar por una incubación más prolongada. Cabe mencionar, que el rango establecido por Lindquist (1986) y también por Morimoto (1993), entre otros, donde indican que la temperatura de inducción de las HSP en E. coli está en el orden de 54 y 50°C y que además, con una exposición prolongada a esas temperaturas, tiene como resultado una traducción sostenida del gen de las HSP. Aunque en nuestro caso, el gen se encuentra bajo el control del promotor T7, cuando se realizó la inducción de la expresión a temperaturas menores (16°C a 37°C); no se tuvo o era muy pobre la expresión (datos no mostrados). También se evaluaron temperaturas de 45°C y de 50°C, pero aumentaba la expresión de otras proteínas de la bacteria, lo cual hacia muy difícil su purificación. Cabe mencionar que temperaturas altas también ayudan a la formación de cuerpos de inclusión y, asimismo si se trata de proteínas heterólogas para el sistema de E. coli, como es el caso del polipeptido recombinante 253a-1/BiP de T. vivax. Esto tiene ventajas y desventajas, como lo menciona Sorensen et al. (2005). El hecho de que estén formando cuerpos de inclusión, ayuda a tener a la proteína con menos proteínas contaminantes, ya que prácticamente se aísla del resto, pero implica llevar a cabo un tratamiento severo para el rompimiento de esos cuerpos de inclusión pudiendo dañar a la proteína.

En consideración a estos planteamientos, en este trabajo se optimizaron varios factores involucrados para este fin, tal es el caso del tiempo de sonicación, de manera tal que no se dañe la proteína ni parte de las colas de histidina que las conforman e incluir un tampón adecuado para lograr la máxima ruptura de estos cuerpos de inclusión sin perjudicar a la proteína y de esa forma, obtener la proteína soluble en las mejores condiciones de integridad posibles.

146 La purificación del polipéptido recombinante, r253a-1/BiP, utilizando una columna de afinidad (Niquel), permitió obtenerla limpia de proteínas contaminantes de E. coli. Esto se facilitó por la elución con bajas concentraciones crecientes de imidazol (Figura 36). En otras purificaciones se evaluaron concentraciones de 150 mM y 250 mM de imidazol, eluídas en un solo paso, que aunque la banda perteneciente a la proteína recombinante presentaba una señal apreciable, con ella también eluían una cantidad considerable de proteínas provenientes de E. coli.

En el ensayo de reconocimiento inmunológico por parte del anticuerpo antihistidina al polipéptido recombinante r253a-1/BiP, en todas las fracciones de la purificación se obtuvo una banda (aunque tenue) de mayor peso molecular (~24kDa) y la esperada de ~14 kDa (9,35 kDa de la proteína + 4,5 kDa de la cola de histidina del vector pET160 = 13,85 kDa) (Figura 43 y 44). Según Fouchag et al. (1999), se debe a que en estas condiciones las proteínas no se ubican en una sola banda (a veces hasta tres, pero siempre una es más intensa), porque la proteína se puede asociar con otras proteínas bacterianas o consigo misma, formando diferentes oligómeros; explicando así su distribución no homogénea. Por lo tanto, se consideró que la banda más intensa era la recombinante, ya que al realizar la inmunodetección con los sueros bovinos infectados experimentalmente con T. vivax (aislado LIEM), éstos solo reconocieron la banda de mayor intensidad (Figura 48).

Determinación de la antigenicidad del polipéptido recombinante Tv253a1BiP/Hsp70. Todo animal infectado con T. vivax representa un reservorio potencial del parásito. De esta forma, la alta prevalencia de la infección en áreas que experimentan altos índices de migración, especialmente de ganado bovino, representa un riesgo en la diseminación del parásito, y justifica de forma importante la realización de estudios que ayuden al diagnóstico de la tripanosomiasis bovina, basado en la presencia de anticuerpos contra el parásito protozoario T. vivax en el suero de animales infectados. Una de las pruebas serológicas es el ELISA, debido a

147 su relativo bajo costo, simplicidad, y resultados que arrojan en términos tanto de especificidad como de sensibilidad.

