Teoricacitometria[1]

Citometría de flujo

Renée L. Crisp

Citometría de Flujo

Jefa TP Turno Noche

Citometría de flujo Es la ciencia que permite clasificar y separar células vivas determinando propiedades físicas o biológicas de las diferentes poblaciones celulares.

Parámetros celulares que pueden estudiarse: • • • • • • • •

Tamaño celular Complejidad celular interna (organelas, gránulos) Contenido de ácidos nucleicos (DNA, RNA) Proteínas de superficie Proteínas citoplasmáticas Actividades enzimáticas Viabilidad etc.

Citometría de flujo ™ Surge a mediados de la década del 70. ™ Resulta de la integración del desarrollo de otras técnicas fundamentales:

• Microscopía • Tinciones citoquímicas – Tinciones fluorescentes (1880) – Anticuerpos conjugados (1950) – Anticuerpos monoclonales (1975)

• Electrónica – Fotomultiplicador (conversión de fotones en pulsos eléctricos (1945)

• Computación

Muestra ™ Células suspendidas en un medio líquido – Sangre – Cultivos celulares – Tejidos – Tumores sólidos – Alimentos (para estudio de contaminación bacteriana)

™ Las muestras sólidas se disgregan por digestión mecánica o enzimática

Parámetros a medir • Tamaño • Complejidad interna • Fluorescencia

Proteínas de superficie Contenido de DNA etc. …

La muestra NO requiere tratamiento adicional Se marcan las células con anticuerpos específicos conjugados con fluorocromos

FLUORESCENCIA Fenómeno en el que un compuesto absorbe energía luminosa a una determinada longitud de onda (espectro de absorción) y luego emite el exceso de energía en forma de fotón a una longitud de onda que le es característica (espectro de emisión)

Fluorescein (FITC) Excitation Emisson 300 nm

400 nm

500 nm

495 nm

600 nm

520 nm

(430-520)

(490-630)

Protein

700 nm

Fluorocromos „

FITC también llamado FL1 (Isotiocianato de fluoresceina) de fluoresceína Isotiocianato

„

PE

„

PerCP llamado FL3 (piridin clorofil proteina)

„

APC llamado FL4 (aloficocianina).

llamado FL2 ( Ficoeritrina)

Espectros de emisión 300 nm

400 nm

500 nm

600 nm

PerCP FITC

PE

700 nm

APC

Componentes básicos de un citómetro ¾ Cámara de flujo ¾ Fuente de luz y óptica de focalización ¾ Fotodetectores y sistema óptico para direccionar ¾ Sistema electrónico (amplificación y conversión a señal eléctrica) ¾ Computadora (hardware y software)

Cámara de flujo: focalización hidrodinámica Muestra suspensión tridimensional

Injector Tip

Fluido: flujo Sheath laminar envolvente Fluid y estable

Luz de emisión Fluorescence (dispersión y signals fluorescencia)

Focused laser Luz de excitación beam (láser) La muestra es inyectada a presión en el centro de un fluido envolvente que se mueve a alta velocidad que logra ordenar a las células que circulan una a una frente a la fuente de excitación.

FUENTE DE EXCITACIÓN Cada célula es expuesta a la luz de excitación durante 1 a 5 useg Fuente de iluminación pequeña y brillante Determinan los fluorocromos que pueden ser utilizados para conjugar los anticuerpos

Láser

(1 o más) Argón: 334-364, 458, 488, 514 Kriptón: 351-356, 407, 568, 647 Helio – Neón: 633

FUENTE DE EXCITACIÓN y FLUOROCROMOS

Common Laser Lines

350 300 nm

457 488 514 400 nm

500 nm

610 632 600 nm

700 nm

PE-TR Conj. Texas Red PI Ethidium PE FITC cis-Parinaric acid

Desviación de la luz Depende de las características de la partícula „

FSC: luz con desviación frontal (Forward Scatter) Depende del tamaño de la partícula

„

SSC: luz con desviación lateral (Side Scatter) Depende de la granularidad

Fluorescence Activated Cell Sorting 488 nm laser

FALS Sensor Fluorescence detector

Charged Plates

Single cells sorted into test tubes

-

+

Standard Long Pass Filters Light Source

520 nm Long Pass Filter Transmitted Light

>520 nm Light

Standard Short Pass Filters Light Source

575 nm Short Pass Filter Transmitted Light

<575 nm Light

Standard Band Pass Filters 630 nm BandPass Filter White Light Source

Transmitted Light

620 -640 nm Light

Optical Filters Dichroic Filter/Mirror at 45 deg

Light Source

Transmitted Light

Reflected light

Compensación electrónica ™Los espectros de emisión pueden ser muy próximos ™Los filtros no son perfectos

Fluorescencia detectada en FL2 pero debida a FITC (FL1)

Los citómetros tienen incorporado un algoritmo matemático que remueve las fluorescencias superpuestas (compensación)

Adquisición Identificación de las poblaciones a ser analizadas „ FSC vs. SSC „ Gráficos Scatter vs. Fluorescencia „ Gráficos Fluorescencia vs. Fluorescencia „

Presentación de Datos „

Histogramas

„

Dot Plots

„

Contour Plots

„

3D Plots

Histogramas

Dot Plot

Contour Plot

Diagrama de densidad

Diagrama de contornos

3D

Selección de poblaciones

Región11 Región Región22 Región Región33 Región

Algunas células sanguíneas y como identificarlas…. Polimorfonucleares neutrófilos (PMN) Poseen gránulos Æ Alta complejidad interna

Monocitos (Mo) Tamaño similar a PMN Complejidad intermedia Linfocitos (Ly) Pequeño tamaño Baja complejidad interna

Cluster CD 45

Linaje Leucocitos

Función Transducción

(Glóbulos Blancos)

CD 14 CD 64 CD 19 CD 20 CD 22 CD 3 Receptor CD 4 HIV CD 8 CD 56

Monocitos

Receptor endotoxina

Receptor Fc

Linfocitos B

Transducción Canal de Ca++ Molécula de adhesión

Linfocitos T T helper T citotóxicos Natural Killer

Transducción Correceptor MHC II Correceptor MCH I Molécula de adhesión

MUESTRA CD 3 CD 4 CD 8 Linfocito CD 19 Monocito PMN

REACTIVO anti CD 3 anti CD 4 anti CD 8

Recuento de linfocitos T (pacientes HIV +)

•

Selección de la población CD 3 positiva (linfocitos T)

•

% de eventos CD4 y CD8 en la población CD3 +

anti CD 3 anti CD 4 anti CD 8

PLOIDIA Indice de replicación tumoral

Clínicas

APLICACIONES

• Evaluación del estado inmunológico • Tipificación de leucemias y linfomas • Grado de crecimiento tumoral • etc…

Industria alimenticia • Contaminación bacteriana o por levaduras Ecología

• Evaluación del impacto ambiental por determinación de autofluorescencia de algas marinas en muestras seriadas

etc…