El uso de antígenos recombinantes y péptidos sintéticos para el diagnóstico serológico de la infección por T. vivax, ha mostrado avances en términos de sensibilidad y especificidad; además, tiene la ventaja de que pueden obtenerse con cierta facilidad y en cantidades apreciables con un alto grado de pureza. Los antígenos recombinantes son más específicos que los extractos del parásito, ya que estos últimos pueden presentar una reacción cruzada con sueros de animales con otras enfermedades como anaplasmosis o babesiosis. En este estudio se utilizó el polipéptido recombinante Tv_253a-1/BiP en dos pruebas serológicas diferentes (ELISA y WB), para determinar anticuerpos anti tripanosoma en muestras de animales infectados experimentalmente con T. vivax.

Es bien sabido la dificultad que existe al estandarizar un método de ELISA indirecto por la adsorción inespecífica de los sueros de bovinos, es por ello que se utilizaron tres soluciones de bloqueo (PBS-T/0,5% gelatina, PBST-T/0,5% OVA y PBS-T/0,5%OVA/2% Suero de conejo) en la estandarización y varios lavados prolongados con PBS-T en cada paso, y con ello se logró mejorar relativamente el problema de adsorción inespecífica. En nuestros resultados (Figuras, 45-47) en el ELISA indirecto, la mayoría de los sueros positivos tomados días después de la infección experimental con T. vivax, mostraron una alta absorbancia a 405nm con respecto a los que fueron tomados antes de dicha inoculación y que, a efectos de este trabajo, se consideran sueros negativos.

Algunos de los sueros posteriores a la infección mostraron una baja absorbancia a 405 nm, lo que se podría explicar un nivel bajo de anticuerpos, cercanos al límite de detección de esta prueba. Para un estudio mas completo y establecer un

148 adecuado y estadísticamente significativo punto de corte en un ELISA con este antígeno recombinante, se hace necesario evaluar un mayor número de sueros, tomados antes y después de la infección experimental y así establecer la especificidad (falsos positivos) y la sensibilidad (falsos negativos) de esta prueba con el antígeno recombinante aquí utilizado.

Por esta razón, algunos de sueros bovinos fueron evaluados mediante la técnica de Inmunodetección (WB) frente al antígeno recombinante r253a-1/BiP. En las muestras tomadas desde 5 días después de la infección (+5) hasta 51 días (+51), al igual que en el ELISA indirecto, se evidenció un reconocimiento del antígeno recombinante de un peso molecular de ~14 kDa correspondiente al fragmento r253a1 de la proteína BiP/Hsp70 de T. vivax, tanto con sueros de la fase temprana como tardía de la infección (Figura, 48) a los anticuerpos primarios; es decir, pudo reconocer anticuerpos contra esa fracción de la proteína BiP/Hsp70 de T. vivax tanto en las infecciones tempranas como las tardías y por el contrario, no detectó la presencia de anticuerpos contra el fragmento recombinante, Tv_253a-1/BiP en los sueros tomados días previos a la infección experimental con T. vivax, ni con el suero de campo negativo (previamente evaluado parasitológica y serológicamente), ni con un suero agammaglobulinémico (Figura, 48). Asimismo, los sueros provenientes de animales infectados experimentalmente con A. marginale y B. bovis (con +58 y +26 días post-infección, respectivamente), no reconocieron este antígeno recombinante (Figura, 48).

Esta especificidad en el reconocimiento antigénico es importante

porque en la naturaleza encontramos animales con infecciones mixtas con estos hemoparásitos, por lo que presentan anticuerpos contra ellos y, por lo tanto, el tener un ensayo inmunológico que pueda discriminar una infección por tripanosoma de A. marginale ó de B. bovis, ayudaría considerablemente para la aplicación del tratamiento adecuado para eliminar la enfermedad.

149 Aunque la técnica inmunotinción o “western blot” no se utiliza de rutina, representa una buena prueba de confirmación, además es relativamente rápida de realizar; no se considera como un sustituto para el serodiagnóstico convencional, pero se podría utilizar como una prueba alternativa y complementaria para la confirmación de la tripanosomiasis bovina.

El empleo de varias técnicas serológicas, asegurará la confiabilidad de los resultados, especialmente para las muestras positivas con títulos bajos. Se recomendaría la inclusión de antígenos recombinantes para el diagnóstico de la infección por T. vivax, si se realiza en paralelo con una prueba como el WB para obtener la especificidad deseada con el antígeno recombinante y la sensibilidad requerida.

Determinación

de

la

antigenicidad

de

los

Péptidos

Sintéticos

correspondientes a la proteína recombinante 253a-1/BiP. En la actualidad se han estudiado diferentes proteínas de la familia HSP70, que actúan como importantes antígenos durante la infección con los tripanosomas que infectan al ganado bovino: Trypanosoma vivax, T. congolense y T. brucei (Bannai, 2003, Bolívar et al.2007, Bossard et al.2010, Manful et al.2010). La gran identidad que presentan las HSP70, provocan la aparición de reacciones cruzadas con anticuerpos generados por estos tripanosomatídeos. Por ello, el uso de proteínas completas con gran homología entre especies están siendo reemplazadas por el uso de fragmentos recombinantes y/o péptidos sintéticos y, de esta manera, tratar de eliminar las reacciones cruzadas. El uso de regiones no conservadas o menos conservadas, dentro de las proteínas HSP70 conservadas, aumentaría la especificidad del diagnóstico al utilizarse este tipo de fragmentos. En este sentido, en el presente trabajo se generó la síntesis de cuatro péptidos sintéticos a través del Laboratorio Nacional de Proteómica e Inmunoquímica de Proteínas de la UCV, identificados como IMT-1883, IMT-1886, IMT-1887 e IMT 1888, correspondientes a las regiones más antigénicas de la

150 proteína BiP/Hsp70 de T. vivax (Anexos 10 y 11). Dos de ellos comprenden a las regiones N- y C- terminal del fragmento recombinante 253a-1/BiP: el primero, desde el aminoácido D8 al A15 (IMT-1883) que, en el fragmento recombinante, se corresponde con los aminoácidos D1 al D9; y el segundo, del aminoácido R1 al H14 (IMT-1886) que, en el fragmento recombinante se sitúan de los aminoácidos R68 al H81. Lo que indica que al igual que el fragmento recombinante, 253a-1/BiP, estos dos fragmentos son reconocidos por los sueros de animales infectados con T. vivax y no por los sueros de animales sanos (Figura, 49). Sin embargo, en vista de que en nuestro país y en Sudamérica no se han encontrado casos de infecciones por T. congolense y T. brucei, no se ha podido evaluar la característica de esta proteína recombinante ni de los péptidos de ella derivados.

Los otros dos péptidos sintéticos, IMT-1887 y IMT-1888, también fueron reconocidos por los sueros provenientes de animales infectados con T. vivax experimentalmente y no fueron reconocidos por los sueros de animales sanos (Figura, 49). Estos péptidos se ubican más hacia el extremo C- terminal, lugar donde muchos autores como Bangs et al., 1993; Boulangé et al., 2002; Bannai y col, 2003, la indican como con menos homóloga y que en su momento pensaron que podría ser especie específica. Pero Bossard et al., 2010 demostraron que no es específica para cada especie de tripanosomas. Para ello, utilizaron un fragmento del C- terminal (C25) de la proteína P69 de T. congolense, con la que obtuvieron un anticuerpo monoclonal y junto con la proteína completa fusionada con MBP (proteína de unión a la maltosa), desarrollaron un ELISA se inhibición, el cual demostró no ser especie específica, ya que reconocía los anticuerpos provenientes de animales infectados con T. congolense, T. vivax y T. brucei. Por otro lado, la prueba resultó tener baja sensibilidad con los sueros provenientes de animales con infecciones primarias.

En nuestro caso, con el uso de los péptidos sintéticos, no se podría hablar de forma cuantitativa como para demostrar si tiene o no baja sensibilidad en animales

151 con infecciones tempranas a la tripanosomiasis, ya que estos péptidos no fueron evaluados por el ELISA indirecto de la forma hecha con el fragmento recombinante 253a-1/BiP de la proteína BiP/Hsp70 de T. vivax; pero sí se pudo demostrar con la prueba de inmunotinción (Westen Blot), que los anticuerpos presentes en los sueros bovinos a los 11 y 17 días post infección pudieron reconocer los cuatro péptidos sintéticos, no así los dos sueros negativos, uno proveniente de un animal de campo (serológicamente negativo) y

la otra muestra tomada a los 56 días previo a la

infección experimental. En cuanto a que si este es un ensayo pan-tripanosoma, al igual que para el ELISA indirecto con el fragmento recombinante 253a-1/BiP, podría ser una interesante posibilidad en función de la considerable homología que presenta la proteína BiP/Hsp70 de T. vivax con las proteínas Grp78/BiP y P69 de T. brucei y T. congolense, respectivamente.

Por otro lado, los resultados obtenidos con los péptidos sintéticos generan una expectativa de su gran utilidad para el diagnóstico de la tripanosomiasis bovina; por lo que, el uso de estos péptidos sintéticos estratégicamente diseñados, pudiera ser una herramienta importante en el diagnóstico de la tripanosomiasis bovina y, aunque un ELISA con péptidos sintéticos como antígenos generalmente no es de rutina, sería importante considerarla como una prueba confirmatoria.

Los resultados de los ensayos serológicos utilizados en este trabajo, sugieren que la proteína parcial recombinante de T. vivax, 253a-1/BiP es capaz de eliminar las reacciones cruzadas con otras enfermedades, incrementando así su especificidad. Aunque es necesario hacer muchos más ensayos con este polipéptido recombinante para confirmar definitivamente que es un antígeno ideal, queda demostrado por los resultados obtenidos en este trabajo, que se trata de un polipéptido muy antigénico, teniendo en cuenta que es una proteína intracelular y que podría ser aprovechada como una herramienta para monitorear a gran escala la enfermedad en áreas endémicas y, en el seguimiento de animales que estén recibiendo o han recibido

152 tratamientos quimioterapéuticos, lo que nos permitiría conocer la efectividad del tratamiento.

En consecuencia, este trabajo constituye un aporte significativo en la materia, pues los resultados obtenidos abren la posibilidad del uso de esta proteína parcial recombinante como instrumento importante para el diagnóstico inmunológico de esta parasitosis, considerada un problema de salud animal causante de importantes pérdidas económicas.

153

V. CONCLUSIONES 1. Se dispone de un método mejorado de purificación del Trypanosoma vivax, que permite la obtención de fracciones ricos en tripanosomas viables. El procedimiento describe una técnica sencilla; utiliza una columna de intercambio aniónico en solución de Krebs modificado pH7,2, alcanzándose rendimientos de purificación del 60%. Por otro lado, se encontró que una buena cantidad (~0,37 x 107 p/ml) de tripanosomas se quedan en el plasma después de la centrifugación añadiéndole 0,5% de glucosa, de donde se pueden obtener sin pasar por la columna cromatográfica, lo que proporciona una herramienta muy útil para la obtención de estos parásitos.

2. Los oligonucleótidos degenerados diseñados a partir de T. congolense, permitieron obtener un fragmento de 320 pb de la secuencia del gen de la proteína Bip/Hsp70 de T. evansi que presenta una homología del 98% y 100% con la secuencia de nucleótidos de las proteína de T. brucei, TREU927/Grp78 y BiP/Grp78, respectivamente. Y con los oligonucleótidos degenerados internos, se logró obtener un fragmento de 520 pb del gen que codifica a la proteína BiP/Hsp70 de T. vivax, el cual presenta una homología del 85% con el gen de la proteína P69 de T. congolense y, a partir de esta secuencia, se consiguió obtener parte de la secuencia del gen bip/hsp70 de T. vivax, que junto con los oligonucleótidos específicos a partir de la secuencia hipotética de este gen se completó la secuencia real del gen de la proteína BiP/Hsp70, la cual presentó 99% de homología con respecto a la secuencia hipotética, 83% con la secuencia del gen grp78/bip de T. brucei y 86% de homología con la secuencia del gen p69/hsp70 de T. congolense.

154 3. El análisis de identidad de la secuencia de aminoácidos de la proteína Bip/Hsp70 de T. vivax con las Hsp70 de otros tripanosomatídeos muestra una elevada conservación, manteniendo la característica que en el aminoterminal de la proteína está más conservado que en la región C-terminal. También presenta la secuencia señal de importación al retículo endoplasmático en el Nterminal (XXXLLLXXX), característica importante de este tipo de proteínas dependientes de ATP; así como también la secuencia señal de la retención (MDDL) en su extremo C- terminal, la cual le hace diferente al resto de los eucariotas estudiados.

4. De la secuencia completa del gen bip/hsp70 de T. vivax se amplificaron secuencias de regiones antigénicas, las cuales fueron clonadas y una de ellas expresada en E. coli Rosetta® (pRARE).

5. El polipéptido recombinante 253a-1/BiP de T. vivax, tanto en el ensayo ELISA indirecto como en la Inmunotinción, es reconocido por sueros de bovinos infectados experimentalmente con este protozoario y no es reconocido por sueros de bovinos infectados experimentalmente con A. marginale y B. bovis, indicando su eventual valor diagnóstico.

6. Los cuatro péptidos sintéticos correspondientes a las regiones con presencia de estructura secundaria tipo “arreglos al azar” y vueltas, correspondientes a las zonas más antigénicas, hidrofílicas y de mayor accesibilidad al solvente, también

fueron

reconocidos

por

los

sueros

de

bovinos

infectados

experimentalmente con T. vivax convirtiéndose así en una posible prueba confirmatoria para la tripanosomiasis bovina.

155

VI. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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de

las

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165

ANEXOS

1. Mapa del plásmido pRARE incluido en E. coli Rosetta

166 2. Mapa y características del vector pET100/D-TOPO®

3. Mapa y características del vector pET160/GW/D-TOPO®

167 4. Protocolo del control piloto de la expresión

168

5. Cromatograma por el programa BioEdit de la secuencia 253a-1

169

6. Secuencia nucleotídica real de la proteína BiP/Hsp70 de T. vivax >Tv_bip/hsp70: 1959pb ATGGCGAAGGCGATGCGGCTCGCAGCTGCGGCGCTGCTCTTGGTGGCTGCCGCCACTGCT GCGTGGGCTGCGCCGGAGGCGAGCGGGAAGGTGGAGGCGCCGTGCGTGGGCATTGACCTT GGCACGACGTACTCGGTGGTGGGCGTGTGGCAGAAGGGCGACGTGCACATCATCCCGAAC GAGATGGGGAACCGCATCACGCCGTCTGTGGTGGCGTTCACGGAGACGGAGCGGCTGATT GGCGACGGCGCGAAGAACCAGCTGCCACAGAACCCGCACAACACCATCTACACGATCAAG CGCCTGATTGGCCGCAAGTACTCGGACCCCGCGGTGCAGGCGGACAAGAAGCTGCTGTCG TACGAGGTTGTTGCGGACCGTGACGGGAAGCCGAAGGTGCAGGTGACGCTGGGCGGGAAG AAGAAGGAGTTCACGCCGGAGGAGGTGAGCGCGATGGTGCTGCAGAAGATGAAGGAGATC GCGGAGACGTACCTGGGCGAGAAGGTGAAGAACGCGGTGGTGACTGTGCCTGCGTACTTC AACGACGCGCAGCGCCAGTCGACGAAGGACGCGGGGACGATCGCGGGGCTGAACGTGGTG CGCATCATCAACGAGCCGACGGCGGCCGCAATCGCGTACGGGCTGAACAAGGCCGGGGAG AAGAACATCCTGGTGTTCGACCTGGGTGGCGGCACGTTCGATGTGTCGCTGCTGACGATC GACGAGGGCTTCTTCGAGGTGGTGGCGACGAACGGCGACACGCACCTTGGCGGCGAGGAC TTTGACAACAACATGATGCGCTACTTTGTGGACATGCTGAAGAAGAAGCGCAACGTGGAC GTGAGCAAGGACCAGAAGGCGCTTGCCCGGCTGCGCAAGGCGTGCGAGGCGGCGAAGCGA CAGCTGTCGTCGCACCCCGAGGCGCGCGTGGAGGTGGACAGTCTGACGGAGGGCTTTGAC TTCAGCGAGAAGATCACGCGCGCGAAGTTCGAGGAGCTGAACATGGACCTGTTCAAGGGG ACGCTGGTGCCCGTGCAGCGCGTGCTGGAGGACGCGAAGCTGAAGAAGAGCGACATCCAC GAGATTGTGCTTGTGGGTGGCTCGACGCGCGTGCCCAAGGTGCAGCAGCTGATCAGCGAC TTCTTTGGCGGGAAGGAGCTGAACCGCGGGATCAACCCCGACGAGGCTGTGGCGTACGGC GCTGCGGTGCAGGCCGCGGTGCTGACGGGCGAGAGCGAGGTGGGCGGGCGCGTGGTGCTT GTGGACGTGATCCCGCTGTCGCTGGGCATTGAGGCGGTGGGCGGGATCATGACGAAGCTG ATCGAGCGCAACACGCAGATCCCGACCAAGAAGAGCCAGGTGTTCTCCACGCACGCGGAC AACCAGCCCGGCGTGCTGATCCAGGTGTACGAGGGCGAGCGCCAGCTGACGAAGGACAAC CGGCTGCTCGGGAAGTTCGAGCTGTCCGGCATCCCGCCTGCGCCGCGCGGCGTGCCGCAG ATCGAGGTGACGTTCGACGTGGACGAGAACAGCATCCTGCAGGTGAGCGCGGTGGACAAG TCGTCCGGGAAGAAGGAGGAGATCACGATCACGAACGACAAGGGGCGGCTGAGCGAGGAG GAGATTGAGCGCATGGTGCGCGAGGCTGCGGAGTTCGAGAACGAGGACCGCAAGGTGCGC GAGCGCGTGGACGCGCGCAACACGCTGGAGAGCGTGACGTACTCGCTGCGCAGCCAGGTG AACGACAAGGACAAGCTGGGCGGGAAGCTGAGCGCCGACGAGAAGAGCACTGTGGAGGCT GCGGTGAAGGAGGCGATCCGGTTCCTGGACGAGAACCCGAACGCGGAGAAGGAGGAGTAC GACGCTGCGCGCGAGAAGCTGCAGGGCGTGACCAACCCCATCATCCAGAAGGCCTACCAG GCTGGTGGCGAGAAGCCGCAGCCGATGGACGACCTGTAA

170

7. Secuencia aminoacídica real de la proteína BiP/Hsp70 de T. vivax

>Tv_bip/hsp70, 653 bases, MAKAMRLAAAALLLVAAATAAWAAPEASGKVEAPCVGIDLGTTYSVVGVW QKGDVHIIPNEMGNRITPSVVAFTETERLIGDGAKNQLPQNPHNTIYTIK RLIGRKYSDPAVQADKKLLSYEVVADRDGKPKVQVTLGGKKKEFTPEEVS AMVLQKMKEIAETYLGEKVKNAVVTVPAYFNDAQRQSTKDAGTIAGLNVV RIINEPTAAAIAYGLNKAGEKNILVFDLGGGTFDVSLLTIDEGFFEVVAT NGDTHLGGEDFDNNMMRYFVDMLKKKRNVDVSKDQKALARLRKACEAAKR QLSSHPEARVEVDSLTEGFDFSEKITRAKFEELNMDLFKGTLVPVQRVLE DAKLKKSDIHEIVLVGGSTRVPKVQQLISDFFGGKELNRGINPDEAVAYG AAVQAAVLTGESEVGGRVVLVDVIPLSLGIEAVGGIMTKLIERNTQIPTK KSQVFSTHADNQPGVLIQVYEGERQLTKDNRLLGKFELSGIPPAPRGVPQ IEVTFDVDENSILQVSAVDKSSGKKEEITITNDKGRLSEEEIERMVREAA EFENEDRKVRERVDARNTLESVTYSLRSQVNDKDKLGGKLSADEKSTVEA AVKEAIRFLDENPNAEKEEYDAAREKLQGVTNPIIQKAYQAGGEKPQPMD DL*

171 8. Regiones antigénicas en la secuencia de la proteína BiP/Hsp70 de T. vivax (enmarcados) y las ubicaciones de los diferentes oligonucleótidos (casilleros de colores)

172 9. Diagrama del Alineamiento de las secuencias de la proteína BiP/Hsp70 de T. vivax con sus homólogos Grp78/BiP y p69 de T. brucei y T. congolense, respectivamente; utilizando el programa JalView. Lo enmarcado en azul indica la ubicación del polipéptido recombinante r253a-1/BiP de T. vivax.

Nota: Lo remarcado en azul es la ubicación del polipéptido recombinante r253a-rBiP/Hsp70

173 10. Análisis de los Péptidos Sintéticos por el programa Antheprot

IMT-1883 IMT-1886 IMT-1887 IMT-1888

LKKKRNVDVSKDQKA RVLEDAKLKKSDIHE ERQLTKDNRLLGKFE NAEKEEYDAAREKLQ

174 11. Ubicación de los péptidos sintéticos dentro de la secuencia de aminoácidos de la proteína BiP/Hsp70 de T. vivax

>Tv_bip/hsp70, 653 bases MAKAMRLAAAALLLVAAATAAWAAPEASGKVEAPCVGIDLGTTYSVVGVW QKGDVHIIPNEMGNRITPSVVAFTETERLIGDGAKNQLPQNPHNTIYTIK RLIGRKYSDPAVQADKKLLSYEVVADRDGKPKVQVTLGGKKKEFTPEEVS AMVLQKMKEIAETYLGEKVKNAVVTVPAYFNDAQRQSTKDAGTIAGLNVV RIINEPTAAAIAYGLNKAGEKNILVFDLGGGTFDVSLLTIDEGFFEVVAT NGDTHLGGEDFDNNMMRYFVDMLKKKRNVDVSKDQKALARLRKACEAAKR QLSSHPEARVEVDSLTEGFDFSEKITRAKFEELNMDLFKGTLVPVQRVLE DAKLKKSDIHEIVLVGGSTRVPKVQQLISDFFGGKELNRGINPDEAVAYG AAVQAAVLTGESEVGGRVVLVDVIPLSLGIEAVGGIMTKLIERNTQIPTK KSQVFSTHADNQPGVLIQVYEGERQLTKDNRLLGKFELSGIPPAPRGVPQ IEVTFDVDENSILQVSAVDKSSGKKEEITITNDKGRLSEEEIERMVREAA EFENEDRKVRERVDARNTLESVTYSLRSQVNDKDKLGGKLSADEKSTVEA AVKEAIRFLDENPNAEKEEYDAAREKLQGVTNPIIQKAYQAGGEKPQPMD D